專利名稱：一種選育甘藍(lán)型油菜顯性細(xì)胞核雄性不育純合兩用系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物新品種選育的方法，具體涉及到一種選育甘藍(lán)型油菜顯性細(xì)胞核雄性不育純合兩用系的方法。
背景技術(shù)：
顯性細(xì)胞核雄性不育是油菜雜種優(yōu)勢育種的一條重要途徑，它具有雄性不育性穩(wěn)定、種子生產(chǎn)風(fēng)險小等優(yōu)點。但其缺點是其不育系中有50％的可育株，在雜交種子生產(chǎn)過程中，需要人工于開花前將這50％的可育株拔除，從而增加種子生產(chǎn)成本，若拔除不徹底，還會影響種子純度。為了克服這一缺點，上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種栽培研究所李樹林等人發(fā)明了甘藍(lán)型油菜細(xì)胞核雄性不育三系育種及制種技術(shù)(專利號ZL89109310.9)，該發(fā)明根據(jù)甘藍(lán)型油菜顯性細(xì)胞核雄性不育是由Ms和Rf兩對顯性上位、抑制互作的遺傳學(xué)原理，采用純合型兩用系、臨保系和恢復(fù)系三系配套的方法來生產(chǎn)雜交種子。該專利技術(shù)的核心技術(shù)是純合型兩用系(基因型為1/2MsMsRfrf+1/2MsMsrfrf)的選育。在傳統(tǒng)的育種方法中，當(dāng)用純合型不育系與其它具有優(yōu)良性狀的供體親本雜交，來改良純合型不育兩用系時，其雜交后代的基因型比較復(fù)雜，從表現(xiàn)型上很難區(qū)別其基因型，選擇難度大。因此，用傳統(tǒng)育種方法改良現(xiàn)有油菜純合型兩用系十分困難。這就是為什么自該專利技術(shù)公開以來，我國乃至世界上還沒有利用該體系生產(chǎn)雜交種子的主要原因之一。
近年來，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展及其輔助選擇技術(shù)的成熟，為解決上述問題提供了可能。所謂分子標(biāo)記輔助選擇，就是借助與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記基因型的分析，鑒定分離出群體中含有目標(biāo)等位基因的個體，從而加速育種進程。但到目前為止，還沒有人將分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)運用于油菜顯性細(xì)胞核雄性不育純合型兩用系的選育。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種有效、可靠的分子標(biāo)記輔助選育甘藍(lán)型油菜顯性細(xì)胞核雄性不育純合兩用系的方法，以提高甘藍(lán)型油菜顯性細(xì)胞核雄性不育純合兩用系的育種效率。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)一種選育甘藍(lán)型油菜顯性細(xì)胞核雄性不育純合兩用系的方法，其步驟包括雜交、回交、自交、育性鑒定和分子標(biāo)記檢測的方法，其特征在于，采用一次雜交、二次回交和一次自交的育種程序，將目標(biāo)基因Ms和Rf同時導(dǎo)入到不同的甘藍(lán)型油菜品種或品系中，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測并選擇與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記基因型，使含有目標(biāo)基因的導(dǎo)入片斷盡可能小，應(yīng)用擴增片斷長度多態(tài)性(AFLP)標(biāo)記、微衛(wèi)星(SSR)標(biāo)記對遺傳背景實施選擇，使除開目標(biāo)基因區(qū)段之外，新選育的純合型不育兩用系與被導(dǎo)入的甘藍(lán)型油菜品種或品系相同，并對選育的純合型不育兩用系進行育性鑒定、繁殖和雜種生產(chǎn)。
本發(fā)明的具體步驟如下列步驟所述一種選育甘藍(lán)型油菜顯性細(xì)胞核雄性不育純合兩用系的方法如下A、以純合兩用系中的可育株或同時含有顯性不育基因Ms和恢復(fù)基因Rf的品系為供體親本，以具有優(yōu)良性狀的品系或材料為輪回親本雜交，所得雜種一代(F1)再與輪回親本回交，得到回交一代，代號為為BC1F1；B、對BC1F1單株進行育性鑒定，并對可育株進行PCR檢測，選出同時含有Ms和Rf基因者進行AFLP篩選，選出輪回親本遺傳背景最多的單株再與輪回親本回交，得到回交二代，代號為BC2F1；C、對BC2F1單株進行育性鑒定，并對可育株進行PCR檢測，選出同時含有Ms和Rf基因者進行AFLP篩選，選出輪回親本遺傳背景最多的單株自交，得到回交二代的F2代，代號為BC2F2；D、對BC2F2單株進行育性鑒定，并對所有單株進行PCR檢測，選擇出基因型分別為MsMsrfrf和MsMsRfrf且輪回親本遺傳背景最多的單株進行相互雜交，其雜交后代即為純合型不育兩用系。
在本發(fā)明中，所述PCR檢測方法包括A、PCR反應(yīng)體系為，各待檢測單株的DNA各30-50ng，依據(jù)與目標(biāo)基因共分離或緊密連鎖的分子標(biāo)記設(shè)計的特異正向引物和反向引物各0.15uM，Taq DNA聚合酶1U，四種脫氧核糖核苷酸dATP，dTTP，dGTP和dCTP各0.1mM，Tris-HCl(pH8.3)和KCl各10mM，以及MgCl2各2mM，PCR反應(yīng)體積為15ul；B、PCR循環(huán)程序為，首先在94℃變性5分鐘，然后在94℃變性45秒，55-58℃退火0.5-1分鐘，72℃延伸1分鐘，運行30個循環(huán)，最后在72℃延伸8-10分鐘；C、PCR產(chǎn)物的檢測為，在1％-1.4％的瓊脂糖凝膠上點樣，在80-120伏直流電壓下電泳3-4小時，進行溴化乙啶染色，置于紫外光下讀取各樣品的PCR帶型，確定各樣品的分子標(biāo)記基因型。
在本發(fā)明中，所述運用AFLP篩選遺傳背景的方法包括A、在37℃對各待測單株的DNA進行限制性內(nèi)切酶MseI和EcoRI雙酶消化5小時后，再在65℃滅活30-45分鐘，然后加入T4 DNA連接酶在22℃連接4小時或室溫過夜；B、取酶切連接產(chǎn)物加入EcoRI+1引物和MseI+1引物以及Taq DNA聚合酶在56℃的退火溫度下進行預(yù)擴增；
C、取預(yù)擴增產(chǎn)物加入EcoRI+3引物和Mse1+3引物以及Taq DNA聚合酶，在65℃向56℃遞減的退火溫度下進行選擇性擴增；D、加入預(yù)擴增產(chǎn)物、EcoRI+3引物、MseI+3引物以及Taq DNA聚合酶，在65℃的退火溫度下進行選擇性擴增；E、PCR產(chǎn)物在6-8％的聚丙烯酰胺凝膠上點樣，在70瓦功率下電泳2.5-3.5小時分離PCR產(chǎn)物；F、電泳完畢取下膠板按銀染程序進行染色與顯影；G、讀取各樣品的AFLP帶型，計算各樣品恢復(fù)輪回親本基因型的比率。
所述育性鑒定方法為，于油菜花期檢查花藥發(fā)育情況，凡花藥干癟者為雄性不育，花藥發(fā)育正常為雄性可育，以此作為育性鑒定的指標(biāo)。
所述甘藍(lán)型油菜顯性細(xì)胞核純合兩用系的繁殖方法包括A、將純合型兩用系種植于人工隔離或天然屏障隔離條件下，種子成熟時于不育株上收獲種子；B、將收獲的純合型兩用系種子與臨保系種子按2∶1或3∶1或4∶1或5∶1或6∶1行比種植于人工隔離或天然屏障隔離條件下，開花期從純合型兩用系中拔除約50％的可育株，種子成熟時于不育株上收獲種子，繁殖出大田制種親本不育系種子。
所述純合型不育系的雜種生產(chǎn)方法是將繁殖的大田制種親本不育系與恢復(fù)系按2∶1或3∶1或4∶1或5∶1行比種植于人工隔離或天然屏障隔離條件下，種子成熟時于不育系上收獲種子，即為純合型不育系的雜種種子。
本發(fā)明的優(yōu)點在于1、通過對與目標(biāo)基因共分離和緊密連鎖分子標(biāo)記基因型的PCR分析和選擇，有效地解決了油菜常規(guī)回交育種中長期存在的連鎖累贅問題，即由于不利基因與目標(biāo)基因緊密連鎖致使所得改良體與預(yù)期的目標(biāo)不盡一致的現(xiàn)象；2、通過運用AFLP技術(shù)對各回交后代個體基因組的背景選擇，有效地解決了油菜常規(guī)回交育種中輪回親本基因型恢復(fù)的偏離問題，使得在改良目標(biāo)性狀的同時，原輪回親本所特有的高配合力、強適應(yīng)性等優(yōu)良性狀得以保持，因而改良體可以替代原輪回親本直接用于雜種生產(chǎn)；3、分子標(biāo)記技術(shù)的運用，使得油菜回交育種的周期縮短，育種進程加快，適應(yīng)了雜交育種的需要。
具體實施例方式
實施例1甘藍(lán)型油菜顯性細(xì)胞核雄性不育純合兩用系代號為195AB的選育a.以純合兩用系中的可育株為顯性不育基因Ms和恢復(fù)基因Rf的品系為供體親本，以優(yōu)良品系195A為輪回親本(油菜195A已于2003年9月5日公開銷售)雜交，所得雜種一代(F1)再與輪回親本回交，得到回交一代，代號為BC1F1；b.對320株BC1F1單株進行育性鑒定，并對其中175株可育株進行PCR檢測，選出同時含有Ms和Rf基因者進行AFLP篩選，選出輪回親本遺傳背景最多的3個單株再與輪回親本195A回交，得到回交二代，代號為BC2F1；c.對其中一個BC2F1群體260個單株進行育性鑒定，并對其中136個可育行PCR檢測，選出同時含有Ms和Rf基因者進行AFLP篩選，選出輪回親本195A遺傳背景最多的3個單株自交，得到BC2F2代；d.對150個BC2F2單株進行育性鑒定，并對所有單株進行PCR檢測，選擇出基因型分別為MsMsrfrf和MsMsRfrf且輪回親本195A遺傳背景最多的一對單株進行相互雜交，其雜交后代即為純合型不育兩用系195AB。
說明在本實施例中，所述的PCR、AFLP、SSR操作、田間試驗選擇的具體操作按照本說明書的《發(fā)明內(nèi)容》所示步驟和標(biāo)準(zhǔn)實施。
權(quán)利要求
1.一種選育甘藍(lán)型油菜顯性細(xì)胞核雄性不育純合兩用系的方法，其步驟包括雜交、回交、自交、育性鑒定，其特征在于，采用一次雜交、二次回交和一次自交的育種程序，將目標(biāo)基因Ms和Rf同時導(dǎo)入到不同的甘藍(lán)型油菜品種或品系中，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測并選擇與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記基因型，使含有目標(biāo)基因的導(dǎo)入片斷盡可能小，應(yīng)用擴增片斷長度多態(tài)性(AFLP)標(biāo)記、微衛(wèi)星(SSR)標(biāo)記對遺傳背景實施選擇，使除開目標(biāo)基因區(qū)段之外，新選育的純合型不育兩用系與被導(dǎo)入的甘藍(lán)型油菜品種或品系相同，并對選育的純合型不育兩用系進行育性鑒定、繁殖和雜種生產(chǎn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述選育甘藍(lán)型油菜顯性細(xì)胞核雄性不育純合兩用系的方法采用如下步驟A、以純合兩用系中的可育株或同時含有顯性不育基因Ms和恢復(fù)基因Rf的品系為供體親本，以具有優(yōu)良性狀的品系或材料為輪回親本雜交，所得雜種一代(F1)再與輪回親本回交，得到回交一代，代號為為BC1F1；B、對BC1F1單株進行育性鑒定，并對可育株進行PCR檢測，選出同時含有Ms和Rf基因者進行AFLP篩選，選出輪回親本遺傳背景最多的單株再與輪回親本回交，得到回交二代，代號為BC2F1；C、對BC2F1單株進行育性鑒定，并對可育株進行PCR檢測，選出同時含有Ms和Rf基因者進行AFLP篩選，選出輪回親本遺傳背景最多的單株自交，得到回交二代的F2代，代號為BC2F2；D、對BC2F2單株進行育性鑒定，并對所有單株進行PCR檢測，選擇出基因型分別為MsMsrfrf和MsMsRfrf且輪回親本遺傳背景最多的單株進行相互雜交，其雜交后代即為純合型不育兩用系。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述PCR檢測方法包括A、PCR反應(yīng)體系為，各待檢測單株的DNA各30-50ng，依據(jù)與目標(biāo)基因共分離或緊密連鎖的分子標(biāo)記設(shè)計的特異正向引物和反向引物各0.15uM，Taq DNA聚合酶1U，四種脫氧核糖核苷酸dATP，dTTP，dGTP和dCTP各0.1mM，Tris-HCl(pH8.3)和KCl各10mM，以及MgCl2各2mM，PCR反應(yīng)體積為15ul；B、PCR循環(huán)程序為，首先在94℃變性5分鐘，然后在94℃變性45秒，55-58℃退火0.5-1分鐘，72℃延伸1分鐘，運行30個循環(huán)，最后在72℃延伸8-10分鐘；C、PCR產(chǎn)物的檢測為，在1％-1.4％的瓊脂糖凝膠上點樣，在80-120伏直流電壓下電泳3-4小時，進行溴化乙啶染色，置于紫外光下讀取各樣品的PCR帶型，確定各樣品的分子標(biāo)記基因型。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述方法，其特征在于，所述運用AFLP篩選遺傳背景的方法包括；A、在37℃對各待測單株的DNA進行限制性內(nèi)切酶MseI和EcoRI雙酶消化5小時后，再在65℃滅活30-45分鐘，然后加入T4 DNA連接酶在22℃連接4小時或室溫過夜；B、取酶切連接產(chǎn)物加入EcoRI+1引物和MseI+1引物以及Taq DNA聚合酶在56℃的退火溫度下進行預(yù)擴增；C、取預(yù)擴增產(chǎn)物加入EcoRI+3引物和MseI+3引物以及Taq DNA聚合酶，在65℃向56℃遞減的退火溫度下進行選擇性擴增；D、加入預(yù)擴增產(chǎn)物、EcoRI+3引物、MseI+3引物以及Taq DNA聚合酶，在65℃的退火溫度下進行選擇性擴增；E、PCR產(chǎn)物在6-8％的聚丙烯酰胺凝膠上點樣，在70瓦功率下電泳2.5-3.5小時分離PCR產(chǎn)物；F、電泳完畢取下膠板按銀染程序進行染色與顯影；G、讀取各樣品的AFLP帶型，計算各樣品恢復(fù)輪回親本基因型的比率。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述甘藍(lán)型油菜顯性細(xì)胞核純合兩用系的繁殖方法包括A、將純合型兩用系種植于人工隔離或天然屏障隔離條件下，種子成熟時于不育株上收獲種子；B、將收獲的純合型兩用系種子與臨保系種子按2∶1、3∶1、4∶1、5∶1或6∶1行比種植于人工隔離或天然屏障隔離條件下，開花期從純合型兩用系中拔除約50％的可育株，種子成熟時于不育株上收獲種子，繁殖出大田制種親本不育系種子。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述純合型不育系的雜種生產(chǎn)方法是將繁殖的大田制種親本不育系與恢復(fù)系按2∶1或3∶1或4∶1或5∶1行比種植于人工隔離或天然屏障隔離條件下，種子成熟時于不育系上收獲種子，即為純合型不育系的雜種種子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種選育甘藍(lán)型油菜顯性細(xì)胞核雄性不育純合兩用系的方法，屬于植物新品種選育的技術(shù)領(lǐng)域。其特征在于，采用一次雜交、二次回交和一次自交的育種程序，將目標(biāo)基因Ms和Rf同時導(dǎo)入到不同的甘藍(lán)型油菜品種或品系中，采用PCR檢測并選擇與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記基因型，使含有目標(biāo)基因的導(dǎo)入片斷盡可能小，應(yīng)用AFLP標(biāo)記、SSR標(biāo)記對遺傳背景實施選擇，使除開目標(biāo)基因區(qū)段之外，新選育的純合型不育兩用系與被導(dǎo)入的甘藍(lán)型油菜品種或品系相同，并對選育的純合型不育兩用系進行育性鑒定、繁殖和雜種生產(chǎn)。與已有技術(shù)相比，本發(fā)明顯著地提高了甘藍(lán)型油菜顯性細(xì)胞核雄性不育純合兩用系的選育效率，同時降低了育種風(fēng)險。
文檔編號C12N15/82GK1559187SQ20041001282
公開日2005年1月5日 申請日期2004年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月9日
發(fā)明者楊光圣, 陸光遠(yuǎn), 洪登峰, 劉平武 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)