專利名稱：用脂肪組織來源的細(xì)胞治療心血管疾病的方法
相關(guān)申請本申請要求標(biāo)題為“用脂肪組織來源的細(xì)胞治療心血管疾病的方法”的2003年2月20日申請的美國臨時(shí)申請?zhí)?0/449,279和標(biāo)題為“用脂肪組織來源的細(xì)胞治療心血管疾病的方法”的2003年4月15日申請的美國臨時(shí)申請?zhí)?0/462,911的優(yōu)先權(quán)。將前述申請的內(nèi)容明確并入本文作為參考。
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及來源于脂肪組織的細(xì)胞，更具體地，涉及脂肪來源的干細(xì)胞和祖細(xì)胞(progenitor cell)，涉及使用脂肪來源的干細(xì)胞和祖細(xì)胞的方法，涉及含有脂肪來源的干細(xì)胞和祖細(xì)胞的組合物，和用于制備和使用脂肪來源的干細(xì)胞和祖細(xì)胞的系統(tǒng)，所述脂肪來源的干細(xì)胞和祖細(xì)胞用于治療心血管疾病和病癥。
2.相關(guān)文獻(xiàn)描述心血管疾病和病癥是所有工業(yè)化國家中死亡和勞動(dòng)能力喪失的主要原因。僅在美國，心血管疾病就占死亡率的約40％，并侵襲5800萬美國人(美國心臟協(xié)會(huì)，2002)。使得心血管疾病尤其具有破壞性的主要因素之一是心臟損失后不能自身修復(fù)。因?yàn)樾募〖?xì)胞，即心肌細(xì)胞不能分裂和在受損部位重新增殖，由于損傷或者疾病導(dǎo)致的心臟細(xì)胞損失很大程度上是不可逆的(Abbate等人，2002；Remme，2000)。
在可以利用的治療形式中，人到人的心臟移植在治療嚴(yán)重心血管疾病和病癥中最有效。實(shí)際上，普通心臟移植受體的一年和五年生存率在當(dāng)前為70％。然而，當(dāng)前，由于許多原因，移植是嚴(yán)重受限的形式，所述原因即適宜供體的缺乏、該方法的花費(fèi)和很可能產(chǎn)生移植物排斥和相關(guān)問題，如感染、腎功能異常和免疫抑制劑相關(guān)的癌(美國心臟協(xié)會(huì)，2002)。
移植療法的備選方案是使用再生藥物修復(fù)和再生受損的心肌細(xì)胞。再生性藥物以臨床靶定的方式控制干細(xì)胞(即機(jī)體的未特化的主細(xì)胞(master cell))自身無限地更新和發(fā)育成成熟的特化細(xì)胞。在發(fā)育早期的胚胎、胎兒組織和某些成年器官和組織中發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞(Pera等人，2000)。已知胚胎干細(xì)胞(下文中稱作“ESCs”)變成身體的許多(如果不是所有)細(xì)胞和組織類型。ESCs不僅含有個(gè)體的所有遺傳信息而且還含有變成身體的200+細(xì)胞和組織的任一種的新生能力。從而，這些細(xì)胞具有作為再生藥物的巨大潛力。例如，ESCs可以生長成特定組織，如心臟、肺或者腎，然后它們可以用于修復(fù)受損和患病的器官(Assady等人，2001；Jacobson等人，2001；Odorico等人，2001)。然而，ESC來源的組織具有臨床局限。因?yàn)镋SCs必須來源于另一個(gè)個(gè)體，即，胚胎，所以存在受體的免疫系統(tǒng)排斥新的生物物質(zhì)的危險(xiǎn)。盡管可以利用防止這種排斥的免疫移植藥物，但是公知這些藥物阻斷所希望的免疫應(yīng)答，如針對細(xì)菌感染和病毒的免疫應(yīng)答。此外，對ESCs來源，即胚胎的倫理上的爭論由來已久并造成了額外的，可能是可預(yù)見的將來不可克服的障礙。
成年人干細(xì)胞(下文中可互換稱作“ASCs”)代表使用ESCs的備選方案。ASCs靜止地存在于許多非胚胎組織中，可能等待應(yīng)答外傷或者其他破壞性疾病過程從而它們可以治療受傷的組織(Arvidsson等人，2002；Bonner-Weir和Sharma，2002；Clarke和Frisen，2001；Crosby和Strain，2001；Jiang等人，2002a)。值得注意地，不斷出現(xiàn)的科學(xué)證據(jù)表明每個(gè)個(gè)體攜帶ASCs庫，其與ESCs都具有變成許多(如果不是所有)細(xì)胞和組織類型的能力(Young等人，2001；Jiang等人，2002a；Jiang等人，2002b；Schwartz等人，2002)。從而，ASCs，像ESCs具有再生藥物的臨床應(yīng)用的巨大潛力。
已經(jīng)表明ASC群體存在于骨髓、皮膚、肌肉、肝臟和腦的一種或多種中(Jiang等人，2002b；Alison，1998；Crosby和Strain，2001)。然而，這些組織中ASCs的頻率很低。例如，估計(jì)骨髓中間充質(zhì)干細(xì)胞頻率為100,000個(gè)有核細(xì)胞中一個(gè)到1,000,000個(gè)有核細(xì)胞中一個(gè)(D＇Ippolito等人，1999；Banfi等人，2001；Falla等人，1993)。類似地，從皮膚摘除ASCs包括數(shù)周內(nèi)一系列復(fù)雜細(xì)胞培養(yǎng)步驟(Toma等人，2001)并且骨骼肌來源的ASCs的臨床應(yīng)用需要兩到三周培養(yǎng)期(Hagege等人，2003)。從而，來自這些組織的ASCs的任何提出的臨床應(yīng)用需要通過細(xì)胞純化和細(xì)胞培養(yǎng)方法增加細(xì)胞數(shù)、純度和成熟。
盡管細(xì)胞培養(yǎng)步驟可以提供增加的細(xì)胞數(shù)、純度和成熟，但是需要付出代價(jià)。該代價(jià)包括下面的技術(shù)困難之一或多個(gè)由于細(xì)胞老化喪失細(xì)胞功能、可能有用的非干細(xì)胞群體的損失、細(xì)胞可能應(yīng)用于患者的延遲、金錢花費(fèi)增加，和培養(yǎng)期間細(xì)胞受到環(huán)境微生物污染的危險(xiǎn)增加。最近檢查骨髓來源的ASCs的治療效果的研究使用基本上完整骨髓以克服與細(xì)胞培養(yǎng)有關(guān)的問題(Horwitz等人，2001；Orlic等人，2001；Stamm等人，2003；Strauer等人，2002)。然而，臨床益處是次最佳的，并且結(jié)果幾乎無疑與有限的ASC劑量和骨髓中內(nèi)在可利用的純度有關(guān)。
最近，已經(jīng)證明脂肪組織是ASCs的來源之一(Zuk等人，2001；Zuk等人，2002)。不像骨髓、皮膚、肌肉、肝臟和腦，脂肪組織相當(dāng)容易以相對大量收獲(Commons等人，2001；Katz等人，2001b)。此外，已經(jīng)表明脂肪來源的ASCs具有在體外產(chǎn)生多種組織，包括骨髓、脂肪、軟骨和肌肉的能力(Ashjian等人，2003；Mizuno等人，2002；Zuk等人，2001；Zuk等人，2002)。從而，脂肪組織給出了用于再生藥物中的ASCs的最佳來源。然而，本領(lǐng)域中缺少收獲脂肪來源的ASCs的適宜方法?，F(xiàn)有方法具有許多缺點(diǎn)。例如，現(xiàn)有方法不能最適地容納用于除去脂肪組織的吸出裝置。現(xiàn)有方法還缺少從脂肪組織收獲期到組織加工期的部分或完全自動(dòng)化(Katz等人，2001a)?，F(xiàn)有方法還缺少大于100ml脂肪組織的容量?，F(xiàn)有方法還缺少從脂肪組織收獲期到組織加工期的部分或全部密閉系統(tǒng)。最后，現(xiàn)有方法缺少組分處理能力以減小一個(gè)樣品與另一個(gè)樣品的物質(zhì)的交叉污染的伴隨危險(xiǎn)?？傊?，從脂肪組織收獲ASCs的現(xiàn)有技術(shù)方法沒有克服與從上述皮膚、肌肉、肝臟和腦收獲ASCs相關(guān)的技術(shù)困難。
因此，考慮到ASCs的巨大的治療潛力，本領(lǐng)域中迫切需要從產(chǎn)生ASCs群體的脂肪組織以高產(chǎn)率、一致性和/或純度收獲ASCs并且快速而可靠地收獲并且對摘除后操作的需要減小或者不存在的裝置、細(xì)胞或者方法。理想地，這種裝置、系統(tǒng)或者方法將以適于直接置于受體的方式產(chǎn)生ASCs。這種裝置、系統(tǒng)或方法的獲得以及使用脂肪來源的ASCs治療心血管疾病和病癥的方法和組合物將對這些疾病的治療產(chǎn)生巨大變化。考慮到心血管疾病的普遍和當(dāng)前治療選擇的不足，迫切需要這種治療。
發(fā)明概述本發(fā)明至少部分基于如下發(fā)現(xiàn)脂肪來源的成年人干細(xì)胞可用于治療心血管病癥、疾病和失調(diào)。本發(fā)明還基于發(fā)現(xiàn)用于制備脂肪來源的成年干細(xì)胞和祖細(xì)胞的裝置、系統(tǒng)和方法。本發(fā)明還基于發(fā)現(xiàn)脂肪來源的成年干細(xì)胞和祖細(xì)胞用于治療心血管病癥、疾病和失調(diào)的方法和組合物。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及使用來源于脂肪組織的細(xì)胞的組合物、方法和系統(tǒng)，所述細(xì)胞與促進(jìn)、產(chǎn)生或者支持治療心血管益處所需的添加劑一起直接置于受體中。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在保持密閉的、無菌流體/組織途徑的系統(tǒng)中發(fā)生脂肪組織處理。這通過使用預(yù)先裝配、連接的一組密閉無菌容器和允許組織和流體成分在密閉途徑中轉(zhuǎn)移的管道來實(shí)現(xiàn)。該處理設(shè)備可以與插入裝置中的一系列處理試劑(例如，鹽水、酶，等等)連通，所述裝置可以控制試劑的加入、溫度，和處理時(shí)間選擇，從而減輕操作人員手動(dòng)操作該過程的需要。在優(yōu)選實(shí)施方案中，從組織切除到加工到置于接受者體內(nèi)的整個(gè)方法將都在相同設(shè)施中進(jìn)行，甚至在經(jīng)歷該方法的患者的相同室內(nèi)進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，處理粗制脂肪組織以基本上除去成熟的脂肪細(xì)胞和結(jié)締組織從而得到適于放置于接受者體內(nèi)的許多異質(zhì)脂肪組織來源的細(xì)胞。所述細(xì)胞可以與其他細(xì)胞、組織、組織碎片，或者細(xì)胞生長和/或分化的其他刺激劑聯(lián)合置于接受體體內(nèi)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)胞與任何上面提到的添加劑以單一操作方法置于這些細(xì)胞所來源的人體中，目的是使該接受者得到治療益處。
在一個(gè)實(shí)施方案中，治療患者的方法包括步驟a)提供組織除去系統(tǒng)；b)使用所述組織除去系統(tǒng)從患者除去脂肪組織，脂肪組織具有濃縮干細(xì)胞；c)處理至少一部分所述脂肪組織以得到與處理前脂肪組織的干細(xì)胞濃度不同的干細(xì)胞濃度；和d)使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的幾種方法，包括但不限于，靜脈內(nèi)、冠狀動(dòng)脈內(nèi)和心內(nèi)膜心肌內(nèi)方法對患者施用干細(xì)胞和祖細(xì)胞而在施用于該患者前不從組織除去系統(tǒng)除去干細(xì)胞和祖細(xì)胞。
按照本文中公開的方法的系統(tǒng)包括a)組織收集容器，其包括i)組織收集入口，其經(jīng)構(gòu)造以收集從患者除去的脂肪組織；和ii)濾器，其置于容器內(nèi)并且經(jīng)構(gòu)造以保留從患者除去的脂肪組織并使從患者除去的非脂肪組織通過；b)混合容器，其與組織收集容器配合以接收從脂肪組織得到的干細(xì)胞而不除去來自組織除去系統(tǒng)的干細(xì)胞，并且包括添加劑口，其用于施用至少一種添加劑以與其中包含的干細(xì)胞混合；和c)出口，其經(jīng)構(gòu)造以允許混合容器中的細(xì)胞從組織收集系統(tǒng)除去以施用于患者。
文中描述的任何特征或者特征的組合都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，條件是根據(jù)上下文、該說明書和本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員的知識(shí)，任何此類組合中包括的特征不相互矛盾。本發(fā)明的其他方面和優(yōu)點(diǎn)在如下詳述中更明顯。
附圖簡述

圖1描繪了處理脂肪組織的組織除去系統(tǒng)。
圖2描繪了圖1的組織除去系統(tǒng)的組織收集容器。
圖3是圖2的組織收集容器的部分橫斷面視圖。
圖4描繪了用于自動(dòng)化組織除去系統(tǒng)的操作的處理裝置。
圖5A和5B描繪了培養(yǎng)的脂肪來源的干細(xì)胞的VEGF(5A)和PIGF(5B)蛋白質(zhì)的表達(dá)。
圖6描繪了脂肪來源的干細(xì)胞群體內(nèi)內(nèi)皮祖細(xì)胞的檢測。
圖7A和7B描繪了正常(7A)和鏈脲佐菌素處理的(7B)小鼠脈管結(jié)構(gòu)的體外發(fā)育。
圖8描繪了與陰性對照比較脂肪來源的干細(xì)胞處理的后肢局部缺血小鼠中血流的平均恢復(fù)的增加。
圖9A和9B表明增加脂肪來源的干細(xì)胞劑量提高移植存活和血管發(fā)生(9A)并描繪了組織樣品中脂肪組織構(gòu)造的保持。
圖10描繪了梗死的心肌區(qū)域中來自供體的脂肪來源的干細(xì)胞移植的組織學(xué)時(shí)間線(timeline)。
圖11描繪了β-半乳糖苷酶和肌球蛋白重鏈的雙陽性染色。高亮細(xì)胞都顯示出藍(lán)色β半乳糖苷酶染色，表明它們來源于供體脂肪組織細(xì)胞，褐色染色表明心肌蛋白肌球蛋白重鏈的表達(dá)。顯示出褐色和藍(lán)色染色的細(xì)胞(如通過箭頭指出)是呈現(xiàn)出心肌細(xì)胞表型的脂肪組織來源的細(xì)胞。
圖12描繪了大鼠中阻塞/再灌注損傷后梗死的心肌區(qū)域中來自供體的脂肪來源的干細(xì)胞群。
發(fā)明詳述本發(fā)明首次提供了使用脂肪來源的干細(xì)胞和祖細(xì)胞治療心血管病癥、疾病和失調(diào)的經(jīng)證明的方法。具體地，本發(fā)明第一次闡明本發(fā)明的脂肪來源的干細(xì)胞和祖細(xì)胞(1)表達(dá)血管生成和動(dòng)脈發(fā)生生長因子，包括胎盤生長因子(PIGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，(2)含有在血管形成中具有明確功能的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，(3)在體外發(fā)育成血管，(4)支持體內(nèi)局部缺血組織生存，(5)誘導(dǎo)后肢的阻塞/再灌注損傷后的再灌注，(6)當(dāng)心臟損傷后注射到動(dòng)物時(shí)歸巢到心臟，和(7)當(dāng)心臟損傷后注射到動(dòng)物時(shí)分化成細(xì)胞，所述細(xì)胞表達(dá)與它們分化成心肌細(xì)胞相一致的標(biāo)記。因此，本公開確實(shí)闡明本發(fā)明的脂肪來源的干細(xì)胞和祖細(xì)胞可用于治療心血管疾病和病癥。
為了更易理解本發(fā)明，首先定義某些術(shù)語。其他定義在詳細(xì)描述全文中給出。
文中所用術(shù)語“脂肪組織”指含有多種細(xì)胞類型，包括脂肪細(xì)胞和微血管細(xì)胞的組織。脂肪組織包括干細(xì)胞和內(nèi)皮前體細(xì)胞。因此，脂肪組織指脂肪，其包括儲(chǔ)存脂肪的結(jié)締組織。
文中所用術(shù)語“脂肪組織單位”指脂肪組織的離散的或者可測量的量。脂肪組織單位可以通過測定該單位的重量和/或體積來測量?；谏厦骅b定的數(shù)據(jù)，從患者除去的一單位處理的吸脂物(lipoaspirate)具有細(xì)胞組分，其中至少0.1％細(xì)胞組分是干細(xì)胞。關(guān)于本文公開，一單位脂肪組織可以指從患者除去的脂肪組織的全部量，或者小于從患者除去的脂肪組織的全部量的量。從而，一單位脂肪組織可以與另一單位脂肪組織聯(lián)合形成一單位脂肪組織，其具有個(gè)體單位總和的重量或者體積。
文中所用術(shù)語“部分”指小于全部的物質(zhì)量。小部分指小于50％的量，大部分指大于50％的量。從而，小于從患者除去的脂肪組織全部量的一單位脂肪組織為所除去的脂肪組織的一部分。
文中所用術(shù)語“干細(xì)胞”指具有分化成多種其他細(xì)胞類型的潛力的多能細(xì)胞，其執(zhí)行一種或多種特定功能并能夠自我更新。文中公開的一些干細(xì)胞可以是多能的。
文中所用術(shù)語“祖細(xì)胞”指能夠分化成一種或多種細(xì)胞類型的單能、雙能或者多能細(xì)胞，其執(zhí)行一種或多種特定功能具有有限的自我更新能力或者無自我更新能力。文中公開的一些祖細(xì)胞可以是多能的。
文中所用“干細(xì)胞數(shù)”或者“干細(xì)胞頻率”指產(chǎn)克隆測定中觀察到的集落數(shù)，所述測定中將脂肪來源的細(xì)胞(ADC)以低細(xì)胞密度(＜10,000個(gè)細(xì)胞/孔)接種并在支持MSC生長的生長培養(yǎng)基(例如，DMEM/F12培養(yǎng)基，補(bǔ)加10％胎牛血清、5％馬血清，和抗生素/抗真菌劑)中生長。細(xì)胞生長2周后將培養(yǎng)物用蘇木精染色并將大于50個(gè)細(xì)胞的集落計(jì)數(shù)為CFU-F。干細(xì)胞頻率計(jì)算為從所接種的每100個(gè)有核細(xì)胞所觀察到的CFU-F數(shù)(例如，在以1,000個(gè)有核ADC細(xì)胞開始的平板中計(jì)數(shù)的15個(gè)集落得到干細(xì)胞頻率為1.5％)。干細(xì)胞數(shù)計(jì)算為干細(xì)胞頻率乘以所得有核ADC細(xì)胞的總數(shù)。從ADC細(xì)胞生長的高百分?jǐn)?shù)(～100％)的CFU-F表達(dá)細(xì)胞表面分子CD105，骨髓來源的干細(xì)胞也表達(dá)CD105(Barry等人，1999)。脂肪組織來源的干細(xì)胞也表達(dá)CD105(Zuk等人，2002)。
文中所用術(shù)語“處理的吸脂物”指脂肪組織，其已經(jīng)經(jīng)處理以將活性細(xì)胞組分(例如，含有干細(xì)胞和祖細(xì)胞的組分)與成熟脂肪細(xì)胞和結(jié)締組織分離。該級(jí)分在文中稱作“脂肪來源的細(xì)胞”或者“ADC”。通常，ADC指通過洗滌和從脂肪組織分離細(xì)胞得到的細(xì)胞沉淀。該沉淀通常通過離心細(xì)胞得到，通過離心，細(xì)胞聚集在離心容器的底部。
文中所用短語“心血管病癥、疾病或失調(diào)”旨在包括特征為不足的、不希望的或者異常的心臟功能的所有失調(diào)，包括局部缺血性心臟病、高血壓心臟病和肺部高血壓心臟病、瓣膜疾病、先天性心臟病和導(dǎo)致受試者中，尤其人類受試者中充血性心力衰竭的任何病癥。不足的或異常的心臟功能可以由疾病、損傷和/或老化導(dǎo)致。作為背景，對心肌損傷的應(yīng)答按照確定的途徑，其中一些細(xì)胞死亡而其他細(xì)胞進(jìn)入休眠狀態(tài)，其中它們還沒有死亡但是功能異常。接著是炎癥細(xì)胞的滲入、膠原作為疤痕部分沉積，所有這些都與新血管的向內(nèi)生長和一定程度的持續(xù)細(xì)胞死亡平行發(fā)生。文中所用術(shù)語“局部缺血”指由于血流減少而引起的任何局部化的組織局部缺血。術(shù)語“心肌局部缺血”指冠狀動(dòng)脈粥樣硬化和/或心肌的供氧不足導(dǎo)致的循環(huán)紊亂。例如，急性心肌梗死代表對心肌組織的不可逆的局部損害。高損害來自于冠狀循環(huán)中的阻塞(例如，血栓形成或栓塞)事件并產(chǎn)生這樣的環(huán)境，其中心肌代謝需要量超過對心肌組織的供氧。
文中所用術(shù)語“血管發(fā)生”指從現(xiàn)有的脈管系統(tǒng)和組織產(chǎn)生新血管的過程(Folkman，1995)。短語“修復(fù)或者重建”指現(xiàn)有脈管系統(tǒng)的改造。組織局部缺血的減輕嚴(yán)重依賴于血管發(fā)生。新血管的自發(fā)生長提供了局部缺血區(qū)域內(nèi)和周圍的側(cè)支循環(huán)，提高了血流，和減輕了局部缺血導(dǎo)致的癥狀。文中所用術(shù)語“血管發(fā)生因子”或者“血管發(fā)生蛋白”指能夠從現(xiàn)有脈管系統(tǒng)生長新血管(“血管發(fā)生”)的任何公知的蛋白質(zhì)。用于本發(fā)明的適宜的血管發(fā)生因子包括，但不限于，胎盤生長因子(Luttun等人，2002)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Aharinejad等人，1995)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Buschmann等人，2003)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)-A，VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E(Mints等人，2002)、神經(jīng)氈蛋白(Wang等人，2003)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)-1，F(xiàn)GF-2(bFGF)、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6(Botta等人，2000)，Angiopoietin 1、Angiopoietin 2(Sundberg等人，2002)、紅細(xì)胞生成素(Ribatti等人，2003)、BMP-2、BMP-4、BMP-7(Carano和Filvaroff，2003)、TGF-β(Xiong等人，2002)、IGF-1(Shigematsu等人，1999)、骨橋蛋白(Asou等人，2001)、多效營養(yǎng)因子(Beecken等人，2000)、激活蛋白(Lamouille等人，2002)、內(nèi)皮素-1(Bagnato和Spinella，2003)和它們的聯(lián)合。血管發(fā)生因子可以獨(dú)立地或者相互聯(lián)合作用。當(dāng)聯(lián)合時(shí)，血管發(fā)生因子可以協(xié)同作用，從而因子的聯(lián)合效果大于單獨(dú)采取的各自因子效果的總和。術(shù)語“血管發(fā)生因子”或者“血管發(fā)生蛋白”還包括這些因子的功能類似物。功能類似物包括，例如，因子的功能部分。功能類似物還包括抗獨(dú)特型抗體，其結(jié)合所述因子的受體，從而模擬所述因子的活性以促進(jìn)血管發(fā)生和/或組織重建。產(chǎn)生這些抗獨(dú)特型抗體的方法是本領(lǐng)域中熟知的并且在例如WO 97/23510中描述，將WO 97/23510的內(nèi)容完整并入本文作為參考。
用于本發(fā)明的血管發(fā)生因子可以從任何適宜的來源產(chǎn)生或者得到。例如，所述因子可以從它們的天然來源純化，或者合成產(chǎn)生或者重組表達(dá)產(chǎn)生。所述因子可以作為蛋白質(zhì)組合物施用于患者。備選地，所述因子可以以編碼該因子的表達(dá)質(zhì)粒的形式施用。適宜的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建是本領(lǐng)域中熟知的。用于構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒的適宜的載體包括，例如，腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、RNA載體、脂質(zhì)體、陽離子脂質(zhì)、慢病毒載體和轉(zhuǎn)座子。
文中所用術(shù)語“動(dòng)脈發(fā)生”指增強(qiáng)側(cè)枝動(dòng)脈和/或來自現(xiàn)有小動(dòng)脈連接的其他動(dòng)脈的生長的過程(Carmeliet，2000；Scholz等人，2001；Scholz等人，2002)。更具體地，動(dòng)脈發(fā)生是通過來自現(xiàn)有小動(dòng)脈連接的內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞的增殖原位募集和擴(kuò)增動(dòng)脈，從而為局部缺血組織、腫瘤或者炎癥部位提供血液。這些血管大部分生長在受影響的組織外部并且對于將營養(yǎng)物向局部缺血區(qū)域、腫瘤或者炎癥部位的遞送是重要的。動(dòng)脈發(fā)生是對心肌局部缺血的正常應(yīng)答的一部分(Mills等人，2000；Monteiro等人，2003)。此外，冠狀動(dòng)脈旁路移植(CABG)的常規(guī)手術(shù)技術(shù)實(shí)際上不過是產(chǎn)生動(dòng)脈側(cè)枝血管(Sergeant等人，1997)。從而，梗死后增強(qiáng)血管發(fā)生的方法將提高到達(dá)局部缺血組織的血流，導(dǎo)致細(xì)胞死亡減少和梗死尺寸減小。這些提高將導(dǎo)致改善的心臟功能和治療益處。
文中所用術(shù)語“治療”包括減少或者減輕心血管病癥、疾病或者失調(diào)的至少一種不利影響和癥狀，所述心血管病癥、疾病或者失調(diào)即特征是不足的或者不希望的心臟功能的任何失調(diào)。心臟失調(diào)的不利影響或者癥狀是本領(lǐng)域中熟知的并且包括，但不限于，呼吸困難、胸痛、心悸、眩暈、syncope、水腫、發(fā)紺、蒼白、疲勞和死亡。
文中所用術(shù)語“施用”、“導(dǎo)入”和“移植”在本文中可以互換使用并且指通過方法和途徑將本發(fā)明的ADC置入受試者中，所述置入導(dǎo)致ADC至少部分定位在所希望的部位?？梢酝ㄟ^任何適宜的途徑施用ADC，所述途徑導(dǎo)致遞送到受試者中所希望的位置，在此處至少部分細(xì)胞或者細(xì)胞組分保持存活。對受試者施用細(xì)胞后存活期可以短至幾小時(shí)，例如，24小時(shí)，到幾天，到長達(dá)數(shù)年。
文中所用術(shù)語“受試者”包括溫血?jiǎng)游?，?yōu)選哺乳動(dòng)物，包括人。在優(yōu)選實(shí)施方案中，受試者為靈長類。在更優(yōu)選實(shí)施方案中，受試者為人。
現(xiàn)在將涉及本發(fā)明的當(dāng)前優(yōu)選的實(shí)施方案，它們的實(shí)例在附圖中闡明。可能時(shí)，在附圖中使用相同和類似的參考號(hào)，并且描述指相同和相似的部分。應(yīng)該注意附圖為簡化形式并且不是精確比例。關(guān)于本文的公開，僅為了方便和清楚，關(guān)于附圖使用方向術(shù)語，如頂部、底部、左、右、上、下、上方、上面、下方、下面、后面，和前面。不應(yīng)將這些方向術(shù)語理解為以任何方式限制本發(fā)明范圍。
盡管文中的公開涉及某些闡明的實(shí)施方案，但是應(yīng)該理解這些實(shí)施方案作為實(shí)例給出并且不作為限制。下面詳細(xì)描述的目的(盡管討論代表性實(shí)施方案)將被理解為覆蓋這些實(shí)施方案的所有修飾、備選方案，和等價(jià)方案，它們都在所附權(quán)利要求書限定的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。本發(fā)明可以與本領(lǐng)域中慣用的多種細(xì)胞和組織分離技術(shù)結(jié)合實(shí)施，并且文中包括的這些常用的方法步驟僅僅用于幫助對本發(fā)明的理解。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及存在于脂肪組織中的細(xì)胞群體，和對人或者動(dòng)物患者施用細(xì)胞群體以治療心血管疾病和病癥的系統(tǒng)和方法。脂肪組織的細(xì)胞群體可以用作治療應(yīng)用的細(xì)胞來源。其中，所述細(xì)胞可用于再生性藥物，如可以用再生性細(xì)胞治療的疾病，包括心血管疾病和病癥?？梢詫⒃撊后w的細(xì)胞施用于患有心血管疾病和病癥的患者而不使用其他脂肪細(xì)胞和結(jié)締組織。
具體地，本發(fā)明涉及脂肪組織來源的細(xì)胞和使用所述細(xì)胞的方法，所述細(xì)胞的若干性質(zhì)可以有助于最小化損傷和促進(jìn)心肌修復(fù)和該修復(fù)過程中的再生。這些性質(zhì)包括能夠合成和分泌刺激新血管形成的生長因子；能夠合成和分泌刺激細(xì)胞存活和增殖的生長因子；能夠增殖和分化成直接參與新血管形成的細(xì)胞；能夠植入受損的心肌和抑制疤痕形成(膠原沉積和交聯(lián))；能夠增殖和分化成能夠促進(jìn)心肌收縮性的肌細(xì)胞；和能夠增殖和分化成心肌細(xì)胞。
I.發(fā)明方法1.得到經(jīng)處理的吸脂物(ADC)的方法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)脂肪組織是干細(xì)胞和祖細(xì)胞的尤其豐富的來源。該發(fā)現(xiàn)至少部分是由于容易除去脂肪組織的主要非干細(xì)胞組分——脂肪細(xì)胞。從而，在人和動(dòng)物研究中，所處理的吸脂物(ADC)含有干細(xì)胞，其頻率為至少0.1％，更通常大于0.5％。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，已經(jīng)得到了含有約2-12％干細(xì)胞的ADC。在其他實(shí)施方案中，處理ADC以得到細(xì)胞群體，其中干細(xì)胞構(gòu)成該群體中高達(dá)100％的細(xì)胞。根據(jù)文中公開的本發(fā)明所得的干細(xì)胞的純度/頻率遠(yuǎn)大于公開的頻率骨髓中1/100,000(0.001％)(DTppolito等人，1999；Banfi等人，2001；Falla等人，1993；Muschler等人，2001)。此外，與收集脂肪組織的相關(guān)的發(fā)病率比收集相同體積的骨髓的相關(guān)的發(fā)病率低(Nishimori等人，2002)。此外，脂肪組織含有內(nèi)皮前體細(xì)胞，其能夠?yàn)榛颊咛峁┲委?見(Asahara等人，1999；Causal等人，2001；Kawamoto等人，2003；Kawamoto等人，2001))。
在實(shí)施文中公開的方法中，施用于患者的細(xì)胞從脂肪組織得到。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以通過任意方法得到脂肪組織。例如，通過抽吸輔助的脂肪整復(fù)(lipoplasty)、超聲輔助的脂肪整復(fù)、和脂肪切除術(shù)可以從患者除去脂肪組織。此外，該方法可以包括這些方法的聯(lián)合，如聯(lián)合脂肪切除術(shù)和抽吸輔助的脂肪整復(fù)。由于所述組織或者其部分將重新植入患者體內(nèi)，所以應(yīng)該以某種方式收集脂肪組織使得保持細(xì)胞組分的生存力和最小化潛在感染性生物，如細(xì)菌和/或病毒污染該組織的可能性。從而，應(yīng)該以無菌的方式實(shí)施組織切除以最小化污染。抽吸輔助的脂肪整復(fù)是從患者除去脂肪組織的所希望的方法，因?yàn)槠涮峁┝耸占M織的最小侵入性方法，干細(xì)胞損害的可能性最小，其他技術(shù)，如超聲輔助的脂肪整復(fù)可以伴隨著所述損害。
關(guān)于抽吸輔助的脂肪整復(fù)方法，通過將插管插入到患者中存在的脂肪組織庫中或附近然后將脂肪抽吸到抽吸裝置中收集脂肪組織。在一個(gè)實(shí)施方案中，小插管可以連接到注射器，可以手工抽吸脂肪組織(Asken，1990)。對收獲相對適量的脂肪組織(例如，0.1ml到數(shù)百毫升脂肪組織)，使用注射器或者其他類似裝置是所希望的。使用這些相對小的裝置的方法的優(yōu)點(diǎn)是相對于全身麻醉，可以僅通過局部麻醉實(shí)施所述方法。高于該范圍(例如，大于數(shù)百毫升)的更大體積脂肪組織可能需要由供體和實(shí)施收集方法的人斟酌使用全身麻醉。當(dāng)希望除去更大體積的脂肪組織時(shí)，在該方法中可以使用相對更大的插管和自動(dòng)化抽吸裝置。
脂肪切除術(shù)方法包括，但不限于，其中除去含有脂肪組織的組織(例如，皮膚)作為該方法的附帶部分，即，手術(shù)的主要目的是除去組織(例如，肥胖治療或者整容手術(shù)中皮膚)的方法，并且其中脂肪組織與主要感興趣的組織一起除去。
將從患者除去的脂肪組織收集到裝置中進(jìn)行進(jìn)一步處理。如文中討論的，在一個(gè)實(shí)施方案中，該裝置經(jīng)設(shè)計(jì)并致力于收集用于生產(chǎn)處理的脂肪組織細(xì)胞群體的目的，所述細(xì)胞群體包括干細(xì)胞和/或內(nèi)皮前體細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，該裝置可以是醫(yī)生實(shí)施抽提方法常用于組織收集的任何常規(guī)裝置。
所收集的組織的量將取決于許多變量，包括，但不限于，供體的身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index)、可接近的脂肪組織收獲部位的可用性、相伴或者預(yù)先存在的藥物治療和狀況(如抗凝血療法)、和所收集的組織的臨床目的。造血干細(xì)胞(用于再生受體的血細(xì)胞形成能力的骨髓或者臍帶血來源的干細(xì)胞)的移植經(jīng)驗(yàn)表明植入是具有閾值效應(yīng)的依賴細(xì)胞劑量的(Smith和Sweetenham，1995；Barker等人，2001)。從而，可能“越多越好”的一般原理將應(yīng)用于其他變量設(shè)置的極限內(nèi)并且可能時(shí)所述收獲將收集盡可能多的組織。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)從瘦的個(gè)體提取的100ml脂肪組織的干細(xì)胞百分?jǐn)?shù)大于從肥胖供體提取的100ml脂肪組織的干細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(表1)。這反映肥胖個(gè)體中增加的脂肪含量的稀釋效應(yīng)。因此，根據(jù)本發(fā)明的一方面，從超重供體得到的脂肪量大于從較瘦患者提取的脂肪量。該觀察還表明本發(fā)明的效用不限于具有大量脂肪組織的個(gè)體。
表1身體質(zhì)量指數(shù)對組織和細(xì)胞產(chǎn)率的影響
濃縮的干細(xì)胞可以在組合物中使用，所述組合物含有脂肪來源的干細(xì)胞和/或內(nèi)皮前體細(xì)胞，基本上無成熟脂肪細(xì)胞和結(jié)締組織。在某些實(shí)施方案中，該組合物含有細(xì)胞組分，其中至少0.1％的細(xì)胞是干細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，該組合物含有細(xì)胞組分，其中干細(xì)胞占細(xì)胞組分的約2％到12％。不同組合物中還包括更高的干細(xì)胞濃度，如高達(dá)100％。該組合物可以包括額外的組分，如細(xì)胞分化因子、生長促進(jìn)劑、免疫抑制劑，或者醫(yī)學(xué)裝置，如文中所討論。為了得到某些組合物，其中該組合物主要含有一種類型的細(xì)胞(例如，脂肪來源的干細(xì)胞或者脂肪來源的內(nèi)皮前體細(xì)胞)，可以使用用于制備不同細(xì)胞類型的任何適宜的方法，如使用細(xì)胞特異抗體，其識(shí)別和結(jié)合存在于干細(xì)胞或者內(nèi)皮前體細(xì)胞上的抗原。
對于多數(shù)應(yīng)用，活性細(xì)胞群體的制備將需要耗竭脂肪組織的成熟的負(fù)荷脂肪的脂肪細(xì)胞組分。這通常通過一系列洗滌和解聚步驟實(shí)現(xiàn)，其中首先洗滌組織以減少游離脂質(zhì)(從破碎的脂肪細(xì)胞釋放)和外周血成分(組織收獲期間從切斷的血管釋放)的存在，然后解聚以從結(jié)締組織基質(zhì)釋放完整的脂肪細(xì)胞和其他細(xì)胞群體。在某些實(shí)施方案中，完整脂肪細(xì)胞組分或者非干細(xì)胞組分與脂肪組織的干細(xì)胞組分分離。在其他實(shí)施方案中，僅一部分或幾部分脂肪細(xì)胞組分與干細(xì)胞分離。從而，在某些實(shí)施方案中，干細(xì)胞可以與內(nèi)皮前體細(xì)胞一起施用。
洗滌是任選的但是優(yōu)選的步驟，其中組織與溶液混合以洗除游離脂質(zhì)和單一細(xì)胞組分，如血液中的那些組分，留下完整的脂肪組織碎片。在一個(gè)實(shí)施方案中，將從患者除去的脂肪組織與等滲鹽水或者其他生理溶液(例如，Baxter Inc.的Plasmalyte或者Abbott Labs的Normoso)混合。通過本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員公知的任一方法，包括，但不限于，過濾、倒出、沉降或者離心，可以將完整脂肪組織碎片與游離脂類和細(xì)胞分離。在本發(fā)明的所闡明的實(shí)施方案中，通過使用如文中討論的組織收集容器內(nèi)放置的濾器將脂肪組織與非脂肪組織分離。在其他實(shí)施方案中，用組織收集容器分離脂肪組織與非脂肪組織，所述容器利用倒出、沉降和/或離心技術(shù)分離物質(zhì)。
然后用任意常規(guī)的技術(shù)或者方法解聚完整組織碎片，所述技術(shù)或方法包括機(jī)械力(切碎或剪切力)、使用一種或者組合蛋白質(zhì)水解酶，如膠原酶、胰蛋白酶、脂肪酶、釋放酶H1或者如美國專利號(hào)5,952,215中公開的Blendzyme家族的成員，和胃蛋白酶的酶消化，或者機(jī)械和酶促方法的聯(lián)合。例如，通過使用膠原酶介導(dǎo)的脂肪組織解離的方法可以解聚完整組織碎片的細(xì)胞組分，所述方法類似于如美國專利號(hào)5,372,945中公開的用于收集脂肪組織中微血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法?？捎糜趯?shí)施本發(fā)明的使用膠原酶的其他方法在美國專利號(hào)5,830,714和5,952,215中，和由Williams等人，1995(Williams等人，1995)公開。類似地，如(Twentyman和Yuhas，1980)中公開的，可以使用中性蛋白酶代替膠原酶。此外，方法可以使用酶的聯(lián)合，如膠原酶和胰蛋白酶的聯(lián)合，如(Russell等人，1976)中公開；或者酶(如胰蛋白酶)和機(jī)械解離的聯(lián)合，如(Engelholm等人，1985)中公開。
通過減少成熟脂肪細(xì)胞的存在可以從解聚的組織碎片得到活性細(xì)胞群體(經(jīng)處理的吸脂物)。然后經(jīng)處理的吸脂物與脂肪組織在其中解聚的液體的懸浮液穿過另一容器，如細(xì)胞收集容器。該懸浮液可以流過一個(gè)或多個(gè)管道到達(dá)細(xì)胞收集容器，這可以通過使用泵，如蠕動(dòng)泵，從組織收集容器抽取懸浮液并將其泵入細(xì)胞收集容器中。其他實(shí)施方案可以使用重力或者真空，同時(shí)保持密閉系統(tǒng)。懸浮液中細(xì)胞的分離可以通過浮力密度沉降、離心、淘析、過濾、差別粘附并從固相部分洗脫、抗體介導(dǎo)的選擇、電荷的差異、免疫磁珠、熒光激活細(xì)胞分類術(shù)(FACS)、或者其他方法實(shí)現(xiàn)。這多種技術(shù)和實(shí)施這些技術(shù)的裝置的實(shí)例可以在(Hemstreet等人，1980；Schweitzer等人，1995；Gryn等人，2002；Prince等人，2002；Watts等人，2002；Mainwaring和Rowley，1985；Greenberg和Hammer，2001)和美國專利號(hào)6,277,060；6,221,315；6,043,066；6,451,207；5,641,622；和6,251,295中發(fā)現(xiàn)。
在所闡明的實(shí)施方案中，使用旋轉(zhuǎn)膜濾器將懸浮液中的細(xì)胞與懸浮液的非細(xì)胞組分分離。在其他實(shí)施方案中，使用離心將懸浮液中的細(xì)胞與非細(xì)胞組分分離。在一個(gè)此類代表性實(shí)施方案中，細(xì)胞收集容器可以是彈性包，其經(jīng)構(gòu)造置于離心機(jī)(例如，手工或者通過機(jī)器人)中。在其他實(shí)施方案中，不使用彈性包。離心后，細(xì)胞組分形成沉淀，可以將其用緩沖液重懸浮從而細(xì)胞可以穿過一個(gè)或多個(gè)管道到達(dá)本文中討論的混合容器?？梢酝ㄟ^任何適宜的方法提供懸浮液。例如，可以將緩沖液注射到細(xì)胞收集容器上的孔，或者細(xì)胞收集容器可以包括緩沖液儲(chǔ)備物，通過破裂該儲(chǔ)備物可以將緩沖液與細(xì)胞沉淀混合。當(dāng)使用旋轉(zhuǎn)膜濾器時(shí)，重懸浮是任選的，因?yàn)榉蛛x步驟后細(xì)胞保持在液體體積中。
盡管本發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及完全解離脂肪組織以分離活性細(xì)胞與成熟脂肪細(xì)胞和結(jié)締組織的方法，但是本發(fā)明的其他實(shí)施方案涉及其中脂肪組織僅部分解離的方法。例如，可以用一種或多種酶實(shí)施部分解離，相對于保持在脂肪組織以完全解離該組織的酶，用于部分解離的所述酶從至少一部分脂肪組織較早除去。這種方法需要較少的處理時(shí)間。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，將組織用無菌緩沖的等滲鹽水洗滌并與膠原酶在一定的膠原酶濃度、溫度下孵育并孵育足夠時(shí)間以提供足夠解離。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所用的膠原酶將由相關(guān)當(dāng)局(例如，美國食品和藥物管理局)批準(zhǔn)用于人。適宜的膠原酶制劑包括重組和非重組膠原酶?？梢詮腇.Hoffmann-La Roche Ltd，Indianapolis，IN和/或Advance Biofactures Corp.，Lynbrook，NY得到非重組膠原酶?？梢匀缑绹鴮＠?hào)6,475,764公開的得到重組膠原酶。
在一個(gè)實(shí)施方案中，溶液含有濃度為約10μg/ml到約50μg/ml的膠原酶并在約30℃到約38℃孵育約20分鐘到約60分鐘。這些參數(shù)將隨著膠原酶的來源而變，通過經(jīng)驗(yàn)研究優(yōu)化，以便證明該系統(tǒng)可以以適宜的時(shí)間時(shí)限有效提取所希望的細(xì)胞群體。尤其優(yōu)選的濃度、時(shí)間和溫度為20μg/ml膠原酶(與中性蛋白酶分散酶；Blendzyme 1，Roche)在37℃下孵育45分鐘。備選的優(yōu)選實(shí)施方案應(yīng)用0.5單位/mL膠原酶(與中性蛋白酶嗜熱菌蛋白酶；Blendzyme 3混合)。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，所用膠原酶經(jīng)過相關(guān)當(dāng)局(例如，美國食品和藥物管理局)批準(zhǔn)用于人。所用膠原酶應(yīng)該沒有微生物和污染物，如內(nèi)毒素。
解離后，可以洗滌/沖洗活性細(xì)胞群體以除去解離過程的添加劑和/或副產(chǎn)物(例如，膠原酶和新近釋放的游離液體)。通過離心或者如上討論的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的其他方法可以濃縮活性細(xì)胞群體。處理后洗滌/濃縮步驟可以分開或者同時(shí)應(yīng)用。
在一個(gè)實(shí)施方案中，濃縮細(xì)胞并通過將細(xì)胞群體穿過連續(xù)流動(dòng)旋轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)等，例如，美國專利號(hào)5,034,135；和5,234,608中公開的系統(tǒng)離心細(xì)胞并除去膠原酶。
除了前面的，還有許多洗滌后方法用于進(jìn)一步純化活性細(xì)胞群體。這些方法包括陽性選擇(選擇靶細(xì)胞)、陰性選擇(選擇性除去不想要的細(xì)胞)，或者它們的聯(lián)合。
在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇具有粘附性質(zhì)的固相材料以允許差別粘附和/或細(xì)胞洗滌步驟后插入系統(tǒng)的經(jīng)處理的吸脂物內(nèi)的細(xì)胞亞群被洗脫。該一般方法已經(jīng)用于臨床輸血中，其中用差別捕獲白細(xì)胞的濾器耗竭污染白細(xì)胞的紅細(xì)胞(Soli等人，2001)。該類型的濾器由PallBedical(Leukogard RS和Purecell RCQ)和Asahi(RS2000)銷售。差別粘附也應(yīng)用于單核細(xì)胞(Berdel等人，1982)和表皮干細(xì)胞(Bickenbach和Dunnwald，2000)的陽性選擇。在該實(shí)施方案中，經(jīng)處理的吸脂物將在流動(dòng)和預(yù)定的緩沖條件下穿過過濾材料，所述緩沖條件用以促進(jìn)靶細(xì)胞和不希望的細(xì)胞群體的差別粘附。對于陽性選擇，濾器材料和條件將允許靶細(xì)胞的優(yōu)先粘附而不想要的材料將自由穿過濾器并用過量緩沖液洗除。通過改變條件，如流速、pH、離子強(qiáng)度、和/或粘附所需的陽離子的存在可以從濾器洗脫靶細(xì)胞。過濾材料可以是三維網(wǎng)孔、小顆粒的填充盒、中空纖維或者具有高表面積的其他機(jī)制的形式。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該過濾裝置將是圖1中所示的一次性裝備的組成部分并且將插入圖4中所示裝置中。所述裝備和裝置將從所指定的圖中所示的那些實(shí)例稍微改變；圖1包括濾器和濾器座，圖4允許插入保持密閉、無菌流體途徑所需的濾器座和管(包括閥門)。備選地，混合室(圖4的組件108；圖1的組件30)可以分別用裝置配件和濾器/濾器座替換。
該差別粘附方法的備選實(shí)施方案將包括使用識(shí)別在靶細(xì)胞和不希望的細(xì)胞上差別表達(dá)的表面分子的抗體和/或抗體組合?；谔囟?xì)胞表面標(biāo)記(或者標(biāo)記的組合)表達(dá)的選擇是另一種常用的技術(shù)，其中抗體(直接或間接)附著到固相支持體結(jié)構(gòu)(Geiselhart等人，1996；Formanek等人，1998；Graepler等人，1998；Kobari等人，2001；Mohr等人，2001)。該方法顯然可用于陽性和陰性選擇中，其中，例如，使用CD45抗體可以除去殘留白細(xì)胞。類似地，Reyes等人已經(jīng)將抗體的復(fù)雜混合應(yīng)用于從人骨髓選擇多能成年祖細(xì)胞(Reyes等人，2001)。例如，特異結(jié)合脂肪細(xì)胞的抗體如AP2(Joyner等人，1999)可用于優(yōu)先耗竭殘留的脂肪細(xì)胞(包括不成熟的脂肪細(xì)胞和adipoblast)。通過使用對靶細(xì)胞群體特異的抗體可以應(yīng)用陽性選擇。例如，Quirici等人用針對神經(jīng)生長因子受體的抗體富集骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(Quirici等人，2002)。
在基于抗體的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，可以將抗體(例如AP2)或者抗體混合物(例如，AP2、CD3、CD19、CD11b)加入經(jīng)處理的吸脂物中。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到許多其他抗體和抗體組合并且這些實(shí)例僅作為實(shí)例提供。孵育后，在允許這些抗體最佳結(jié)合它們的相關(guān)抗原的預(yù)定條件下，通過將細(xì)胞穿過旋轉(zhuǎn)膜濾器或者細(xì)胞洗滌室的其他實(shí)施方案洗滌以除去未結(jié)合的過量抗體。然后細(xì)胞將穿過固相結(jié)構(gòu)，其類似于上面實(shí)施方案中描述的固相結(jié)構(gòu)但是其中固相附著二級(jí)抗體，該抗體能夠高親和性附著現(xiàn)在結(jié)合到細(xì)胞表面的一級(jí)抗體。靶細(xì)胞，例如，脂肪組織來源的干細(xì)胞，將由于沒有表達(dá)所選抗體(抗體混合物)識(shí)別的細(xì)胞表面抗原而自由穿過該濾器，從而產(chǎn)生陰性選擇系統(tǒng)。在該實(shí)施方案中，將一次性裝備(圖3)和裝置(圖4)進(jìn)行非常類似于上面實(shí)施方案中所描述的微小改變。
通過包括第三種添加劑以非常相似的方式實(shí)現(xiàn)抗體介導(dǎo)的陽性選擇實(shí)施方案，所述添加劑促進(jìn)細(xì)胞從固相支持體脫離。在該實(shí)施方案中，可以加入木瓜蛋白酶或者木瓜凝乳蛋白酶以切割抗體分子和從固相支持體釋放細(xì)胞(Civin等人，1990)。另一種備選方案是使用與細(xì)胞表面抗原競爭結(jié)合抗體的特定肽，如Tseng-Law等人，美國專利號(hào)6,017,719中所述。
在另一實(shí)施方案中，細(xì)胞沉淀可以經(jīng)重懸浮、在形成連續(xù)或者不連續(xù)密度梯度的液體材料上(或下)分層，和置于離心機(jī)中以基于細(xì)胞密度分離細(xì)胞群體。適于形成這些梯度的介質(zhì)的實(shí)例包括Percoll和Ficoll-Paque(Qian等人，1998)(Smits等人，2000)或Ficoll-Paque(Lehner和Holter，2002；Van，V等人，2001)。該實(shí)施方案將能夠從細(xì)胞群體分離出某些殘留的血細(xì)胞群體和不成熟的脂肪細(xì)胞(前脂肪細(xì)胞)。
在類似實(shí)施方案中，也可以使用連續(xù)流動(dòng)方法，如脫落(apheresis)(Smith，1997)，和淘析(用或不用逆流)(Lasch等人，2000)，也可以使用(Ito和Shinomiya，2001)的方法。這些機(jī)理已經(jīng)用于分級(jí)分離血細(xì)胞，包括基于年齡分離血紅細(xì)胞(Lasch等人，2000)，用該一般方法從經(jīng)處理的吸脂物進(jìn)一步純化目標(biāo)細(xì)胞對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。該實(shí)施方案可能需要修飾圖4中的裝置和一次性裝備(圖3)從而該裝置將與另一裝置整合以提供脫落或者淘析能力。
通過短期細(xì)胞擴(kuò)增后附著到塑料已經(jīng)應(yīng)用于骨髓來源的成年干細(xì)胞群體(Jaiswal等人，2000)。該方法使用培養(yǎng)條件優(yōu)先擴(kuò)增一種群體而其他群體得到保持(從而通過用生長選擇的細(xì)胞稀釋減少)或者由于缺少所需的生長條件而損失。Sekiya等人已經(jīng)描述了在這點(diǎn)上用于骨髓來源的干細(xì)胞的條件(Sekiya等人，2002)。該方法(利用或不利用差別附著到組織培養(yǎng)塑料)可用于本發(fā)明的其他實(shí)施方案中。在該實(shí)施方案中，從圖4中所示裝置除去細(xì)胞并將細(xì)胞置于提供細(xì)胞培養(yǎng)組分的另一裝置中。這可以是常規(guī)實(shí)驗(yàn)室組織培養(yǎng)的培養(yǎng)箱或者生物反應(yīng)器型的裝置，如Tsao等人，美國專利號(hào)6,001,642，或者Armstrong等人，美國專利號(hào)6,238,908所述。在備選實(shí)施方案中，混合組分(圖4中所示裝置的組件108；圖3中的組件30)可以由允許經(jīng)處理的吸脂物的短期粘附和/或細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器組分替換。該備選實(shí)施方案將允許將生物反應(yīng)器組件整合到裝置并且不需要從該裝置除去細(xì)胞并置于另一裝置中。
i.得到經(jīng)處理的吸脂物的闡明方法用以從患者除去脂肪組織的組織除去系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)例在圖1中闡明。在廣義實(shí)施方案中，組織除去系統(tǒng)10包括組織收集容器12和連接到組織收集容器12的混合容器30。混合容器30和組織收集容器12之間的連接優(yōu)選定義了密閉系統(tǒng)，其中從組織收集容器12導(dǎo)向混合容器30的組織不暴露于外部環(huán)境。系統(tǒng)10還包括出口32，其經(jīng)構(gòu)造以允許濃縮干細(xì)胞從組織收集系統(tǒng)10除去以施用于患者。組織收集容器12包括組織收集入口14和濾器16。濾器16布置在該容器內(nèi)，并且經(jīng)構(gòu)造以例如在從患者除去組織時(shí)保持脂肪組織和穿過非脂肪組織。更具體地，濾器16允許穿過自由液體、血液和鹽水，而在脂肪組織的最初收獲期間或者在另一實(shí)施方案中，脂肪組織的最初收獲后保持脂肪組織碎片。在那點(diǎn)上，濾器16包括許多孔，它們具有相同或不同的大小，但是大小為約20μm到5mm。在優(yōu)選實(shí)施方案中，濾器為厚約200μm的醫(yī)學(xué)級(jí)聚酯篩，其具有約265μm的孔大小和約47％的有效篩孔面積。該材料在洗滌期間保持組織但是在組織解離后允許細(xì)胞穿過網(wǎng)孔。從而，當(dāng)從患者抽吸組織時(shí)，非脂肪組織可以與脂肪組織分離?；旌先萜?0包括添加口30，其經(jīng)構(gòu)造以允許使用者向混合容器30施用添加劑以與混合容器30中所含干細(xì)胞混合。在優(yōu)選實(shí)施方案中，組織收集容器12的尺寸應(yīng)該允許在濾器中保持約1升組織碎片。在其他實(shí)施方案中，組織收集容器12的大小可以保持更大或更小體積的組織碎片；例如，組織收集容器的大小可以儲(chǔ)存至少100mL脂肪組織碎片，和高達(dá)約2L脂肪組織碎片。
關(guān)于圖1的系統(tǒng)10中存在的額外特征，組織入口14通過管22連接到插管24以限定組織除去線。在所闡明的實(shí)施方案中，插管24是集成的、單一用途吸脂術(shù)插管，并且該管為彈性管。該管的尺寸使得可以將其插入患者以從該患者除去脂肪組織。系統(tǒng)中所用的管22應(yīng)該能夠抵抗與吸脂輔助的脂肪整復(fù)相關(guān)的負(fù)壓以減小壓扁的可能性。組織收集容器12還包括置于濾器16上與組織入口14相反側(cè)的抽吸孔18。抽吸孔18經(jīng)構(gòu)造以連接到抽吸裝置20，其可以經(jīng)手工操作或者自動(dòng)操作。抽吸裝置20可以是注射器或者可以是電真空等。抽吸裝置20應(yīng)該能夠提供為容器12和插管24提供足夠負(fù)壓以從患者抽吸組織。如所闡明的，抽吸裝置20通過管22連接到抽吸孔18。
組織除去系統(tǒng)10圖解為還包括位于組織收集容器12和混合容器30之間的細(xì)胞收集容器26。細(xì)胞收集容器26位于系統(tǒng)10內(nèi)從而細(xì)胞(如干細(xì)胞)穿過組織收集容器12到達(dá)細(xì)胞收集容器26再穿過混合容器30。在所闡明的實(shí)施方案中，細(xì)胞收集容器26通過細(xì)胞收集孔48與組織收集容器12連接。在系統(tǒng)10的實(shí)施方案中，細(xì)胞收集容器26包括細(xì)胞濃縮器(未顯示)，其方便懸浮液中細(xì)胞的分離。細(xì)胞濃縮器的一個(gè)實(shí)例是離心裝置，其可以基于例如，細(xì)胞的大小或密度將細(xì)胞與其他物質(zhì)分開。另一實(shí)例是如上文討論的旋轉(zhuǎn)膜濾器。系統(tǒng)10還圖解為包括濾器28，其構(gòu)造使得細(xì)胞從細(xì)胞收集容器26穿過濾器28到達(dá)混合容器30，和防止例如大于細(xì)胞的物質(zhì)穿過。細(xì)胞收集容器26還包括到達(dá)廢物容器36的出口。細(xì)胞收集容器26中所含的物質(zhì)的流動(dòng)方向由一個(gè)或多個(gè)閥門的位置確定，這些閥門可以控制物質(zhì)流向廢物容器36或者混合容器30。
在所圖解的實(shí)施方案中，細(xì)胞濾器28含有許多直徑或者長度小于200μm的孔。在某些實(shí)施方案中，孔的直徑小于200μm。在其他實(shí)施方案中，孔的直徑為20到200μm。細(xì)胞濾器28可以遠(yuǎn)離細(xì)胞收集容器26或者可以包含在細(xì)胞收集容器26內(nèi)。細(xì)胞濾器28還可以集成在細(xì)胞收集容器26中。系統(tǒng)10的額外的實(shí)施方案不包括細(xì)胞濾器28。細(xì)胞收集容器可以由任何適宜的材料制造。例如，細(xì)胞收集容器26可以是塑料袋，如常規(guī)用于血庫中處理血液的那些塑料袋；或者在其他實(shí)施方案中，細(xì)胞收集容器26可以是結(jié)構(gòu)上剛性的。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞收集容器26可以包括組分制備室和細(xì)胞洗滌/分離室。
在某些實(shí)施方案中，組分制備室包括一個(gè)或多個(gè)孔，其用于加入增強(qiáng)分離施用于患者的干細(xì)胞的試劑，如生長因子或者用于懸浮細(xì)胞的緩沖液，如上文討論。在這些實(shí)施方案中，組分制備室優(yōu)選包括混合裝置以混合或者攪拌容器中的細(xì)胞和添加劑。組分制備室還包括用于除去其中收集的細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)孔?？梢蕴峁┮粋€(gè)孔以容許細(xì)胞穿過而流向混合容器30。可以提供其他孔將細(xì)胞或者部分細(xì)胞導(dǎo)向其他靶標(biāo)，如植入材料，包括骨碎片，或者導(dǎo)向細(xì)胞培養(yǎng)或者純化裝置。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞洗滌/分離室包括旋轉(zhuǎn)膜濾器組分，其可以用作細(xì)胞濃縮器，還可以或者優(yōu)選地作為離心裝置的備選方案。
還圖解系統(tǒng)10包括組織回收線路34，其用于提供從組織收集容器12到混合容器30的管道。從而，組織回收線路34穿過或者引導(dǎo)組織收集容器12中的組織到達(dá)混合容器30，在混合容器30中組織可以與從細(xì)胞收集容器26得到的細(xì)胞混合。在所圖解的實(shí)施方案中，組織回收線路34延伸到組織容器12中以除去濾器16中所含的脂肪組織。使用一個(gè)或多個(gè)泵或者抽吸裝置使組織穿過或者通過組織回收線路34以輸送已經(jīng)沖洗但是不一定解離的脂肪組織。
在一個(gè)實(shí)施方案中，系統(tǒng)10包括溫度控制裝置，其關(guān)于系統(tǒng)10放置以調(diào)節(jié)組織收集容器12中所含物質(zhì)的溫度。在某些實(shí)施方案中，溫度控制裝置為加熱器，在其他實(shí)施方案中，溫度控制裝置為冷卻器。在額外實(shí)施方案中，溫度控制裝置能夠在加熱器和冷卻器之間轉(zhuǎn)換。溫度控制裝置可以是調(diào)節(jié)組織收集容器12中所含脂肪組織的溫度的裝置或者可以是用于改變被輸送到組織收集容器12的液體的溫度的裝置。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)加熱脂肪組織促進(jìn)該組織的解離以增強(qiáng)活性細(xì)胞組分的分離。此外，希望在某些實(shí)施方案中冷卻一部分組織，優(yōu)選活性細(xì)胞組分以提供對該細(xì)胞的保護(hù)。甚至細(xì)胞的稍稍冷卻也可提供適宜的保護(hù)以增強(qiáng)處理期間細(xì)胞的存活。
組織除去系統(tǒng)10的出口32圖解為混合容器20的元件。在額外實(shí)施方案中，出口32的位置與混合容器32分離。出口32優(yōu)選含有封口，其保持組織除去系統(tǒng)10的密閉結(jié)構(gòu)，在某些實(shí)施方案中，出口32含有流體不可透過的膜(例如，液體和空氣不可透過的膜)。出口32的結(jié)構(gòu)應(yīng)該為在適宜條件下使混合容器30中的組合物穿過到達(dá)患者。例如，如果用注射器抽取組合物，出口32將能夠容納注射器針頭而不危害該系統(tǒng)或者組合物的無菌性。在額外實(shí)施方案中，如果該出口連接到裝置，該裝置經(jīng)設(shè)定施用組合物，但是不抽取組合物，如插管，其通過應(yīng)用正壓力使組合物通過插管移動(dòng)而施用該組合物，出口32的構(gòu)造應(yīng)該允許混合容器30中所含組合物穿過該插管。在其他實(shí)施方案中，出口32可以含有，或者以密閉系統(tǒng)方式連接到用于施用組合物的裝置，如注射器針頭或者用于通過正壓力施用組合物的插管。
組織除去系統(tǒng)10還圖解為包括廢物容器36，其用于從收集容器12收集廢物。在所圖解的實(shí)施方案中，廢物容器36還經(jīng)連接并在適當(dāng)位置上以接受來自細(xì)胞收集容器26的廢物。提供了與洗滌線路39流體連通的洗滌容器38，以通過洗滌孔46輸送洗滌液體，如鹽水或者其他適宜的緩沖液到組織收集容器12。組織收集容器12還包括空氣入口40，其用于控制組織收集容器12中的壓力量。提供組織收集容器12上的添加線路42以允許將添加劑加入組織收集容器12中。關(guān)于文中公開的方法，提供添加線路42以將一種或多種酶輸送到組織收集容器12以方便活性細(xì)胞組分與濾器16中所含的剩余脂肪組織分離。如所圖解的，添加線路42含有針頭44，其可用于從適宜的容器接收酶。
組織除去系統(tǒng)10組件的一個(gè)具體實(shí)施方案在圖2和圖3中闡明，其中同樣的數(shù)字代表同樣的部分。在圖2和3的具體實(shí)施方案中，組織收集容器12包括一個(gè)物體，當(dāng)對該容器應(yīng)用抽吸時(shí)該物體保持其形狀。更具體地，組織收集容器12包括剛性物體，例如，由醫(yī)學(xué)級(jí)聚酯制造的物體，其含有醫(yī)學(xué)級(jí)聚酯的大體上為圓錐形的濾袋，該濾袋的網(wǎng)孔大小為275μm。該剛性組織收集容器可以具有約8英寸高和約5英寸直徑的尺寸；壁厚度可以為約0.125英寸。該圓柱的內(nèi)部由兩個(gè)用于抽吸管的孔、兩個(gè)具有管用于通過無菌停靠技術(shù)連接的孔，和兩個(gè)用于通過用針頭刺穿橡膠隔片的孔進(jìn)入。可以用不同材料、網(wǎng)孔大小和數(shù)目和類型的孔實(shí)現(xiàn)相同的功能。例如，小于100μm或者大至幾千微米的網(wǎng)孔大小將實(shí)現(xiàn)相同的目的，即允許鹽水和血細(xì)胞穿過而保留脂肪組織聚集物和碎片。類似地，通過使用備選的剛性塑料材料，通過用非一次性的可多次使用的無菌插管代替一次性插管，或者通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的許多其他修飾可以實(shí)現(xiàn)裝置目的。然而，在組織除去系統(tǒng)10的其他實(shí)施方案中，組織收集容器12可以包括可壓扁的物體，如組織收集袋。在此類系統(tǒng)中，優(yōu)選為袋提供支持體，如內(nèi)部或者外部框架，其幫助減小對袋應(yīng)用抽吸時(shí)該袋將壓扁的可能性。
為了減小組織除去系統(tǒng)10內(nèi)的污染，可以在多種線路或管道上提供一個(gè)或多個(gè)夾子23以控制物質(zhì)通過線路流到該系統(tǒng)的多種組件。夾子23允許使用者有效封閉組織除去系統(tǒng)10的多個(gè)區(qū)域。在優(yōu)選實(shí)施方案中，系統(tǒng)10的一個(gè)或多個(gè)組件是一次性的。在該實(shí)施方案中避免重復(fù)使用組件有助于減小與反復(fù)使用多種組件有關(guān)的污染。此外，在一次性裝備中提供組件提供了能夠一次消毒所有組件的優(yōu)點(diǎn)，這可以極大地減少實(shí)施文中公開的方法所需的時(shí)間。在完全或部分自動(dòng)化的實(shí)施方案中，可以實(shí)現(xiàn)計(jì)算機(jī)控制的閥門作為夾子23的補(bǔ)充或者替代。
此外，組織除去系統(tǒng)10可以包括額外的裝置或者組件，其允許確定濾器16中保留的物質(zhì)的體積，以允許記錄關(guān)于提取或者處理步驟的文字信息，或者執(zhí)行其他補(bǔ)充功能，如在操作期間將所述裝置連接到架子或者襯墊。
組織除去系統(tǒng)10的組件應(yīng)該由不與生物流體或者組織反應(yīng)并且不與用于處理生物流體和組織的試劑反應(yīng)的材料制成。此外，用于制造多種組件的材料應(yīng)該能夠抵抗消毒，例如，通過高壓滅菌和放射，包括但不限于β-或γ-放射進(jìn)行的消毒。管道和插管把柄可以由任何適宜的材料，如聚乙烯制成。插管可以由任何適宜的材料(包括不銹鋼)制成。
根據(jù)文中公開的本發(fā)明，組織除去系統(tǒng)10提供了密閉系統(tǒng)，其方便除去、處理和施用脂肪組織中發(fā)現(xiàn)的成年干細(xì)胞。該系統(tǒng)置于患者附近以除去脂肪組織，可以處理組織而不需要從該系統(tǒng)除去該組織。從而，提供了系統(tǒng)，其為患者提供新鮮的干細(xì)胞增強(qiáng)的組合物，并減小了與培養(yǎng)和保存干細(xì)胞相關(guān)的潛在危險(xiǎn)。
因此，基于本公開，本發(fā)明提供了使用下面的步驟從患者提取組織的方法(i)關(guān)于常規(guī)脂肪整復(fù)準(zhǔn)備患者；(ii)從包裝材料將插管和組織除去系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到無菌區(qū)域；(iii)將抽脂泵(帶有常規(guī)捕集器和內(nèi)嵌的微生物濾器)連接到從組織收集容器引出的軟管接頭；(iv)確保管螺旋夾沒有夾住組織收集容器的抽吸孔；(v)使用插管作為常規(guī)抽脂插管以除去不想要的脂肪組織；(vi)用組織收集容器收集所希望量的脂肪組織后，在手工操作實(shí)施方案中用兩個(gè)管螺旋夾封閉組織收集容器；(vii)確保組織收集容器被正確標(biāo)記患者識(shí)別標(biāo)簽，按照慣例記錄標(biāo)簽上的其他信息(步驟的日期和時(shí)間，等等)，和(viii)從患者提取脂肪組織。
關(guān)于所圖解的組織除去系統(tǒng)10，通過用嵌入式流體捕集器將管22連接到抽吸源20并將插管24插入收獲部位將組織直接收集到處理組件中。然后將脂肪組織抽吸入組織收集容器12，在12中脂肪組織被組織收集容器12內(nèi)的濾器16保留。組織收集后，可以將收集的脂肪組織用洗滌容器38中的洗滌液，如無菌等滲鹽水洗滌，所述洗滌液通過洗滌線路39加到組織收集容器12中。當(dāng)所圖解的實(shí)施方案中組織收集容器12由剛性材料制成以維持抽吸下的收集時(shí)，鹽水加入期間從機(jī)架(housing)轉(zhuǎn)移的空氣可以通過空氣入口40放出。備選地，空氣可以轉(zhuǎn)移到廢物容器36或者類似的支撐位置。一旦沖洗組織，可以允許廢物材料流入廢物容器36。
收集組織后，可以將針頭44插入含有膠原酶溶液的無菌小瓶中，然后該溶液進(jìn)入組織收集容器12，在12中該溶液與脂肪組織在或者約37℃混合15-60分鐘。如需要可以重復(fù)洗滌步驟并且洗脫活性細(xì)胞群體后可以洗滌解離的組織以便產(chǎn)率最大化。在組織解離結(jié)束時(shí)，組織收集容器12直立以允許脂肪細(xì)胞的浮懸。然后讓活性細(xì)胞群體流入細(xì)胞收集容器26中，在26中細(xì)胞與膠原酶和殘留的游離脂質(zhì)分離?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員公知的任意方法洗滌和/或濃縮細(xì)胞，所述方法包括但不限于順序離心/重懸浮洗滌或者連續(xù)流動(dòng)機(jī)制。然后允許濃縮的、經(jīng)洗滌的細(xì)胞流入混合容器30中，在30中這些細(xì)胞與來自組織回收線路34和/或任何計(jì)劃的添加劑混合后從出口32除去以施用于患者。細(xì)胞收集容器26中所含物質(zhì)可以在用細(xì)胞濾器28過濾后洗滌以加強(qiáng)除去不想要的殘留細(xì)胞和組織聚集物，它們在應(yīng)用時(shí)可以導(dǎo)致栓塞。
在處理期間，如果需要可以向多種容器加入一種或多種添加劑以提高結(jié)果。添加劑的某些實(shí)例包括優(yōu)化洗滌和解離的試劑、增強(qiáng)處理期間活細(xì)胞群體的生存力的添加劑、抗微生物劑(例如，抗生素)、裂解脂肪細(xì)胞和/或血紅細(xì)胞的添加劑，或者富集目的細(xì)胞群體(通過差別附著到固相部分或者促進(jìn)細(xì)胞群體的大量減少或者富集)的添加劑。
在上面的實(shí)施方案中，組織收集容器12為組織除去系統(tǒng)10的處理組件內(nèi)在的。備選地，可以使用單獨(dú)的組織收集容器，如2002年9月12日申請的標(biāo)題為“保護(hù)非胚胎細(xì)胞不受造血組織損害”的專利申請?zhí)?0/242,094中描述的組織收集容器可完整或者部分使用并隨后將解離的材料轉(zhuǎn)移到處理組件中，所述專利申請要求普通轉(zhuǎn)讓的2001年9月14日申請的美國臨時(shí)專利申請60/322,070的益處，將這些專利申請的內(nèi)容特意并入本文作為參考。其他可能的組織收集容器在美國專利號(hào)6,316,247和5,372,945中公開。
如上面指出的，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，通過提供可以自動(dòng)執(zhí)行該方法的步驟的一個(gè)或多個(gè)額外的裝置可以自動(dòng)化所述方法。在這些實(shí)施方案中，處理裝置(例如，微處理器或者個(gè)人計(jì)算機(jī))是部分或完全自動(dòng)化上述步驟的裝置?？梢赃M(jìn)行此類自動(dòng)化的步驟的實(shí)例包括，但不限于，通過控制系統(tǒng)或者處理裝置的泵或閥門控制流體和組織沿著特定管道途徑的進(jìn)出；用壓力傳感器檢測堵塞；混合機(jī)制，使用容積機(jī)制測量將沿著特定途徑移動(dòng)的組織和/或流體的量；用熱控制裝置保持多種組分的溫度；用時(shí)間選擇和軟件機(jī)制洗滌和濃縮細(xì)胞，和集成該過程。在一個(gè)實(shí)施方案中，軟件可以控制該過程的參數(shù)以允許產(chǎn)生根據(jù)特定操作人員限定的參數(shù)制備的細(xì)胞群體。從而，一種或多種自動(dòng)化裝置提高了所述方法的性能，并提供了脂肪組織的自動(dòng)收獲和脂肪組織的處理以施用于患者。
一種具體的自動(dòng)化裝置在圖4中圖解。將組織除去容器(未顯示)置于裝置100中，使用不同顏色標(biāo)記的引導(dǎo)標(biāo)記112-118將管正確排列和插入到適宜的途徑中。裝置100包括許多閥門105和110，許多泵104和109。將管置于一系列閥門105、110和泵104、109，它們受到集成微處理系統(tǒng)的控制以按照用戶限定的程序協(xié)調(diào)流體和組織流動(dòng)。通過用戶界面板106介導(dǎo)程序選擇。將鹽水容器置于支持結(jié)構(gòu)101上并連接到組織收集容器。將膠原酶或者其他組織解離介質(zhì)或混合物的小瓶或管(未顯示)在點(diǎn)103處插入組織收集容器中。將廢物袋(未顯示)插入支持結(jié)構(gòu)111中，細(xì)胞分離室/細(xì)胞收集容器置于支持結(jié)構(gòu)107中，組織/細(xì)胞混合容器置于支持結(jié)構(gòu)108中。組織收集容器置于攪拌/孵育室102中。
可以將脂肪組織收集到組織收集容器中而該容器位于該裝置中或者該裝置位置之前。該裝置可以含有任選的透明插入物119或者其他裝置以允許確定組織收集容器內(nèi)的組織的體積。備選地，通過測量攪拌/孵育室102(相應(yīng)于組織收集容器12)所含物質(zhì)的重量可以確定體積。該體積可以顯示在用戶界面屏106上。
然后微處理器打開線路114和115上的閥門105并開動(dòng)線114上的泵104以將鹽水導(dǎo)入收集室102并除去廢物物質(zhì)115進(jìn)入廢物袋111。在該過程期間，收集室通過搖動(dòng)攪動(dòng)并通過集成到室102的加熱裝置保持在程序設(shè)定的溫度。在某些實(shí)施方案中，組織處理可以使用預(yù)熱的鹽水，在該情況下攪拌/孵育室的加熱裝置的作用是保持溫度在確定的程序設(shè)定點(diǎn)而不是升高溫度。
一旦洗滌組織，從0％到100％的某一分?jǐn)?shù)的完整的、經(jīng)洗滌的脂肪組織可以通過開動(dòng)線路116上的泵109和閥門110從孵育室102除去。此時(shí)抽取的物質(zhì)保持在混合室108中。通過打開線路113上的閥門105，關(guān)閉113上的其他閥門和開動(dòng)泵104可以將解離介質(zhì)103加入室102中剩余的物質(zhì)。加入解離介質(zhì)后，室102經(jīng)攪動(dòng)并保持在如上描述的溫度下。在程序化孵育期結(jié)束時(shí)，停止攪動(dòng)以允許脂肪細(xì)胞浮選?？梢约尤腩~外的鹽水以促進(jìn)該過程。脂肪細(xì)胞浮選后，打開線112和115上的閥門以允許從室102除去靶細(xì)胞群體進(jìn)入細(xì)胞洗滌室107中。經(jīng)洗滌的細(xì)胞通過線路117除去進(jìn)入混合室108，將上清液和洗滌溶液通過線路118除去進(jìn)入廢物室111。額外的鹽水通過線路114穿過該系統(tǒng)以完成洗滌過程。細(xì)胞在室108中與早先處理的通過線路116除去的任何完整組織混合。可通過本領(lǐng)域中技術(shù)人員公知的任何方法實(shí)現(xiàn)混合，所述方法包括但不限于室的攪拌搖動(dòng)/翻轉(zhuǎn)，或者通過壓縮脈沖或者通過移動(dòng)滾筒。然后通過一次性裝備的混合室中的孔除去混合的物質(zhì)。
該裝置包括根據(jù)預(yù)先程序設(shè)定的參數(shù)106的自動(dòng)化該過程的微處理器控制的機(jī)制。該系統(tǒng)還可以包括使用壓力傳感器檢測堵塞和類似安全和質(zhì)量控制機(jī)制。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該系統(tǒng)的軟件組件將包括“運(yùn)行數(shù)據(jù)”的自動(dòng)化收集，所述數(shù)據(jù)包括，例如，一次性組件的批號(hào)、溫度和體積測量、組織體積和細(xì)胞數(shù)參數(shù)、所應(yīng)用的酶的劑量、孵育時(shí)間、操作人員身份、日期和時(shí)間、患者身份，等等。在該裝置的優(yōu)選實(shí)施方案中，將集成條形碼閱讀系統(tǒng)以允許這些變量(例如，一次性裝備批號(hào)和失效期、膠原酶的批號(hào)和失效期、患者/樣品標(biāo)識(shí)符，等等)的數(shù)據(jù)作為處理文件的一部分進(jìn)入裝置控制器。這將減少數(shù)據(jù)輸入錯(cuò)誤的機(jī)會(huì)。使用USB或者本領(lǐng)域中公知的其他接口或者系統(tǒng)可以將該裝置整合到控制系統(tǒng)。這樣，該裝置將提供數(shù)據(jù)輸入和過程記錄的集成控制。這些參數(shù)的打印報(bào)告將是該裝置的程序化操作的用戶定義的參數(shù)的一部分。自然，這將需要在軟件中集成打印機(jī)組件(硬件和驅(qū)動(dòng)程序)或者打印機(jī)驅(qū)動(dòng)程序以及該裝置的硬件中打印機(jī)的接口輸出連接器(例如，USB端口)。
在另一實(shí)施方案中，整合到控制器的軟件將提示用戶進(jìn)行將管和其他元件正確插入裝置的步驟。軟件將還開始自動(dòng)化檢測以證實(shí)管的正確插入、不存在堵塞，等等。
該裝置中處理的一般方法將使用與該公開中別處關(guān)于手工細(xì)胞處理所描述的參數(shù)相同的參數(shù)。
用于細(xì)胞處理的分階段機(jī)制的許多其他構(gòu)造將對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，并且僅包括本描述作為一個(gè)實(shí)例。例如，洗滌和解離期間組織和鹽水的混合可以通過本實(shí)例中的攪拌或者通過流體再循環(huán)發(fā)生。細(xì)胞洗滌可以通過連續(xù)流動(dòng)機(jī)制如旋轉(zhuǎn)膜方法、差別粘附、差別離心(包括，但不限于差別沉降、速度、或者梯度分離)，或者通過方法的聯(lián)合來介導(dǎo)。類似的，允許細(xì)胞的進(jìn)一步操作的其他組分包括加入生長因子或者其他生物應(yīng)答修飾劑(Lind，1998)(Hanada等人，1997)(Lieberman等人，1998)，將細(xì)胞與天然或者合成的組分混合，所述組分將與細(xì)胞一起植入接受者(Fukuda，2001；Sodian等人，2002；Ye等人，2000)。
處理后操作可以還包括細(xì)胞培養(yǎng)(Caplan和Bruder，2001；DeUgarte等人，2003；Zuk等人，2001)、基因轉(zhuǎn)移(Luskey等人，1990；Morizono等人，2003)，或者進(jìn)一步細(xì)胞純化(Greenberg和Hammer，2001；Mainwaring和Rowley，1985；Schweitzer等人，1995)。執(zhí)行這些功能的機(jī)制可以集成到圖4中所示裝置或者可以整合到單獨(dú)的裝置中。
在本發(fā)明的額外實(shí)施方案中，可以將收集到常規(guī)脂肪組織捕集器的組織轉(zhuǎn)移到經(jīng)設(shè)計(jì)用于處理其他組織的處理裝備。例如，Baxter Inc.生產(chǎn)和銷售用于骨髓移植收獲背景中的一系列塑料袋和濾器(″BoneMarrow Collection Kit with Flexible Pre-Filters and Inline Filters″，產(chǎn)品號(hào)，4R2107，美國專利號(hào)4,346,703和5,724,988)。該袋裝置含有具有集成的800μm濾器的大的錐形袋，所述濾器可用于洗滌收集的脂肪組織。在該實(shí)例中，大于800μm的脂肪組織碎片將保持在該袋中。通過反復(fù)加入鹽水(或者其他洗滌溶液)然后通過濾器下面的孔除去廢物可以洗滌這些碎片?？梢酝ㄟ^手工或者使用桌面搖動(dòng)裝置實(shí)現(xiàn)混合，通過使用加熱墊可以升溫?？梢栽谠摯那粌?nèi)發(fā)生解離。解離后，細(xì)胞將穿過集成的800μm濾器(和任選地通過與試劑盒提供的一個(gè)或多個(gè)更小網(wǎng)孔大小的濾器)并收集到收集袋(也提供)中。該袋將置于離心機(jī)(例如，Sorval RC-3C)中，細(xì)胞可以在該離心機(jī)中順序洗滌和濃縮。也可以用現(xiàn)有的細(xì)胞洗滌裝置(主要為洗滌人血液產(chǎn)品開發(fā))如Baxter Inc(Cytomate或Baxter CS3000)或Cobe Inc.(Cobe Spectra)銷售的裝置洗滌細(xì)胞?？梢杂蒙a(chǎn)商提供的配件將一次性元件集成或者可以通過使用無菌連接裝置，如Terumo Inc生產(chǎn)的那些裝置連接這些一次性元件。類似地，該較少集成的方法中描述的機(jī)制可以連接到中央控制器并作為更集成的裝置的組件裝配?？梢杂萌鋭?dòng)泵或者泵組自動(dòng)化流體流動(dòng)，使用手工或者自動(dòng)化夾具打開和關(guān)閉流體路徑。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，組織除去系統(tǒng)和加工裝備將存在于接受治療的患者的附近，如手術(shù)室或者門診病人處理室(有效地在患者的床邊)。這允許快速、有效組織收獲和加工，除去了樣品處理/標(biāo)記錯(cuò)誤的機(jī)會(huì)從而允許整個(gè)過程的執(zhí)行在一個(gè)手術(shù)步驟中進(jìn)行。
提供下面的實(shí)施例以闡明該技術(shù)可以應(yīng)用的特定條件和背景，這些實(shí)施例不打算限制本公開中包括的本發(fā)明和權(quán)利要求的范圍。
2.用經(jīng)處理的吸脂物(ADC)治療心血管疾病和病癥的方法如在本公開中闡明的，在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的ADC可用于治療心血管疾病和病癥。通過實(shí)施本發(fā)明的方法得到的脂肪組織來源的干細(xì)胞和祖細(xì)胞具有一些性質(zhì)，這些性質(zhì)有助于減小和/或最小化損傷和促進(jìn)損傷后心肌或者心血管修復(fù)和再生。這些性質(zhì)包括能夠合成和分泌刺激新血管形成的生長因子；能夠合成和分泌刺激細(xì)胞存活和增殖的生長因子；能夠增殖和分化成直接參與新血管形成的細(xì)胞；能夠植入受損的心肌和抑制疤痕形成(膠原沉積和交聯(lián))；能夠增殖和分化成能夠促進(jìn)心肌收縮性的肌細(xì)胞；和能夠增殖和分化成心肌細(xì)胞。
使用本發(fā)明的脂肪來源的成年干細(xì)胞的前面減小和/或最小化損傷和促進(jìn)損傷后心肌或者心血管修復(fù)和再生的方法在本公開下面的實(shí)施例部分詳細(xì)描述。具體地，本發(fā)明第一次闡明本發(fā)明的脂肪來源的干細(xì)胞(或者ADC)表達(dá)多種血管生成生長因子，包括胎盤生長因子(PIGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，含有內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，其在血管形成中具有確定的功能，體外發(fā)育成血管，支持體內(nèi)局部缺血性組織存活，誘導(dǎo)后肢的阻塞/再灌注損傷后的再灌注，當(dāng)動(dòng)物心臟損傷后注射到動(dòng)物時(shí)歸巢到心臟，和分化成表達(dá)標(biāo)記的細(xì)胞，所述標(biāo)記與當(dāng)動(dòng)物心臟損傷后注射到動(dòng)物時(shí)它們分化成心肌細(xì)胞的標(biāo)記一致。
因此，在本發(fā)明的一方面，從供體的脂肪組織提取脂肪組織來源的細(xì)胞并將其用于通過文中闡明的一種或多種機(jī)制引起對損害或者再生的心肌或者其他心肌組織的治療益處。在優(yōu)選實(shí)施方案中，從人的脂肪組織提取細(xì)胞并將該細(xì)胞植入所述人中，從而減小與針對移植物的抗原和/或免疫原應(yīng)答有關(guān)的潛在并發(fā)癥。通常評價(jià)患者以評估心肌損傷或者疾病，這可以通過醫(yī)生或者其他臨床供應(yīng)者實(shí)施一個(gè)或多個(gè)下面的步驟來完成患者的健康史、體檢、和客觀數(shù)據(jù)，包括但不限于EKG、血清心臟酶圖譜，和超聲波心動(dòng)描記法。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在患者接受經(jīng)設(shè)計(jì)用以減少血液凝固和治療心肌梗死的任意產(chǎn)品之前進(jìn)行收獲步驟。然而，在某些實(shí)施方案中，可以在收獲步驟之前讓患者接受阿司匹林。此外，一種優(yōu)選的方法包括在任何試圖的血管再形成步驟之前收集脂肪組織。然而，如本領(lǐng)域中技術(shù)人員理解的，將預(yù)期收集的時(shí)間選擇不同并且取決于多種因素，包括患者穩(wěn)定性、患者凝固圖譜、供給者的可用性，和質(zhì)量照顧標(biāo)準(zhǔn)。最后，收集的時(shí)間選擇將由負(fù)責(zé)對受侵襲的患者進(jìn)行護(hù)理的開業(yè)醫(yī)生決定。
從患者收集的脂肪組織的體積可以為約0cc到約2000cc，在一些實(shí)施方案中，高達(dá)約3000cc。所除去的脂肪的體積將在患者之間不同并且將取決于許多因素，包括但不限于年齡、體質(zhì)、凝血圖、血液動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性、梗死的嚴(yán)重性、共-發(fā)病、和醫(yī)生的偏愛。
細(xì)胞可以施用于其中心肌功能受損的任何背景下的患者。這些背景的實(shí)例包括，但不限于，急性心肌梗死(心臟病發(fā)作)、充血性心力衰竭(作為治療或者作為移植的橋接)，和冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)手術(shù)的補(bǔ)充，等等?？梢灶A(yù)先提取細(xì)胞并將其以冷凍保存的方式保存或者可以在明確需要時(shí)或者接近該時(shí)間時(shí)提取細(xì)胞。如文中討論的，可以將細(xì)胞施用于患者，或者直接應(yīng)用于受損的組織，或者受損組織附近，而不進(jìn)一步處理或者按照其他的方法進(jìn)一步純化、修飾、刺激或者改變細(xì)胞。例如，從患者所得細(xì)胞可以施用于需要該細(xì)胞的患者而不在將它們施用于該患者前培養(yǎng)所述細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，將在患者的床邊實(shí)施脂肪組織的收集?？梢杂醚簞?dòng)力學(xué)監(jiān)視患者的臨床狀態(tài)。
根據(jù)文中公開的本發(fā)明，可以在從患者收獲脂肪組織后不久將脂肪來源的細(xì)胞遞送給該患者。例如，可以在處理脂肪組織后將細(xì)胞立即施用以得到脂肪來源的干細(xì)胞的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，遞送的優(yōu)選計(jì)時(shí)應(yīng)該在梗死后數(shù)小時(shí)到數(shù)天后發(fā)生以利用心臟損傷后存在的神經(jīng)激素環(huán)境。最后，遞送的計(jì)時(shí)將取決于患者可用性和處理脂肪組織所需的處理時(shí)間。在另一實(shí)施方案中，如果將再次輸注于患者的細(xì)胞受到如文中討論的額外的修飾、純化、刺激或者其他操作，那么遞送計(jì)時(shí)將相對更長。此外，梗死后可以多次施用脂肪來源的細(xì)胞。例如，細(xì)胞可以在更長的時(shí)間內(nèi)(例如數(shù)小時(shí))連續(xù)施用，或者可以在更長的時(shí)間內(nèi)多次快速濃注施用。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞的最初施用將在梗死后約12小時(shí)內(nèi)施用，如在6小時(shí)，或者一次和多次細(xì)胞劑量將以12小時(shí)間隔施用。
施用于患者的細(xì)胞數(shù)可以例如與脂肪組織處理后的細(xì)胞產(chǎn)率有關(guān)。細(xì)胞總數(shù)的一部分可以保留用于以后使用或者冷藏。此外，所遞送的劑量將取決于細(xì)胞向患者的遞送途徑。當(dāng)使用心外和心內(nèi)遞送系統(tǒng)時(shí)，需要較少的細(xì)胞，因?yàn)檫@些系統(tǒng)和方法可以提供治療心血管疾病的最直接的途徑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將要遞送到患者的細(xì)胞，例如，未純化的細(xì)胞數(shù)預(yù)計(jì)為約5.5×104個(gè)細(xì)胞。然而，可以以數(shù)量級(jí)調(diào)節(jié)該數(shù)目以實(shí)現(xiàn)所希望的療效。
細(xì)胞可以與添加劑一起應(yīng)用以增強(qiáng)、控制或者指導(dǎo)預(yù)定的療效。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，如文中描繪，可以通過抗體介導(dǎo)的陽性和/或陰性細(xì)胞選擇進(jìn)一步純化細(xì)胞以富集細(xì)胞群體以增加功效、減少發(fā)病率，或者促進(jìn)所述方法的容易性。類似地，細(xì)胞可以與生物相容的基質(zhì)一起應(yīng)用，所述基質(zhì)通過支持和/或指導(dǎo)植入細(xì)胞的命運(yùn)而促進(jìn)體內(nèi)組織工程化。同樣地，可以將細(xì)胞基因操作后施用從而它們表達(dá)基因產(chǎn)物，認(rèn)為或預(yù)定所述基因產(chǎn)物促進(jìn)所述細(xì)胞提供的治療應(yīng)答。操作的實(shí)例包括控制(增加或減少)促進(jìn)血管發(fā)生或者脈管發(fā)生的因子(例如VEGF)的表達(dá)、促進(jìn)分化成特定細(xì)胞譜系的發(fā)育基因(例如，MyoD)或者刺激細(xì)胞生長和分化的發(fā)育基因(例如，bFGF-1)的表達(dá)的操作。
還可以將細(xì)胞在支架材料上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)后植入。從而，使用ADC可以在天然或者合成的基質(zhì)或支架上合成組織工程化瓣膜、心室補(bǔ)片、心包膜、血管，和其他結(jié)構(gòu)后插入或者植入接受者(Eschenhagen等人，2002；Zimmermann等人，2004；Zimmermann等人，2002；Nerem和Ensley，2004)。實(shí)際上，已經(jīng)闡明了脂肪組織來源的干細(xì)胞和祖細(xì)胞體外分化成心肌細(xì)胞的細(xì)胞表達(dá)標(biāo)記(Gaustad等人，2004；Rangappa等人，2003)。
3.用于治療心血管疾病和病癥的ADC的施用途徑在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選將細(xì)胞直接施用于目的計(jì)劃益處的部位。這可以通過直接注射到心臟的外部表面(心外膜)、通過插入適宜的插管通過內(nèi)表面(心內(nèi)的)直接注射到心肌、通過動(dòng)脈或者靜脈輸液(包括逆行流動(dòng)機(jī)制)或者通本文中公開的或者本領(lǐng)域中公知的其他方法實(shí)現(xiàn)。本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員公知的施用途徑包括但不限于，靜脈內(nèi)、冠狀動(dòng)脈內(nèi)、心肌內(nèi)、心肌外膜、心室內(nèi)、后竇或者靜脈內(nèi)。
如上文提到的，通過一些途徑可以施用細(xì)胞，這些途徑包括通過靜脈或者動(dòng)脈輸液(包括逆行流動(dòng)輸液)全身性施用或者直接注射到心臟。全身性施用，尤其通過外圍靜脈通路全身性施用依賴于心臟的天然灌注從而具有最小侵入性和脂肪組織來源的細(xì)胞能夠靶定損傷部位的優(yōu)點(diǎn)。細(xì)胞可以以單次快速濃注注射，這可通過緩慢輸液或者通過相隔數(shù)小時(shí)的交錯(cuò)系列應(yīng)用或者如果細(xì)胞經(jīng)適宜保存，可以相隔數(shù)天或者數(shù)周交錯(cuò)系列應(yīng)用?？梢酝ㄟ^導(dǎo)管插入術(shù)應(yīng)用細(xì)胞從而通過使用氣囊控制心肌血流增強(qiáng)細(xì)胞通過心臟的首次穿過。關(guān)于外周靜脈通路，可以通過導(dǎo)管以單次快速濃注或者以多次更小的等分試樣注射細(xì)胞。還可以通過心外膜注射將細(xì)胞直接應(yīng)用于心肌。這可以在打開心臟方法(如冠狀動(dòng)脈旁路移植手術(shù))或者放置心室輔助裝置的背景下在直接觀察下應(yīng)用。裝備針頭的導(dǎo)管可以用于將細(xì)胞以心內(nèi)方式直接遞送到心肌，這可以允許直接應(yīng)用的較小的侵入性方法。
在一個(gè)實(shí)施方案中，遞送途徑包括通過標(biāo)準(zhǔn)外周靜脈導(dǎo)管、中央靜脈導(dǎo)管、或者肺動(dòng)脈導(dǎo)管的靜脈內(nèi)遞送。在其他實(shí)施方案中，可以通過當(dāng)前可接受的方法得到的冠狀動(dòng)脈內(nèi)途徑遞送細(xì)胞。通過位于患者脈管系統(tǒng)內(nèi)遠(yuǎn)端和近端氣囊的連續(xù)充氣/放氣可以控制細(xì)胞的流動(dòng)，從而產(chǎn)生暫時(shí)的無流動(dòng)區(qū)，其促進(jìn)細(xì)胞植入或者細(xì)胞治療作用。在另一實(shí)施方案中，可以通過心內(nèi)(心室的內(nèi)表面)方法遞送細(xì)胞，該方法需要使用相容的導(dǎo)管以及能夠成像或者檢測所計(jì)劃的靶組織。備選地，可以通過心外膜(心臟的外表面)方法遞送細(xì)胞。該遞送可以通過打開心臟方法時(shí)的直接觀察或者通過需要專門的細(xì)胞遞送儀器的胸腔鏡方法實(shí)現(xiàn)。此外，應(yīng)該按照單獨(dú)或者與上面鑒別的一種或多種方法聯(lián)合的下述途徑遞送細(xì)胞皮下、肌內(nèi)、舌下、逆行冠狀輸液、冠狀旁路機(jī)制、離體膜充氧(ECMO)設(shè)備和通過心包窗。
在一個(gè)實(shí)施方案中，將細(xì)胞作為血管內(nèi)快速濃注或者定時(shí)輸液施用于患者。在另一實(shí)施方案中，可以將細(xì)胞重懸在人工或者天然培養(yǎng)基或者組織支架中后施用于患者。
施用于患者的細(xì)胞劑量將取決于收獲的脂肪組織量和供體的身體質(zhì)量指數(shù)(作為可利用的脂肪組織的量度)。也可通過心肌損傷或者退化的程度確定所獲的組織的量。本發(fā)明的范圍包括使用多次組織收獲的多次治療或者使用應(yīng)用間細(xì)胞的適宜保存的單次收獲的多次治療。
所處理的吸脂物的部分在施用于患者前可以保存起來。對于短期保存(少于6小時(shí))，可以將細(xì)胞在室溫或者室溫下保存在密閉容器中，容器中補(bǔ)加或者不補(bǔ)加營養(yǎng)溶液。中期保存(小于48小時(shí))優(yōu)選在2-8℃下等滲的緩沖液(例如，Plasmalyte)的容器中進(jìn)行，所述容器含有防止細(xì)胞貼壁的材料或者由防止細(xì)胞貼壁的材料組成。長期保存優(yōu)選通過適宜的冷藏進(jìn)行并且將細(xì)胞保存在促進(jìn)細(xì)胞功能保持的條件下，如2002年9月13日申請的普通擁有和轉(zhuǎn)讓的PCT申請?zhí)朠CT/US02/29207和2001年9月14日申請的美國臨時(shí)申請?zhí)?0/322,070中公開的條件，這里引用所述專利申請作為參考。
按照本發(fā)明的一個(gè)方面，施用于患者的脂肪組織來源的細(xì)胞可以作為生長因子遞送載體。例如，通過工程化細(xì)胞以表達(dá)適于減輕與心血管病癥或疾病有關(guān)的癥狀的一種或多種生長因子，可以將細(xì)胞施用于患者，并且工程化以釋放一種或多種生長因子。所述釋放可以以受控的方式長期釋放。因?yàn)榭梢钥刂漆尫牛陨L因子以脈沖的或者定期的方式釋放從而在組織的損傷區(qū)域附近生長因子局部升高和/或生長因子的量局部下降。
施用于患者的細(xì)胞不僅幫助恢復(fù)受損或者不健康組織的功能，而且促進(jìn)受損組織的重建。
可以進(jìn)行細(xì)胞遞送但是其不限于下面的場所診所、門診部、急診室、醫(yī)院病房、重病監(jiān)護(hù)室、手術(shù)室、導(dǎo)管插入室，和放射室。
在一個(gè)實(shí)施方案中，將通過但不限于下面的臨床量度之一闡明細(xì)胞遞送療法的效果心臟射血分?jǐn)?shù)增加、心力衰竭率降低、梗死尺寸減小、患病率(肺水腫、腎衰竭、心率不齊)的減小、運(yùn)動(dòng)耐受性的改善或者其他生命質(zhì)量量度，和死亡率降低。該方法后數(shù)天到數(shù)周時(shí)間里細(xì)胞療法的效果將變得明顯。然而，有益效果可以在早至該方法后數(shù)小時(shí)后觀察到，并且可以持續(xù)數(shù)年。
通常在細(xì)胞遞送之前和期間監(jiān)視患者。監(jiān)視方法包括，但不限于凝血研究、氧飽和、血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)視，和心律監(jiān)視。細(xì)胞遞送后，患者需要約24小時(shí)對副反應(yīng)的監(jiān)視。用于評估所述方法的功能改進(jìn)的跟蹤研究可以包括但不限于患者功能性能力(例如，用力時(shí)呼吸困難、爆發(fā)性夜間呼吸困難、咽峽炎)、超聲波心動(dòng)描記法、核灌注研究、磁共振成像、正電子成像術(shù)，和冠狀血管造影術(shù)。
如前面提出的，在優(yōu)選實(shí)施方案中，將ADC，即活性脂肪來源的干細(xì)胞群體直接施用于患者。換句話說，將活性細(xì)胞群體(即干細(xì)胞和/或內(nèi)皮前體細(xì)胞)施用于患者而不從系統(tǒng)除去或者在施用于患者前暴露于系統(tǒng)的外部環(huán)境。提供密閉的系統(tǒng)減小了施用于患者的材料污染的可能性。從而，在密閉系統(tǒng)中處理脂肪組織提供了相對于現(xiàn)有方法的益處，因?yàn)榛钚约?xì)胞群體更可能是無菌的。在這種實(shí)施方案中，干細(xì)胞和/或內(nèi)皮前體細(xì)胞暴露于外部環(huán)境或者從系統(tǒng)除去的唯一時(shí)間是細(xì)胞被吸入應(yīng)用裝置或者施用于患者時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，應(yīng)用裝置可以是密閉系統(tǒng)的部分。從而，用于這些實(shí)施方案中的細(xì)胞不經(jīng)處理以用于培養(yǎng)或者冷藏并且可以不經(jīng)處理而施用于患者，或者可以與其他組織或者細(xì)胞混合后施用于患者。
在其他實(shí)施方案中，保存至少一部分活性細(xì)胞群體以用于以后的植入/灌注?？梢詫⒃撊后w分成一份以上的等分試樣或者單位從而干細(xì)胞或者內(nèi)皮前體細(xì)胞群體的部分保留用于以后應(yīng)用而部分立即應(yīng)用于患者。細(xì)胞庫中所有或部分細(xì)胞的中到長期保存也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，如2002年9月12日申請的標(biāo)題為“保存非胚胎細(xì)胞防止非造血組織的危害”的美國專利申請?zhí)?0/242,094中公開的，該申請要求普通轉(zhuǎn)讓的2001年9月14日申請的美國臨時(shí)專利申請60/322,070的益處，將這些文獻(xiàn)特別并入本文作為參考。處理結(jié)束時(shí)，可以將濃縮的細(xì)胞裝入遞送裝置，如注射器，以通過本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員公知的任意方法置于接受者中。
II.藥物組合物活性細(xì)胞群體可以單獨(dú)應(yīng)用或者與其他細(xì)胞、組織、組織碎片、生長因子，如VEGF和其他公知的血管生成和動(dòng)脈生成性生長因子、生物活性或惰性化合物、可以再吸收的塑料支架，或者旨在增強(qiáng)群體的遞送、功效、耐受性或者功能的其他添加劑聯(lián)合應(yīng)用。通過插入DNA或者通過將DNA以這樣的方式置于細(xì)胞培養(yǎng)物中使得改變、增強(qiáng)或者補(bǔ)充細(xì)胞的功能以得到結(jié)構(gòu)或者治療目的來修飾細(xì)胞群體。例如，干細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)是本領(lǐng)域中技術(shù)人員公知的，如(Morizono等人，2003；Mosca等人，2000)中公開，并且可以包括病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，更具體地，如(Walther和Stein，2000)和(Athanasopoulos等人，2000)中公開的腺相關(guān)病毒基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。還可以如(Muramatsu等人，1998)中公開的實(shí)施基于非病毒的技術(shù)。
另一方面，細(xì)胞可以與編碼原-血管生成和/或心肌生成的生長因子的基因結(jié)合，所述基因允許細(xì)胞在心臟修復(fù)或再生期間作為它們的生長因子的自身來源。還可以應(yīng)用編碼抗凋亡因子的基因或者試劑。可以通過本領(lǐng)域中公知的任意技術(shù)加入基因(或者基因的聯(lián)合)，所述技術(shù)包括，但不限于腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)、“基因槍”、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，和逆轉(zhuǎn)錄病毒或者慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)、質(zhì)粒、腺相關(guān)病毒。細(xì)胞可以與攜帶基因遞送載體的載體材料一起植入，所述基因遞送載體能夠隨時(shí)間釋放和/或遞送基因到細(xì)胞從而轉(zhuǎn)導(dǎo)可以持續(xù)或者在原位啟動(dòng)。尤其當(dāng)細(xì)胞和/或含有該細(xì)胞的組織施用于該細(xì)胞和/或含有該細(xì)胞的組織從中得到的患者之外的患者時(shí)，可以對接受該細(xì)胞和/或含有該細(xì)胞的組織的患者施用一種或多種免疫抑制劑以減小，優(yōu)選防止移植物的排斥。文中所用術(shù)語“免疫抑制藥物或試劑”旨在包括一種或者干擾正常免疫功能的藥物試劑。適宜用于文中公開的方法的免疫抑制劑的實(shí)例包括抑制T-細(xì)胞/B細(xì)胞共刺激途徑的試劑，如美國專利
發(fā)明者J·K·弗拉塞爾, M·H·赫德里克, M·朱, B·M·斯特雷姆, E·丹尼爾斯, I·烏盧爾 申請人:馬克羅珀?duì)柹锿饪乒?br>