專利名稱：小鼠巢蛋白基因啟動子及其組織特異性增強子的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學和DNA重組技術領域。更具體地，本發(fā)明涉及巢蛋白基因的啟動子及其組織特異性增強子，以及它們的用途。
背景技術：
哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)是由胚胎早期的神經(jīng)管發(fā)育分化而來的。在這個復雜的分化過程中，涉及許多神經(jīng)組織特異性及神經(jīng)細胞特異性基因的階段性表達。巢蛋白(nestin)作為中等纖維蛋白家族的一員，因其在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)前體細胞中的特異性表達而被克隆，并被作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)干細胞的標記分子而被廣泛應用。
目前，大鼠和人的巢蛋白基因都已被克隆。轉(zhuǎn)基因動物的結(jié)果顯示，在大鼠巢蛋白基因第一個內(nèi)含子中，存在調(diào)控該基因在肌肉組織中表達的增強子序列，而在第二個內(nèi)含子中，存在調(diào)控巢蛋白基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達的增強子序列。人的巢蛋白基因表達調(diào)控亦有類似的元件存在。巢蛋白基因的第二個內(nèi)含子已被用來指導某些外源基因在神經(jīng)組織中專一性表達。
然而，在本申請之前，還沒有獲得小鼠巢蛋白基因序列以及有關的調(diào)控序列。
鑒于小鼠是一種重要的試驗動物，而且巢蛋白是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特異性表達的蛋白，因此，本領域迫切需要開發(fā)小鼠的巢蛋白基因序列以及有關的調(diào)控序列。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種新的小鼠巢蛋白基因序列以及有關的調(diào)控序列。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些調(diào)控序列的方法以及所述調(diào)控序列的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種啟動子元件，該啟動子元件包括巢蛋白基因啟動子的核苷酸序列。較佳地，所述的啟動子元件包含SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種增強子元件，它包括小鼠巢蛋白基因的第二內(nèi)含子的核苷酸序列。較佳地，所述的增強子元件包含SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種用于在神經(jīng)干細胞中特異性表達的構(gòu)建物，該構(gòu)建物含有外源基因以及與該外源基因可操作地連接的權利要求3所述的增強子元件。較佳地，所述構(gòu)建物還含有與該外源基因可操作地連接的權利要求1所述的啟動子元件。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種載體，該載體含有上述的啟動子元件和/或增強子元件。較佳地，所述的載體是表達載體和質(zhì)粒。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種在神經(jīng)干細胞中特異性表達外源基因的方法，它包括步驟(a)提供一構(gòu)建物，所述構(gòu)建物含有外源基因以及與該外源基因可操作地連接的增強子元件，所述的增強子元件包含小鼠巢蛋白基因的第二內(nèi)含子的核苷酸序列，(b)將步驟(a)中的構(gòu)建物導入神經(jīng)干細胞，使外源基因在神經(jīng)干細胞中表達。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，步驟(a)中構(gòu)建物還含有與外源基因可操作地連接的巢蛋白基因啟動子元件。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權利要求書所界定的本發(fā)明范圍。
圖1顯示了小鼠巢蛋白基因的結(jié)構(gòu)。
圖2是構(gòu)建物pNH84的結(jié)構(gòu)圖。
圖3顯示了對小鼠巢蛋白基因的啟動子區(qū)域進行瞬時轉(zhuǎn)染分析的結(jié)果。
圖4顯示了對與熒光素酶報道基因相連的小鼠巢蛋白第二個內(nèi)含子進行系列缺失的示意圖。
圖5顯示了對小鼠巢蛋白基因的第二內(nèi)含子區(qū)域進行瞬時轉(zhuǎn)染分析的結(jié)果。
圖6顯示了小鼠巢蛋白基因的第二內(nèi)含子使外源基因(報道基因LacZ)在發(fā)育的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中表達。圖6A顯示了用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠的DNA片段的結(jié)構(gòu)。圖6B和6C顯示了在小鼠巢蛋白基因的啟動子和第二內(nèi)含子的指導下，報道基因lacZ在CNS中特異性地表達。
圖7顯示了小鼠巢蛋白基因的啟動子元件的核苷酸序列。
圖8顯示了小鼠巢蛋白基因的增強子元件(即第二內(nèi)含子)的核苷酸序列。
具體實施例方式
本發(fā)明人通過篩選小鼠細菌人工染色體(BAC)基因組文庫，獲得小鼠巢蛋白基因。構(gòu)建系列缺失質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染胚胎性癌細胞(Embryonal Carcinoma，EC)P19鑒定出小鼠巢蛋白基因的啟動子及增強子區(qū)域。利用小鼠巢蛋白基因的啟動子及其組織特異性增強子，得到在發(fā)育的中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異表達報告基因LacZ的轉(zhuǎn)基因小鼠。小鼠巢蛋白基因的啟動子及其增強子可用于在P19細胞中表達外源基因或增強外源基因的表達。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，術語“巢蛋白啟動子元件”、“巢蛋白啟動子區(qū)域”可互換使用，指具有巢蛋白啟動子序列(SEQ ID NO1)或其活性片段的多聚核苷酸。
如本文所用，術語“巢蛋白的增強子元件”、“巢蛋白第二內(nèi)含子”以及“巢蛋白的神經(jīng)系統(tǒng)表達增強子”等可互換使用，指具有巢蛋白增強子序列(SEQ ID NO2)或其活性片段的多聚核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述啟動子和增強子的多核苷酸變異體。這些多核苷酸變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變該啟動子或增強子的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上至巢蛋白啟動子元件和/或增強子元件的全長。核酸片段可用于核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離本發(fā)明的啟動子或增強子的核苷酸序列。
本發(fā)明的人巢蛋白啟動子和增強子的核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關核苷酸序列來設計引物，并用小鼠基因組DNA或含小鼠染色體的人工染色體克隆作為模板，擴增而得有關序列。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經(jīng)可以完全通過化學合成來得到本發(fā)明啟動子或增強子(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細胞中。
應用PCR技術擴增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的啟動子或增強子元件。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明啟動子和/或增強子元件的構(gòu)建物或載體，以及用所述構(gòu)建物或載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導的宿主細胞，以及經(jīng)重組技術產(chǎn)生外源蛋白的方法。
適用于本發(fā)明的外源基因沒有特別限制，幾乎所有的外源基因都可用于本發(fā)明。代表性的外源基因的例子包括(但并不限于)BDNF、NT-3、STAT3及APP等。應注意，外源基因還包括來自宿主本身的基因。例如，對于某些神經(jīng)系統(tǒng)的遺傳病(例如因某蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)中表達不足或不表達所導致的疾病)，可以從病人本身分離得到有關基因，然后將其與本發(fā)明的巢蛋白啟動子元件和/或增強子元件相連，形成含外源基因的構(gòu)建物，然后將所述構(gòu)建物用于基因治療。
一種構(gòu)建物的例子就是與巢蛋白啟動子元件和/或增強子元件相連的外源基因。至于巢蛋白啟動子元件和/或增強子元件與外源基因的位置關系，啟動子應位于外源基因的上游，而增強子可位于外源基因的上游或下游。
本發(fā)明中，含巢蛋白啟動子和/或增強子元件的核苷酸序列可優(yōu)選地插入到載體，例如表達載體中。術語“載體”指本領域熟知的細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于表達載體、克隆載體，例如適用于原核(如大腸桿菌等細菌)、真核(如酵母)、昆蟲細胞、植物細胞、哺乳動物細胞中的載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。在表達載體中，除了含有含有復制起點、巢蛋白啟動子元件和/或巢蛋白增強子元件之外，還可含有標記基因和其他翻譯控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用于構(gòu)建含巢蛋白啟動子元件和/或增強子元件和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內(nèi)重組技術等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效地與待表達的外源基因相連接，以指導所述外源基因mRNA合成。
此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎?，以使其能夠表達外源蛋白質(zhì)。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS、293細胞、或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規(guī)技術進行。一些采用的轉(zhuǎn)化方法包括但并不限于磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，以表達外源基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長和表達的條件下進行培養(yǎng)。
在本發(fā)明的一個實施例中，從10天小鼠全胚胎cDNA文庫中篩選巢蛋白cDNA，并得到小鼠巢蛋白的cDNA 5983bp的全長序列。利用基因組文庫的PCR篩選方法，得到一個巢蛋白基因的細菌人工染色體(BAC)克隆。以小鼠巢蛋白cDNA序列作探針作Southern雜交。通過比較比較巢蛋白cDNA和基因組DNA序列可以得出小鼠巢蛋白的基因結(jié)構(gòu)，即該基因由4個外顯子和3個內(nèi)含子所組成。
與大鼠及人巢蛋白基因相比，小鼠巢蛋白基因內(nèi)含子的位置及大小均較保守。目前，大鼠及人巢蛋白基因的5′上游區(qū)、第1及第3個內(nèi)含子的序列尚未見文獻報道。本發(fā)明的小鼠巢蛋白基因的第2個內(nèi)含子與大鼠及人巢蛋白基因第2個內(nèi)含子的同源性分別為88％和56％。
本發(fā)明人還進一步仔細分析了小鼠巢蛋白啟動子元件和增強子元件。并通過實驗確定了小鼠巢蛋白啟動子元件和增強子元件的確切序列，并證實了巢蛋白增強子元件可特異性地在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中增強外源基因的表達。
本發(fā)明的巢蛋白啟動子元件和/或增強子元件具有廣闊的應用前景，例如1)小鼠巢蛋白基因啟動子可指導外源基因在P19細胞等多潛能細胞中表達。2)小鼠巢蛋白基因第二內(nèi)含子可增強外源基因在P19細胞等多潛能細胞中的表達。3)小鼠巢蛋白基因第二內(nèi)含子因其神經(jīng)干細胞中的特異表達特性，可與巢蛋白啟動子或其他啟動子結(jié)合在哺乳動物發(fā)育的神經(jīng)系統(tǒng)中過量表達外源基因。因此，本發(fā)明的巢蛋白啟動子元件和/或增強子元件可應用于研究神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中重要分子的功能、神經(jīng)疾患動物模型的建立以及神經(jīng)疾患的基因治療。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1小鼠巢蛋白cDNA序列和基因組序列的獲得利用我們制備的小鼠巢蛋白的抗體(Jing N.H.，Kitani H.，et al.，1996，ChineseJournal of Physiological Sciences，Vol 12，p1-8)，篩選小鼠神經(jīng)前體細胞cDNA文庫，得到小鼠巢蛋白基因cDNA 3′端3.6Kb(M5)。以M5 5′端740bp(2402-3143位核苷酸)的片段篩選用常規(guī)方法構(gòu)建的10天小鼠全胚胎cDNA文庫，得到小鼠巢蛋白的cDNA 5983bp的全長序列(小鼠巢蛋白基因cDNA GenBank accessionno.AF076623)。
利用基因組文庫的PCR篩選方法，得到一個巢蛋白基因的細菌人工染色體(BAC)克隆。以小鼠巢蛋白cDNA序列中5′端第1-1203位以及5427-5983位的DNA片段為探針作Southern雜交。本發(fā)明人獲得了4個可拼接出小鼠巢蛋白的基因結(jié)構(gòu)的陽性克隆pNX7、pNB6、pNX5及pNX9(圖1)。通過比較比較巢蛋白cDNA和基因組DNA序列可以得出小鼠巢蛋白的基因結(jié)構(gòu)，即該基因由4個外顯子和3個內(nèi)含子所組成(圖1)。
與大鼠及人巢蛋白基因相比，小鼠巢蛋白基因內(nèi)含子的位置及大小均較保守。目前，大鼠及人巢蛋白基因的5′上游區(qū)、第1及第3個內(nèi)含子的序列尚未見文獻報道。本發(fā)明的小鼠巢蛋白基因的第2個內(nèi)含子與大鼠及人巢蛋白基因第2個內(nèi)含子的同源性分別為88％和56％。
實施例2巢蛋白啟動子元件的鑒定小鼠胚胎性癌細胞P19是一株多潛能細胞，該細胞具有正常雄性小鼠染色體核型，在10-6mol/L的視黃酸(retinoic acid，RA)誘導下，可向神經(jīng)細胞方向分化。在這一過程中，神經(jīng)發(fā)育相關基因的表達模式基本模擬了正常小鼠神經(jīng)發(fā)育過程。因此，P19細胞目前被作為一個研究小鼠神經(jīng)發(fā)育的體外實驗模型。通過分析巢蛋白基因在小鼠胚胎發(fā)育不同時期和視黃酸(Retinoic Acid，RA)誘導的胚胎性癌細胞(Embryonal Carcinoma，EC)P19體外神經(jīng)分化過程中的表達規(guī)律，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)巢蛋白基因在P19神經(jīng)分化過程中的表達規(guī)律與該基因在動物體內(nèi)的表達模式類似。
將小鼠巢蛋白基因的調(diào)控序列構(gòu)建到含熒光素酶報告基因的pGL3載體上，通過脂質(zhì)體LipofectAMINE轉(zhuǎn)染P19細胞。利用Promega公司的雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(dual-luciferase reporter assay system)檢測報告基因的活性，從而確定出小鼠巢蛋白基因的調(diào)控區(qū)域。
為了分析小鼠巢蛋白基因的啟動子特性，構(gòu)建了一系列質(zhì)粒。以pNX7為模板，設計引物作PCR反應得到小鼠巢蛋白基因cDNA 5′上游887bp及2,660bp的片段。這兩個片段克隆進T-vector后構(gòu)建成質(zhì)粒CLP3和CLP5。
制備質(zhì)粒CLP3時所用引物為正向5′-GAGAACGCGTAGAGCCGCGTAACTTCTTCACT-3′(SEQ ID NO3)；反向5′-GAGACTCGAGGTGGAGCACTAGAGAAGGGAGT-3′(SEQ ID NO4)。
制備質(zhì)粒CLP5所用引物為正向5′-GAGAACGCGTGGCAGGTGGCTCACAACTATCT-3′(SEQ ID NO5)；反向5′-GAGACTCGAGGTGGAGCACTAGAGAAGGGAGT-3′(SEQ ID NO4)。
測序鑒定后，CLP3和CLP5用限制性內(nèi)切酶Mlu I和Xho I切割并分別回收895bp和2,668bp片段。這兩個片段與經(jīng)同樣兩種限制性內(nèi)切酶處理的含報告基因的載體pGL3-Basic(購自Promega公司)連接，得到克隆pNH85和pNH83。
pNX7經(jīng)限制性內(nèi)切酶Sac I及Aat II切割后，回收3.2Kb的片段。該片段構(gòu)建到經(jīng)兩種同樣限制性內(nèi)切酶處理的pNH85中，得到質(zhì)粒pNH84(圖2)。pNH84中插入質(zhì)粒pBluescript KSII(-)的多克隆位點后，得到質(zhì)粒pNH81。pNH81經(jīng)限制性內(nèi)切酶Pst I或Apa I切割后作自連反應，可得到質(zhì)粒pNH82及pNH86。PNH81經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoR V及Pvu II切割后作自連反應，得到質(zhì)粒pNH87。
除了按照5′到3′的方向?qū)π∈蟪驳鞍谆?′上游序列作系列缺失外，本發(fā)明人在質(zhì)粒pNH84的基礎上分別缺失5′上游近端2,342bp及780bp，得到質(zhì)粒pNH45及pNH46。pNH45為pNH84經(jīng)Nco I酶切后自連而成。它包含小鼠巢蛋白基因5′上游遠端1,650bp長的序列。質(zhì)粒pNH84經(jīng)Aat II和Xho I酶切后，回收8,007bp長的片段。該片段經(jīng)綠豆核酸酶處理后，自連得到質(zhì)粒pNH46。pNH46包含小鼠巢蛋白基因5′上游遠端3,212bp長的序列。
對獲得的質(zhì)粒進行熒光素酶活性檢測，結(jié)果如圖3所示。分析結(jié)果表明，小鼠巢蛋白5′端上游344bp長的區(qū)域即具有啟動子活性(圖3)。小鼠巢蛋白啟動子元件的具體核苷酸序列如圖7和SEQ ID NO1所示。
實施例3巢蛋白增強子元件的鑒定為了驗證小鼠巢蛋白基因第2個內(nèi)含子是否具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異表達的特性，本發(fā)明人首先在體外檢測其對報告基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的活性。
在構(gòu)建轉(zhuǎn)細胞系列缺失質(zhì)粒的過程中，先對帶報告基因熒光素酶的質(zhì)粒pGL3-Promoter進行改造。pGL3-Promoter經(jīng)XhoI酶切后，用Klenow酶補平，然后自連以消除XhoI位點。為方便構(gòu)建系列缺失質(zhì)粒，把pBluescript II SK(-)上SacI至KpnI間的多克隆位點構(gòu)建到去除XhoI位點的pGL3-Promoter中，并命名該質(zhì)粒為pGL3-Px′。
巢蛋白基因的第2個內(nèi)含子來自克隆pNB6。系列缺失質(zhì)粒的構(gòu)建過程參見圖4。
報告基因檢測結(jié)果顯示，小鼠巢蛋白基因的第二個內(nèi)含子3′端約800bp長的區(qū)域?qū)蟾婊虻谋磉_具有增強作用(圖5)。小鼠巢蛋白增強子元件的具體核苷酸序列如圖8和SEQ ID NO2所示。
實施例4構(gòu)建含小鼠巢蛋白啟動子元件和/或增強子元件的構(gòu)建物在得到小鼠巢蛋白基因的啟動子和增強子區(qū)域的基礎上，構(gòu)建包含小鼠巢蛋白基因啟動子、增強子及報告基因lacZ的DNA片段制備轉(zhuǎn)基因小鼠。質(zhì)粒pNH86經(jīng)限制性內(nèi)切酶Kpn I及Xho I切割后，得到小鼠巢蛋白基因啟動子344bp片段。該片段與經(jīng)Kpn I及Xho I切割的載體pβgal-Basic(購自Clontech公司)_連接得到質(zhì)粒pNH101。質(zhì)粒pNH92經(jīng)限制性內(nèi)切酶Bgl II切割后，得到小鼠巢蛋白基因增強子753bp片段。該片段與經(jīng)Bgl II切割及牛小腸堿性磷酸酶(CIP)處理的載體pNH101連接得到質(zhì)粒pNH102。用限制性內(nèi)切酶Apa I將質(zhì)粒pNH102線性化，制備轉(zhuǎn)基因小鼠。轉(zhuǎn)基因小鼠的制備按文獻所述的方法(Section 19Transgenic mouse preparation.in Basic Methods in MolecularBiology/Leonard G.Davis，W.Michael Kuehl，James F.Battey.-2nd ed.1994.By Appleton & Lange Norwalk，Connecticut，USA.)。
構(gòu)建物如圖6A所示，從5′至3′方向，依次含有小鼠巢蛋白基因344bp啟動子區(qū)域、753bp增強子區(qū)域、報告基因lacZ及載體序列。
實驗結(jié)果如圖6B和C所示，報告基因lacZ與內(nèi)源巢蛋白基因相似的表達模式表明，小鼠巢蛋白基因的啟動子在動物體內(nèi)具有功能，而其第二內(nèi)含子3′端約753bp(在SEQ ID NO2中為753bp)長的區(qū)域則具有指導外源基因在神經(jīng)干細胞中表達的能力。
實施例5利用PCR從小鼠基因組DNA獲得小鼠巢蛋白啟動子元件合成如下引物正向引物5′-GGGCCCAGTTCTGTGCA-3′(SEQ ID NO6)，反向引物5′-GTGGAGCACTAGAGAAG-3′(SEQ ID NO7)。
以小鼠基因組DNA為模板，在如下條件進行PCR反應94℃，1min；45℃1min；72℃30sec，共35個循環(huán)。獲得了約350bp的擴增產(chǎn)物。對擴增產(chǎn)物進行測序鑒定，結(jié)果表明與SEQ ID NO1所示的小鼠巢蛋白啟動子元件的序列相符。
小鼠巢蛋白啟動子元件可用于指導外源基因的表達，尤其在哺乳動物細胞中的表達。
實施例6利用PCR從小鼠基因組DNA獲得小鼠巢蛋白增強子元件合成如下正向引物5′-AGATCTAGGAGAGGAGCT-3′(SEQ ID NO8)，反向引物；5′-GGATCACTCTTTATTGTG-3′(SEQ ID NO9)。
以小鼠基因組DNA為模板，在如下條件進行PCR反應94℃，1min；45℃1min；72℃1min，共35個循環(huán)。獲得了約750bp的擴增產(chǎn)物。對擴增產(chǎn)物進行測序鑒定，結(jié)果表明與SEQ ID NO1所示的小鼠巢蛋白增強子元件的序列相符。
小鼠巢蛋白組織特異性增強子可用于在哺乳動物發(fā)育的神經(jīng)系統(tǒng)中過量表達外源基因。這可用于研究基因功能、建立神經(jīng)疾患的動物模型及神經(jīng)疾患的基因治療。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國科學院上海生物化學研究所<120>小鼠巢蛋白基因啟動子及其組織特異性增強子<130>002117F1<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>344<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<400>1gggcccagtt ctgtgcatct tagggtgttc tgggctgtct ggctgtatct caagcctctt 60tcggaaaatc acccgcaccg gacgggatcc ccgccagggc gaggctacaa tttgattctt120ctctgctgag ctgggatgat gcagggaccc gggctgtgtg ttgcactgaa ctctaaaggg180ttaaggccta gggaccgccc cttttccgcc cggccggcgg gagtatgaat accctcgctt240cagctcgctg ctggaatcct ccgcttccgc tgggtcactg tcgccgctac tccctttctc300ccccttaaaa gctccaaggg ccactccctt ctctagtgct ccac 344<210>2<211>753<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<400>2agatctagga gaggagctgg agggtagaag tccagagaag ggaagccagt gagtgtctag 60gaaggactga atgcacaagg caggacacta tgaggacgga ggaaaggcta ttttgagaac120cagatgtgct cagaggccat gaatggaaac aagggactag ctccgaatcc cttgtgaact180gattcccctc atctcctccc atcagctgtg aacctaaaga cctctggcct gaaggaggat240ttgtgatcct aagatgaggg ccttcgcccc agtcagtctt ctgaggcgag gggaagggtc300
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<221>misc_feature<223>引物<400>3gagaacgcgt agagccgcgt aacttcttca ct 32<210>4<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4gagactcgag gtggagcact agagaaggga gt 32<210>5<211>32<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5gagaacgcgt ggcaggtggc tcacaactat ct 32<210>6<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6gggcccagtt ctgtgca17<210>7<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>7gtggagcact agagaag17<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>8agatctagga gaggagct 18
<210>9<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>9ggatcactct ttattgtg 18
權利要求
1.一種啟動子元件，其特征在于，它包括巢蛋白基因啟動子的核苷酸序列。
2.如權利要求1所述的啟動子元件，其特征在于，它包含SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
3.一種用于在神經(jīng)干細胞中特異性表達的構(gòu)建物，其特征在于，它含有外源基因以及與該外源基因可操作地連接的權利要求1所述的啟動子元件。
4.如權利要求3所述的構(gòu)建物，其特征在于，它還含有與該外源基因可操作地連接的巢蛋白增強子元件。
5.如權利要求4所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述的啟動子元件包含SEQ IDNO1所示的核苷酸序列，而且所述的增強子元件包含SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權利要求1所述的啟動子元件。
7.一種在神經(jīng)干細胞中特異性表達外源基因的方法，其特征在于，它包括步驟(a)提供一構(gòu)建物，所述構(gòu)建物含有外源基因以及與該外源基因可操作地連接的權利要求1所述的啟動子元件和巢蛋白增強子元件，所述的增強子元件包含小鼠巢蛋白基因的第二內(nèi)含子的核苷酸序列，(b)將步驟(a)中的構(gòu)建物導入神經(jīng)干細胞，使外源基因在神經(jīng)干細胞中表達。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述的啟動子元件包含SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，而且所述的增強子元件包含SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了小鼠巢蛋白啟動子元件和增強子元件，含這些元件的構(gòu)建物和載體，以及它們的用途。本發(fā)明的巢蛋白啟動子元件和/或增強子元件可用于指導外源基因的表達，研究神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中重要分子的功能、神經(jīng)疾患動物模型的建立以及神經(jīng)疾患的基因治療。
文檔編號C12N15/63GK1550551SQ200410047450
公開日2004年12月1日 申請日期2000年11月30日 優(yōu)先權日2000年11月30日
發(fā)明者景乃禾, 程樂平, 高翔 申請人:中國科學院上海生物化學研究所