專利名稱：用于在植物細胞中表達dna序列的人工啟動子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，更具體而言涉及植物基因工程。具體地本發(fā)明提供了嵌合DNA構(gòu)建體，與其融合的任何核苷酸序列在雙子葉和單子葉植物細胞中均顯示高轉(zhuǎn)錄/翻譯活性，可以獲得目的基因和DNA序列較高表達水平的轉(zhuǎn)基因植物。
現(xiàn)有技術(shù)已證明植物基因工程是在新生物技術(shù)產(chǎn)品的基礎(chǔ)研究和商業(yè)化生產(chǎn)中具有極大價值的技術(shù)(Hammond J.Curr.Top.Microbiol.Immunol 1999，2401-19；Simoens C.和Van Montagu M.ReproductionUpdate 1995，1523-542)。
選擇啟動子信號，確保通過分子生物學技術(shù)的遺傳操作而引入植物的基因或DNA序列以足夠強度及時間或空間特異性表達，對于成功進行植物基因工程極其重要。這就是為什么在過去二十年間，大量努力致力于探求能夠確保所需每一轉(zhuǎn)基因表達的啟動子和信號。為此，評價了不同來源(植物、病毒、Ti或Ri土壤農(nóng)桿菌或嵌合)啟動子并用于轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)。
廣泛用于植物遺傳操作的組成型啟動子有花椰菜花葉病毒(caMV)35S ARN啟動子(Odell J.T；Nagy F；Chua N.H.Na ture 1985，313810-812)；來自根瘤土壤桿菌Ti質(zhì)粒的胭脂氨酸合成酶基因(nos)啟動子(An G；Costa M.A；Mitra A；Ha S；Marton L.Plant Phisiol.1986，88547-552)，稻肌動蛋白-1基因啟動子(McElroy D；Zhang W；Cao J；Wu R.Plant Cell 1990，2163-171)以及玉米遍在蛋白-1基因啟動子(Christensen A.H；Sharrock R.A；Quail P.H.Plant Mo1.Biol.1992，18675-689)。然而，這些天然表達系統(tǒng)均有局限，主要因其不能在任意種類植物中達到足夠高的表達水平；例如，啟動子表達水平在雙子葉植物細胞中低，而在單子葉植物幾乎檢測不到，最廣泛使用的啟動子CaMV 35S在煙草細胞中更強于單子葉植物(Topfer R；Maas C；Horicke-Grandpierre C；Schell J；Steinbiss H.H.MethodsEnzymol.1993，21767-78；Mitsuhara I；Ugaki M；Hirochika H；Ohshima M；Murakami T；Gotoh Y等人Plant Cell Physiol.1996，3749-59)。類似地，稻肌動蛋白-1和玉米遍在蛋白-1啟動子在單子葉植物細胞中極有效促進其下游基因的轉(zhuǎn)錄，但其啟動子活性在煙草細胞中很低(Schledzewski K；Mendel R.R.Transgenic Research1994，3249-255)。
為提高轉(zhuǎn)基因植物中異源蛋白質(zhì)表達水平，設(shè)計了多種天然啟動子與轉(zhuǎn)錄或翻譯增強子相結(jié)合的嵌合啟動子。在這些增強子元件中，我們可以提及煙草花葉病毒(TMV)的ω翻譯增強子(Gallie D.R；SleatD.E；Watts J.W；Turner P.C；Wilson T.M.A.Nucleic Acids Res.1987，153257-3273)、煙草蝕紋病毒(TEV)翻譯增強子(CarringtonJ.C；Freed D.D.J.Virol.1990，641590-1597)、章魚氨酸合酶(Fromm H；Katagiri F；Chua N.H.Plant Cell 1989，1977-984)、甘露氨酸合酶(Comai L；Moran P；Maslyar D.Plant Mol Biol.1990，15373-381)的啟動子轉(zhuǎn)錄增強子和CaMV 35S啟動子(Kay R；Chan A；Daly M；McPherson J.Science 1987，2361299-1302)；以及天然外顯子和內(nèi)含子，例如玉米乙醇脫氫酶內(nèi)含子1(Callis J；Fromm M；Walbot V.Genes Devel.1987，11183-1200；Last D.I；BrettellR.I.S；Chamberlaine D.A；Chaudhury A.M；Larkin P.J等人TheorAppl.Gen.1991，81581-588)、玉米蔗糖合酶的第一外顯子/內(nèi)含子(Maas C；Laufs J；Grant S；Korfhage C；Werr W.Plant Mol.Biol.1991，16199-207)、稻肌動蛋白-1基因的第一外顯子/內(nèi)含子(McElroy D；Blowers A.D；Jenes B；Wu R.Mol.Gen.Genet.1991，231150-160)等。這樣得到象2×35S、Mac、Emu等(EP0459643；EP0651812)主要在特定種類的雙子葉或單子葉植物細胞中的強啟動子。(Schledzewski K；Mendel R.R.Transgenic Research 1994，3249-255)。
開發(fā)可用于在雙子葉和單子葉植物細胞中表達基因的強啟動子一直是很多實驗室的相關(guān)課題，不僅因其所代表的科學挑戰(zhàn)或擁有可轉(zhuǎn)化不同種類植物的獨特的遺傳構(gòu)建體所帶來的便利，而且為了擁有更易于生物技術(shù)產(chǎn)品生產(chǎn)和商品化的自己的表達系統(tǒng)。專利申請WO9943838所要求的合成啟動子要求一條從TATA盒直到轉(zhuǎn)錄起始位點的序列，GC含量較高(64％或更高)，其5’端融合了來自35S、玉米遍在蛋白-1以及章魚氨酸合酶啟動子的轉(zhuǎn)錄增強子。另一方面，為了尋找不僅在雙子葉和單子葉植物中表達、也可避免序列同源性依賴性基因沉默(Park Y.D；Papp I；Moscone E；Iglesias V；Vaucheret H；Matzke A；Matzke M.A.Plant J.1996，9183-194)，專利申請WO0058485要求來源于兩種植物病毒基因組鴨跖草黃斑駁病毒(Commelina Yellow Mottle Virus，CoYMV)和木薯葉脈花葉病毒(Cassava Vein Mossaic Virus，CsVMV)的序列組合以及35S啟動子增強子序列的人工啟動子。
可使不同遺傳元件增強核苷酸序列轉(zhuǎn)錄或翻譯的機理尚不清楚。例如，已報道許多RNA病毒的前導序列可以增強不同信使RNA(mRNA)的翻譯，而與5′端融合的帽(m7G(5′)PPP(5′)N)的存在無關(guān)(SleatD.E；Wilson T.M.A.1992.Plant virus genomes as sources of novelfunctions for genetic manipulations.InT.M.A.Wilson & J.W.Davies(Eds)，Genetic engineering with plant viruses.CRC Press，Inc.p.55-113；Gallie D.R；Sleat D.E；Watts J.W；Turner P.C；Wilson T.M.Nucleic Acids Res.1987，158693-8711)。然而，除所有這些病毒前導序列的RNA二級結(jié)構(gòu)不復雜之外，尚未確定其核苷酸序列間負責翻譯增強子特性的另一共同元件。
特別地，已報道TMVω片段的翻譯增強是由于在其序列中重復的至少一個拷貝的八聚物ACATTTAC以及一個據(jù)認為是重要基序的25堿基(CAA)n區(qū)(兩個拷貝的(CAA)n區(qū)足以賦予高增強子水平)(GallieD.R；Walbot V.Nucleic Acids Res.1992，204631-4638)。然而，馬鈴薯X病毒(PVX)前導序列28堿基CA豐富區(qū)本身未顯示翻譯增強子活性(Pooggin M.M；Skryabin K.G.Mol.Gen.Genet.1992，234329-331)，但報道PVX前導序列的CA區(qū)存在的CCACC五核苷酸可能與18S rRNA 3′端具有配對相互作用(Tomashevskaya O.L；SolovyevA.G；Karpova O.V；Fedorkin O.N；Rodionova N.P；Morozov S.Y；Atabekov J.G.J.Gen.Virol.1993，742717-2724)。
已確定某些病毒前導序列具有涉及翻譯增強子活性的序列元件，諸如香石竹潛隱病毒前導序列如馬鈴薯病毒S(PVS)中保守的CCTTTAGGTT序列(Turner R；Bate N；Tewell D；Foster G.D.Arch.Virol.1994，134321-333)以及在苜?；ㄈ~病毒(Alfalfa MosaicVirus，A1MV)RNA3前導序列27堿基重復區(qū)中發(fā)現(xiàn)的所謂2型內(nèi)部控制區(qū)(ICR2)基序(GGTTCGANTCC)，需要兩個以達到理想的翻譯水平(vander Vossen E.A.G；Neeleman L；Bol J.F.Nucleic Acids Res.1993，211361-1367)。
對于TEV前導序列，稱為CIRE-1和CIRE-2的兩個區(qū)分別位于28-65和66-118，已被鑒定為負責該148bp前導序列的翻譯增強子活性(Niepel M；Gallie D.R.J.Virol.1999，739080-9088)。但并未在CIRE區(qū)內(nèi)確定認為對這些病毒前導序列的增強子活性極為重要的特定元件。
如上所及，天然來源的內(nèi)含子及其臨近序列也已廣泛用于增強不同的基因表達系統(tǒng)，特別是當內(nèi)含子靠近基因5’端時。但據(jù)報道，內(nèi)含子介導的基因表達增強(IME)有賴于內(nèi)含子來源、外顯子的側(cè)翼區(qū)以及細胞類型等因素。主要在單子葉植物細胞中觀察到強的表達IME，但雙子葉植物一般不超過2-5倍。尚未完全揭示IME后的分子機理(Simpson G.G；Filipowicz W.Plant Mol.Biol.1996，321-41；Schuler M.A.1998.Plant pre-MRNA splicing.InJ.Bailey-Serres & D.R.Gallie(Eds)，Alook beyond transcriptionmechanisms determining MRNA stability and trans lation in plants.American Society of Plant Physiologists.P.1-19；Lorkovic Z.J；Kirk D.A.W；Lambermon M.H.L；Filipowicz W.Trends in PlantScience.2000，5160-167)。
觀察到的單子葉和雙子葉植物細胞間IME表達變化可起因于不同種類植物細胞中前mRNA適當加工所需條件的已知差異。實際上，在單子葉而非雙子葉植物細胞中，內(nèi)含子序列存在富含AU的片段并非為其加工所必需；單子葉細胞可加工高GC含量(超過50％)的內(nèi)含子及復雜二級結(jié)構(gòu)(發(fā)夾-環(huán))，表明雙子葉植物細胞不能加工復雜二級結(jié)構(gòu)的內(nèi)含子(Goodall G.J；Filipowicz W.The EMBO Journal 1991，102635-2644；Lorkovic Z.J；Kirk D.A.W；Lambermon M.H.L；Filipowicz W.Trends in Plant Science.2000，5160-167)。這些原因至少可以部分解釋，為什么目前利用IME人工增強核苷酸序列表達的系統(tǒng)具有類型特異性。
發(fā)明詳述本專利申請?zhí)岢龅谋磉_啟動子序列提供了一組不同的特征1)具有普遍功能性，在雙子葉及單子葉植物細胞中均有活性，可以獲得目的基因和DNA序列高水平表達的任何類型的轉(zhuǎn)基因植物；2)基于人工裝配的遺傳元件的組合，不僅通過IME提高了mRNA水平，還促進其翻譯；3)該啟動子中缺少與天然或病毒基因具有同一序列的長DNA片段，最大限度減少了RNA介導的同源基因沉默風險以及因株內(nèi)(inplanta)同源重組而出現(xiàn)新病毒種或株的可能性；4)從TATA盒到轉(zhuǎn)錄起始位點間序列的GC含量不一定要高；5)本啟動子序列的多變性可以在其5’端插入轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件，賦予表達的時間、器官或組織特異性；6)包含它的人工遺傳元件也可功能性插入在植物細胞中起作用的任何啟動子與任何DNA序列之間，以提高其轉(zhuǎn)錄/翻譯。
對任何類型植物細胞中mRNA累積具有高增強活性的嵌合外顯子/內(nèi)含子/外顯子區(qū)設(shè)計及其與人工翻譯增強子的功能性整合，構(gòu)成了本專利申請的兩個基本部分，因為這些元件可使我們在植物細胞中有效表達任何目的DNA序列。
重要的是要清楚，當我們稱某區(qū)域、分子或DNA序列是人工或嵌合時，我們是指它是經(jīng)體外設(shè)計并合成，因而不是具有同樣一級DNA結(jié)構(gòu)的任何遺傳元件，盡管其序列的小片段可能具有天然來源。
為設(shè)計帶有對應的鄰近外顯子序列、能夠促進IME表達的內(nèi)含子，我們對具有報道轉(zhuǎn)錄增強子活性的植物內(nèi)含子，研究了其共同的序列基序及遺傳元件。同時，我們必須解決該內(nèi)含子不論其GC含量而均能在雙子葉和單子葉植物中獲得足夠及有效加工的挑戰(zhàn)。
在比較廣泛用作轉(zhuǎn)錄增強子啟動子的稻肌動蛋白-1、玉米遍在蛋白-1和蔗糖合酶-1的內(nèi)含子序列時，可以檢測它們之中共有及重復的序列基序(

圖1)。尚未證明其中任何基序負責這些內(nèi)含子所致IME基因表達，但這些區(qū)域及多種植物啟動子TATA盒5’區(qū)中的CTCC基序(或其同源序列CTC、TCC和TC)的高度保守水平表明該基序有利于結(jié)合可促進RNA聚合酶II活性的轉(zhuǎn)錄因子的可能性。同時，第一內(nèi)含子(仍然是非翻譯性mRNA非翻譯前導序列的區(qū)域)以及具有報道翻譯增強子活性的病毒前導序列中富含C和A序列的豐度及保守性，表明此類序列可促進所得mRNA的穩(wěn)定性及其被翻譯的能力。
應當強調(diào)，上文所說明的理論均未有完整的科學證明，因而并非顯而易見構(gòu)建包含特定重復序列基序、帶有相鄰外顯子序列的人工內(nèi)含子能夠得到可促進高轉(zhuǎn)錄水平及mRNA積累的區(qū)域；但我們的工作結(jié)果證實了這一點。
根據(jù)所述不同內(nèi)含子(連同其相應外顯子)的比較研究，我們決定將富含我們所認定的IME表達相關(guān)基序的稻肌動蛋白-1和玉米遍在蛋白-1內(nèi)含子/外顯子序列片段相結(jié)合，設(shè)計人工外顯子/內(nèi)含子/外顯子區(qū)。為達此目的，我們必須注意所得人工內(nèi)含子一定要在雙子葉植物細胞中有效加工，才能在這類植物中也發(fā)生基因表達增加。盡管如此，我們發(fā)現(xiàn)所用作原材料的內(nèi)含子序列GC含量高、具有大量發(fā)夾-環(huán)的復雜二級結(jié)構(gòu)、其AG受體3’剪接位點序列有些不同于分支點共有序列，因而這些內(nèi)含子難以在雙子葉植物細胞中加工。
為簡化我們設(shè)計的外顯子/內(nèi)含子/外顯子的二級結(jié)構(gòu)，以便可以在任何類型的植物細胞中加工，我們決定在其序列中做些精確的改變并插入激活加工的UUUUUAU樣序列(Gniadkowski M；Hemmings-Mieszczak M；Klahre U；Liu H.X；Filipowicz W.NucleicAcids Res.1996，24619-627)。此外，我們的嵌合序列與第二個外顯子融合并插入玉米肌動蛋白-1基因的第二個內(nèi)含子(IVS2)而利用它在雙子葉植物中的有效加工(例如煙草)(Goodall G.J；FilipowiczW.The EMBO Journal 1991，102635-2644)。通過使用PCFOLD 4.0程序的計算方法(Zuker M.Meth.Rnzymology 1989，180262-288)，研究推斷的每一人工外顯子/內(nèi)含子/外顯子變體二級結(jié)構(gòu)。我們制備的人工外顯子/內(nèi)含子/外顯子序列由此稱為ART。
如已述及，本專利申請的第二個相關(guān)組分是為提高基因表達水平而融合到嵌合外顯子/內(nèi)含子下游的人工翻譯增強子。
根據(jù)某些病毒前導序列的序列及所形成的二級結(jié)構(gòu)分析，設(shè)計人工翻譯增強子。我們從該分析中推斷出翻譯增強子具有3個基本元件。1)低復雜度的二級結(jié)構(gòu)；2)富含C和A的序列片段；3)與共有HCAYYY序列(H＝C或U或A；Y＝C或U，參見表1)具有高達83％同源性的基序，暴露并頻繁重復和/或位于具有低熔解點尾部的發(fā)夾結(jié)構(gòu)中。
表1.某些RNA病毒前導序列片段中的結(jié)構(gòu)性保守序列(H＝C/U/A；Y＝C/U)。
根據(jù)上述前提，我們設(shè)計了人工翻譯增強子，其中發(fā)夾-環(huán)結(jié)構(gòu)中的每一HCAYYY樣序列內(nèi)都插入45堿基的富含C和A的序列。該人工翻譯增強子與提供其構(gòu)建(confection)所用理論前提的RNA病毒前導序列的同源性不超過55％，甚至沒有一個序列片段有6個以上的核苷酸具有100％同源性。這就是為什么我們可以肯定我們的翻譯增強子不是先前報道或受保護(EP 0270611)的任何翻譯增強子的衍生物；也不具有直接源自其中的序列。
為便于操作及目的基因融合，給我們的翻譯增強子添加限制性位點。最后，在新的翻譯增強子與我們制備的人工外顯子/內(nèi)含子融合之前，其體內(nèi)功能性顯示，具有與TMVω片段相同的增強嵌合基因表達的能力。我們制備的人工翻譯增強子稱為Eureka。(圖2).
為構(gòu)建本專利所要求的啟動子序列，首先設(shè)計由共有序列TATA盒(Joshi C.P.Nucleic Acids Res.1987，156643-6653)形成的核心啟動子，與CaMV 35S-24至-4區(qū)(距轉(zhuǎn)錄起始位點)融合，后接提供轉(zhuǎn)錄起始位點和C和A豐富區(qū)的肌動蛋白-1-5至+27啟動子區(qū)。將玉米遍在蛋白-1距轉(zhuǎn)錄起始位點+26至+72區(qū)融合到下游，提供AC-和TC-豐富區(qū)，得到第一個人工外顯子，再連接玉米肌動蛋白-1第二個外顯子的IVS2內(nèi)含子5’拼接位點前12個堿基并包括其自身。根據(jù)計算方法的預測在連接附近進行堿基改變、添加或缺失，以避免據(jù)推測可影響RNA成熟的二級結(jié)構(gòu)。我們設(shè)計的人工內(nèi)含子的組成如下，IVS2內(nèi)含子的前54個堿基，融合玉米遍在蛋白-1第一個內(nèi)含子5’區(qū)對應距轉(zhuǎn)錄起始位點+89至+126的37個堿基，后接稻肌動蛋白-1第一個內(nèi)含子的375個堿基(距基因轉(zhuǎn)錄起始位點+103至+477)，融合玉米遍在蛋白-1內(nèi)含子3’端的33個堿基(距轉(zhuǎn)錄起始位點+1051-1083)，連接肌動蛋白-1 IVS2內(nèi)含子第二部分(距其3’加工起始位點-52至+5)以及包含限制性位點和翻譯起始共有序列的29堿基嵌合序列。(Lütcke H.A；Chow K.C；Mickel F.S；Moss K.A；Kern H.F；Scheele G.A.The EMBO Journal.1987，643-48)。我們制備的人工外顯子/內(nèi)含子/外顯子ART序列如圖3所示。一旦通過煙草和稻細胞中的瞬時表達測試所構(gòu)建人工外顯子/內(nèi)含子/外顯子的有效加工，便將翻譯增強子Eureka融合到其3’端，圖4顯示本發(fā)明目標啟動子序列的最終結(jié)構(gòu)(PARTB啟動子)。
必須強調(diào)，我們設(shè)計的增強子元件ART比通常使用的稻肌動蛋白-1基因第一個外顯子/內(nèi)含子/外顯子顯示更高的基因表達增強子效率。Eureka片段是其活性的另一增強子。
此工作首次獲得了兩個人工的高效遺傳元件，可增強任何類型轉(zhuǎn)基因植物細胞中任何DNA序列的表達，證明了我們所根據(jù)的理論原則的正確性。AT含量低于52％的人工啟動子可在雙子葉植物細胞中充分加工，促進高IME表達，這也是首次。構(gòu)建與ARN病毒前導序列同源性低的完全人工的高效翻譯增強子，也是新穎的。
將不同的轉(zhuǎn)錄增強子序列融合到本發(fā)明目標啟動子序列的5’。因此，如圖5所示，將稻肌動蛋白-1的-43至-310區(qū)(距轉(zhuǎn)錄起始位點)融合到啟動子PARTE 5’端，形成啟動子區(qū)APARTE，還具有as-1樣轉(zhuǎn)錄增強子元件(Benfey P.N；Chua N.H.Science，1990，250959-966)和玉米遍在蛋白-1啟動子5’區(qū)556堿基片段(距轉(zhuǎn)錄起始位點-299至-855)，最終獲得U3ARTE啟動子，結(jié)構(gòu)如圖6所示。
從所述遺傳元件構(gòu)建了許多啟動子序列變體(參見圖7)，均通過體內(nèi)分析表明了其功能性，證明所用的增強子和活化子區(qū)域?qū)虮磉_都具有協(xié)同效應。
在我們的構(gòu)建體中用作轉(zhuǎn)錄增強子的as-1元件(參見圖6)具有創(chuàng)新設(shè)計，因為它與章魚氨酸合酶回文結(jié)構(gòu)增強子的同源性低于50％(Ellis J.G；Llewellyn D.J；Walker J.C；Dennis E.S；Peacock W.J.EMBO J.1987，63203-3208；EP0278659)，不同于Ellis等人(BouchezD；Tokuhisa J.G；Llewellyn D.J；Dennis E.S；Ellis J.G.EMBO J.1989，84197-4204；美國專利5,837,849)所做研究中要求的任何該類型的序列變體(同一性低于85％)，并且其中發(fā)現(xiàn)的TGACG基序具有獨特的側(cè)翼序列內(nèi)容。
盡管已經(jīng)描述稻肌動蛋白-1基因并用于表達不同基因(McElroy D；Zhang W；Cao J；Wu R.Plant Cell 1990，2163-171；WO9109948)，但重要在于強調(diào)我們的工作揭示了其5’區(qū)的轉(zhuǎn)錄增強子活性及其作為異源表達增強子的用途。類似地，盡管已經(jīng)要求玉米遍在蛋白-15’轉(zhuǎn)錄增強子區(qū)的用途(EP0342926)，但我們利用的556堿基片段并不包含被確定為該增強子功能性所必需的“熱休克”元件(位于該啟動子序列-188至-214)，因而是原始的，并不排除我們所用遍在蛋白序列的轉(zhuǎn)錄增強子活性。
PARTE啟動子也與稻gluB-1基因(Takaiwa F；Oono K；Kato A.Plant Mol.Biol.1991，1649-58)距轉(zhuǎn)錄起始位點-31至-245區(qū)對應的214堿基小片段融合，形成新的啟動子區(qū)CARTE(圖8)。瞬時表達分析證明，該新的人工啟動子GARTE在種子胚乳中高效表達DNA序列。
因此，我們斷定這些嵌合5’轉(zhuǎn)錄增強子的功能性組合具有新穎性，極適用于制備可在植物細胞中(而不論其所屬類型)獲得DNA序列高水平表達的遺傳元件。
顯然，來自不同啟動子的其它5’調(diào)節(jié)區(qū)可與本發(fā)明目標順式融合，以便獲得高水平表達和/或賦予該表達的時間(temporal)、器官或組織特異性。
對遺傳工程技術(shù)的熟練人員而言，此處所述將使利用ART和Eureka增強子與植物細胞的任何轉(zhuǎn)錄啟動子元件聯(lián)合成為可能，以增強任何DNA序列在單、雙子葉植物細胞中的轉(zhuǎn)錄/翻譯。類似地，從我們的觀察中獲得的、引導我們設(shè)計ART和Eureka的理論原則，可以被分子生物學技術(shù)熟練人員用于構(gòu)建植物細胞中新的DNA表達增強子序列。
考慮到過去20年間植物遺傳工程的迅猛發(fā)展，連接任何基因和轉(zhuǎn)錄終止子序列的本發(fā)明的目標啟動子顯然可以插入植物細胞遺傳轉(zhuǎn)化載體，并通過使用成熟有效的技術(shù)而獲得能夠表達目的基因的轉(zhuǎn)基因植物。
在本發(fā)明申請中，遺傳轉(zhuǎn)化載體是指作為運載體將預先插入其中的任何DNA片段引入植物細胞的DNA分子(已純化或包含于細菌細胞或病毒之中)。
附圖描述圖1.稻肌動蛋白-1(Act)、玉米遍在蛋白-1(Ubi)和玉米蔗糖合酶(Shrun)距轉(zhuǎn)錄起始位點的基因序列。大寫字母所示為第一個外顯子，小寫字母為第一個內(nèi)含子的5’區(qū)，下劃線為重復及共有序列基序的位置。
圖2.所示為Bureka人工翻譯增強子序列的相關(guān)元件及限制性內(nèi)切酶識別位點。
圖3.ART外顯子/內(nèi)含子/外顯子人工序列，顯示其每一組成片段的起源(小寫字母人工內(nèi)含子；雙下劃線為插入產(chǎn)生UUUUUAU樣序列的堿基；單下劃線標識限制性內(nèi)切酶的某些相關(guān)識別位點)。
圖4.本發(fā)明目標(PARTE啟動子)的一級結(jié)構(gòu)，顯示融合到ART外顯子/內(nèi)含子/外顯子區(qū)(內(nèi)含子堿基小寫，外顯子大寫)以及人工翻譯增強子EUREKA的核心啟動子(小寫斜體)。下劃線為限制性內(nèi)切酶的某些相關(guān)識別位點。雙下劃線為TATA盒，黑體為翻譯起始密碼子。
圖5.APARTE啟動子的一級結(jié)構(gòu)，顯示融合到PARTE啟動子(斜體小寫為啟動子，小寫為內(nèi)含子，大寫為外顯子)的稻肌動蛋白-1 5’調(diào)節(jié)區(qū)(距轉(zhuǎn)錄起始位點-43至-310的區(qū)域)。下劃線標識限制性內(nèi)切酶的某些相關(guān)識別位點。雙下劃線為TATA盒，黑體為翻譯起始密碼子。
圖6.U3ARTE啟動子的一級結(jié)構(gòu)，顯示其組成元件玉米ubi-1基因轉(zhuǎn)錄起始位點-299至-855區(qū)，大寫；as-1樣轉(zhuǎn)錄增強子，大寫黑體；稻act-1基因轉(zhuǎn)錄起始位點-43至-310區(qū)，大寫斜體；PARTE啟動子為小寫(雙下劃線為TATA盒，斜體為ART內(nèi)含子，單下劃線為翻譯起始位點)。
圖7.帶有本發(fā)明目標增強子元件的啟動子變體。A35SEureka；B35SART；C35SARTE；DPARTE；EAPARTE；F2A1PARTE；G2APARTE；HU3ARTE. 35S啟動子(1.3Kb)； 翻譯增強子Eureka ART外顯子/內(nèi)含子/外顯子； 人工啟動子核心； 稻肌動蛋白-1基因5’活化區(qū)(-43至-221)； 稻肌動蛋白-1基因5’活化區(qū)(-226至-310)； ASP(as-1樣增強子)； 玉米遍在蛋白-1啟動子5’活化區(qū)(-299至-855)。
圖8.GARTE啟動子一級結(jié)構(gòu)，顯示其組成元件稻gluB-1基因轉(zhuǎn)錄起始位點-31至-245區(qū)，大寫斜體；PARTE啟動子(啟動子為小寫斜體，內(nèi)含子為小寫；外顯子為大寫；某些相關(guān)限制性位點為下劃線；TATA盒為雙下劃線；翻譯起始密碼子為黑體)。
圖9.pUC-GUSint圖。
圖10.pBPFΩ(omega)7圖。
圖11.pBPFA19-接頭圖。
圖12.通過加速微粒轟擊引入帶有GUSint基因的不同遺傳構(gòu)建體的瞬時表達，利用X-Gluc組織化學染色的ART和EUREKA元件在稻細胞中功能性的比較驗證。
微生物保藏物質(zhì)粒pC-EURGUSint；pC-ARTEGUSint；pGARTEGUSint和pC-U3ARTEGUSint按微生物保存布達佩斯條約保藏于BelgianCoordinated Collection of Microorganism，Plasmid Collection(BCCM/LMBP)Universiteit Gent，′Fiers-Schell-Van Montagu′building，Technologiepark 927，B-9052 Gent-Zwijnaarde，Belgica。質(zhì)粒pC-EURGUSint；pC-ARTEGUSint；pGARTEGUSint的登錄號分別為LMBP 4727；LMBP 4725；LMBP 4728，日期為2003年5月19日，pC-U3ARTEGUSint號碼為4791，2003年11月25日。
實施例實施例1構(gòu)建用于在植物細胞中表達DNA序列的新的嵌合系統(tǒng)的組成元件制備所有合成的DNA序列均帶有不同II型限制性內(nèi)切酶限制性位點的粘性末端，以便使其正確克隆更為容易。
a)Eureka翻譯增強子克隆利用在合成的DNA片段設(shè)計中包括的酶粘性末端，將翻譯增強子EUREKA(SEQ ID NO1)對應的86堿基對(bp)DNA片段克隆到預先經(jīng)限制性酶PstI和SacI消化的載體pBluescript II SK(Stratagene，USA)。所得質(zhì)粒命名為pBS-Eureka。
b)人工外顯子/內(nèi)含子/外顯子區(qū)ART裝配通過一個接一個地克隆、裝配所設(shè)計的DNA片段，構(gòu)建人工外顯子/內(nèi)含子/外顯子區(qū)ART。首先，將包含核心啟動子、第一個外顯子及部分人工內(nèi)含子的名為P35AcU(SEQ ID NO2)的DNA合成片段克隆到經(jīng)Eco RI和Spe I限制性酶消化的pBluescript II SK載體，獲得質(zhì)粒pBS-AcU。此后，用Spe I和Sac I消化該質(zhì)粒，在其中插入編碼部分人工內(nèi)含子的DNA合成片段I-U/Ac(SEQ ID NO3)。這樣獲得pBS-AcUAc質(zhì)粒。
然后將帶有人工內(nèi)含子末端的DNA合成片段I-Ac/U(SEQ ID NO4)插入經(jīng)限制性酶BamHI和Sac I消化的pBS-AcUAc質(zhì)粒，生成質(zhì)粒pBS-AcUAcU。
將片段IniT(SEQ ID NO5)插入SpeI/SacI消化的pBS-AcUAcU，便完成了人工外顯子/內(nèi)含子/外顯子ART(SEQ ID NO6)，形成質(zhì)粒pBS-ART，其位于pBluescript II載體限制性位點EcoRI和SacI間的一級結(jié)構(gòu)如序列SEQ ID NO7所示。
c)PARTE啟動子構(gòu)建為構(gòu)建本發(fā)明目標啟動子序列(PARTE啟動子)，通過XhoI/PstI消化pBS-ART質(zhì)粒獲得包含核心啟動子和外顯子/內(nèi)含子/外顯子區(qū)ART(沒有3’區(qū))的DNA片段，插入經(jīng)相同酶消化的pBS-Eureka質(zhì)粒。至此我們獲得了質(zhì)粒pPARTE(圖4、圖7D)，其EcoRI和SacI位點間序列如序列SEQ ID NO9所示。
實施例2Eureka和ART增強子元件在植物細胞中功能性的證明a)翻譯增強子Eureka在煙草細胞中的功能性為檢驗Eureka在煙草和稻細胞中的增強子實力而制備一系列輔助性遺傳構(gòu)建體。
利用Nco I/Sac I消化質(zhì)粒pUC-GUSint(圖9)，獲得在Sna BI位點插入馬鈴薯ST-LSl基因IV2內(nèi)含子的報告基因uidA(GUSint)，克隆到質(zhì)粒pBS-Eureka的相同位點，得到載體Pbs-EURGUSint。該載體進一步經(jīng)限制性酶PstI和SalI消化并用S-1核酸酶處理，獲得質(zhì)粒pBS-ΔEURGUSint；經(jīng)Xho I/Kpn I消化獲得的DNA片段包含融合GUSint基因的Eureka增強子，將其插入pBPFΩ(omega)7載體(圖10)。至此我們獲得pBPF-EURGUSint載體(圖7A)，具有位于CaMV 35S啟動子(1.3kb形式)、Eureka增強子和根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)nos基因轉(zhuǎn)錄終止信號(tNOS)控制下的GUSint基因表達。
將質(zhì)粒pUC-GUSint經(jīng)SalI/Klenow和KpnI消化獲得GUSint基因，克隆到pBPFΩ(omega)7載體的SmaI和KpnI位點，構(gòu)建質(zhì)粒pBPFΩ(omega)-GUSint，作為對照來評價構(gòu)建體pBPF-EURGUSint的表達。該質(zhì)粒類似于pBPF-EURGUSint，只是存在控制GUSint的翻譯增強子Ω(omega)，而非Eureka。
通過Xho I-Nco I消化去除質(zhì)粒pBPFΩ(omega)-GUSint的增強子Ω，經(jīng)Klenow處理及質(zhì)粒自連，獲得pBPF-GUSint載體，構(gòu)建另一對照質(zhì)粒。
質(zhì)粒pBPFΩ(omega)-GUSint，pBPF-GUSint，和pBPF-EURGUSint經(jīng)HindIII消化，獲得在植物中的GUSint表達盒；克隆到HindIII消化的雙載體pCAMBIA2300，分別得到雙載體pC-Ω(omega)7GUSint，pC-GUSint和pC-EURGUSint。
將所得雙載體引入根瘤土壤桿菌株LBA4404，我們繼續(xù)通過在NT1煙草細胞中的瞬時表達實驗，按照有所修改的An等人所述規(guī)程(AnG.Plant Physiol.1985，79568-570)，分析增強子Eureka的功能性。煙草細胞與攜帶每個雙載體的根瘤土壤桿菌共培養(yǎng)4天以后，收集細胞并如Jefferson所述處理(Jefferson R.A.1988.Plantreporter genesthe GUS gene fusion system.InJ.K.Setlow(Ed)，Genetic Engineering.Vol.10，Plenum Publishing Corporation.P.247-263)，以測定其β-葡糖醛酸酶(GUS)活性。每個實驗重復3次，每次每一構(gòu)建體5次重復。結(jié)果如下表所示。
表2.翻譯增強子Eureka在煙草細胞中的功能性證明
如表2所示結(jié)果可知，Eureka與TMVω前導序列相比，其增強子活性沒有顯著差異，證明首次獲得完全人工的有效翻譯增強子。這也證實了我們的理論原則，表明有可能通過將C和A豐富的序列區(qū)域與基序HCAYYY(H＝C/T/A；Y＝C/T)同源的序列相結(jié)合，構(gòu)建具有顯著特性的遺傳元件，以增強在其3’端下游融合的DNA序列的翻譯。
b)人工外顯子/內(nèi)含子/外顯子ART在煙草細胞中的功能性為測試ART元件在煙草細胞中的功能性，首先從Nco I-Sac I消化的質(zhì)粒pUC-GUSint獲得GUSint片段，克隆到相同酶消化的pBS-ART，獲得質(zhì)粒pBS-ARTGUSint。然后該質(zhì)粒經(jīng)SalI-BglII消化及S1核酸酶處理，獲得pBS-ΔARTGUSint，再經(jīng)XhoI-KpnI消化得到ARTGUSint片段，克隆到經(jīng)相同酶消化的載體pBPFΩ(omega)7-GUSint，得到質(zhì)粒pBPFARTGUSint(圖7B)，，其中GUSint表達位于CaMV 35S啟動子(1.3kb形式)、人工外顯子/內(nèi)含子/外顯子區(qū)ART以及根瘤土壤桿菌nos基因轉(zhuǎn)錄終止信號(tNOS)控制之下。
利用XhoI/PstI消化從質(zhì)粒pBS-ΔARTGUSint獲得包含ART元件的條帶，融合到經(jīng)相同酶消化的pBS-BURGUSint載體，獲得質(zhì)粒pBS-ARTEGUSint。該質(zhì)粒經(jīng)XhoI/KpnI消化獲得DNA片段，得到位于遺傳元件ART和Eureka信號控制之下的GUSint基因，引入同樣消化的pBPFΩ(omega)7載體，產(chǎn)生pBPFARTEGUSint質(zhì)粒(Figure 7C)。
質(zhì)粒pBPFARTGUSint和pBPFARTEGUSint經(jīng)HindIII消化，得到GUSint的植物表達盒；將其克隆到雙載體pCAMBIA2300，分別產(chǎn)生雙質(zhì)粒pC-ARTGUSint和pC-ARTEGUSint。
將所得雙質(zhì)粒引入根瘤土壤桿菌株LBA4404以后，我們使用本實施例部分(a)所述NT1煙草細胞，在瞬時表達試驗中繼續(xù)分析翻譯增強子Eureka的功能性。所得結(jié)果如表3所示。
表3.遺傳元件ART和Eureka在煙草細胞中的功能性證明
煙草細胞中的ART功能性評價結(jié)果顯示，人工內(nèi)含子正確加工并在雙子葉植物細胞中具有表達增強子活性。我們的實驗結(jié)果還表明構(gòu)建體pBPFARTEGUSint中ART和Eureka元件相互作用所獲正協(xié)同作用，將已知天然啟動子CaMV 35S的表達能力提高5倍。
同時證明，所設(shè)計的人工遺傳元件(ART和Eureka)可以功能性插入在植物細胞中起作用的任何啟動子(本例CaMV 35S啟動子)和任何其它DNA序列(本例GUSint)之間，提高其轉(zhuǎn)錄/翻譯。
c)增強子元件Eureka和ART在稻細胞中的功能性制備一組新的構(gòu)建體，以證明我們的人工增強子在單子葉植物細胞中的功能性。首先，質(zhì)粒pBPFARTGUSint的XhoI-KpnI片段帶有融合到人工外顯子/內(nèi)含子ART 5’端的uidA(gus)基因，將其插入經(jīng)相同限制性酶消化的pBPFA19-linker載體(圖11)，形成質(zhì)粒pBPFA19ARTGUSint。在該質(zhì)粒中，pBPFA19-linker中存在的稻肌動蛋白-1外顯子/內(nèi)含子/外顯子區(qū)已被人工ART元件取代，保留其它調(diào)節(jié)元件，包括嵌合啟動子A19(其中四份章魚氨酸合酶as-1樣增強子融合到CaMV 35S啟動子(400bp形式))和tNOS轉(zhuǎn)錄終止信號。
類似地，將質(zhì)粒pBS-ARTEGUSint的XhoI-KpnI片段克隆到pBPFA19-linker載體，獲得構(gòu)建體pBPFA19ARTEGUSint。將質(zhì)粒pUC-GUSint的GUSint片段克隆到NcoI/SacI消化的pBPFA19-linker載體，制備構(gòu)建體pBPFA 19GUSint，用作對照。所用另一對照質(zhì)粒為pBPFΩ(omega)-GUSint。
通過分析多種indica Perla愈傷組織中的瞬時表達，定量評價ART和Eureka增強稻細胞中基因表達的能力。愈傷組織得自預先經(jīng)次氯酸鈉和乙醇消毒的成熟種子，在N6-2培養(yǎng)基N6鹽和維生素(chuC.C等人Scientia Sinic 1975，18659)；0.1g/L myo-肌醇；1g/L酪蛋白水解物；2mg/L 2，4D；30g/L蔗糖；3g/L植物凝膠(Phytagel)，pH 5.7)中暗處培養(yǎng)21天。通過微粒轟擊進行轉(zhuǎn)化轟擊之前將愈傷組織傳代培養(yǎng)于添加0.4M Manitol的N6-2培養(yǎng)基中，進行滲透預處理。按照發(fā)表的規(guī)程，使用1μm球狀金顆粒(BioRad)作為轟擊用微粒(Russel1 D.R.，Wallace K.M.，Bathe J.H.等人Plant Cell Rep.1993，12165-169)。利用PDS-1000/He系統(tǒng)(BioRad)進行轉(zhuǎn)化。將30個愈傷組織置于平皿中心進行轟擊，條件為1100psi壓力、距離6cm、每皿轟擊一次。轟擊之后，將愈傷組織保持在相同滲透培養(yǎng)基中暗處16小時，然后在不含Manitol的N6-2培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)2天。利用組織化學方法由X-Gluc顯示GUS活性(Jefferson R.A.1988.Plant reporter genesthe GUS gene fusion system.InJ.K.Setlow(Ed)，Genetic Engineering.Vol.10，Plenum PublishingCorporation.P.247-263)。在立體顯微鏡下計數(shù)每一愈傷組織的藍色點片，進行評價(圖12)。表4顯示4次實驗、每次3個重復所得結(jié)果。
表4.ART和Eureka在稻細胞中的功能性比較證明
可以看出，這些實驗結(jié)果也證實ART和Eureka在單子葉植物細胞中作為基因表達增強子元件的功能性。重要的是要強調(diào)，在我們的分析中，由人工外顯子/內(nèi)含子/外顯子ART(pA19ARTGUSint)所產(chǎn)生的IME活性高于稻肌動蛋白-1基因第一個外顯子/內(nèi)含子/外顯子(pBPFA19GUSint)，是具有認可的基因表達增強子能力的遺傳元件。此外，盡管在我們的實驗中，構(gòu)建體pA19ARTGUSint和pA19ARTEGUSint所得結(jié)果之間的顯著差異不可理解，但在圖12中是顯著的，由于pA19ARTEGUSint轟擊的愈傷組織經(jīng)X-Gluc組織化學染色后的藍色區(qū)片的大小及密度，后一構(gòu)建體中存在的Eureka片段強力提高表達(圖12)。
總之，本實施例表明人工遺傳元件ART和Eureka在任何類型植物細胞中作為基因表達增強子的功能性。此外，證明這些增強子元件高效增加表達水平，與其所融合的啟動子無關(guān)。最后，還證明ART和Eureka可以聯(lián)合起來，更協(xié)同增強下游基因的表達。
另外表明ART和Eureka可以功能性插入任何植物活性的啟動子(例如A19)和任何DNA序列(GUSint基因)之間，提高其轉(zhuǎn)錄/翻譯。
實施例3利用不同5’轉(zhuǎn)錄增強子區(qū)域的PARTE表達系統(tǒng)變體a)為PARTE啟動子添加稻肌動蛋白-1 5’轉(zhuǎn)錄活化子區(qū)為將稻肌動蛋白-1基因5’轉(zhuǎn)錄增強子區(qū)與PARTE啟動子順式融合，利用酶EcoRI和EcoRV消化pPARTE質(zhì)粒，其中插入帶有這些酶連接末端的合成DNA片段En-Ac1(稻肌動蛋白-1基因轉(zhuǎn)錄起始位點-43至-221；SEQ ID NO10)。所得質(zhì)粒pA1PARTE經(jīng)Eco RV和Hind III消化，插入合成DNA片段En-Ac2(稻肌動蛋白-1基因轉(zhuǎn)錄起始位點-226至-310；SEQ ID NO11)，完成肌動蛋白-1基因啟動子5’活化區(qū)，得到質(zhì)粒pAPARTE(圖5、圖7E)，其限制性位點HindIII和SacI之間的核苷酸序列如序列SEQ ID NO12所示。
b)為APARTE啟動子添加as-1樣轉(zhuǎn)錄增強子序列質(zhì)粒pA1PARTE經(jīng)NruI和SalI消化，其中插入稱為ASP的DNA合成片段(SEQ ID NO13)，該片段具有所述限制性酶的粘性末端并編碼as-1樣轉(zhuǎn)錄增強子序列，從而產(chǎn)生構(gòu)建體pASPΔA1PARTE。該質(zhì)粒經(jīng)Sal I消化、S1核酸酶處理、再經(jīng)Pst I消化，獲得約900bp DNA片段后，克隆到NruI和PstI消化的載體pA1PARTE，最終獲得質(zhì)粒pASPA1PARTE，其中具有在NruI位點插入稻肌動蛋白-1 5’轉(zhuǎn)錄活化區(qū)的ASP增強子。經(jīng)過EcoRV-XhoI消化，將第二個ASP增強子插入質(zhì)粒pASPA1PARTE，得到載體p2A1PARTE(在序列SEQ ID NO14中，顯示限制性位點KpnI和SacI之間的核苷酸序列)，其結(jié)構(gòu)如圖7F所示。
如上文針對pA1PARTE所述，也將En-Ac2片段插入pASPA1PARTE，獲得構(gòu)建體pASPAPARTE，其中第二個ASP增強子經(jīng)EcoRV-SalI消化而插入，最終獲得載體p2APARTE(圖7G)。位點SalI和SacI之間的核苷酸序列如SEQ ID NO15所示。
c)U3ARTE啟動子構(gòu)建首先，使用引物Oli-U1(S3Q ID NO16)和Oli-U2(SEQ ID NO17)，通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增對應于玉米ubi-1基因轉(zhuǎn)錄起始位點-299至-680區(qū)約395bp DNA片段。擴增的片段經(jīng)限制性酶KpnI和XhoI消化(兩位點均包括在引物內(nèi)部)，克隆到同樣處理的pBluescript II SK載體，獲得構(gòu)建體pBS-Ubil。此后，將編碼玉米ubi-1基因-680至-855(序列SEQ ID NO18)的合成DNA片段(En-U2)克隆到NcoI/KpnI消化的pBS-Ubil載體，得到構(gòu)建體pBS-Ubi2，其中包含玉米遍在蛋白-1基因5’活化子區(qū)(-299至-855，序列SEQ IDNO19)。
通過Xho I-Kpn I消化質(zhì)粒pBS-Ubi2，獲得不包含“熱休克”盒的玉米遍在蛋白-1基因5’轉(zhuǎn)錄活化子克隆區(qū)，并通過SalI-KpnI消化該載體而順式插入啟動子2APARTE的5’端，獲得所述構(gòu)建體pU3ARTE(圖6、圖7H)。載體pU3ARTE介于位點Kpn I和Sac I之間的序列如序列SEQ ID NO20所示。
d)GARTE啟動子構(gòu)建為證明本發(fā)明目標的可塑性，我們決定將啟動子的5’調(diào)節(jié)區(qū)與器官、組織或發(fā)育特異性相融合，賦予所述特征高水平表達。因此，控制谷蛋白(gluteline)器官特異性表達的稻gluB-1基因5’調(diào)節(jié)區(qū)順式融合到PARTE啟動子5’端。為達此目的，合成了對應于gluB-1轉(zhuǎn)錄起始位點-31至-245區(qū)(SEQ ID NO21)以及方便的克隆位點的214bp片段(GLU)，插入EcoRI和XhoI消化的pPARTE質(zhì)粒，產(chǎn)生pGARTE載體(圖8)，其XhoI和SacI位點間的一級結(jié)構(gòu)如序列SEQ ID NO22所示。
實施例4PARTE表達系統(tǒng)不同變體在煙草和稻細胞中的功能性為評價本發(fā)明目標的每個啟動子變體在單子葉和雙子葉植物細胞中的表達水平，通過SmaI-SpeI消化缺失雙載體pC-ARTE-GUSint中控制GUSint表達的CaMV 35S啟動子，在其位置插入來自構(gòu)建體pAPARTE、p2A1PARTE、p2APARTE和pU3ARTE的KpnI/S1核酸酶-SpeI片段，產(chǎn)生新的雙載體pC-APARTEGUSint、pC-2A1PARTEGUSint、pC-2APARTEGUSint和pC-U3ARTEGUSint。
a)煙草中分析將雙載體pC-APARTEGUSint、pC-2A1PARTEGUSint、pC-2APARTEGUSint和pC-U3ARTEGUSint引入根瘤土壤桿菌細胞，如實施例2部分(a)所述，在NT1煙草細胞中進行瞬時表達分析實驗。所用對照質(zhì)粒pC-GUSint的GUS表達位于CaMV 35S啟動子(1,3kb形式)和tNOS終止子控制下。實驗進行兩次(每次處理5次重復)，結(jié)果如下表所示
表5.PARTE表達系統(tǒng)不同變體在煙草細胞中的功能性
顯然，我們的結(jié)果確證了本發(fā)明目標中不同啟動子變體的功能性，也表明有可能依靠融合到PARTE的5’轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)調(diào)節(jié)其活性。必須強調(diào)，我們利用我們的遺傳構(gòu)建體在雙子葉植物中達到了比天然啟動子CaMV 35S控制下更高的表達水平。
b)稻中分析如實施例2部分(c)所述，利用雙載體pC-APARTEGUSint、pC-2A1PARTEGUSint、pC-2APARTEGUSint和pC-U3ARTEGUSint轟擊稻愈傷組織，以便進行PARTE啟動子不同變體活性的瞬時評價。對照質(zhì)粒pActl-F(McElroy D；Zhang W；Cao J；Wu R.Plant Cell 1990，2163-171)的gus基因表達位于稻肌動蛋白-1基因啟動子和tNOS終止子控制下。經(jīng)KpnI-XbaI消化，從這些質(zhì)粒中分離表達盒，插入經(jīng)系統(tǒng)限制性酶消化的雙質(zhì)粒pCAMBIA 2300，產(chǎn)生載體pC-Act1F。
轟擊實驗進行3次，待評價的每個構(gòu)建體3次重復。所得結(jié)果如下表所示表6.PARTE啟動子表達系統(tǒng)不同變體在稻細胞中的功能性
該表所示結(jié)果證明PARTE啟動子不同變體在單子葉植物細胞中的功能性，獲得高于稻肌動蛋白-1基因天然啟動子的表達水平。因而證實本發(fā)明目標作為置于其順式控制下的DNA序列獲得高水平表達的有效遺傳工具的用途。
c)稻種中分析為評價GARTE啟動子在稻細胞胚乳中的組織特異性，將pBPFARTEGUSint載體約2.5Kb的SalI/Klenow-RstI片段(其中包含與帶有nos終止子(tNOS)的GUSint基因融合的Eureka片段)克隆到XbaI/Klenow-PstI消化的pGARTE載體，得到構(gòu)建體pGARTEGUSint。
還構(gòu)建了對照質(zhì)粒，將pGARTEGUSint中的GARTE啟動子經(jīng)Xho I-Nco I消化而替換為pGEM-T-GluB-1質(zhì)粒經(jīng)SalI-NcoI消化獲得的種子胚乳特異性高效稻谷蛋白B-1啟動子。從而獲得pGluGUSint。
根據(jù)Y-S.Hwang(Hwang Y-S；McCullar Cass；Huang N.PlantScience.2001，1611107-1116)所述，通過轟擊從溫室培養(yǎng)的稻品種indica Perla的谷穗穎果(ear cariopsis)中分離的未成熟胚乳(極化后8-9天)，評價GARTE啟動子并與GluB1比較。利用包裹待評價質(zhì)粒DNA的金微粒轟擊后24小時，根據(jù)Jefferson(Jefferson R.A.1988.Plant reporter genesthe GUS gene fusion system.InJ.K.Setlow(Ed)，Genetic Engineering.Vol.10，Plenum PublishingCorporation.P.247-263)所述進行熒光分析，以測定胚乳中的GUS活性。兩次獨立實驗(每次5個重復)所獲GUS活性結(jié)果如表7所示。
表7.GARTE啟動子在稻種胚乳中的功能性
這些結(jié)果證實，基于我們所設(shè)計的人工元件的嵌合啟動子GARTE在種子胚乳中高效表達基因；盡管插入GARTE啟動子的GLU序列能夠賦予表達的特異性，其自身并不能保證高水平，還依賴于構(gòu)成該啟動子的其它元件(Takaiwa F；Yamanouchi U；Yoshihara T；Washida H；Tanabe F；Kato A；Yamada K.Plant Mol Biol.1996，301207-1221)。
所示數(shù)據(jù)再次確認，在本發(fā)明目標元件上游插入調(diào)節(jié)區(qū)可使其用于有效導致任何DNA序列的發(fā)育、器官或組織特異性表達。分子生物學的熟練人員顯而易見，插入GARTE啟動子的GluB-1啟動子調(diào)節(jié)序列可以成功替換為響應生物壓力(例如病原體攻擊)、非生物因素(例如傷害、極高或極低溫度、鹽度、干旱、存在某些化學物質(zhì))、氧化壓力、不同器官和組織發(fā)育階段等的調(diào)節(jié)序列。
還很明顯，利用已知的生物學或物理-化學轉(zhuǎn)化方法，可以將克隆于本發(fā)明目標調(diào)節(jié)區(qū)之下的DNA序列引入植物細胞并穩(wěn)定插入，并有可能從這些遺傳修飾的細胞中再生可繁殖的植物，其中DNA序列將按照其所融合的啟動子變體而適宜表達。因此，本發(fā)明揭示其有助于生成具有較高水平的對害蟲、疾病、多種壓力的抗性、較高的農(nóng)業(yè)產(chǎn)量或高效生產(chǎn)醫(yī)學或工業(yè)應用的化合物以及其它用途的轉(zhuǎn)基因植物的潛力。
序列表<110>Center for Genetic Engineering and Biotechnology<120>用于在植物細胞中表達DNA序列的人工啟動子<130>用于植物中DNA表達的啟動子<140>0000<141>2002-11-18<160>22<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>86<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述Eureka轉(zhuǎn)錄增強子<400>1gaaacaaatt gaacatcatt ctatcaatac aacacaaaca caacacaact caatcattta 60tttgacaaca caactaaaca accatg 86<210>2<211>198<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成片段P35AcU.
<400>2gaattctata tataggaagt tcatttcatt tggagccccc caaccctacc accaccacca 60ccaccacctc ctccttcaca caacacacac acaacagatc tcccccatcc tccctcccgt 120cgcgccgcgc aacacctggt aagatggctg tgcgctcaga tatatatagt gatatgcact 180acaaagatca taactagt 198
<210>3<211>231<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成片段I-U/Ac.
<400>3ctagaccgcc gcctcccccc ccccccctct ctaccttctc tctttctttc tccgtttttt 60ttttccgtct cgtctcgatc tttggccttg gtagtttggg ggcgagaggc ggcttcgtcg 120cccagatcgg tgcgcgtttt tttatttgga ggggcgggat ctcgcggctg ggtctcggcg 180tgcggccgga ttctcgcggg gaatggggct ctcggatgtg gatccgagct c 231<210>4<211>255<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成片段I-Ac/U.
<400>4gatctgatcc gccgttgttg ggggagatat ggggcgttta aaatttcgcc atgctaaaca 60agatcaggaa gaggggaaaa gggcactatg gtttaatttt tatatatttc tgctgctgct 120cgtcaggatt agatgtgctt gatctttctt tcttcttttt gtgggtagaa tttgaatccc 180tcagcattgt tcatcggtag tttttctttt gtcgatgctc accctgttgt ttggtgtttt 240tatactagtg agctc 255<210>5<211>93<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成片段IniT.
<400>5
ctagtggcta tcctgacacg gtctctttgt caaatatctc tgtgtgcagg tataactgca 60ggaaacaaca acaataacca tggtctagag ctc 93<210>6<211>692<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述人工外顯子/內(nèi)含子/外顯子ART.
<400>6accaccacca ccaccaccac ctcctccttc acacaacaca cacacaacag atctccccca 60tcctccctcc cgtcgcgccg cgcaacacct ggtaagatgg ctgtgcgctc agatatatat 120agtgatatgc actacaaaga tcataactag accgccgcct cccccccccc ccctctctac 180cttctctctt tctttctccg tttttttttt ccgtctcgtc tcgatctttg gccttggtag 240tttgggggcg agaggcggct tcgtcgccca gatcggtgcg cgttttttta tttggagggg 300cgggatctcg cggctgggtc tcggcgtgcg gccggattct cgcggggaat ggggctctcg 360gatgtggatc tgatccgccg ttgttggggg agatatgggg cgtttaaaat ttcgccatgc 420taaacaagat caggaagagg ggaaaagggc actatggttt aatttttata tatttctgct 480gctgctcgtc aggattagat gtgcttgatc tttctttctt ctttttgtgg gtagaatttg 540aatccctcag cattgttcat cggtagtttt tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg 600tgtttttata ctagtggcta tcctgacacg gtctctttgt caaatatctc tgtgtgcagg 660tataactgca ggaaacaaca acaataacca tg 692<210>7<211>750<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述載體pBS-ART的EcoRI和SacI位點間的序列<400>7gaattctata tataggaagt tcatttcatt tggagccccc caaccctacc accaccacca 60ccaccacctc ctccttcaca caacacacac acaacagatc tcccccatcc tccctcccgt 120cgcgccgcgc aacacctggt aagatggctg tgcgctcaga tatatatagt gatatgcact 180acaaagatca taactagacc gccgcctccc cccccccccc tctctacctt ctctctttct 240ttctccgttt tttttttccg tctcgtctcg atctttggcc ttggtagttt gggggcgaga 300ggcggcttcg tcgcccagat cggtgcgcgt ttttttattt ggaggggcgg gatctcgcgg 360
ctgggtctcg gcgtgcggcc ggattctcgc ggggaatggg gctctcggat gtggatctga 420tccgccgttg ttgggggaga tatggggcgt ttaaaatttc gccatgctaa acaagatcag 480gaagagggga aaagggcact atggtttaat ttttatatat ttctgctgct gctcgtcagg 540attagatgtg cttgatcttt ctttcttctt tttgtgggta gaatttgaat ccctcagcat 600tgttcatcgg tagtttttct tttgtcgatg ctcaccctgt tgtttggtgt ttttatacta 660gtggctatcc tgacacggtc tctttgtcaa atatctctgt gtgcaggtat aactgcagga 720aacaacaaca ataaccatgg tctagagctc 750<210>8<211>757<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述人工外顯子/內(nèi)含子/外顯子ARTE.
<400>8accaccacca ccaccaccac ctcctccttc acacaacaca cacacaacag atctccccca 60tcctccctcc cgtcgcgccg cgcaacacct ggtaagatgg ctgtgcgctc agatatatat 120agtgatatgc actacaaaga tcataactag accgccgcct cccccccccc ccctctctac 180cttctctctt tctttctccg tttttttttt ccgtctcgtc tcgatctttg gccttggtag 240tttgggggcg agaggcggct tcgtcgccca gatcggtgcg cgttttttta tttggagggg 300cgggatctcg cggctgggtc tcggcgtgcg gccggattct cgcggggaat ggggctctcg 360gatgtggatc tgatccgccg ttgttggggg agatatgggg cgtttaaaat ttcgccatgc 420taaacaagat caggaagagg ggaaaagggc actatggttt aatttttata tatttctgct 480gctgctcgtc aggattagat gtgcttgatc tttctttctt ctttttgtgg gtagaatttg 540aatccctcag cattgttcat cggtagtttt tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg 600tgtttttata ctagtggcta tcctgacacg gtctctttgt caaatatctc tgtgtgcagg 660tataactgca ggaaacaaat tgaacatcat tctatcaata caacacaaac acaacacaac 720tcaatcattt atttgacaac acaactaaac aaccatg 757<210>9<211>815<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述載體pPARTE的EcoRI和SacI位點間的序列<400>9
gaattctata tataggaagt tcatttcatt tggagccccc caaccctacc accaccacca 60ccaccacctc ctccttcaca caacacacac acaacagatc tcccccatcc tccctcccgt 120cgcgccgcgc aacacctggt aagatggctg tgcgctcaga tatatatagt gatatgcact 180acaaagatca taactagacc gccgcctccc cccccccccc tctctacctt ctctctttct 240ttctccgttt tttttttccg tctcgtctcg atctttggcc ttggtagttt gggggcgaga 300ggcggcttcg tcgcccagat cggtgcgcgt ttttttattt ggaggggcgg gatctcgcgg 360ctgggtctcg gcgtgcggcc ggattctcgc ggggaatggg gctctcggat gtggatctga 420tccgccgttg ttgggggaga tatggggcgt ttaaaatttc gccatgctaa acaagatcag 480gaagagggga aaagggcact atggtttaat ttttatatat ttctgctgct gctcgtcagg 540attagatgtg cttgatcttt ctttcttctt tttgtgggta gaatttgaat ccctcagcat 600tgttcatcgg tagtttttct tttgtcgatg ctcaccctgt tgtttggtgt ttttatacta 660gtggctatcc tgacacggtc tctttgtcaa atatctctgt gtgcaggtat aactgcagga 720aacaaattga acatcattct atcaatacaa cacaaacaca acacaactca atcatttatt 780tgacaacaca actaaacaac catggtctag agctc815<210>10<211>184<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成片段En-Acl.
<400>10atcaccgtga gttgtccgca ccaccgcacg tctcgcagcc aaaaaaaaaa aaagaaagaa 60aaaaaagaaa aagaaaaaac agcaggtggg tccgggtcgt gggggccgga aaagcgagga 120ggatcgcgag cagcgacgag gccggccctc cctccgcttc caaagaaacg ccccccatca 180attc 184<210>11<211>94<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成片段En-Ac2.
<400>11aagcttgata tccatagcaa gcccagccca acccaaccca acccaaccca ccccagtgca 60gccaactggc aaatagtctc cacaccccgg cact 94
<210>12<211>1087<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述載體pAPARTE的HindIII和SacI位點間的序列<400>12aagcttgata tccatagcaa gcccagccca acccaaccca acccaaccca ccccagtgca 60gccaactggc aaatagtctc cacaccccgg cactatcacc gtgagttgtc cgcaccaccg 120cacgtctcgc agccaaaaaa aaaaaaagaa agaaaaaaaa gaaaaagaaa aaacagcagg 180tgggtccggg tcgtgggggc cggaaaagcg aggaggatcg cgagcagcga cgaggccggc 240cctccctccg cttccaaaga aacgcccccc atcaattcta tatataggaa gttcatttca 300tttggagccc cccaacccta ccaccaccac caccaccacc tcctccttca cacaacacac 360acacaacaga tctcccccat cctccctccc gtcgcgccgc gcaacacctg gtaagatggc 420tgtgcgctca gatatatata gtgatatgca ctacaaagat cataactaga ccgccgcctc 480cccccccccc cctctctacc ttctctcttt ctttctccgt tttttttttc cgtctcgtct 540cgatctttgg ccttggtagt ttgggggcga gaggcggctt cgtcgcccag atcggtgcgc 600gtttttttat ttggaggggc gggatctcgc ggctgggtct cggcgtgcgg ccggattctc 660gcggggaatg gggctctcgg atgtggatct gatccgccgt tgttggggga gatatggggc 720gtttaaaatt tcgccatgct aaacaagatc aggaagaggg gaaaagggca ctatggttta 780atttttatat atttctgctg ctgctcgtca ggattagatg tgcttgatct ttctttcttc 840tttttgtggg tagaatttga atccctcagc attgttcatc ggtagttttt cttttgtcga 900tgctcaccct gttgtttggt gtttttatac tagtggctat cctgacacgg tctctttgtc 960aaatatctct gtgtgcaggt ataactgcag gaaacaaatt gaacatcatt ctatcaatac 1020aacacaaaca caacacaact caatcattta tttgacaaca caactaaaca accatggtct 1080agagctc 1087<210>13<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成片段ASP.
<400>13gtcgactgac gcttcgaatg acgcacatgc c 31
<210>14<211>1065<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述載體p2A1PARTE的KpnI和SacI位點間的序列<400>14ggtaccgggc cccccctcga ctgacgcttc gaatgacgca catgccatca ccgtgagttg 60tccgcaccac cgcacgtctc gcagccaaaa aaaaaaaaag aaagaaaaaa aagaaaaaga 120aaaaacagca ggtgggtccg ggtcgtgggg gccggaaaag cgaggaggat cgctgacgct 180tcgaatgacg cacatgcccg agcagcgacg aggccggccc tccctccgct tccaaagaaa 240cgccccccat caattctata tataggaagt tcatttcatt tggagccccc caaccctacc 300accaccacca ccaccacctc ctccttcaca caacacacac acaacagatc tcccccatcc 360tccctcccgt cgcgccgcgc aacacctggt aagatggctg tgcgctcaga tatatatagt 420gatatgcact acaaagatca taactagacc gccgcctccc cccccccccc tctctacctt 480ctctctttct ttctccgttt tttttttccg tctcgtctcg atctttggcc ttggtagttt 540gggggcgaga ggcggcttcg tcgcccagat cggtgcgcgt ttttttattt ggaggggcgg 600gatctcgcgg ctgggtctcg gcgtgcggcc ggattctcgc ggggaatggg gctctcggat 660gtggatctga tccgccgttg ttgggggaga tatggggcgt ttaaaatttc gccatgctaa 720acaagatcag gaagagggga aaagggcact atggtttaat ttttatatat ttctgctgct 780gctcgtcagg attagatgtg cttgatcttt ctttcttctt tttgtgggta gaatttgaat 840ccctcagcat tgttcatcgg tagtttttct tttgtcgatg ctcaccctgt tgtttggtgt 900ttttatacta gtggctatcc tgacacggtc tctttgtcaa atatctctgt gtgcaggtat 960aactgcagga aacaaattga acatcattct atcaatacaa cacaaacaca acacaactca 1020atcatttatt tgacaacaca actaaacaac catggtctag agctc 1065<210>15<211>1135<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述載體p2APARTE的SalI和SacI位點間的序列<400>15gtcgactgac gcttcgaatg acgcacatgc catccatagc aagcccagcc caacccaacc 60caacccaacc caccccagtg cagccaactg gcaaatagtc tccacacccc ggcactatca 120
ccgtgagttg tccgcaccac cgcacgtctc gcagccaaaa aaaaaaaaag aaagaaaaaa 180aagaaaaaga aaaaacagca ggtgggtccg ggtcgtgggg gccggaaaag cgaggaggat 240cgctgacgct tcgaatgacg cacatgcccg agcagcgacg aggccggccc tccctccgct 300tccaaagaaa cgccccccat caattctata tataggaagt tcatttcatt tggagccccc 360caaccctacc accaccacca ccaccacctc ctccttcaca caacacacac acaacagatc 420tcccccatcc tccctcccgt cgcgccgcgc aacacctggt aagatggctg tgcgctcaga 480tatatatagt gatatgcact acaaagatca taactagacc gccgcctccc cccccccccc 540tctctacctt ctctctttct ttctccgttt tttttttccg tctcgtctcg atctttggcc 600ttggtagttt gggggcgaga ggcggcttcg tcgcccagat cggtgcgcgt ttttttattt 660ggaggggcgg gatctcgcgg ctgggtctcg gcgtgcggcc ggattctcgc ggggaatggg 720gctctcggat gtggatctga tccgccgttg ttgggggaga tatggggcgt ttaaaatttc 780gccatgctaa acaagatcag gaagagggga aaagggcact atggtttaat ttttatatat 840ttctgctgct gctcgtcagg attagatgtg cttgatcttt ctttcttctt tttgtgggta 900gaatttgaat ccctcagcat tgttcatcgg tagtttttct tttgtcgatg ctcaccctgt 960tgtttggtgt ttttatacta gtggctatcc tgacacggtc tctttgtcaa atatctctgt 1020gtgcaggtat aactgcagga aacaaattga acatcattct atcaatacaa cacaaacaca 1080acacaactca atcatttatt tgacaacaca actaaacaac catggtctag agctc 1135<210>16<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸引物Oli-U1.
<400>16gaaggtaccg ccatggtcta aaggacaatt g 31<210>17<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸引物Oli-U2.
<400>17ctcctcgagg gcgtttaaca ggctggc 27
<210>18<211>186<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成片段En-U2.
<400>18ggtaccgagc attgcatgtc taagttataa aaaattacca catatttttt ttgtcacact 60tgtttgaagt gcagtttatc tatctttata catatattta aactttactc tacgaataat 120ataatctata gtacaacaat aatatcagtg ttttagagaa tcatataaat gaacagttag 180acatgg186<210>19<211>563<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述玉米遍在蛋白-1基因的轉(zhuǎn)錄活化子序列(-299至-855區(qū)).
<400>19ggtaccgagc attgcatgtc taagttataa aaaattacca catatttttt ttgtcacact 60tgtttgaagt gcagtttatc tatctttata catatattta aactttactc tacgaataat 120ataatctata gtacaacaat aatatcagtg ttttagagaa tcatataaat gaacagttag 180acatggtcta aaggacaatt gagtattttg acaacaggac tctacagttt tatcttttta 240gtgtgcatgt gttctccttt ttttttgcaa atagcttcac ctatataata cttcatccat 300tttattagta catccattta gggtttaggg ttaatggttt ttatagacta atttttttag 360tacatctatt ttattctatt ttagcctcta aattaagaaa actaaaactc tattttagtt 420tttttattta ataatttaga tataaaatag aataaaataa agtgactaaa aattaaacaa 480atacccttta agaaattaaa aaaactaagg aaacattttt cttgtttcga gtagataatg 540ccagcctgtt aaacgccctc gac 563<210>20<211>1692<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述載體pU3RTE的KpnI和SacI位點間的序列<400>20ggtaccgagc attgcatgtc taagttataa aaaattacca catatttttt ttgtcacact 60tgtttgaagt gcagtttatc tatctttata catatattta aactttactc tacgaataat 120ataatctata gtacaacaat aatatcagtg ttttagagaa tcatataaat gaacagttag 180acatggtcta aaggacaatt gagtattttg acaacaggac tctacagttt tatcttttta 240gtgtgcatgt gttctccttt ttttttgcaa atagcttcac ctatataata cttcatccat 300tttattagta catccattta gggtttaggg ttaatggttt ttatagacta atttttttag 360tacatctatt ttattctatt ttagcctcta aattaagaaa actaaaactc tattttagtt 420tttttattta ataatttaga tataaaatag aataaaataa agtgactaaa aattaaacaa 480atacccttta agaaattaaa aaaactaagg aaacattttt cttgtttcga gtagataatg 540ccagcctgtt aaacgccctc gactgacgct tcgaatgacg cacatgccat ccatagcaag 600cccagcccaa cccaacccaa cccaacccac cccagtgcag ccaactggca aatagtctcc 660acaccccggc actatcaccg tgagttgtcc gcaccaccgc acgtctcgca gccaaaaaaa 720aaaaaagaaa gaaaaaaaag aaaaagaaaa aacagcaggt gggtccgggt cgtgggggcc 780ggaaaagcga ggaggatcgc tgacgcttcg aatgacgcac atgcccgagc agcgacgagg 840ccggccctcc ctccgcttcc aaagaaacgc cccccatcaa ttctatatat aggaagttca 900tttcatttgg agccccccaa ccctaccacc accaccacca ccacctcctc cttcacacaa 960cacacacaca acagatctcc cccatcctcc ctcccgtcgc gccgcgcaac acctggtaag 1020atggctgtgc gctcagatat atatagtgat atgcactaca aagatcataa ctagaccgcc 1080gcctcccccc ccccccctct ctaccttctc tctttctttc tccgtttttt ttttccgtct 1140cgtctcgatc tttggccttg gtagtttggg ggcgagaggc ggcttcgtcg cccagatcgg 1200tgcgcgtttt tttatttgga ggggcgggat ctcgcggctg ggtctcggcg tgcggccgga 1260ttctcgcggg gaatggggct ctcggatgtg gatctgatcc gccgttgttg ggggagatat 1320ggggcgttta aaatttcgcc atgctaaaca agatcaggaa gaggggaaaa gggcactatg 1380gtttaatttt tatatatttc tgctgctgct cgtcaggatt agatgtgctt gatctttctt 1440tcttcttttt gtgggtagaa tttgaatccc tcagcattgt tcatcggtag tttttctttt 1500gtcgatgctc accctgttgt ttggtgtttt tatactagtg gctatcctga cacggtctct 1560ttgtcaaata tctctgtgtg caggtataac tgcaggaaac aaattgaaca tcattctatc 1620aatacaacac aaacacaaca caactcaatc atttatttga caacacaact aaacaaccat 1680ggtctagagc tc 1692<210>21<211>223<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成片段GLU.
<400>21ctcgagatac atattaagag tatggacaga catttcttta acaaactcca tttgtattac 60tccaaaagca ccagaagttt gtcatggctg agtcatgaaa tgtatagttc aatcttgcaa 120agttgccttt ccttttgtac tgtgttttaa cactacaagc catatattgt ctgtacgtgc 180aacaaactat atcaccatgt atcccaagat gcttttttaa ttc 223<210>22<211>1032<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述載體pGARTE的XhoI和SacI位點間的序列<400>22ctcgagatac atattaagag tatggacaga catttcttta acaaactcca tttgtattac 60tccaaaagca ccagaagttt gtcatggctg agtcatgaaa tgtatagttc aatcttgcaa 120agttgccttt ccttttgtac tgtgttttaa cactacaagc catatattgt ctgtacgtgc 180aacaaactat atcaccatgt atcccaagat gcttttttaa ttctatatat aggaagttca 240tttcatttgg agccccccaa ccctaccacc accaccacca ccacctcctc cttcacacaa 300cacacacaca acagatctcc cccatcctcc ctcccgtcgc gccgcgcaac acctggtaag 360atggctgtgc gctcagatat atatagtgat atgcactaca aagatcataa ctagaccgcc 420gcctcccccc ccccccctct ctaccttctc tctttctttc tccgtttttt ttttccgtct 480cgtctcgatc tttggccttg gtagtttggg ggcgagaggc ggcttcgtcg cccagatcgg 540tgcgcgtttt tttatttgga ggggcgggat ctcgcggctg ggtctcggcg tgcggccgga 600ttctcgcggg gaatggggct ctcggatgtg gatctgatcc gccgttgttg ggggagatat 660ggggcgttta aaatttcgcc atgctaaaca agatcaggaa gaggggaaaa gggcactatg 720gtttaatttt tatatatttc tgctgctgct cgtcaggatt agatgtgctt gatctttctt 780tcttcttttt gtgggtagaa tttgaatccc tcagcattgt tcatcggtag tttttctttt 840gtcgatgctc accctgttgt ttggtgtttt tatactagtg gctatcctga cacggtctct 900ttgtcaaata tctctgtgtg caggtataac tgcaggaaac aaattgaaca tcattctatc 960aatacaacac aaacacaaca caactcaatc atttatttga caacacaact aaacaaccat 1020ggtctagagc tc 103權(quán)利要求
1).人工啟動子，其特征在于是啟動融合到其3’端的任何DNA序列在植物細胞中表達的重組DNA分子，包含a).5’轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件，后接b).包含TATA盒、GC含量少于64％的核苷酸序列以及轉(zhuǎn)錄起始位點的人工核心啟動子，其3’端融合到c).可轉(zhuǎn)錄但不可翻譯的合成核苷酸序列，包含第一嵌合外顯子、一個能夠增強與其融合的基因在植物中表達的人工內(nèi)含子及對下游插入的任何基因具有翻譯增強特性的第二嵌合外顯子。
2).權(quán)利要求1的人工啟動子，特征在于它是具有人工的5’轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的重組DNA分子。
3).權(quán)利要求1的人工啟動子，特征在于它是具有與天然增強和/或調(diào)節(jié)植物細胞中基因表達的DNA序列同源的5’轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的重組DNA分子。
4).權(quán)利要求3的人工啟動子，其5’轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件來自稻肌動蛋白-1基因。
5).權(quán)利要求4的人工啟動子，其5’轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件包含稻肌動蛋白-1基因轉(zhuǎn)錄起始位點的-43至-310區(qū)。
6).權(quán)利要求5的人工啟動子，其5’轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件核苷酸序列對應于SEQ ID NO10序列或其片段。
7).權(quán)利要求5的人工啟動子，其5’轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件核苷酸序列對應于SEQ ID NO11序列或其片段。
8).權(quán)利要求3的人工啟動子，其5’轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件來自玉米遍在蛋白-1基因。
9).權(quán)利要求8的人工啟動子，其核苷酸序列包含玉米遍在蛋白-1基因轉(zhuǎn)錄起始位點的-299至-855區(qū)。
10).權(quán)利要求9的人工啟動子，其5’轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件對應于SEQ IDNO19序列或其片段。
11).權(quán)利要求2和3的人工啟動子，其5’轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件是as-1樣轉(zhuǎn)錄增強子。
12).權(quán)利要求11的人工啟動子，其as-1樣轉(zhuǎn)錄增強子的核苷酸序列與對應于SEQ ID NO13中核苷酸7-26或互補序列的序列片段基本相同。
13).權(quán)利要求3的人工啟動子，其5’轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件來自病毒啟動子。
14).權(quán)利要求13的人工啟動子，其5’轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件來自CaMV35S啟動子。
15).權(quán)利要求2和3的人工啟動子，其5’轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件控制植物細胞中發(fā)育、器官或組織特異性的基因表達。
16).權(quán)利要求15的人工啟動子，其5’轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件控制種子中的表達。
17).權(quán)利要求16的人工啟動子，其5’轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件來自稻谷蛋白B-1基因。
18).權(quán)利要求17的人工啟動子，其5’轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件包含稻谷蛋白B-1基因轉(zhuǎn)錄起始位點-31至-245區(qū)的片段。
19).權(quán)利要求18的人工啟動子，其中5’轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件對應于SEQID NO21序列或其片段。
20).權(quán)利要求15的人工啟動子，其中5’轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件控制植物細胞中生物或非生物壓力下的基因表達。
21).權(quán)利要求15的人工啟動子，其中5’轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件控制植物創(chuàng)傷組織中的基因表達。
22).權(quán)利要求1的人工啟動子，其中5’轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件包含有效融合的2個或多個不同來源的調(diào)節(jié)元件，它們分別符合權(quán)利要求2-21所述的任意特征。
23).權(quán)利要求1的人工啟動子，其中人工外顯子/內(nèi)含子/外顯子區(qū)的第一個外顯子包含富含C和A的序列基序。
24).權(quán)利要求1的人工啟動子，其中人工外顯子/內(nèi)含子/外顯子區(qū)的第一個外顯子包含其中CTCC基序和/或其同源性序列CTC、TCC和TC頻繁重復的序列。
25).權(quán)利要求1的人工啟動子，其中人工外顯子/內(nèi)含子/外顯子區(qū)的內(nèi)含子包含其中CTCC基序和/或其同源性序列CTC、TCC和TC頻繁重復的序列。
26).權(quán)利要求23-25的人工啟動子，其中人工外顯子/內(nèi)含子/外顯子區(qū)的核苷酸序列對應于SEQ ID NO6或其片段。
27).權(quán)利要求1的人工啟動子，其中人工外顯子/內(nèi)含子/外顯子區(qū)的第二個外顯子包含高C和A含量的序列基序。
28).權(quán)利要求1的人工啟動子，其中人工外顯子/內(nèi)含子/外顯子區(qū)的第二個外顯子包含至少與基序HCAYYY(H＝C或T或A；Y＝C或T)具有83％同源性的序列。
29).權(quán)利要求27和28的人工啟動子，其中人工外顯子/內(nèi)含子/外顯子區(qū)的第二個外顯子的核苷酸序列對應于SEQ ID NO1序列。
30).權(quán)利要求23-29的人工啟動子，其中人工外顯子/內(nèi)含子/外顯子區(qū)的核苷酸序列對應于SEQ ID NO8或其片段。
31).權(quán)利要求1-30的人工啟動子，其中人工外顯子/內(nèi)含子/外顯子區(qū)的核苷酸序列至少部分對應于SEQ ID NO20中的序列。
32).權(quán)利要求1-31的人工啟動子的DNA片段，在與植物中具有功能的任何啟動子融合以后，有助于增強受該啟動子控制的DNA序列的表達。
33).權(quán)利要求32的人工啟動子片段，能夠增強與其融合的基因的翻譯。
34).權(quán)利要求33的人工啟動子片段，包含至少與基序HCAYYY(H＝C或T或A；Y＝C或T)具有83％同源性的序列。
35).權(quán)利要求33的人工啟動子片段，具有富含C和A的序列基序。
36).權(quán)利要求33的人工啟動子片段，其中核苷酸序列對應于SEQID NO；1序列。
37).權(quán)利要求33-36的人工啟動子片段，有助于增強植物細胞中由CaMV 35S啟動子生成的mRNA的翻譯。
38).權(quán)利要求32的人工啟動子片段，對應于外顯子/內(nèi)含子/外顯子區(qū)。
39).權(quán)利要求38的人工啟動子片段，其中第一個外顯子包含富含C和A的序列基序。
40).權(quán)利要求38的人工啟動子片段，其中第一個外顯子包含其中CTCC基序和/或其同源性序列CTC、TCC和TC頻繁重復的序列。
41).權(quán)利要求38的人工啟動子片段，其中內(nèi)含子包含其中CTCC基序和/或其同源性序列CTC、TCC和TC頻繁重復的序列。
42).權(quán)利要求38的人工啟動子片段，其中核苷酸序列對應于SEQID NO6中的序列。
43).權(quán)利要求38的人工啟動子片段，其中核苷酸序列對應于SEQID NO8中的序列。
44).權(quán)利要求38-43的人工啟動子片段，有助于增強植物細胞中CaMV 35S啟動子控制下的任何基因的表達。
45).權(quán)利要求32的人工啟動子片段，對應于as-1樣轉(zhuǎn)錄增強子。
46).人工啟動子片段，其核苷酸序列與SEQ ID NO13中核苷酸7-26對應片段或其互補序列基本相同。
47).權(quán)利要求32的人工啟動子片段，對應于5’轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件。
48).權(quán)利要求47的人工啟動子片段，其中5’轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件來自稻肌動蛋白-1基因。
49).權(quán)利要求48的人工啟動子片段，其中核苷酸序列包含稻肌動蛋白-1基因轉(zhuǎn)錄起始位點-43至-310區(qū)的片段。
50).權(quán)利要求49的人工啟動子片段，其中核苷酸序列對應于SEQID NO10中序列或其片段。
51).權(quán)利要求49的人工啟動子片段，其核苷酸序列對應于SEQID NO11序列或其片段。
52).權(quán)利要求47的人工啟動子片段，其5’轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件來自玉米遍在蛋白-1基因。
53).權(quán)利要求52的人工啟動子片段，其中核苷酸序列包含玉米遍在蛋白-1基因轉(zhuǎn)錄起始位點的-299至-855區(qū)。
54).權(quán)利要求53的人工啟動子片段，其中5’轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件對應于SEQ ID NO19中的序列或其片段。
55).在植物細胞中DNA序列表達盒子，其包含符合權(quán)利要求1-31中任一項的人工啟動子。
56).在植物細胞中DNA序列表達盒子，其包含與相應于權(quán)利要求32-54中任一項的DNA片段功能性融合的轉(zhuǎn)錄增強子元件。
57).用于植物細胞轉(zhuǎn)化的DNA載體，包含具有權(quán)利要求55或56特征的表達盒之一。
58).帶有權(quán)利要求57的載體的細菌細胞及其后代。
59).權(quán)利要求57的載體轉(zhuǎn)化的植物細胞及其后代。
60).權(quán)利要求59的植物細胞，在通過權(quán)利要求57所述載體引入的表達盒中的人工啟動子控制下表達DNA片段。
61).權(quán)利要求59的植物細胞，其基因組中穩(wěn)定整合了具有權(quán)利要求55或56特征的表達盒。
62).由具有權(quán)利要求61特征的植物細胞再生的轉(zhuǎn)基因植物。
63).權(quán)利要求62的轉(zhuǎn)基因植物，在通過權(quán)利要求57所述載體引入的表達盒所含人工啟動子控制下表達DNA片段。
64).具有權(quán)利要求63特征的轉(zhuǎn)基因植物后代。
65).權(quán)利要求64的植物，是雙子葉植物。
66).權(quán)利要求65的植物，是茄科植物。
67).權(quán)利要求66的植物，屬于以下物種之一煙草、番茄或馬鈴薯。
68).權(quán)利要求64的植物，是單子葉植物。
69).權(quán)利要求68的植物，是禾本科植物。
70).權(quán)利要求69的植物，屬于以下物種之一稻、甘蔗、玉米、小麥或大麥。
71).權(quán)利要求60或63的細胞或植物因位于通過權(quán)利要求57所述載體引入的表達盒所含人工啟動子控制下表達DNA片段而生成的重組蛋白質(zhì)的純化或用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及特征在于包含嵌合重組DNA分子的人工啟動子，當引入任何類型的植物細胞以后，可促進與其3′端融合的任何DNA分子的高水平表達。本發(fā)明所述啟動子的基本遺傳元件為具共有序列TATA盒的核心啟動子后接外顯子/內(nèi)含子/外顯子區(qū)以及翻譯增強子元件，均為人工構(gòu)建。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件可插入所述啟動子上游，以提供具有器官或組織特異的時間應答能力的表達。所設(shè)計的人工遺傳元件可功能性插入在植物細胞中起作用的任何啟動子與任何DNA序列之間，以提高其轉(zhuǎn)錄/翻譯水平。
文檔編號C12N15/82GK1738902SQ200380108708
公開日2006年2月22日 申請日期2003年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月27日
發(fā)明者G·塞爾曼－豪森索莎, A·薩拉查羅德里格斯, D·阿布雷烏雷梅迪奧斯, O·拉莫斯岡薩雷斯 申請人:遺傳工程與生物技術(shù)中心