專利名稱：生產(chǎn)低聚木糖的方法及其專用固定化木聚糖酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)低聚木糖的方法及其用于該方法的專用固定化木聚糖酶。
背景技術(shù)：
低聚木糖亦稱木寡糖(xylooligosaccharides)，是由2～10個D-木糖以β-1，4-木糖苷鍵結(jié)合而成的非均一性多糖，是功能性低聚糖家族中的一個重要成員。它的甜度比蔗糖和葡萄糖均低，與麥芽糖相當(dāng)，約為蔗糖的40％。低聚木糖具有顯著的雙歧菌增殖效果，能抑制腸道有害菌的生長發(fā)育、降低血清膽固醇和中性脂肪、防止老化和骨質(zhì)疏松癥，具有抗齲齒，有利于口腔健康、清除腸內(nèi)毒素、防止便秘；體內(nèi)轉(zhuǎn)化產(chǎn)熱量低等生理功能；具有對pH值酸堿及熱的穩(wěn)定性好等良好的加工工藝性能，近年來已成為功能性食品基材研究的熱點課題，其生產(chǎn)和應(yīng)用日漸增多。
低聚木糖的生產(chǎn)主要有物理法如高溫蒸煮(日本專利申請JP62281890A2、JP6197800A2、中國專利申請CN99105722.8等)、微波處理(日本專利申請JP1224384 A2)等；化學(xué)法如酸水解法等；酶水解法(Kusakabe I et al.preparation of crystallinexylooligosaccharides from xylan.Nippon Nogeikagaku Kaishi，1975，49383～385)等。
我國是農(nóng)業(yè)大國，有著豐富的木聚糖資源。以玉米芯為例，我國近年年產(chǎn)量穩(wěn)定在4000萬噸左右，而玉米芯的木聚糖含量高達(dá)30％-42％，非常適宜作為低聚木糖生產(chǎn)原料。木聚糖的降解需要多種酶的參與，β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶(endo-xylanase，EC.3.2.1.8)以內(nèi)切方式作用于主鏈，產(chǎn)生長度不同的低聚木糖和少量的木糖，是木聚糖水解酶中最關(guān)鍵的酶。目前關(guān)于低聚木聚糖的專利主要集中在酶法水解生產(chǎn)低聚木糖領(lǐng)域，如日本特開昭62-155095、JP02119791A2、06261750JPA2、JP10215866A2、JP10295372A2等；國內(nèi)蔡敬民(CN99126547.5)等用玉米芯、玉米秸桿、稻草等作為原料，堿法提取半纖維素(木聚糖)后，加酶水解生產(chǎn)低聚木糖；陶文沂(CN 00109788.1)等以麩皮、蔗渣或玉米芯為原料，堿法制備木聚糖，然后以突變株假單胞菌(Pseudomonas sp.XUN024)來源木聚糖酶進(jìn)行水解生產(chǎn)低聚木糖，低聚木糖產(chǎn)品中木二糖、木三糖含量占總糖組分90％以上；余世袁(CN02112568.6)等采用里氏木霉產(chǎn)木聚糖酶水解堿法提取精制木聚糖生產(chǎn)低聚木糖；以及本發(fā)明的發(fā)明人以前所申請的專利(CN01131171.1)將原料玉米芯用堿金屬氫氧化物預(yù)處理；在弱酸型催化劑如乙酸、甲酸、檸檬酸等作用下進(jìn)行直熱裂解，然后與木聚糖酶液反應(yīng)制備低聚木糖。這些方法均采用從原料中堿法提取木聚糖后酶水解制備低聚木糖，工藝復(fù)雜，而且所用降解酶均為游離酶。
與游離酶相比，固定化酶具有穩(wěn)定性高，產(chǎn)物與酶分離回收容易，可多次重復(fù)使用，酶的利用效率高、可連續(xù)操作及自動化控制、工藝簡便、生產(chǎn)成本低等一系列優(yōu)點，成為現(xiàn)代酶工程領(lǐng)域的研究熱點。然而，木聚糖為生物大分子且難溶于水，在自然狀態(tài)又多與其它成分如木質(zhì)素復(fù)合存在，由于底物空間位阻和載體擴(kuò)散限制效應(yīng)的影響，使得固定化木聚糖酶難以對其進(jìn)行有效地水解，因此木聚糖酶的固定化研究和應(yīng)用受到了很大限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種穩(wěn)定、高效的固定化木聚糖酶。
本發(fā)明所提供的固定化木聚糖酶，其制備包括如下步驟按酶與載體Eupergit C比為100～500U/g載體的比例將木聚糖酶液加入到濃度為0.2～1.2mol/L、pH4.3～7.8的磷酸鹽緩沖溶液中，攪拌均勻后加入Eupergit C，4～25℃下固定12～60h，經(jīng)過濾、洗滌得到固定化木聚糖酶。
所述木聚糖酶液為培養(yǎng)橄欖綠鏈霉菌QM-6制得，其制備方法為橄欖綠鏈霉菌E-86菌種經(jīng)平板活化后，在30℃搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)6天后離心得粗酶液，粗酶液經(jīng)透析、聚乙二醇(20000)濃縮后得到木聚糖酶；所述搖瓶培養(yǎng)基組成為1.5％木聚糖、1％KH2PO4、0.05％MgSO4、0.5％吐溫80、0.3％酵母提取物、1.5％蛋白胨。
制備Eupergit C為載體的固定化酶的優(yōu)選條件為酶與載體Eupergit C的比例為285U/g；所述磷酸鹽緩沖溶液為1mol/L、pH5.8的磷酸鉀緩沖液；溫度為25℃；固定時間為48h。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種高效、連續(xù)的生產(chǎn)低聚木糖的方法一種利用Eupergit C為載體的固定化木聚糖酶生產(chǎn)低聚木糖的方法，包括如下步驟1)玉米芯粉汽爆處理將玉米芯粉與水重量比為1∶6～1∶16的比例將玉米芯粉與水混合，通入155-180℃的蒸汽，反應(yīng)30～180min，離心得到汽爆液；2)固定化酶水解將固定化酶裝入固定床反應(yīng)器中，夾套保溫在45～65℃；將汽爆液調(diào)節(jié)pH為5.3～6.3后，按0.3～4.5倍酶床體積/h的流速從上端進(jìn)入固定床反應(yīng)器，經(jīng)酶水解后從下端流出，收集流出液。
水解結(jié)束后得到的流出液經(jīng)過活性碳脫色、離子交換除雜、真空濃縮等步驟，得到總糖含量為55％～75％的低聚木糖糖漿，也可以采用噴霧干燥法制備成低聚木糖粉。
步驟1)玉米芯粉是將玉米芯除雜、粉碎得到的。
步驟2)玉米芯粉汽爆處理優(yōu)選條件為所述玉米芯粉與水重量比為1∶8；蒸汽溫度為165℃；反應(yīng)時間為90min。
步驟3)固定化酶水解優(yōu)選條件為所述夾套溫度為55℃；汽爆液pH為5.8；汽爆液流速為1.5倍床體積/h。
本發(fā)明生產(chǎn)低聚木糖的工藝流程如圖1所示。本發(fā)明所用的載體Eupergit C為商業(yè)固定化酶用載體，固定化酶活力回收較高，穩(wěn)定性和裝柱后連續(xù)操作性能優(yōu)良，便于連續(xù)化生產(chǎn)，且產(chǎn)物組成穩(wěn)定易于控制；所用木聚糖酶來源于橄欖綠鏈霉菌E-86(Streptomyces olivaceoviridis E-86)，該木聚糖酶(分子量47kDa)對酸、堿和熱具有良好的穩(wěn)定性，最適溫度較高(55℃)和pH條件溫和(5.5～6.3)，對木聚糖作用迅速而對低聚糖的分解滯后，水解產(chǎn)物中木二糖、木三糖的組成高。在進(jìn)行水解前，采用汽爆處理玉米芯，使玉米芯中的木聚糖部分降解而成溶解狀態(tài)，便于采用固定床反應(yīng)器連續(xù)生產(chǎn)低聚木糖。
本發(fā)明采用固定化酶連續(xù)生產(chǎn)低聚木糖，酶利用效率高，操作簡便；以玉米芯等農(nóng)業(yè)廢棄物為原料，生產(chǎn)成本低。本發(fā)明不僅具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益，而且可解決農(nóng)產(chǎn)品增值和農(nóng)業(yè)廢棄物污染問題，具有極高的社會效益。


圖1為低聚木糖的生產(chǎn)工藝流程圖具體實施方式
實施例1、木聚糖酶的制備本發(fā)明所采用的木聚糖酶來源于橄欖綠鏈霉菌E-86(Kusakabe I，Kawaguchi M，Yasui T，Kobayashi T.Purification and some properties of extracellularxylanase from Streptomyces olivaceoviridis E-86.Nippon Nogeikagaku Kaishi，1977；51429-37)。其制備方法為橄欖綠鏈霉菌QM-6菌種經(jīng)平板活化后，在30℃、150rpm搖瓶培養(yǎng)。培養(yǎng)基組成1.5％木聚糖、1％KH2PO4、0.05％MgSO4、0.5％吐溫80、0.3％酵母提取物、1.5％蛋白胨(Tryptone)，培養(yǎng)6天后離心得粗酶液。粗酶液蒸餾水透析(截留分子量12kDa～14kDa)、聚乙二醇(20000)濃縮，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 實施例2、以Eupergit C為載體固定化酶的制備取1kg Eupergit C，按酶與載體比為100U/g載體比例取制備好的木聚糖酶溶液加入到6L濃度為1.2mol/L、pH4.8的磷酸鉀鹽緩沖溶液中，攪拌均勻后加入Eupergit C。在4℃、150rpm固定化48h。過濾去除清液，用蒸餾水反復(fù)沖洗5次，每次3L。真空抽濾后加入0.2mol/l巰基乙醇4L，4℃處理12h，清水沖洗干凈后4℃冷藏備用。固定化酶活力30U/g。
實施例3、以Eupergit C為載體固定化酶的制備取1kg Eupergit C，按酶與載體比為500U/g載體比例取制備好的木聚糖酶溶液加入到6L濃度為0.2mol/L、pH7.8的磷酸鉀鹽緩沖溶液中，攪拌均勻后加入Eupergit C。在25℃、150rpm固定化48h。過濾去除清液，用蒸餾水反復(fù)沖洗5次，每次3L。真空抽濾后加入0.2mol/l巰基乙醇4L，4℃處理12h，清水沖洗干凈后4℃冷藏備用。固定化酶活力68U/g。
實施例4、以Eupergit C為載體固定化酶的制備取1kg Eupergit C，按酶與載體比為285 U/g載體比例取制備好的木聚糖酶溶液加入到6L濃度為1mol/L、pH5.8的磷酸鉀鹽緩沖溶液中，攪拌均勻后加入EupergitC。在25℃、150rpm固定化48h。過濾去除清液，用蒸餾水反復(fù)沖洗5次，每次3L。真空抽濾后加入0.2mol/l巰基乙醇4L，4℃處理12h，清水沖洗干凈后4℃冷藏備用。固定化酶活力97U/g。
實施例5、低聚木糖的生產(chǎn)取40～60目的玉米芯粉10kg，加水80kg，在汽爆裝置中通入165℃蒸汽，處理90min，瞬間汽爆后離心分離得到汽爆液，經(jīng)活性炭脫色后用NaOH調(diào)節(jié)pH至5.8。
取Eupergit C固定化木聚糖酶裝入夾套式固定床反應(yīng)器(酶床體積1L)，夾套水浴保溫55℃。汽爆液以0.3L/h(即空間流速0.3/h)的流速，從上端連續(xù)進(jìn)入固定床經(jīng)酶水解后從下端流出，收集流出液。流出液先在75℃下真空濃縮為總糖含量25％的低聚木糖糖漿，然后進(jìn)行活性炭脫色，經(jīng)過離子交換樹脂柱(強(qiáng)酸型陽離子樹脂E306FG及大孔弱堿型陰離子交換樹脂D001)進(jìn)行除雜。在75℃下，將糖液濃縮至總糖含量為70％的低聚木糖糖漿。低聚木糖占總糖的比例70％以上，木聚糖轉(zhuǎn)化率64％(以直接還原糖計)。
實施例6、低聚木糖的生產(chǎn)汽爆液制備同實施例5。
取Eupergit C固定化木聚糖酶裝入夾套式固定床反應(yīng)器(酶床體積1L)，夾套水浴保溫55℃。汽爆液以4.5L/h(即空間流速4.5/h)的流速，從上端連續(xù)進(jìn)入固定床經(jīng)酶水解后從下端流出，收集流出液。流出液先在75℃下真空濃縮為總糖含量25％的低聚木糖糖漿，然后進(jìn)行活性炭脫色，經(jīng)過離子交換樹脂柱(強(qiáng)酸型陽離子樹脂E306FG及大孔弱堿型陰離子交換樹脂D001)進(jìn)行除雜。在75℃下，將糖液濃縮至總糖含量為70％的低聚木糖糖漿。低聚木糖占總糖的比例70％以上，汽爆液木聚糖轉(zhuǎn)化率32％(以直接還原糖計)。
實施例7、低聚木糖的生產(chǎn)汽爆液制備同實施例5。
取Eupergit C固定化木聚糖酶裝入夾套式固定床反應(yīng)器(酶床體積1L)，夾套水浴保溫55℃。汽爆液以1.5L/h(即空間流速1.5/h)的流速，從上端連續(xù)進(jìn)入固定床經(jīng)酶水解后從下端流出，收集流出液。流出液先在75℃下真空濃縮為總糖含量25％的低聚木糖糖漿，然后進(jìn)行活性炭脫色，經(jīng)過離子交換樹脂柱(強(qiáng)酸型陽離子樹脂E306FG及大孔弱堿型陰離子交換樹脂D001)進(jìn)行除雜。在75℃下，將糖液濃縮至總糖含量為70％的低聚木糖糖漿。低聚木糖占總糖的比例75％以上，汽爆液木聚糖轉(zhuǎn)化率52％(以直接還原糖計)。
權(quán)利要求
1.一種固定化木聚糖酶，是由以下工藝制備的按酶與載體Eupergit C比為100～500U/g載體的比例將木聚糖酶液加入到濃度為0.2～1.2mol/L、pH4.3～7.8的磷酸鹽緩沖溶液中，攪拌均勻后加入Eupergit C，4～25℃下固定12～60h，經(jīng)過濾、洗滌得到固定化木聚糖酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化木聚糖酶，其特征在于所述所述木聚糖酶液為培養(yǎng)橄欖綠鏈霉菌E-86制得。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的固定化木聚糖酶，其特征在于所述木聚糖酶液的制備方法為橄欖綠鏈霉菌E-86菌種經(jīng)平板活化后，在30℃搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)6天后離心得粗酶液，粗酶液經(jīng)透析、聚乙二醇(20000)濃縮后得到木聚糖酶；所述搖瓶培養(yǎng)基組成為1.5％木聚糖、1％KH2PO4、0.05％MgSO4、0.5％Tween 80、0.3％酵母提取物、1.5％蛋白胨。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的固定化木聚糖酶，其特征在于其制備過程優(yōu)選條件為所述酶與載體Eupergit C的比例為285U/g；所述磷酸鉀鹽緩沖溶液為1mol/L、pH5.8的磷酸鉀緩沖液；溫度為25℃；固定時間為48h。
5.一種利用權(quán)利要求1所述的固定化木聚糖酶生產(chǎn)低聚木糖的方法，包括如下步驟1)玉米芯粉汽爆處理將玉米芯粉與水按重量比為1∶6～1∶16的比例混合，通入155～180℃的蒸汽，反應(yīng)30～180min，汽爆后離心得到汽爆液；2)固定化酶水解將固定化酶裝入固定床反應(yīng)器中，夾套保溫在45～65℃；將汽爆液調(diào)節(jié)pH為5.3～6.3后，按1.5～4.5倍床體積/h的流速從上端進(jìn)入固定床反應(yīng)器，經(jīng)酶水解后從下端流出，收集流出液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟1)玉米芯粉是將玉米芯除雜、粉碎得到的。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于步驟3)所述流出液還需經(jīng)過活性碳脫色、離子交換除雜、真空濃縮步驟，得到低聚木糖糖漿。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于步驟2)所述玉米芯粉汽爆處理條件為所述玉米芯粉與水重量比為1∶8；蒸汽溫度為165℃；反應(yīng)時間為90min。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于步驟3)所述固定化酶水解條件為所述夾套溫度為55℃；汽爆液pH為5.8；汽爆液流速為1.5倍床體積/h。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)低聚木糖的方法及其專用固定化木聚糖酶。本發(fā)明所提供的固定化木聚糖酶，是用以下工藝生產(chǎn)的按酶與載體Eupergit C比為100～500U/g載體的比例將木聚糖酶液加入到濃度為0.2～1.2mol/L、pH 4.3～7.8的磷酸鹽緩沖溶液中，攪拌均勻后加入Eupergit C，4～25℃下固定12～60h，經(jīng)過濾、洗滌得到固定化木聚糖酶。利用該固定化酶生產(chǎn)低聚木糖的方法包括1)玉米芯粉汽爆處理；2)固定化酶水解。本發(fā)明采用固定化酶連續(xù)生產(chǎn)低聚木糖，酶利用效率高，操作簡便；以玉米芯等農(nóng)業(yè)廢棄物為原料，生產(chǎn)成本低。本發(fā)明不僅具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益，而且可解決農(nóng)產(chǎn)品增值和農(nóng)業(yè)廢棄物污染問題，具有極高的社會效益。
文檔編號C12N1/20GK1584026SQ20041004612
公開日2005年2月23日 申請日期2004年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月1日
發(fā)明者李里特, 江正強(qiáng), 艾志錄, 日下部功 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)