專利名稱：靈芝菌絲體三萜類物質(zhì)提取工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種工業(yè)化的靈芝菌絲體三萜類物質(zhì)提取工藝。
背景技術：
靈芝[(Ganoderma lucidum(Fr.)Karst]又稱為瑞草、靈芝草，其英文名稱為Reishi mushroom。按照Ainsworth1973的真菌分類系統(tǒng)，靈芝隸屬于擔子菌亞門(Basidiomycotina)、層菌綱(Hymenomycetes)、無隔擔子菌亞綱(Holobasidiomycetidae)、非褶菌目(Aphyllophorales)或者多孔菌目(Polyporales)、靈芝菌科(Ganodermataceae)、靈芝屬(Ganoderma)。
靈芝在我國有悠久的藥用歷史，據(jù)古書記載，我國對靈芝的認識和利用，應始于堯(公元前2100年)，距今至少有4000年的歷史。早在《列子篇》(公元前1100年)中已有“朽壤之上有菌芝者的記載”，而我國最早的藥學專著，東漢時期成書的《神農(nóng)本草經(jīng)》將靈芝列為上品，認為它可以“補肝氣，安精魂，堅筋骨”，并認為靈芝有六種，分別具有不同的醫(yī)療功能。在明代李時珍的《本草綱目》中記載靈芝“乃腐朽余氣所生”，“久食輕身不老，延年若神仙”。
三萜類化合物是靈芝的主要化學成分之一，自1982年Kubota等首次從赤芝子實體中分離得到三萜類化合物靈芝酸A和B以米，有關靈芝三萜類化合物的研究倍受矚目，其中對此研究最多的是日本，其次是中國(包括臺灣)。到目前為止，已先后從赤芝子實體和孢子粉中分離得到了100多種新的三萜類化學成分。靈芝中的很多三萜化合物都具有一定的生理活性，其主要藥理作用為抗腫瘤、抗病毒、保肝以及降壓作用。
靈芝野生資源較少，目前主要通過人工栽培獲得，但人工栽培具有周期長、占地面積大、產(chǎn)量及質(zhì)量均不穩(wěn)定等缺點。而且栽培的子實體由于木質(zhì)化三萜含量很低。菌絲體發(fā)酵則周期較短、產(chǎn)量高且質(zhì)量穩(wěn)定，適合工業(yè)化生產(chǎn)。查閱現(xiàn)有的文獻，靈芝的深層發(fā)酵目前的規(guī)模只限于20噸規(guī)模以下。影響發(fā)酵規(guī)模的因素主要是菌種的發(fā)酵能力以及發(fā)酵的配方和工藝條件。三萜是靈芝中的重要的有效成分，目前的學術研究主要集中在子實體或孢子三萜的提取和藥理作用方面，菌絲體的三萜提取工藝相關的報道很少。文獻中報道的相關提取工藝主要是利用甲醇、氯仿和乙醚等有毒性的有機溶劑，使得這類工藝的工業(yè)化前景受到一定影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過對靈芝菌種的改良以及發(fā)酵工藝的研究和提取工藝的優(yōu)化，建立了一種工業(yè)化的靈芝菌絲體三萜類物質(zhì)提取工藝，從而解決了已有技術存在的各種問題。
靈芝菌絲體三萜類物質(zhì)提取工藝主要包括以下步驟(1)將制備的靈芝原生質(zhì)體與亞硝基胍混合后震蕩40～60分鐘后離心，接入發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)8天左右，進行搖瓶培養(yǎng)篩選，篩選發(fā)酵產(chǎn)率和三萜類物質(zhì)含量高的菌種作為生產(chǎn)菌種。
(2)將搖瓶培養(yǎng)的靈芝生產(chǎn)菌種接入500L的一級種子罐，保持罐溫20～22℃，罐壓20～30kPa，攪拌速率60～80r/min，通氣量1∶0.2～0.3，培養(yǎng)90～100小時；(3)將種子罐菌種轉(zhuǎn)接到5噸罐中，保持罐溫20～22℃，罐壓20～30kPa，攪拌速率60～80r/min，通氣量1∶0.3～0.4，培養(yǎng)90～100小時；(4)將二級種子罐中菌種轉(zhuǎn)接到50噸發(fā)酵罐中，保持罐溫20～22℃，罐壓30～40kPa，攪拌速率60～80r/min，通氣量為1∶0.4～0.5，培養(yǎng)72～80小時，然后將發(fā)酵罐溫度降低到17～19℃，繼續(xù)培養(yǎng)24小時左右。然后將發(fā)酵液用板框壓濾機壓濾，得濕菌絲體。放罐標準為PH值降至3.0～3.5左右，取一定量的發(fā)酵液進行離心，菌絲體體積比含量達到30～40％。
(5)將1噸靈芝濕菌絲體加入5～6噸95％食用酒精回流提取兩次，每次2～3個小時，合并兩次的溶劑，總體積為10～12噸左右，然后在酒精濃縮罐中50～55℃減壓濃縮至體積為1～1.2噸左右。濃縮液加入2～3噸飽和的碳酸氫鈉溶液進行萃取，萃取液在0～5℃條件下加入磷酸，將pH值調(diào)至4左右，過濾分離沉淀，沉淀中加入400～600公斤食用酒精回流提取1～2小時，提取液進行真空干燥，得到靈芝菌絲體三萜提取物。
所用的靈芝原生質(zhì)體制備條件是3％～4％的溶壁酶5毫升與一克靈芝濕菌絲體混合后，在30～35℃水浴中反應3～4小時。
誘變劑為亞硝基胍，濃度為0.3～0.5毫克/毫升。
發(fā)酵培養(yǎng)基的成份及配比為麩皮2％～3％，蛋白胨1％～2％，葡萄糖0.3％～0.5％，蔗糖1％～2％，硫酸鎂0.03％～0.05％，磷酸二氫鉀0.1％～0.15％，維生素B1為100～150ppm，PH值為5.0～5.5。
本發(fā)明的工藝適用于各種靈芝菌種。通過該工藝改良的菌種三萜含量較高、發(fā)酵生產(chǎn)的規(guī)模高于現(xiàn)有的生產(chǎn)技術，而且采用的發(fā)酵工藝有利于靈芝三萜類物質(zhì)的合成和積累，在提取工藝方面利用食用級的提取溶劑，使生產(chǎn)過程和產(chǎn)成品的安全性有了很大的提高。本發(fā)明工藝的靈芝菌絲干粉得率達0.8％～1.2％，每百克菌絲干粉的三萜類物質(zhì)含量達到5～7克，提取后的三萜類物質(zhì)含量＞25％。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發(fā)明作進一步說明。
實施例1將3.5％的溶壁酶5毫升與一克靈芝濕菌絲體混合后，在32℃水浴中反應3小時。過濾除去雜質(zhì)后加入亞硝基胍，濃度為0.4毫克/毫升。將靈芝原生質(zhì)體與亞硝基胍混合后震蕩45分鐘后離心，接入發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)8天左右，進行搖瓶培養(yǎng)篩選，篩選發(fā)酵產(chǎn)率和三萜類物質(zhì)含量高的菌種作為生產(chǎn)菌種。經(jīng)過初篩和精篩，篩選了一株搖瓶發(fā)酵產(chǎn)率達到1.8％三萜含量為5.6％的菌株。將搖瓶培養(yǎng)的靈芝生產(chǎn)菌種接入500L的一級種子耀，發(fā)酵培養(yǎng)基的成份及配比為麩皮2％，蛋白胨1％，葡萄糖0.3％，蔗糖2％，硫酸鎂0.05％，磷酸二氫鉀0.15％，維生素B1為150ppm，PH值為5。保持罐溫22℃，罐壓26kPa，攪拌速率70r/min，通氣量1∶0.25，培養(yǎng)96小時后將種子罐菌種轉(zhuǎn)接到5噸罐中，保持罐溫22℃，罐壓30kPa，攪拌速率70r/min，通氣量1∶0.35，培養(yǎng)92小時；將二級種子罐中菌種轉(zhuǎn)接到50噸發(fā)酵罐中，保持罐溫22℃，罐壓40kPa，攪拌速率70r/min，通氣量為1∶0.4，培養(yǎng)72小時，然后將發(fā)酵罐溫度降低到18℃，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。然后將發(fā)酵液用板框壓濾機壓濾，得濕菌絲體。將濕菌絲體干燥后測定得率，干粉得率為1.06％，利用分光光度方法測定三萜含量為5.8％。將1噸靈芝濕菌絲體加入6噸95％食用酒精回流提取兩次，每次2.7個小時，合并兩次的溶劑，總體積為12噸左右，然后在酒精濃縮罐中52℃減壓濃縮至體積為1.2噸左右。濃縮液加入2.5噸飽和的碳酸氫鈉溶液進行萃取，萃取液在0℃條件下加入磷酸，將pH值調(diào)至4左右，過濾分離沉淀，沉淀中加入600公斤食用酒精回流提取1.5小時，提取液進行真空干燥，得到靈芝菌絲體三萜提取物。利用分光光度方法測定三萜含量為29.4％。
實施例2將3.5％的溶壁酶5毫升與一克靈芝濕菌絲體混合后，在32℃水浴中反應3小時。過濾除去雜質(zhì)后加入亞硝基胍，濃度為0.4毫克/毫升。將靈芝原生質(zhì)體與亞硝基胍混合后震蕩45分鐘后離心，接入發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)8天左右，進行搖瓶培養(yǎng)篩選，篩選發(fā)酵產(chǎn)率和三萜類物質(zhì)含量高的菌種作為生產(chǎn)菌種。經(jīng)過初篩和精篩，篩選了一株搖瓶發(fā)酵產(chǎn)率達到1.8％三萜含量為5.6％的菌株。將搖瓶培養(yǎng)的靈芝生產(chǎn)菌種接入500L的一級種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基的成份及配比為麩皮2.6％，蛋白胨1.7％，葡萄糖0.36％，蔗糖1.5％，硫酸鎂0.04％，磷酸二氫鉀0.13％，維生素B1為120ppm，PH值為5.4。保持罐溫21℃，罐壓30kPa，攪拌速率80r/min，通氣量1∶0.3，培養(yǎng)98小時后將種子罐菌種轉(zhuǎn)接到5噸罐中，保持罐溫21℃，罐壓28kPa，攪拌速率80r/min，通氣量1∶0.39，培養(yǎng)97小時；將二級種子罐中菌種轉(zhuǎn)接到50噸發(fā)酵罐中，保持罐溫21℃，罐壓35kPa，攪拌速率80r/min，通氣量為1∶0.3，培養(yǎng)78小時，然后將發(fā)酵罐溫度降低到17℃，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。然后將發(fā)酵液用板框壓濾機壓濾，得濕菌絲體。將濕菌絲體干燥后測定得率，干粉得率為1.18％，利用分光光度方法測定三萜含量為6.7％。將1噸靈芝濕菌絲體加入6噸95％食用酒精回流提取兩次，每次2.7個小時，合并兩次的溶劑，總體積為12噸左右，然后在酒精濃縮罐中52℃減壓濃縮至體積為1.2噸左右。濃縮液加入2.5噸飽和的碳酸氫鈉溶液進行萃取，萃取液在0℃條件下加入磷酸，將pH值調(diào)至4左右，過濾分離沉淀，沉淀中加入600公斤食用酒精回流提取1.5小時，提取液進行真空干燥，得到靈芝菌絲體三萜提取物。利用分光光度方法測定三萜含量為29.4％。
權利要求
1.一種靈芝菌絲體三萜類物質(zhì)提取工藝，其特征是包括以下步驟(1)將制備的靈芝原生質(zhì)體與亞硝基胍混合后震蕩40～60分鐘后離心，接入發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)8天，進行搖瓶培養(yǎng)篩選，篩選發(fā)酵產(chǎn)率和三萜類物質(zhì)含量高的菌種作為生產(chǎn)菌種；(2)將搖瓶培養(yǎng)的靈芝生產(chǎn)菌種接入500L的一級種子罐，保持罐溫20～22℃，罐壓20～30kPa，攪拌速率60～80r/min，通氣量1∶0.2～0.3，培養(yǎng)90～100小時；(3)將種子罐菌種轉(zhuǎn)接到5噸罐中，保持罐溫20～22℃，罐壓20～30kPa，攪拌速率60～80r/min，通氣量1∶0.3～0.4，培養(yǎng)90～100小時；(4)將二級種子罐中菌種轉(zhuǎn)接到50噸發(fā)酵罐中，保持罐溫20～22℃，罐壓30～40kPa，攪拌速率60～80r/min，通氣量為1∶0.4～0.5，培養(yǎng)72～80小時，然后將發(fā)酵罐溫度降低到17～19℃，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，然后將發(fā)酵液用板框壓濾機壓濾，得濕菌絲體；(5)將1噸靈芝濕菌絲體加入5～6噸95％食用酒精回流提取兩次，每次2～3個小時，合并兩次的溶劑，總體積為10～12噸，然后在酒精濃縮罐中50～55℃減壓濃縮至體積為1～1.2噸，濃縮液加入2～3噸飽和的碳酸氫鈉溶液進行萃取，萃取液在0～5℃條件下加入磷酸，將pH值調(diào)至4，過濾分離沉淀，沉淀中加入400～600公斤食用酒精回流提取1～2小時，提取液進行真空干燥，得到靈芝菌絲體三萜提取物。
2.根據(jù)權利要求1所述的靈芝菌絲體三萜類物質(zhì)提取工藝，其特征是所用的靈芝原生質(zhì)體制備條件是3％～4％的溶壁酶5毫升與一克靈芝濕菌絲體混合后，在30～35℃水浴中反應3～4小時。
3.根據(jù)權利要求1所述的靈芝菌絲體三萜類物質(zhì)提取工藝，其特征是所用的誘變劑為亞硝基胍，濃度為0.3～0.5毫克/毫升。
4.根據(jù)權利要求1所述的靈芝菌絲體三萜類物質(zhì)提取工藝，其特征是所用的發(fā)酵培養(yǎng)基的成份及配比為麩皮2％～3％，蛋白胨1％～2％，葡萄糖0.3％～0.5％，蔗糖1％～2％，硫酸鎂0.03％～0.05％，磷酸二氫鉀0.1％～0.15％，維生素B1為100～150ppm，PH值為5.0～5.5。
全文摘要
一種工業(yè)化的靈芝菌絲體三萜類物質(zhì)提取工藝，通過對靈芝菌種的改良、發(fā)酵工藝的步驟、參數(shù)和培養(yǎng)基配方的改進以及三萜類物質(zhì)提取工藝的改進，成功地建立了工業(yè)化規(guī)模的靈芝菌絲體三萜類物質(zhì)提取工藝。通過該工藝改良的菌種三萜含量較高、發(fā)酵生產(chǎn)的規(guī)模高于現(xiàn)有的生產(chǎn)技術，而且采用的發(fā)酵工藝有利于靈芝三萜類物質(zhì)的合成和積累，在提取工藝方面利用食用級的提取溶劑，使生產(chǎn)過程和產(chǎn)成品的安全性有了很大的提高。本發(fā)明工藝的靈芝菌絲干粉得率達0.8％～1.2％，每百克菌絲干粉的三萜類物質(zhì)含量達到5～7克，提取后的三萜類物質(zhì)含量＞25％。
文檔編號C12P33/00GK1563408SQ20041001302
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月13日 優(yōu)先權日2004年4月13日
發(fā)明者徐志祥 申請人:徐志祥