專利名稱：使用生物標(biāo)記譜診斷膿毒或者sirs的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及診斷或者預(yù)測(cè)個(gè)體中膿毒或者其發(fā)展階段的方法。本發(fā)明還涉及診斷個(gè)體中系統(tǒng)性炎性應(yīng)答綜合癥的方法。
背景技術(shù)：
疾病狀態(tài)的早期檢出通常容許更有效的治療性治療和相應(yīng)的更有利的臨床結(jié)果。然而，在許多情況中，疾病癥狀的早期檢出存在問(wèn)題；所以，在可能診斷之前疾病可能變成相對(duì)的晚期。系統(tǒng)性炎性病癥代表一類這種疾病。這些病癥，尤其是膿毒，通常由病原微生物和宿主的防御系統(tǒng)的相互作用引起，該相互作用在宿主中引發(fā)過(guò)度且調(diào)節(jié)異常的炎性反應(yīng)。系統(tǒng)性炎性反應(yīng)期間宿主應(yīng)答的復(fù)雜性使得針對(duì)理解疾病病理的努力錯(cuò)綜復(fù)雜(Healy，Annul.Pharmacother.36648-54(2002)中的綜述)。疾病病理的不完全理解又使發(fā)現(xiàn)診斷性生物標(biāo)記變得困難。然而，由于膿毒非?？斓匕l(fā)展成威脅生命的病癥，所以迫切需要早期并且可靠的診斷。
膿毒遵循一種明確的時(shí)間歷程，從系統(tǒng)性炎性應(yīng)答綜合癥(“SIRS”)-陰性到SIRS-陽(yáng)性到膿毒，然后膿毒發(fā)展成嚴(yán)重膿毒、膿毒性休克、多種器官功能異常(“MOD”)，最終死亡。當(dāng)受感染的個(gè)體隨后發(fā)生SIRS時(shí)，該個(gè)體中也可以出現(xiàn)膿毒?！癝IRS”通常被定義為存在下面參數(shù)的兩種或多種體溫大于38℃或者小于36℃；心率大于每分鐘90次；呼吸率大于每分鐘20次呼吸；PCO2小于32mm Hg；和白細(xì)胞數(shù)小于4.0×109個(gè)細(xì)胞/L或者大于12.0×109個(gè)細(xì)胞/L，或者具有大于10％不成熟帶形?！澳摱尽蓖ǔ１欢x為具有確定的感染過(guò)程的SIRS。“嚴(yán)重膿毒”與MOD、低血壓、彌漫性血管內(nèi)凝血(“DIC”)或者灌注不足異常，其包括乳酸中毒癥、少尿、和精神狀態(tài)的改變?！澳摱拘孕菘恕蓖ǔ１欢x為膿毒誘導(dǎo)的低血壓，其抗液體復(fù)蘇并且還存在灌注不足異常。
記載臨床上對(duì)膿毒重要的病原微生物的存在已經(jīng)被證明是困難的。通常通過(guò)培養(yǎng)患者的血液、痰、尿、傷口分泌物、內(nèi)在的線導(dǎo)管表面，等等來(lái)檢測(cè)致病微生物。然而，致病微生物可能僅存在于某些身體的微環(huán)境中，從而所培養(yǎng)的具體材料可能不含有污染性微生物。可以由于感染部位存在的微生物數(shù)目少而使得檢測(cè)更加復(fù)雜。血樣中病原數(shù)目少給通過(guò)培養(yǎng)血液診斷膿毒帶來(lái)了特別的問(wèn)題。在一個(gè)研究中，例如，僅在17％的具有膿毒臨床表現(xiàn)的患者中得到陽(yáng)性培養(yǎng)結(jié)果(Rangel-Frausto等人，JAMA 273117-23(1995).)。非病原微生物污染樣品可以使診斷進(jìn)一步復(fù)雜化。例如，僅12.4％的被檢測(cè)的微生物在707名敗血病患者的研究中是臨床上重要的。(Weinstein等人，Clinical Infectious Diseases 24584-602(1997).)膿毒的早期診斷的困難可以由與該疾病相關(guān)的高發(fā)病和高死亡率反映。當(dāng)前膿毒是美國(guó)第十位主要的死亡原因并且在非冠狀重病監(jiān)護(hù)室(ICUs)的住院患者中特別普遍，重病監(jiān)護(hù)室中膿毒是最常見(jiàn)的死亡原因?？偹劳雎矢哌_(dá)35％，估計(jì)僅在美國(guó)每年就發(fā)生750,000例。僅美國(guó)治療膿毒的年花費(fèi)就為數(shù)十美元。
因此，需要足夠早地診斷并且允許有效干預(yù)和防止膿毒的方法。大多數(shù)現(xiàn)有的膿毒打分系統(tǒng)或者預(yù)測(cè)模型僅預(yù)測(cè)已經(jīng)被認(rèn)為是膿毒的患者中晚期并發(fā)癥(包括死亡)的危險(xiǎn)。然而，這些系統(tǒng)和模型不預(yù)測(cè)膿毒自身的發(fā)展。尤其需要將那些患者分成將患膿毒或者不患膿毒的SIRS患者的方法。當(dāng)前，研究人員通常定義單一的生物標(biāo)記，該生物標(biāo)記在膿毒患者組和患者的正常(即，非膿毒)對(duì)照組中的表達(dá)水平不同。2003年3月26日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)序號(hào)10/400,275(其完整內(nèi)容被并入作為參考)公開(kāi)了通過(guò)分析各種生物標(biāo)記的表達(dá)水平中的依賴時(shí)間的變化揭示早期膿毒的方法。因此，診斷早期膿毒的最佳方法當(dāng)前需要檢測(cè)多種生物標(biāo)記和監(jiān)視一段時(shí)間內(nèi)這些生物標(biāo)記的表達(dá)。
本領(lǐng)域中持續(xù)迫切需要特異且靈敏地診斷膿毒，而不需要隨時(shí)間監(jiān)視患者。理想地，通過(guò)一種技術(shù)進(jìn)行診斷，該技術(shù)準(zhǔn)確、快速并且在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)多種生物標(biāo)記，從而使在診斷所需的時(shí)間內(nèi)疾病的發(fā)展最小化。
發(fā)明概述本發(fā)明通過(guò)在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)檢測(cè)來(lái)自生物樣品的一種以上的生物標(biāo)記而允許準(zhǔn)確、快速和靈敏地預(yù)測(cè)和診斷膿毒。通過(guò)在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)從個(gè)體，尤其具有患膿毒危險(xiǎn)、患有膿毒，或者被懷疑患有膿毒的個(gè)體得到生物標(biāo)記譜，并將來(lái)自該個(gè)體的生物標(biāo)記譜與參比生物標(biāo)記譜相比較，實(shí)現(xiàn)該預(yù)測(cè)和診斷?？梢詮囊蝗簜€(gè)體(“參比群體”)得到參比生物標(biāo)記譜，這些個(gè)體例如，受到膿毒的折磨或者遭受膿毒發(fā)作或者處于膿毒發(fā)展的特定階段。如果來(lái)自該個(gè)體的生物標(biāo)記譜含有來(lái)自參比群體的生物標(biāo)記譜的適宜的特征性特征，那么該個(gè)體被診斷為更可能與參比群體一樣發(fā)展成膿毒、受到膿毒的折磨或者處于膿毒發(fā)展的特定階段。從各種個(gè)體群體也可以得到參比生物標(biāo)記譜，這些群體包括患有SIRS或者受到感染但是沒(méi)有SIRS的那些個(gè)體。因此，本發(fā)明允許臨床醫(yī)生確定哪些患者不患有SIRS，哪些患有SIRS但是不可能在研究的期限內(nèi)患膿毒，哪些患者患有膿毒，或者哪些處于最終患膿毒的危險(xiǎn)中。
盡管本發(fā)明的方法尤其可用于檢測(cè)或預(yù)測(cè)SIRS患者中膿毒的發(fā)作，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解本發(fā)明的方法可以用于任一患者，該患者包括，但不限于，被懷疑患有SIRS或者處于膿毒的任一階段的患者。例如，可以從患者采集生物樣品，并且可以將該樣品中的生物標(biāo)記譜與幾種不同的參比生物標(biāo)記譜相比較，這些參比生物標(biāo)記譜的每一種來(lái)自例如患有SIRS或者處于膿毒的特定階段的患者。將該患者的生物標(biāo)記譜分類為相應(yīng)于來(lái)自特定參比群體的圖可以預(yù)測(cè)該患者屬于該參比群體中?；趶谋景l(fā)明的方法所得的診斷，可以啟動(dòng)適宜的治療方案。
用于診斷或者預(yù)測(cè)SIRS、膿毒或者膿毒發(fā)展的階段的現(xiàn)有方法是基于非特異的臨床病征和癥狀；因此，所得診斷通常具有有限的臨床效用。因?yàn)楸景l(fā)明的方法準(zhǔn)確地檢測(cè)膿毒的各種階段，所以這些方法可用于鑒定可能適宜地參加治療研究的那些個(gè)體。因?yàn)榭梢詮膯蝹€(gè)時(shí)間點(diǎn)所得的生物樣品中生物標(biāo)記表達(dá)的“快照”預(yù)測(cè)或診斷膿毒，所以該治療研究可以在嚴(yán)重的臨床癥狀出現(xiàn)之前開(kāi)始。因?yàn)闇y(cè)定生物樣品的生物標(biāo)記譜，所以不必鑒定具體生物標(biāo)記。然而，本發(fā)明提供了鑒定膿毒或者膿毒發(fā)展的特定階段的特征性圖譜的特定生物標(biāo)記的方法。這些生物標(biāo)記自身將是預(yù)測(cè)或者診斷膿毒的有用工具。
因此，本發(fā)明提供了預(yù)測(cè)個(gè)體中膿毒發(fā)作的方法。這些方法包括在單個(gè)時(shí)間點(diǎn)從個(gè)體得到生物標(biāo)記譜并將該個(gè)體的生物標(biāo)記譜與參比生物標(biāo)記譜相比較。生物標(biāo)記譜的比較可以預(yù)測(cè)個(gè)體中膿毒的發(fā)作，預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確度為至少60％?？梢栽谀摱景l(fā)作前任何時(shí)間再次重復(fù)該方法。
本發(fā)明還提供了確定患有或者被懷疑患有膿毒的個(gè)體中膿毒發(fā)展的方法，該方法包括在單個(gè)時(shí)間點(diǎn)從該個(gè)體得到生物標(biāo)記譜并將該個(gè)體的生物標(biāo)記譜與參比生物標(biāo)記譜相比較。生物標(biāo)記譜的比較可以診斷個(gè)體中的膿毒，診斷的準(zhǔn)確度為至少60％?？梢栽谌魏螘r(shí)間對(duì)該個(gè)體重復(fù)該方法。
本發(fā)明還提供了確定患有或者被懷疑患有膿毒的個(gè)體中膿毒的發(fā)展(例如，階段)的方法。該方法包括在單個(gè)時(shí)間點(diǎn)從該個(gè)體得到生物標(biāo)記譜并將該個(gè)體的生物標(biāo)記譜與參比生物標(biāo)記譜相比較。生物標(biāo)記譜的比較可以測(cè)定個(gè)體中的膿毒的發(fā)展，該測(cè)定的準(zhǔn)確度為至少約60％。可以在任何時(shí)間對(duì)該個(gè)體重復(fù)該方法。
此外，本發(fā)明提供了診斷患有或者被懷疑患有SIRS的個(gè)體中SIRS的方法。該方法包括在單個(gè)時(shí)間點(diǎn)從該個(gè)體得到生物標(biāo)記譜并將該個(gè)體的生物標(biāo)記譜與參比生物標(biāo)記譜相比較。生物標(biāo)記譜的比較可以診斷個(gè)體中SIRS，該診斷的準(zhǔn)確度為至少約60％?？梢栽谌魏螘r(shí)間對(duì)該個(gè)體重復(fù)該方法。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了確定個(gè)體中膿毒狀態(tài)或者診斷SIRS的方法，該方法包括應(yīng)用決策規(guī)則。該決策規(guī)則包括比較(i)在單個(gè)時(shí)間點(diǎn)從該個(gè)體采集的生物樣品產(chǎn)生的生物標(biāo)記譜與(i)從參比群體產(chǎn)生的生物標(biāo)記譜。應(yīng)用該決策規(guī)則可以確定該個(gè)體中的膿毒狀態(tài)或者診斷SIRS?？梢栽谝粋€(gè)或多個(gè)分開(kāi)的、單一時(shí)間點(diǎn)對(duì)該個(gè)體重復(fù)該方法。
本發(fā)明還提供了確定個(gè)體中膿毒狀態(tài)或者診斷SIRS的方法，該方法包括從該個(gè)體得到生物標(biāo)記譜并將該個(gè)體的生物標(biāo)記譜與參比生物標(biāo)記譜相比較。一次這種比較就能夠?qū)⒃搨€(gè)體歸為具有參比群體的成員資格。生物標(biāo)記譜的比較還確定了該個(gè)體中膿毒的狀態(tài)或者診斷SIRS。
本發(fā)明還提供了確定個(gè)體中膿毒狀態(tài)或者診斷SIR的方法，該方法包括從采自該個(gè)體的生物樣品得到生物標(biāo)記譜并將該個(gè)體的生物標(biāo)記譜與從來(lái)自參比群體的生物樣品得到的參比生物標(biāo)記譜相比較。參比群體可以選自正常的參比群體、SIR-陽(yáng)性參比群體、受感染的/SIRS陰性參比群體、膿毒陽(yáng)性參比群體、處于膿毒的發(fā)展特定階段的參比群體、通過(guò)常規(guī)技術(shù)在約0到36小時(shí)后將被證實(shí)患有膿毒的SIR-陽(yáng)性參比群體、通過(guò)常規(guī)技術(shù)在約36-60小時(shí)后將被證實(shí)患有膿毒的SIR-陽(yáng)性參比群體、通過(guò)常規(guī)技術(shù)在約60-84小時(shí)后將被證實(shí)患有膿毒的SIR-陽(yáng)性參比群體。一次這種比較就能夠?qū)⒃搨€(gè)體歸為是否為該參比群體成員，并且該比較確定該個(gè)體中膿毒狀態(tài)或者診斷SIRS。
在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了確定個(gè)體中膿毒狀態(tài)或者診斷SIRS的方法。該方法包括比較從該個(gè)體采集的生物樣品得到的生物標(biāo)記譜與從參比群體的生物樣品得到的生物標(biāo)記譜之間的至少一種生物標(biāo)記的可檢測(cè)的特征?；谠摫容^，該個(gè)體被歸為屬于或者不屬于該參比群體。因此，該比較確定該個(gè)體中膿毒狀態(tài)或者診斷SIRS。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些生物標(biāo)記選自表2-13的任一個(gè)中所示的生物標(biāo)記群。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了確定個(gè)體中膿毒狀態(tài)或者診斷SIRS的方法，該方法包括從個(gè)體的生物樣品產(chǎn)生的譜中的一組生物標(biāo)記選擇至少兩種特征。將這些特征與從參比群體的生物樣品產(chǎn)生的譜中的一組相同生物標(biāo)記相比較。一次這種比較就能夠?qū)⒃搨€(gè)體歸為是否為該參比群體成員，準(zhǔn)確度為至少約60％，并且該比較確定該個(gè)體中膿毒狀態(tài)或者診斷SIRS。
本發(fā)明還提供了確定個(gè)體中膿毒狀態(tài)或者診斷SIRS的方法，該方法包括確定個(gè)體的生物樣品中所含的至少兩種生物標(biāo)記的豐度的變化并且將該個(gè)體的樣品中這些生物標(biāo)記的豐度與參比群體的生物樣品中這些生物標(biāo)記的豐度相比較。該比較能夠?qū)⒃搨€(gè)體歸為是否為該參比群體成員，并且該比較確定該個(gè)體中膿毒狀態(tài)或者診斷SIRS。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了確定個(gè)體中膿毒狀態(tài)的方法，該方法包括確定與來(lái)自患有膿毒的參比群體和不患膿毒的參比群體的生物樣品的至少1、2、3、4、5、10或20種生物標(biāo)記的豐度的變化相比，該個(gè)體的至少1、2、3、4、5、10或20種生物標(biāo)記的豐度的變化。生物標(biāo)記選自表2-13任一個(gè)中所列的生物標(biāo)記。備選地，至少1、2、3、4、5、10或20種生物標(biāo)記的豐度可以與至少1、2、3、4、5、10或20種生物標(biāo)記的豐度相比。
本發(fā)明還提供了分離生物標(biāo)記的方法，該生物標(biāo)記在生物樣品中的存在可以診斷或者預(yù)測(cè)膿毒。該方法包括從個(gè)體的群體得到參比生物標(biāo)記譜并鑒定該參比生物標(biāo)記譜中可以預(yù)測(cè)或者診斷膿毒或者膿毒發(fā)展中的階段之一的特征。該方法還包括鑒定與該特征相應(yīng)的生物標(biāo)記，然后分離該生物標(biāo)記。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了試劑盒，其含有選自表2-13任一個(gè)中所列的生物標(biāo)記的至少1、2、3、4、5、10或所有生物標(biāo)記。
在另一實(shí)施方案中，參比生物標(biāo)記譜可以含有至少兩種特征，優(yōu)選5、10或20或更多種的組合，其中這些特征是該樣品中生物標(biāo)記所特有的。在該實(shí)施方案中，這些特征將有助于預(yù)測(cè)該個(gè)體包括在特定參比群體中。通過(guò)數(shù)據(jù)分析算法可以確定這些特征在預(yù)測(cè)包括中的相對(duì)貢獻(xiàn)，該算法預(yù)測(cè)類包括(Class inclusion)的準(zhǔn)確度為至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％。在一個(gè)實(shí)施方案中，特征的組合允許在通過(guò)常規(guī)技術(shù)確定的膿毒的實(shí)際發(fā)作前約24、約48、或約72小時(shí)預(yù)測(cè)膿毒的發(fā)作。
在另一實(shí)施方案中，參比生物標(biāo)記譜可以含有至少兩種特征，其中的至少一個(gè)是相應(yīng)生物標(biāo)記所特有的并且其中該特征將允許預(yù)測(cè)個(gè)體包括在膿毒-陽(yáng)性或者SIRS-陽(yáng)性群體中。在該實(shí)施方案中，該特征被分配p值，該p值從非參數(shù)檢驗(yàn)，如Wilcoxon帶符號(hào)的秩檢驗(yàn)得到，該p值與確定性程度直接相關(guān)，使用該確定性程度該特征可以將個(gè)體分類成屬于膿毒-陽(yáng)性或者SIRS-陽(yáng)性群體。在另一實(shí)施方案中，該特征將個(gè)體分類成屬于膿毒-陽(yáng)性或者SIRS-陽(yáng)性群體，分類的準(zhǔn)確度為至少約60％、約70％、約80％、或約90％。在再一個(gè)實(shí)施方案中，該特征允許通過(guò)常規(guī)技術(shù)確定的膿毒的實(shí)際發(fā)作前約24、約48、或約72小時(shí)預(yù)測(cè)膿毒的發(fā)作。
在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了顆粒的陣列，這些顆粒表面粘附有捕獲分子，可以特異結(jié)合選自表2-13任一個(gè)中所列的生物標(biāo)記的至少1、2、3、4、5、10種或所有生物標(biāo)記。
附圖簡(jiǎn)述

圖1圖解了SIRS向膿毒的發(fā)展。膿毒的病癥由至少三個(gè)階段組成，膿毒患者從嚴(yán)重膿毒發(fā)展到膿毒性休克到多種器官功能異常。
圖2顯示了膿毒和SIRS之間的關(guān)系。維恩(Venn)圖中所示的多個(gè)集合相應(yīng)于具有所表示的病癥的個(gè)體的群體。
圖3顯示了膿毒陽(yáng)性群體相對(duì)于SIRS-陽(yáng)性群體，約400種離子的平均標(biāo)準(zhǔn)化峰強(qiáng)度中比例的自然對(duì)數(shù)。
圖4顯示了在ESI-質(zhì)譜圖譜中m/z為437.2Da并且在C18反相柱上保留時(shí)間為1.42分鐘的離子的強(qiáng)度。圖4A顯示了患有膿毒的個(gè)體的多種群體中離子存在的變化。膿毒組中膿毒的臨床懷疑在“時(shí)間0”發(fā)生，該臨床懷疑通過(guò)常規(guī)技術(shù)檢測(cè)?！皶r(shí)間-24小時(shí)”和“時(shí)間-48小時(shí)”代表分別在膿毒組中膿毒發(fā)作的臨床懷疑前約24小時(shí)和約48小時(shí)采集的樣品。個(gè)體在“天1”進(jìn)入研究。圖4B表明從在時(shí)間0時(shí)沒(méi)有患膿毒的個(gè)體的群體采集的樣品中存在該相同的離子。
圖5是對(duì)10名膿毒患者和10名SIRS患者中從時(shí)間0開(kāi)始的數(shù)據(jù)擬合的分類樹(shù)，表明通過(guò)電噴霧質(zhì)譜鑒定的三種生物標(biāo)記與辨別膿毒與SIRS有關(guān)。
圖6顯示了使用實(shí)施例中描述的配置，從血漿樣品得到的代表性LC/MS和LC/MS/MS譜。
圖7A和7B顯示了在轉(zhuǎn)化成膿毒前在血漿中以更高水平被調(diào)節(jié)長(zhǎng)達(dá)48小時(shí)的蛋白質(zhì)。
圖8A和8B顯示了在轉(zhuǎn)化成膿毒前在血漿中以更低水平被調(diào)節(jié)長(zhǎng)達(dá)48小時(shí)的蛋白質(zhì)。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述本發(fā)明允許利用在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)(“快照”)或者在疾病發(fā)展的過(guò)程中從個(gè)體得到的一種或多種生物樣品快速、靈敏和準(zhǔn)確地診斷或預(yù)測(cè)膿毒。有利地，可以在臨床癥狀發(fā)作前診斷或者預(yù)測(cè)膿毒，從而允許更有效的治療干預(yù)。
“系統(tǒng)性炎性應(yīng)答綜合癥”或者“ISRS”指對(duì)多種嚴(yán)重的臨床損傷的臨床應(yīng)答，其表現(xiàn)為24小時(shí)內(nèi)下面的狀況的兩種或多種*體溫大于38℃(100.4°F)或者小于36℃(96.8°F)；*心率(HR)大于90次/分鐘；*呼吸率(RR)大于20次呼吸/分鐘，或者PCO2小于32mm Hg，或者需要機(jī)械通氣；和*白細(xì)胞數(shù)(WBC)大于12.0×109/L或者小于4.0×109/L或者大于10％未成熟形式(帶)。
SIRS的這些癥狀代表SIRS的一致定義，該定義在將來(lái)可以被修改或者由改良的定義代替。本定義用于闡明當(dāng)前的臨床實(shí)踐并且不代表本發(fā)明的關(guān)鍵方面。
患有SIRS的患者具有臨床表現(xiàn)，其被歸為如上面定義的SIRS，但是在臨床上不被認(rèn)為是膿毒的。處于發(fā)生膿毒的危險(xiǎn)中的個(gè)體包括ICU中的患者和遭受生理創(chuàng)傷，如燒傷或者其他損傷的患者。“膿毒”指與證實(shí)的感染過(guò)程相關(guān)的SIRS-陽(yáng)性病癥。膿毒的臨床懷疑由感染過(guò)程導(dǎo)致的SIRS患者的SIRS-陽(yáng)性病癥的懷疑引起。本文中，“膿毒”包括膿毒的所有階段，包括，但不限于，膿毒的發(fā)作、嚴(yán)重膿毒和與膿毒的末期相關(guān)的MOD。
“膿毒的發(fā)作”指膿毒的早期，即，臨床表現(xiàn)足夠支持膿毒的臨床懷疑之前的階段。因?yàn)楸景l(fā)明的方法用于檢測(cè)使用常規(guī)技術(shù)懷疑膿毒的時(shí)間之前的膿毒，所以只能在膿毒的表現(xiàn)在臨床上更明顯的時(shí)候回顧地證實(shí)早期膿毒時(shí)該患者的疾病狀態(tài)?；颊咝纬赡摱镜拇_切機(jī)理不是本發(fā)明的關(guān)鍵方面。本發(fā)明的方法可獨(dú)立于感染過(guò)程的起源檢測(cè)生物標(biāo)記譜中的變化。不管膿毒怎樣產(chǎn)生，本發(fā)明的方法都允許確定患有或者懷疑患有通過(guò)前面所用的標(biāo)準(zhǔn)分類的膿毒或者SIR的患者的狀態(tài)。
“嚴(yán)重膿毒”指與器官功能異常、灌注不足異常、或者膿毒誘導(dǎo)的低血壓有關(guān)的膿毒。灌注不足異常包括，但不限于，乳酸中毒、少尿或者精神狀態(tài)的急劇改變。“膿毒性休克”指膿毒誘導(dǎo)的低血壓，其對(duì)于足夠的靜脈內(nèi)液體刺激不響應(yīng)并且表現(xiàn)為外周低血壓?！稗D(zhuǎn)變患者”指SIRS陽(yáng)性患者，該患者在被監(jiān)視期間，通常在ICU停留期間發(fā)展成膿毒的臨床懷疑?！胺寝D(zhuǎn)變患者”指SIRS陽(yáng)性患者，該患者在被監(jiān)視期間，通常在ICU停留期間不發(fā)展成膿毒的臨床懷疑。
“生物標(biāo)記”是存在于生物樣品并且可以從該生物樣品分離或者在該生物樣品中檢測(cè)的幾乎任一種生物化合物，如蛋白質(zhì)或者其片段、肽、多肽、蛋白聚糖、糖蛋白、脂蛋白、糖、脂質(zhì)、核酸、有機(jī)或無(wú)機(jī)化學(xué)品、天然聚合物，和小分子。此外，生物標(biāo)記可以是完整分子，或者其可以是該完整分子的部分，該部分可以具有部分功能或者可以被例如，抗體或者其他特異結(jié)合蛋白質(zhì)識(shí)別。如果生物標(biāo)記的可檢測(cè)方面與該患者的給定狀態(tài)，如膿毒的特定階段有關(guān)，那么認(rèn)為該生物標(biāo)記物是可提供信息的。這種可檢測(cè)的方面可以包括，例如，來(lái)自該個(gè)體的生物樣品中該生物標(biāo)記的存在、缺乏，或者濃度，和/或該生物標(biāo)記作為生物標(biāo)記譜的一部分存在。生物標(biāo)記的這種可檢測(cè)的方面在本文中被定義為“特征”。特征還可以是生物標(biāo)記的兩個(gè)或多個(gè)可檢測(cè)方面的比例，這些生物標(biāo)記例如，可以具有或者不具有公知的同一性?！吧飿?biāo)記譜”包括至少兩種這些特征，其中這些特征可以相應(yīng)于相同的或者不同類別的生物標(biāo)記，如核酸和糖。生物標(biāo)記譜還可以含有至少3、4、5、10、20、30或者更多種特征。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物標(biāo)記譜含有數(shù)百，或者甚至數(shù)千種特征。在另一實(shí)施方案中，生物標(biāo)記譜含有至少一種內(nèi)標(biāo)的至少一個(gè)可檢測(cè)的方面。
“表型變化”是與患者的給定狀態(tài)有關(guān)的參數(shù)的可檢測(cè)的變化。例如，表型變化可以包括體液中生物標(biāo)記的增加或者減少，其中該變化與膿毒或者膿毒的發(fā)作有關(guān)。表型變化可以還包括該患者的給定狀態(tài)的可檢測(cè)方面的變化，該變化不是生物標(biāo)記的可檢測(cè)方面的變化。例如，表型中的變化可以包括體溫、呼吸率、脈搏、血壓、或者其他生理參數(shù)中的可檢測(cè)的變化。這些變化可通過(guò)臨床觀察和使用技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)檢測(cè)來(lái)確定。本文中，“常規(guī)技術(shù)“是基于表型變化對(duì)個(gè)體分類的技術(shù)，這些技術(shù)不得到根據(jù)本發(fā)明的生物標(biāo)記譜。
“決策規(guī)則(Decision rule)”是用于將患者分類的方法。該規(guī)則可以采取本領(lǐng)域中公知的一種或多種形式，如Hastie等人，“TheElements of Statistical Learning，”Springer-Verlag(Springer，New York(2001))中所例證的形式，該文獻(xiàn)被完整并入本文作為參考。對(duì)樣品內(nèi)分子的復(fù)雜混合物的生物標(biāo)記分析產(chǎn)生了數(shù)據(jù)集中的特征。可以用決策規(guī)則作用于特征的數(shù)據(jù)集以預(yù)測(cè)膿毒的發(fā)作、確定膿毒的發(fā)展、診斷膿毒，或者診斷SIRS。
決策規(guī)則的應(yīng)用不需要完美分類。在一個(gè)實(shí)施方案中，分類可以具有至少約90％或者甚至更高的確定性。在其他實(shí)施方案中，該確定性為至少約80％、至少約70％、或至少約60％。，確定性的有用的程度可以根據(jù)本發(fā)明的具體方法而變。“確定性”被定義為被準(zhǔn)確分類的個(gè)體的總數(shù)與被分類的個(gè)體總數(shù)的商。本文中，“確定性”指“準(zhǔn)確度”。分類的特征還在于其“靈敏性”。分類的“靈敏性”涉及當(dāng)前被鑒定患有膿毒的膿毒患者的百分?jǐn)?shù)?！办`敏性”在本領(lǐng)域中被定義為真陽(yáng)性數(shù)與真陽(yáng)性和假陰性之和的商。相比，該方法的“特異性”被定義為被正確鑒定為不患有膿毒的患者的百分?jǐn)?shù)。即，“特異性”涉及真陰性與真陰性和假陽(yáng)性之和的商。在一個(gè)實(shí)施方案中，靈敏性和/或特異性為至少約90％、至少約80％、至少約70％或至少約60％?？梢杂糜谝宰銐虻拇_定性對(duì)個(gè)體分類的特征的數(shù)目通常為約4個(gè)。然而，根據(jù)所尋找的確定性的程度，特征數(shù)可以更多或更少，但是在所有情況中，特征數(shù)為至少1個(gè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于分類個(gè)體的特征數(shù)被優(yōu)化而允許以高確定性對(duì)個(gè)體分類。
患者中膿毒或者SIRS的“狀態(tài)確定”包括對(duì)患者的生物標(biāo)記譜分類以(1)檢測(cè)該患者中膿毒或者SIRS的存在，(2)預(yù)測(cè)該患者中膿毒或者SIRS的發(fā)作，或(3)檢測(cè)患者中膿毒的發(fā)展。“診斷”膿毒或者SIRS指鑒定或者檢測(cè)患者中的膿毒或者SIRS。因?yàn)楸景l(fā)明能夠在明顯可觀察到的臨床表現(xiàn)之前更靈敏地檢測(cè)膿毒，所以膿毒的鑒定或者檢測(cè)包括檢測(cè)如上定義的膿毒的發(fā)作。即，“預(yù)測(cè)膿毒的發(fā)作”指將該患者的生物標(biāo)記譜歸類為相應(yīng)于來(lái)自一些個(gè)體的生物標(biāo)記譜，這些個(gè)體正從SIRS的特定階段發(fā)展到膿毒或者從被感染狀態(tài)到膿毒(即，從感染到具有相伴的SIRS的感染)。膿毒或者SIRS的“發(fā)展檢測(cè)”或者“發(fā)展確定”指對(duì)已經(jīng)被診斷患有膿毒或者SIRS的患者的生物標(biāo)記譜分類。例如，將已經(jīng)被診斷為患有膿毒的患者的生物標(biāo)記分類可以包括檢測(cè)或者確定該患者從膿毒到嚴(yán)重膿毒或者到具有MOD的膿毒的發(fā)展。
根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)從個(gè)體得到的樣品得到生物標(biāo)記譜可以診斷或者預(yù)測(cè)膿毒。本文中，“得到”指“擁有”。本發(fā)明尤其可用于預(yù)測(cè)和診斷個(gè)體中的膿毒，其中該個(gè)體患有感染，或者甚至膿毒，但是該患者還沒(méi)有被診斷為患有膿毒、懷疑患有膿毒，或者處于發(fā)生膿毒的危險(xiǎn)中。本發(fā)明以相同的方式可用于檢測(cè)和診斷個(gè)體中SIRS。即，本發(fā)明可以用于證實(shí)SIRS的臨床懷疑。本發(fā)明還可用于檢測(cè)膿毒過(guò)程的多個(gè)階段，諸如感染、菌血癥、膿毒、嚴(yán)重膿毒、膿毒性休克，等等。
將從個(gè)體得到的生物標(biāo)記譜，即，受試生物標(biāo)記譜與參比生物標(biāo)記譜向比較。該生物標(biāo)記譜可以從一個(gè)個(gè)體或者兩個(gè)或多個(gè)個(gè)體的群體產(chǎn)生。該群體例如，可以含有3、4、5、10、15、20、30、40、50或更多個(gè)體。此外，如果受試和參比圖從在不同時(shí)間點(diǎn)采集的生物樣品產(chǎn)生并且相互比較，那么在本發(fā)明方法中被比較的參比生物標(biāo)記譜和個(gè)體的(受試)生物標(biāo)記譜可以從相同個(gè)體產(chǎn)生。例如，可以在研究期開(kāi)始時(shí)從個(gè)體得到樣品。然后從該樣品得到的參比生物標(biāo)記譜可以與從該同一個(gè)體的隨后樣品產(chǎn)生的生物標(biāo)記譜相比較。這種比較可用于，例如，通過(guò)隨時(shí)間重復(fù)分類確定該個(gè)體的膿毒狀態(tài)。
參比群體可以選自沒(méi)有SIRS(“SIRS-陰性”)的個(gè)體、沒(méi)有SIRS但是經(jīng)歷感染過(guò)程的個(gè)體、患有SIRS但是不存在膿毒(“SIRS-陽(yáng)性”)的個(gè)體、患有膿毒的發(fā)作的個(gè)體、膿毒陽(yáng)性并且處于膿毒發(fā)展的階段之一的個(gè)體，或者具有增加發(fā)生膿毒的危險(xiǎn)性的生理創(chuàng)傷的個(gè)體。此外，參比群體可以是SIRS-陽(yáng)性的并隨后用常規(guī)技術(shù)診斷膿毒。例如，用于產(chǎn)生參比圖的SIRS-陽(yáng)性患者的群體可以在為了產(chǎn)生參比圖而從這些患者采集生物樣品之后約24、48、72、96或更多小時(shí)后被診斷為膿毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用常規(guī)技術(shù)在生物樣品采集后約0-36小時(shí)、約36-60小時(shí)、約60-84小時(shí)、或約84-108小時(shí)后將SIRS-陽(yáng)性個(gè)體的群體診斷為膿毒。如果該生物標(biāo)記譜可以預(yù)示膿毒或者其發(fā)展階段之一，那么臨床醫(yī)生就可以在膿毒的臨床癥狀表現(xiàn)之前開(kāi)始治療。治療通常包括檢查該患者以確定感染源。一旦定位了感染源，臨床醫(yī)生通常將從感染部位得到培養(yǎng)物，這優(yōu)選在開(kāi)始相關(guān)的經(jīng)驗(yàn)性抗微生物治療和可能額外的輔助性治療措施，如排出膿腫或者除去受感染的導(dǎo)管之前。膿毒的療法在Healy(如前)中綜述。
本發(fā)明的方法包括將個(gè)體的生物標(biāo)記譜與參比生物標(biāo)記譜比較。本文中，“比較”包括辨別個(gè)體和參比生物標(biāo)記譜中至少一處不同的方法。從而，比較可以包括通過(guò)視覺(jué)檢查層析圖譜，并且比較可以包括分配給圖譜的特征的算術(shù)上的和統(tǒng)計(jì)學(xué)上的比較。這種統(tǒng)計(jì)學(xué)比較包括，但不限于，應(yīng)用決策規(guī)則。如果生物標(biāo)記譜含有至少一種內(nèi)標(biāo)，那么用以辨別生物標(biāo)記譜中的差異的比較還可以包括這些內(nèi)標(biāo)的特征，從而生物標(biāo)記的特征與內(nèi)標(biāo)的特征相關(guān)。該比較可以預(yù)測(cè)獲得膿毒或者SIRS的機(jī)會(huì)；或者該比較可以證實(shí)存在或者不存在膿毒或者SIRS；或者該比較可以指出個(gè)體所處的膿毒的階段。
因此，本發(fā)明不需要在監(jiān)視期內(nèi)實(shí)施時(shí)間-密集的測(cè)定，也不需要鑒定每種生物標(biāo)記。盡管本發(fā)明不需要監(jiān)視期來(lái)對(duì)個(gè)體分類，但是應(yīng)該理解對(duì)該個(gè)體的重復(fù)分類，即重復(fù)快照，可以隨時(shí)間進(jìn)行直到該個(gè)體不再處于危險(xiǎn)中。備選地，從該個(gè)體得到的生物標(biāo)記譜可以與在不同時(shí)間點(diǎn)從該相同個(gè)體得到的一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)記譜相比較。技術(shù)人員將明白在重復(fù)分類過(guò)程中做出的每次比較都能夠?qū)⒃搨€(gè)體歸類為參比群體中的成員。
通過(guò)特征性生物標(biāo)記譜可以區(qū)分具有相應(yīng)于從無(wú)膿毒到MOD的膿毒發(fā)展的多個(gè)階段的多種生理狀況的個(gè)體。本文中，“個(gè)體”是動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人或者非人靈長(zhǎng)類。術(shù)語(yǔ)“個(gè)體”、“受試者”和“患者”在本文中可互換使用。個(gè)體可以是正常的、被懷疑患有SIRS或者膿毒、處于患SIRS或者膿毒的危險(xiǎn)中，或者被證實(shí)患有SIRS或者膿毒。盡管有許多公知的生物標(biāo)記與膿毒的發(fā)展有關(guān)，但是并不是所有這些標(biāo)記都在最初的臨床前階段出現(xiàn)。實(shí)際上，僅能通過(guò)從最終表現(xiàn)膿毒的臨床癥狀的個(gè)體所得樣品的回顧分析確定早期膿毒的特征性生物標(biāo)記的子集。不被理論所束縛，即使導(dǎo)致膿毒的最初病理感染也可以引起生理變化，這些生理變化在生物標(biāo)記表達(dá)中的特定變化中體現(xiàn)。例如，一旦確定了膿毒階段的特征性生物標(biāo)記譜，就可以將從個(gè)體得到的生物樣品的生物標(biāo)記譜與該參比譜相比較以確定該受試者是否也處于膿毒的那一特定階段。
群體從膿毒的一個(gè)階段發(fā)展到另一階段，或者從常態(tài)(即，特征是不患有膿毒或者SIRS的狀態(tài))到膿毒或者SIRS和反之亦然的特征是生物標(biāo)記譜中的改變，因?yàn)槟承┥飿?biāo)記譜以更高的水平表達(dá)并且其他生物標(biāo)記的表達(dá)被下調(diào)。生物標(biāo)記譜中的這些變化可以反映參比群體對(duì)例如感染和/或炎癥的生理應(yīng)答中的漸進(jìn)性建立。技術(shù)人員將明白隨著生理應(yīng)答的消退，參比群體的生物標(biāo)記譜也將變化。如上所述，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是能夠使用來(lái)自單個(gè)生物樣品的生物標(biāo)記譜將個(gè)體歸類為特定群體中的成員。然而，技術(shù)人員將明白通過(guò)對(duì)該個(gè)體的隨后分類可以有助于確定特定生理應(yīng)答正在被建立或者正在消退。為此，本發(fā)明提供了多種生物標(biāo)記，在對(duì)膿毒或者SIRS的生理應(yīng)答被建立或者消退時(shí)這些生物標(biāo)記的表達(dá)水平有的增加，有的降低。例如，研究人員可以選擇個(gè)體的生物標(biāo)記譜的一種特征，公知隨著對(duì)膿毒的生理應(yīng)答的建立該特征的強(qiáng)度改變。來(lái)自該個(gè)體的隨后的生物樣品的譜中相同特征的比較可以確定該個(gè)體是否正在向更嚴(yán)重的膿毒發(fā)展或者正在向常態(tài)發(fā)展。
生物標(biāo)記的分子身份不是本發(fā)明必需的。實(shí)際上，本發(fā)明不應(yīng)局限于以前已經(jīng)鑒定的生物標(biāo)記(見(jiàn)美國(guó)專利申請(qǐng)序號(hào)10/400,275，2003年3月26日提交)。因此，預(yù)期將鑒定新的生物標(biāo)記，這些生物標(biāo)記是給定個(gè)體群體，特別膿毒早期之一的群體所特有的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，鑒定并分離的生物標(biāo)記。然后該生物標(biāo)記被用于產(chǎn)生特異結(jié)合的抗體，該抗體可以促進(jìn)多種診斷測(cè)定中的生物標(biāo)記檢測(cè)。為此，任一免疫測(cè)定可以使用能夠結(jié)合生物標(biāo)記分子的任何抗體、抗體片段或者衍生物(例如，F(xiàn)ab、Fv、或scFv片段)。這些免疫測(cè)定是本領(lǐng)域中熟知的。如果該生物標(biāo)記是蛋白，那么可以用成熟的技術(shù)將其測(cè)序并且克隆其編碼基因。
本發(fā)明的方法可以用于篩選，例如，ICU所接納的患者。當(dāng)接納時(shí)立即采集生物樣品，例如，血。血中蛋白質(zhì)和其他分子的復(fù)雜混合物被分解成生物標(biāo)記譜。這可以通過(guò)使用任一技術(shù)或技術(shù)的組合實(shí)現(xiàn)，該技術(shù)可以基于某種物理或者化學(xué)性質(zhì)可再現(xiàn)地區(qū)分這些分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，分子被固定在基質(zhì)上，然后通過(guò)激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分離和區(qū)分這些分子。通過(guò)特征性解吸模式產(chǎn)生波譜，該解析模式反映了每個(gè)分子或者其片段的質(zhì)量/電荷比。在另一實(shí)施方案中，生物標(biāo)記選自從細(xì)胞提取物得到的多種mRNA種類，并通過(guò)將該個(gè)體的mRNA種類與cDNAs陣列雜交得到圖。cDNA陣列的診斷用途是本領(lǐng)域中熟知的(見(jiàn)，例如，Zou，等人，Oncogene 214855-4862(2002))。在再一個(gè)實(shí)施方案中，聯(lián)合使用蛋白質(zhì)和核酸分離方法可以得到圖譜。
本發(fā)明還提供了試劑盒，該試劑盒可用于確定個(gè)體中膿毒的狀態(tài)或者診斷SIRS。本發(fā)明的試劑盒含有至少一種生物標(biāo)記。用于本發(fā)明的特定生物標(biāo)記在本文中給出。該試劑盒的生物標(biāo)記可用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的生物標(biāo)記譜。試劑盒中化合物類別的實(shí)例包括，但不限于，蛋白質(zhì)、其片段、肽、多肽、蛋白聚糖、糖蛋白、脂蛋白、糖類、脂質(zhì)、核酸、有機(jī)和無(wú)機(jī)化學(xué)品，和天然和合成的聚合物。該生物標(biāo)記可以是陣列的部分，或者該生物標(biāo)記可以被分開(kāi)和/或單獨(dú)地包裝。該試劑盒可以還含有至少一種內(nèi)標(biāo)，該內(nèi)標(biāo)用于產(chǎn)生本發(fā)明的生物標(biāo)記譜。同樣，內(nèi)標(biāo)可以是上述任一種化合物類別。本發(fā)明的試劑盒可以還含有試劑，該試劑可用于可檢測(cè)地標(biāo)記生物樣品中所含的生物標(biāo)記，其中生物標(biāo)記譜從該生物樣品產(chǎn)生。為此，試劑盒可以含有一組抗體或者它們的功能片段，這些抗體或者它們的功能片段結(jié)合下面列出生物標(biāo)記的表的任一個(gè)表中所給出的生物標(biāo)記的至少2、3、4、5、10、20或更多種?？贵w自身可以被可檢測(cè)地標(biāo)記。試劑盒可以還含有特異生物標(biāo)記結(jié)合組分，如適合體(aptamer)。如果生物標(biāo)記含有核酸，那么試劑盒可以提供寡核苷酸探針，該探針能夠與該生物標(biāo)記或者生物標(biāo)記的互補(bǔ)鏈形成雙鏈體。寡核苷酸探針可被檢測(cè)地標(biāo)記。
當(dāng)生物標(biāo)記被用于產(chǎn)生抗體時(shí)，本發(fā)明的試劑盒可以還包括藥物賦形劑、稀釋劑和/或佐劑。藥物佐劑的實(shí)例包括，但不限于，防腐劑、增濕劑、乳化劑，和分散劑。通過(guò)包括多種抗細(xì)菌和抗真菌劑，例如，對(duì)羥基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等等可以確保防止微生物的作用?？赡苓€希望包括等滲劑，如糖、氯化鈉，等等。通過(guò)包括延緩吸收的試劑如單硬脂酸鋁和明膠，可以延長(zhǎng)可注射的藥物形式的吸收。
產(chǎn)生生物標(biāo)記譜根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的方法包括從從個(gè)體采集的生物樣品得到生物標(biāo)記譜。生物樣品可以是血液、血漿、血清、唾液、痰、尿、腦脊液、細(xì)胞、細(xì)胞提取物、組織樣品、組織活檢、糞便樣品，等等。例如，從個(gè)體的群體可以得到參比生物標(biāo)記譜，這些個(gè)體選自SIRS-陰性個(gè)體、SIRS-陽(yáng)性個(gè)體、患有膿毒發(fā)作的個(gè)體和已經(jīng)患有膿毒的個(gè)體?？梢栽谀摱景l(fā)展的任一階段，如感染、菌血癥、嚴(yán)重膿毒、膿毒性休克或者M(jìn)OD，得到已經(jīng)患有膿毒的個(gè)體的參比生物標(biāo)記譜。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以用分離方法產(chǎn)生生物標(biāo)記譜，從而僅分析樣品中生物標(biāo)記的子集。例如，在樣品中分析的生物標(biāo)記可以由來(lái)自細(xì)胞提取物的mRNA種類組成，該細(xì)胞提取物已經(jīng)被分級(jí)分離而僅樣品中的核酸生物標(biāo)記，或者生物標(biāo)記可以由樣品中蛋白質(zhì)的總補(bǔ)體的一部分組成，所述蛋白質(zhì)已經(jīng)通過(guò)層析技術(shù)被分級(jí)分離。備選地，可以不用分離方法而產(chǎn)生生物標(biāo)記譜。例如，可以用標(biāo)記化合物詢問(wèn)(interrogate)生物樣品，該標(biāo)記化合物與樣品的中的生物標(biāo)記形成特異復(fù)合物，其中該特異復(fù)合物中標(biāo)記的強(qiáng)度是該生物標(biāo)記的可檢測(cè)的特征。適于形成這種特異復(fù)合物的化合物是被標(biāo)記的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用具有可擴(kuò)增的核酸作為標(biāo)記的抗體檢測(cè)生物標(biāo)記。在再一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)兩種抗體(每種綴合到核酸標(biāo)記的一條鏈)與生物標(biāo)記相互作用時(shí)，該核酸標(biāo)記變得可被擴(kuò)增，從而，兩條核酸鏈形成可擴(kuò)增的核酸。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，生物標(biāo)記譜可來(lái)自測(cè)定，如核酸的測(cè)定，其中生物標(biāo)記是核酸或者它們的互補(bǔ)物。例如，生物標(biāo)記可以是核糖核酸。使用選自核磁共振、核酸陣列、點(diǎn)印跡、狹線印跡、反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增和RNA印跡分析的方法可以得到生物標(biāo)記譜。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)對(duì)該生物標(biāo)記特異的反應(yīng)性抗體，或者該抗體的功能片段通過(guò)免疫學(xué)檢測(cè)該生物標(biāo)記譜。抗體的功能片段是抗體的片段，其至少保留結(jié)合完整抗體所結(jié)合的抗原的一定能力。該片段包括，但不限于，scFv片段、Fab片段和F(ab)2片段，這些片段可以通過(guò)重組方法或者酶產(chǎn)生。在另一實(shí)施方案中，不同于抗體的特異結(jié)合分子，如適合體，可用于結(jié)合該生物標(biāo)記。在再一個(gè)實(shí)施方案中，生物標(biāo)記譜可以含有感染物或者其組分的可檢測(cè)方面。在再一個(gè)實(shí)施方案中，生物標(biāo)記譜可以含有小分子的可檢測(cè)方面，這些小分子可以包括蛋白質(zhì)或者核酸的片段，或者可以包括代謝物。
使用一種或多種分離方法可以產(chǎn)生生物標(biāo)記譜。例如，適宜的分離方法可以包括質(zhì)譜方法，如電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)、ESI-MS/MS、ESI-MS/(MS)(n是大于0的整數(shù))、基質(zhì)輔助的激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)、表面增強(qiáng)的激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)、硅上解吸/電離(DIOS)、二級(jí)離子質(zhì)譜(SIMS)、四極飛行時(shí)間(Q-TOF)、大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜(APCI-MS)n、APCI-MS/MS、APCI-(MS)、大氣壓光電離質(zhì)譜(APPI-MS)、APPI-MS/MS，和APPI-(MS)n。其他質(zhì)譜方法可以包括四極、傅立葉變換質(zhì)譜(FTMS)和離子阱。其他適宜的分離方法可包括化學(xué)萃取分配、柱層析、離子交換層析、疏水(反相)液體層析、等電聚焦、一維聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-PAGE)或者其他層析，如薄層、氣相或液相層析，或者它們的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物樣品可以在應(yīng)用分離方法前被分級(jí)分離。
通過(guò)不需要生物標(biāo)記自身的物理分離的方法也可以產(chǎn)生生物標(biāo)記譜。例如，可以用核磁共振(NMR)波譜學(xué)從分子的復(fù)雜混合物分辨生物標(biāo)記譜。用NMR對(duì)腫瘤分類的類似用途在例如Hagberg，NMRBiomed.11148-56(1998)中公開(kāi)。額外的方法包括核酸擴(kuò)增技術(shù)，這些技術(shù)可用于產(chǎn)生生物標(biāo)記譜而不用物理分離各個(gè)生物標(biāo)記。(見(jiàn)例如，Stordeur等人，J.Immunol.，Methods 25955-64(202)和Tan等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 9911387-11392(2002))。
在一個(gè)實(shí)施方案中，使用激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜產(chǎn)生生物標(biāo)記譜，其中生物標(biāo)記是蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)片段，它們已經(jīng)被入射激光輻射電離或者從固定支持物蒸發(fā)。通過(guò)每種蛋白的特征性飛行時(shí)間產(chǎn)生圖譜，該特征性飛行時(shí)間取決于其質(zhì)荷比(“m/z”)。多種激光解吸/電離技術(shù)也是本領(lǐng)域中公知的。(見(jiàn)，例如，Guttman等人，Anal.Chem.731252-62(2001)和Wei等人，Nature 399243-46(1999))。
激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜允許在相對(duì)短的期限內(nèi)產(chǎn)生大量信息。生物樣品被應(yīng)用于多種支持體之一，該支持體結(jié)合樣品中的所有生物標(biāo)記，或者這些生物標(biāo)記的子集。細(xì)胞裂解物或者樣品以少至0.5μL的體積被直接應(yīng)用于這些表面，這些細(xì)胞裂解物或者樣品被或者不被預(yù)先純化或者分級(jí)分離。裂解物或樣品在應(yīng)用于支持體表面上時(shí)可以被濃縮或稀釋。然后用激光解吸/電離在少至3個(gè)小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生樣品的質(zhì)譜。
在另一實(shí)施方案中，測(cè)定了來(lái)自該個(gè)體的細(xì)胞提取物的總mRNA，并且將從該生物樣品所得多種mRNA種類用作生物標(biāo)記。例如，使用本領(lǐng)域中公知的標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將這些mRNA與探針陣列雜交可以得到圖譜，該探針陣列可以含有寡核苷酸或者cDNA。備選地，可以將mRNA實(shí)施凝膠電泳或者印跡方法，如點(diǎn)印跡、狹線印跡或者RNA印跡分析，所有這些方法都是本領(lǐng)域中公知的(見(jiàn)，例如，Sambrook等人，“Molecular Cloning，第三版”，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(2001))。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄，然后如Stordeur等人(如前)公開(kāi)的擴(kuò)增并檢測(cè)所得cDNA也可以得到mRNA圖。在另一實(shí)施方案中，使用組合方法，如核酸陣列與質(zhì)譜的組合，可以得到該圖。
數(shù)據(jù)分析算法的使用在一個(gè)實(shí)施方案中，個(gè)體生物標(biāo)記譜與參比生物標(biāo)記譜的比較包括應(yīng)用決策規(guī)則。該決策規(guī)則可以包括數(shù)據(jù)分析算法，如計(jì)算機(jī)模式識(shí)別算法。其他適宜的算法包括，但不限于，可以檢測(cè)特征值的分布中的差異的邏輯回歸或者非參數(shù)算法(例如，Wilcoxon有符號(hào)的秩檢驗(yàn))。決策規(guī)則可以基于1、2、3、4、5、10、20或更多種特征。在一個(gè)實(shí)施方案中，決策規(guī)則基于數(shù)百或者更多特征。應(yīng)用決策規(guī)則也可以包括使用分類樹(shù)算法。例如，參比生物標(biāo)記譜可以含有至少三種特征，其中這些特征是分類樹(shù)算法中的預(yù)測(cè)值。數(shù)據(jù)分析算法預(yù)測(cè)群體(或者類)中的成員資格，其準(zhǔn)確度為至少約60％、至少約70％、至少約80％和至少約90％。
適宜的算法是本領(lǐng)域中公知的，一些算法在Hastie等(如前)中綜述。這些算法將來(lái)自生物材料，如血樣的復(fù)雜光譜分類以將個(gè)體區(qū)分為正常的或者具有特定病態(tài)的特征性生物標(biāo)記表達(dá)水平。盡管這些算法可用于增加應(yīng)用決策規(guī)則的速度和效率并避免研究人員偏倚，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到不需要基于計(jì)算機(jī)的算法來(lái)實(shí)施本發(fā)明的方法。
不管用于產(chǎn)生生物標(biāo)記譜的方法，都可以應(yīng)用算法比較生物標(biāo)記譜。例如，適宜的算法可應(yīng)用于使用氣相色譜產(chǎn)生的生物標(biāo)記譜，如Harper，“Pyrolysis and GC in Polymer Analysis”Dekker，New York(1985)中所討論的。此外，Wagner等人，Anal.Chem 741824-35(2002)公開(kāi)了一種算法，該算法提高了基于通過(guò)靜態(tài)飛行時(shí)間二級(jí)離子質(zhì)譜(TOF-SIMS)得到的光譜對(duì)個(gè)體分類的能力。此外，Bright等人，J.Microbiol.Methods 48127-38(2002)公開(kāi)了通過(guò)分析MALDI-TOF-MS光譜以高確定性(79-89％正確分類率)區(qū)分細(xì)菌株系的方法。Dalluge，F(xiàn)resenius J.Anal.Chem.366701-11(2000)討論了使用MALDI-TOF-MS和液相色譜-電噴霧電離質(zhì)譜(LC/ESI-MS)對(duì)復(fù)雜生物樣品中生物標(biāo)記譜分類。
生物標(biāo)記通過(guò)產(chǎn)生生物標(biāo)記譜可以實(shí)施本發(fā)明的方法，這些生物標(biāo)記譜可以診斷或者預(yù)測(cè)膿毒或者SIRS。因?yàn)閳D譜產(chǎn)生足夠?qū)嵤┍景l(fā)明，所以組成該圖譜的生物標(biāo)記不必已知或者被隨后鑒定。
可用于產(chǎn)生本發(fā)明的生物標(biāo)記譜的生物標(biāo)記可以包括公知提供關(guān)于應(yīng)答感染中免疫系統(tǒng)的狀態(tài)的信息的那些生物標(biāo)記；然而，這些生物標(biāo)記不總是同等地提供信息。這些生物標(biāo)記可以包括激素、自身抗體、可溶的和不可溶的受體、生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞表面標(biāo)記和可溶的標(biāo)記，這些生物標(biāo)記來(lái)自宿主或者來(lái)自病原自身，如外殼蛋白、脂多糖(內(nèi)毒素)、脂磷壁酸質(zhì)，等等。其他生物標(biāo)記包括，但不限于，細(xì)胞表面蛋白，如CD64蛋白；CD11b蛋白；HLA II類分子，包括HLA-DR蛋白和HLA-DQ蛋白；CD54蛋白；CD71蛋白；CD86蛋白；表面結(jié)合的腫瘤壞死因子受體(TNF-R)；模式識(shí)別受體如類似Toll的受體；可溶的標(biāo)記如白介素IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、和IL-18；腫瘤壞死因子α(TNF-α)；新喋呤；C-反應(yīng)蛋白(CRP)；原降鈣素(PCT)；6-酮F1α；血栓烷B2；白三烯B4、C3、C4、C5、D4和E4；γ干擾素(IFN γ)；α/β干擾素(IFNα/β)；α淋巴毒素(LTα)；補(bǔ)體組分(C’)；血小板活化因子(PAF)；緩激肽、一氧化氮(NO)；粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)；巨噬細(xì)胞抑制因子(MIF)；白介素-1受體拮抗劑(IL-1ra)；可溶性腫瘤壞死因子受體(sTNFr)；可溶性白介素受體sIL-1r和sIL-2r；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGFβ)；前列腺素E2(PGE2)；粒細(xì)胞-集落刺激因子(G-CSF)；和其他炎癥介質(zhì)。(在Oberholzer等人，Shock 1683-96(2001)和Vincent等人，“The Sepsis Text，”Carlet等人，編者，(KluwerAcademic Publishers，2002)中綜述)。通常和在臨床上與菌血癥有關(guān)的生物標(biāo)記也是用于本發(fā)明的生物標(biāo)記的候選者，條件是這些生物標(biāo)記在生物樣品中通常和經(jīng)常發(fā)生。生物標(biāo)記可以包括低分子量化合物，它們可以是蛋白質(zhì)或者核酸的片段，或者它們可以包括代謝物。低分子量化合物，如代謝物的存在或者濃度可以反映與膿毒和/或SIRS有關(guān)的表型變化。具體地，小分子量生物標(biāo)記的濃度的變化與應(yīng)答SIRS和/或膿毒過(guò)程中任何生理變化產(chǎn)生的細(xì)胞代謝的變化相關(guān)，這些生理變化為諸如低體溫或者高體溫、心率或者呼吸率增加、組織低氧、代謝性酸中毒或者M(jìn)OD。生物標(biāo)記還可以包括編碼蛋白質(zhì)生物標(biāo)記的RNA和DNA分子。
生物標(biāo)記還可以包括與白細(xì)胞調(diào)節(jié)，如嗜中性粒細(xì)胞活化或者單核細(xì)胞失活有關(guān)的至少一種分子。CD64和CD11b的表達(dá)增加被認(rèn)為是嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞活化的信號(hào)。(Oberholzer等人，如前和Vincent等人，如前中綜述)。可用于本發(fā)明的那些生物標(biāo)記包括與巨噬細(xì)胞裂解產(chǎn)物相關(guān)的生物標(biāo)記，如細(xì)胞因子代謝變化的標(biāo)記(見(jiàn)，Gognon等人，Cell 110119-31(2002)；Oberholzer，等人，如前；Vincent，等人，如前)。
生物標(biāo)記可以還包括公知參與或者被發(fā)現(xiàn)參與炎癥過(guò)程的信號(hào)因子。信號(hào)因子可以啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)事件級(jí)聯(lián)，包括受體結(jié)合、受體活化、細(xì)胞內(nèi)激酶的活化、轉(zhuǎn)錄因子的活化、基因轉(zhuǎn)錄和/或翻譯水平的變化，和代謝過(guò)程的變化，等。為了本發(fā)明的目的，這些分子活化的信號(hào)分子和過(guò)程被全體定義為“與膿毒途徑有關(guān)的生物分子”。相關(guān)的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)記可以包括與膿毒途徑有關(guān)的生物分子。
因此，盡管本發(fā)明的方法可以使用無(wú)偏的方法鑒定預(yù)測(cè)性生物標(biāo)記，但是技術(shù)人員清楚與生理應(yīng)答或者與多種信號(hào)途徑相關(guān)的生物標(biāo)記的特定組可以是具體關(guān)注的主題。這對(duì)于如下情況尤其是如此來(lái)自生物樣品的生物標(biāo)記與陣列(例如，抗體陣列或核酸陣列)接觸，其中該陣列可通過(guò)與生物標(biāo)記的直接和特異相互作用用于檢測(cè)多種生物標(biāo)記的量。在該情況中，陣列組分的選擇可基于如下提示，即具體途徑與個(gè)體中膿毒或者SIRS的狀態(tài)的確定有關(guān)。特定生物分子具有可以預(yù)測(cè)或者診斷膿毒或SIRS的特征的指示可以導(dǎo)致預(yù)期在生理上以一致方式被調(diào)節(jié)的其他生物分子同樣可以提供預(yù)測(cè)或者診斷特征。然而，技術(shù)人員將明白，由于生物系統(tǒng)的復(fù)雜性這種預(yù)期可能不被實(shí)現(xiàn)。例如，如果特定mRNA生物標(biāo)記的量是預(yù)測(cè)性特征，如果另一生物標(biāo)記的表達(dá)在翻譯后水平上被調(diào)節(jié)，那么該另一生物標(biāo)記的mRNA表達(dá)中的一致變化可能不能被檢測(cè)。此外，生物標(biāo)記的mRNA表達(dá)水平可以受到多種會(huì)聚途徑的影響，這些途徑可以與對(duì)膿毒的生理應(yīng)答有關(guān)或者無(wú)關(guān)。
可以從任一生物樣品得到生物標(biāo)記，作為實(shí)例但不限制，該生物樣品可以是血液、血漿、唾液、血清、尿、腦脊液、痰、糞便、細(xì)胞和細(xì)胞提取物，或者其他生物流體樣品、來(lái)自宿主或患者的組織樣品或者組織活檢樣品。從個(gè)體所得的確切的生物樣品可以不同，但是采樣優(yōu)選侵入性最小并且容易通過(guò)常規(guī)技術(shù)實(shí)施。
通過(guò)任一常規(guī)技術(shù)可以實(shí)施表型變化的檢測(cè)。通過(guò)臨床觀察和檢測(cè)可以實(shí)現(xiàn)體溫、呼吸率、脈搏、血壓、或其他生理參數(shù)的檢測(cè)。生物標(biāo)記分子的檢測(cè)可以包括，例如，指出存在、濃度、表達(dá)水平、或者任何其他與生物標(biāo)記分子相關(guān)的值的檢測(cè)。生物標(biāo)記分子的檢測(cè)形式通常取決于用于從生物樣品形成這些生物標(biāo)記譜的方法。例如，通過(guò)考馬斯藍(lán)染色或者通過(guò)銀染可以檢測(cè)通過(guò)2D-PAGE分開(kāi)的生物標(biāo)記，所述染色方法是本領(lǐng)域中成熟的。
分離有用的生物標(biāo)記預(yù)期有用的生物標(biāo)記將包括還沒(méi)有鑒定或者與相關(guān)生理狀態(tài)有關(guān)的生物標(biāo)記。在本發(fā)明的一方面，有用的生物標(biāo)記被鑒定為來(lái)自生物樣品的生物標(biāo)記譜的組分。這種鑒定可以通過(guò)本領(lǐng)域中任一種熟知的方法實(shí)施，該方法包括免疫測(cè)定或者自動(dòng)化微測(cè)序。
一旦鑒定了有用的生物標(biāo)記，就可以通過(guò)許多熟知的分離方法之一分離該生物標(biāo)記。因此，本發(fā)明提供了分離可以診斷或者預(yù)測(cè)膿毒的生物標(biāo)記的方法，該方法包括從個(gè)體的群體得到參比生物標(biāo)記譜，鑒定可以預(yù)測(cè)或者診斷膿毒或者膿毒發(fā)展階段之一的參比生物標(biāo)記譜的一種特征，鑒定與該特征相應(yīng)的生物標(biāo)記，并分離該生物標(biāo)記。一旦分離，例如，如果該生物標(biāo)記是蛋白，那么該生物標(biāo)記就可用于產(chǎn)生結(jié)合該標(biāo)記的抗體，如果該生物標(biāo)記是核酸，那么該生物標(biāo)記可用于開(kāi)發(fā)特異寡核苷酸探針。
技術(shù)人員將容易明白可以進(jìn)一步表征有用的特征以確定該生物標(biāo)記的分子結(jié)構(gòu)。以這種方式表征生物分子的方法是本領(lǐng)域中熟知的并且包括高分辨率質(zhì)譜、紅外光譜、紫外分光法和核磁共振。確定核酸生物標(biāo)記的核苷酸序列、多肽生物標(biāo)記的氨基酸序列，和糖生物標(biāo)記的組成和序列的方法是本領(lǐng)域中熟知的。
本發(fā)明應(yīng)用于SIRS患者在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)前描述的方法被用于篩選尤其處于患膿毒的危險(xiǎn)中的SIRS患者。從SIRS陽(yáng)性患者采集生物樣品，并將該樣品中生物標(biāo)記譜與來(lái)自最終發(fā)展成膿毒的SIRS-陽(yáng)性患者的參比圖相比較。將該患者的生物標(biāo)記譜歸類成相應(yīng)于發(fā)展成膿毒的SIRS-陽(yáng)性群體的參比圖可以診斷該SIRS-陽(yáng)性患者將同樣發(fā)展成膿毒。然后可以啟動(dòng)治療方案以阻止或者防止膿毒的發(fā)展。
在另一實(shí)施方案中，當(dāng)前描述的方法被用于證實(shí)患者患有SIRS的臨床懷疑。在該情況中，將樣品中生物標(biāo)記譜與患有SIRS或者不患有SIRS的個(gè)體的參比群體比較。將該患者的生物標(biāo)記譜歸類為相應(yīng)于一個(gè)群體或者另一群體可以用于診斷該個(gè)體患有SIRS或者不患有SIRS。
實(shí)施例下面的實(shí)施例是本發(fā)明所包括的實(shí)施方案的代表并且絕不限制本發(fā)明所包括的主題。
實(shí)施例1使用定量液相層析/電噴霧電離質(zhì)譜(LC/ESI-MS)鑒定小分子生物標(biāo)記1.1接受和分析的樣品為患者的兩個(gè)群體建立參比生物標(biāo)記譜。第一個(gè)群體(“SIRS組”)代表患有SIRS并且在“天1”進(jìn)入本研究但是在它們的住院期間沒(méi)有發(fā)展成膿毒的20名患者。第二個(gè)群體(“膿毒組”)代表同樣患有SIRS并且在天1進(jìn)入本研究但是在進(jìn)入研究至少數(shù)天后發(fā)展成膿毒的患者。約每24小時(shí)從每個(gè)研究組采集血樣。膿毒組中膿毒的臨床懷疑在“時(shí)間0”發(fā)生，該臨床懷疑通過(guò)常規(guī)技術(shù)檢測(cè)?！皶r(shí)間-24小時(shí)”和“時(shí)間-48小時(shí)”分別代表膿毒組中膿毒發(fā)作的臨床懷疑前約24小時(shí)和約48小時(shí)采集的樣品。即，來(lái)自膿毒組的樣品包括在進(jìn)入研究當(dāng)天(天1)、膿毒的臨床懷疑前48小時(shí)(時(shí)間-48小時(shí))、膿毒的臨床懷疑前24小時(shí)(時(shí)間-24小時(shí))、和膿毒發(fā)作的臨床懷疑當(dāng)天(時(shí)間0)采集的樣品。共分析了160個(gè)血樣80個(gè)樣品來(lái)自膿毒組的20名患者，另外80個(gè)樣品來(lái)自SIRS組的20名患者。
1.2樣品制備在血漿中，許多種小分子可以結(jié)合到蛋白質(zhì)，這可以降低通過(guò)模式-產(chǎn)生方法檢測(cè)到的小分子的數(shù)量。因此，從血漿樣品除去多數(shù)蛋白質(zhì)，然后釋放可以結(jié)合這些蛋白質(zhì)的小分子。除去蛋白質(zhì)的適宜方法包括，但不限于，用冰預(yù)冷的甲醇、乙腈(CAN)、丁醇，或者三氯乙酸(TCA)萃取血漿或者熱變性或者酸水解。在該實(shí)例中，用冰預(yù)冷的甲醇萃取血漿。優(yōu)選甲醇萃取，因?yàn)槠鋵?dǎo)致可以檢測(cè)到最高數(shù)目的小分子。從每種血漿樣品取50μL與100μL冰預(yù)冷的100％甲醇混合，甲醇的最終體積百分?jǐn)?shù)為67％。將該溶液渦旋混合60秒。然后將樣品在4℃孵育20分鐘，通過(guò)以12,000rpm離心10分鐘沉淀蛋白。除去上清液，將其干燥，并重懸在50μL水中。LC/MS分析前，向被萃取的血漿樣品加入兩種低分子量分子磺胺氯噠酮和十八胺。這些分子作為使離子強(qiáng)度和保留時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)標(biāo)。磺胺氯噠酮的m/z為285.0Da(通過(guò)MS確定)，在44％ACN處洗脫(通過(guò)LC確定)；十八胺的m/z為270.3Da，在89％ACN處洗脫。
1.3LC/ESI-MS分子將10μL重懸的上清液注射到2.1×100mm C18Waters SymmetryLC柱(顆粒大?。?.5μm，內(nèi)部孔徑＝100)。在25℃下用溶于0.1％甲酸中的ACN的三步線性梯度以300μL/分鐘洗脫柱子。對(duì)于t＝0-0.5分鐘，ACN濃度為9.75％到24％；對(duì)于t＝0.5-20分鐘，ACN濃度為24％到90.5％；對(duì)于t＝20-27分鐘，ACN濃度為90.5％到92.4％。前面提到的實(shí)驗(yàn)條件在此處被稱作“LC實(shí)驗(yàn)條件”。在LC實(shí)驗(yàn)條件下，磺胺氯噠酮在44％ACN處洗脫，保留時(shí)間為6.4分鐘，十八胺在89％ACN處洗脫，保留時(shí)間為14.5分鐘。使用Agilent MSD 1100四級(jí)質(zhì)譜儀通過(guò)ESI-MS分析通過(guò)LC分級(jí)分離的樣品，該質(zhì)譜儀串聯(lián)到LC柱(LC/ESI-MS)。以陽(yáng)離子模式和4000V的毛細(xì)管電壓為質(zhì)/荷比(m/z)為100或者150-1000Da的離子得到質(zhì)譜數(shù)據(jù)。對(duì)每種樣品實(shí)施三次LC/ESI-MS分析。數(shù)據(jù)可表達(dá)為每種離子的m/z(道爾頓)和保留時(shí)間(分鐘)(“m/z，保留時(shí)間”)，其中離子的保留時(shí)間是在線性ACN梯度中從反相柱洗脫所需的時(shí)間。然而，為了計(jì)算每次實(shí)驗(yàn)中保留時(shí)間的輕微變化，數(shù)據(jù)也可以表達(dá)為m/z和離子從C18柱洗脫時(shí)ACN的百分?jǐn)?shù)，其代表該離子的內(nèi)在性質(zhì)，不會(huì)受到實(shí)驗(yàn)變異性的顯著影響。保留時(shí)間和洗脫時(shí)的百分?jǐn)?shù)ACN之間的關(guān)系可通過(guò)下面的方程表達(dá)％ACN＝28.5t+9.75(0＜t＜0.5)；％ACN＝3.4103(t-0.5)+24(0.5＜t＜20)；
％ACN＝0.27143(t-20)+90.5(20＜t＜27)然而，這些參數(shù)的值應(yīng)該被理解為近似值并且可能在實(shí)驗(yàn)時(shí)間輕微變化；然而，離子可被再現(xiàn)地識(shí)別，特別當(dāng)用一種或多種相同的內(nèi)標(biāo)制備樣品時(shí)。在下面所示的數(shù)據(jù)中，m/z值被確定為在±0.4m/z內(nèi)，而離子洗脫時(shí)百分?jǐn)?shù)ACN被確定為在±10％以內(nèi)。
1.4.數(shù)據(jù)分析和結(jié)果從每種血漿樣品分析數(shù)百種光譜特征。光譜之間進(jìn)行相似特征的比對(duì)。比對(duì)算法的選擇對(duì)于本發(fā)明不是關(guān)鍵的，并且技術(shù)人員明白多種比對(duì)算法可用于該目的。總共分析了4930種光譜特征。對(duì)于該實(shí)施例，“特征”與相應(yīng)于特定離子的“峰”互換使用。從5名不同個(gè)體得到的樣品的代表性峰在表1中顯示。第一列在括號(hào)中分別列出了每個(gè)離子的m/z和洗脫時(shí)ACN的百分?jǐn)?shù)。剩余的列是來(lái)自每個(gè)患者的相應(yīng)離子的標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)度，它們通過(guò)將強(qiáng)度對(duì)兩個(gè)內(nèi)標(biāo)的強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化得到。400個(gè)以上的峰具有大于0.1的平均標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)度。
表1多種患者中存在的代表性離子
可以用多種方法鑒定離子，所述離子為辨別SIRS和膿毒組的決策規(guī)則提供信息。在該實(shí)施例中，所選的方法為(1)比較兩組間平均離子強(qiáng)度，和(2)使用數(shù)據(jù)分析算法產(chǎn)生分類樹(shù)。
1.4.1比較平均離子強(qiáng)度平均離子強(qiáng)度的比較有效突出SIRS和膿毒患者之間個(gè)體離子強(qiáng)度中的差異。為膿毒組和SIRS組分別平均了1800個(gè)以上的標(biāo)準(zhǔn)化的離子強(qiáng)度。將膿毒組或者SIRS組中平均標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)度大于0.1的離子與兩個(gè)組中標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)度小于0.1的離子分開(kāi)分析。確定了膿毒組對(duì)SIRS組中標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)度大于0.1的約400種離子的平均標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)度的比值。這些離子的相對(duì)強(qiáng)度比值的分布在圖3中顯示。
使用該方法，觀察到23種離子(表2中列出)顯示出在膿毒患者中的強(qiáng)度比SIRS患者中的強(qiáng)度高至少3倍(見(jiàn)圖3，其中離子強(qiáng)度的自然對(duì)數(shù)大于約1.1)并且存在于至少半數(shù)膿毒患者中并且通常存在于約1/3或者1/4的SIRS患者中。在該上下文中，生物標(biāo)記的“存在”指特定患者中該生物標(biāo)記的平均標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)度為所有患者的標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)度的至少25％。盡管這些離子，或者其子集將可用于實(shí)施本發(fā)明的方法，但是也可以使用另外的離子或者其他離子的子集。
表2含有所列離子的患者樣品的百分?jǐn)?shù)
在膿毒陽(yáng)性群體的大多數(shù)中這些生物標(biāo)記的子集以至少3倍高的強(qiáng)度存在。具體地，在膿毒-陽(yáng)性群體的半數(shù)以上中發(fā)現(xiàn)這些生物標(biāo)記的至少12種水平升高，并且在85％的膿毒陽(yáng)性群體中存在至少7種生物標(biāo)記，表明這些標(biāo)記的組合將提供膿毒發(fā)作的有用的預(yù)測(cè)值。對(duì)于SIRS-陽(yáng)性群體所有生物標(biāo)記的水平都升高，如表3中所示。
表3膿毒組對(duì)SIRS組中的離子強(qiáng)度
觀察到表4中所列的兩種離子在SIRS群體的平均標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)度比膿毒群體中高3倍(見(jiàn)圖3，其中離子強(qiáng)度比值的自然對(duì)數(shù)小于約-1.1)。
表4膿毒組對(duì)SIRS組的離子強(qiáng)度
鑒定了32種平均標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)度大于0.1的離子，這些離子在膿毒組中的強(qiáng)度比SIRS組中高至少3倍。這些離子在表5A中列出。同樣，鑒定了48種平均標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)度小于0.1的離子，這些離子在膿毒組中的強(qiáng)度比SIRS組中高至少3倍。這些離子在表5B中列出。(負(fù)保留時(shí)間反映了保留時(shí)間對(duì)內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化這一事實(shí))。
表5A平均標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)度＞0.1的離子
表5B平均標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)度＜0.1的離子
從而，本發(fā)明的參比生物標(biāo)記譜可以包含特征的組合，其中這些特征可以是如通過(guò)電噴霧離子質(zhì)譜以陽(yáng)性模式確定的m/z約100或者150Da到約1000Da的離子強(qiáng)度，并且其中這些特征在膿毒-陽(yáng)性參比群體與SIRS-陽(yáng)性參比群體中平均標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)度的比例為約3∶1或更高。備選地，這些特征在膿毒-陽(yáng)性參比群體與SIRS-陽(yáng)性參比群體中平均標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)度的比例為約1∶3或更低。因?yàn)樵谕ㄟ^(guò)常規(guī)技術(shù)確定膿毒發(fā)作前約48小時(shí)從生物樣品所得生物標(biāo)記中存在這些生物標(biāo)記，所以預(yù)期這些生物標(biāo)記是膿毒發(fā)作的預(yù)測(cè)者。
1.4.2特征強(qiáng)度隨時(shí)間改變所檢查的生物標(biāo)記譜顯示出一些特征，隨著個(gè)體向膿毒發(fā)作的發(fā)展這些特征的表達(dá)水平有的升高，有的降低。預(yù)期相應(yīng)于這些特征的生物標(biāo)記是對(duì)個(gè)體中感染和/或炎癥的生理應(yīng)答所特有的。由于上面提出的原因，預(yù)期這些生物標(biāo)記將為確定個(gè)體中膿毒或SIRS狀態(tài)提供尤其有用的預(yù)測(cè)。即，預(yù)期從一個(gè)個(gè)體的不同生物樣品所得圖譜中這些特征的比較將確定該患者是向嚴(yán)重膿毒發(fā)展還是SIRS正向常態(tài)發(fā)展。
在表2中所列的23種離子中，14種在時(shí)間-48小時(shí)群體中顯示出最大強(qiáng)度，8種在時(shí)間-24小時(shí)群體中顯示出最大強(qiáng)度，1種在時(shí)間0群體中顯示出最大強(qiáng)度。來(lái)自膿毒組的生物樣品中生物標(biāo)記的強(qiáng)度隨時(shí)間的代表性變化在圖4A中顯示，而來(lái)自SIRS組的生物樣品中同一生物標(biāo)記的強(qiáng)度的變化在圖4B中顯示。該特定離子的m/z為437.2Da，保留時(shí)間為1.42分鐘，該離子在通過(guò)常規(guī)技術(shù)診斷這些患者向膿毒的轉(zhuǎn)化之前48小時(shí)在膿毒組中的強(qiáng)度達(dá)到峰值。從而該離子在生物樣品中的相對(duì)強(qiáng)度的波峰作為約48小時(shí)內(nèi)該個(gè)體中膿毒發(fā)作的預(yù)測(cè)者。
1.4.3交叉驗(yàn)證當(dāng)決策規(guī)則是基于來(lái)自相對(duì)少的生物標(biāo)記譜的大量特征時(shí)，選擇偏倚可以影響為決策規(guī)則提供信息的特征的鑒定。(見(jiàn)Ambroise等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 996562-66(2002))。當(dāng)數(shù)據(jù)被用于選擇特征，并且對(duì)所選的特征實(shí)施有條件的估計(jì)性能而不考慮選擇過(guò)程中的變異性時(shí)，將發(fā)生選擇偏倚。結(jié)果是對(duì)分類準(zhǔn)確度的過(guò)高估計(jì)。如果不對(duì)選擇偏移調(diào)整，那么分類準(zhǔn)確度可以達(dá)到100％，甚至決策規(guī)則是基于隨機(jī)輸入?yún)?shù)時(shí)也是如此(Id.)?？梢栽谛阅芄烙?jì)過(guò)程中包括特征選擇來(lái)避免選擇偏倚，而不管該性能估計(jì)過(guò)程是10倍交叉驗(yàn)證或者一種自舉方法(見(jiàn)，例如，Hastie等人，如前，7.10-7.11，被并入本文作為參考)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)10倍交叉驗(yàn)證檢測(cè)模型性能。通過(guò)將數(shù)據(jù)隨機(jī)分配到10個(gè)排他性組進(jìn)行10倍交叉驗(yàn)證。然后依次將每組排除，并用模型擬合剩下的9組。將所擬合的模型應(yīng)用于被排除的組，產(chǎn)生所預(yù)測(cè)的類別概率。通過(guò)簡(jiǎn)單地產(chǎn)生預(yù)測(cè)類別可以將預(yù)測(cè)的類別概率與實(shí)際的類別成員資格比較。例如，如果膿毒的概率為，例如，大于0.5，那么該預(yù)測(cè)的類別是膿毒。
偏差(Deviance)是比較概率與實(shí)際結(jié)果的一種量度。本文中，“偏差”被定義為 其中P為特定類別的類別概率。當(dāng)對(duì)于實(shí)際的類別類別概率高時(shí)，偏差減小。兩種模型可以對(duì)給定數(shù)據(jù)做出相同預(yù)測(cè)，然而優(yōu)選的模型將具有更小的預(yù)測(cè)偏差。對(duì)于10倍交叉驗(yàn)證中的10次迭代的每一次迭代，對(duì)于該迭代期間模型擬合之外的病例計(jì)算預(yù)測(cè)偏差。結(jié)果是10個(gè)無(wú)偏偏差。通常，將這10個(gè)偏差相加產(chǎn)生對(duì)總數(shù)據(jù)集的模型性能(即，準(zhǔn)確度)的概括。因?yàn)閷?shí)際上10種不同的模型適合時(shí)，交叉驗(yàn)證不能證明特定模型的性能。相反，通過(guò)通常的建模方法產(chǎn)生10種模型，并且交叉驗(yàn)證證明了該方法的性能。從該方法得到的第11種模型將具有頭10個(gè)的預(yù)測(cè)性能。使用10倍交叉驗(yàn)證通常導(dǎo)致模型的性能小于100％，但是當(dāng)決策規(guī)則應(yīng)用于訓(xùn)練組之外的樣品得到的生物標(biāo)記時(shí)，預(yù)期10倍交叉驗(yàn)證后所得性能更準(zhǔn)確地反映該決策規(guī)則的生物學(xué)上有意義的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度。
分類樹(shù)分析分析該數(shù)據(jù)的一種方法是使用分類樹(shù)算法，該算法研究大數(shù)據(jù)集中的模式和關(guān)系?！胺诸悩?shù)”是使用一系列問(wèn)題將特定患者分類到特定類別(例如，膿毒或者SIRS)的遞歸劃分，這些問(wèn)題被設(shè)計(jì)使得將該患者準(zhǔn)確置于一個(gè)類別中。每個(gè)問(wèn)題詢問(wèn)患者的條件是否滿足給定預(yù)測(cè)值，每個(gè)問(wèn)題被用于使用者沿著分類樹(shù)下降直到可以確定該患者進(jìn)入的類別。本文中，“預(yù)測(cè)值”是一系列特征的值的范圍，在該實(shí)例中為具有特征m/z和來(lái)自ACN中C18柱的洗脫圖的離子的離子強(qiáng)度?！皸l件”是在個(gè)體的生物標(biāo)記譜中檢測(cè)特征的單一的、特定的值。在該實(shí)例中，“類別名”是膿毒和SIRS。從而，分類樹(shù)使用者將首先提問(wèn)在該個(gè)體的生物標(biāo)記譜中檢測(cè)的第一離子強(qiáng)度是否在第一個(gè)離子的預(yù)測(cè)范圍的給定范圍內(nèi)。第一個(gè)問(wèn)題的回答將在確定該個(gè)體為SIRS或者膿毒中是決定性的。另一方面，對(duì)第一個(gè)問(wèn)題的回答還可以指導(dǎo)使用者詢問(wèn)在該個(gè)體的生物標(biāo)記譜中檢測(cè)的第二離子強(qiáng)度是否在第二個(gè)離子的預(yù)測(cè)范圍的給定范圍內(nèi)。再次，對(duì)該第二個(gè)問(wèn)題的回答可以決定或者指導(dǎo)使用者進(jìn)一步沿著分類樹(shù)向下直到患者的分類被最終確定。
用分類樹(shù)算法分析了時(shí)間0時(shí)從膿毒和SIRS群體收集的離子強(qiáng)度的代表性集合，其結(jié)果在圖5中顯示。在該情況中，所分析的離子集合包括標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)度小于0.1的那些離子。分類樹(shù)中的第一個(gè)決策點(diǎn)是具有m/z為約448.5道爾頓和洗脫處百分?jǐn)?shù)ACN為約32.4％的離子的標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)度是否小于約0.0414。如果該問(wèn)題的回答是“是”，那么繼續(xù)沿著左枝向下到另一個(gè)問(wèn)題或者另一個(gè)類名。在該情況中，如果標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)度小于約0.0414，那么進(jìn)行到類名“SIRS”并且該個(gè)體被歸類為SIRS-陽(yáng)性，但是膿毒陰性。如果答案是“否”，那么沿著右枝向下到另一個(gè)決策點(diǎn)，如此直到達(dá)到類名。在該實(shí)例中，用三個(gè)決策點(diǎn)為個(gè)體預(yù)測(cè)類名。盡管可以用單個(gè)決策點(diǎn)將患者分類為SIRS-或者膿毒-陽(yáng)性，但是使用其他離子的額外的決策點(diǎn)通常提高分類的準(zhǔn)確度。技術(shù)人員將明白從大數(shù)據(jù)集可以得到許多不同的分類樹(shù)。即，例如，生物標(biāo)記的許多可能組合可用于將個(gè)體分類為屬于SIRS群體或者膿毒群體。
1.4.5多重累加回歸樹(shù)使用一種自動(dòng)化的靈活的建模技術(shù)將特征的集合歸類為屬于兩個(gè)群體之一，該技術(shù)使用多重累加回歸樹(shù)(MART)。MART模型使用最初偏移量，該偏移量指定應(yīng)用于所有預(yù)測(cè)的常數(shù)，然后指定一系列回歸樹(shù)。該模型的擬合由每種樹(shù)中決定點(diǎn)的數(shù)目指定、用于擬合的樹(shù)的數(shù)目、和指定特定樹(shù)怎樣根本地影響MART模型的“粒度常數(shù)”指定。對(duì)于每次迭代，回歸樹(shù)被擬合以估計(jì)擬合標(biāo)準(zhǔn)的最陡峭的下降的方向。在該方向采取具有該粒度常數(shù)指定的長(zhǎng)度的步驟。這樣MART模型由最初的偏移量加上回歸樹(shù)提供的步驟組成。再次計(jì)算觀察值和預(yù)測(cè)值之間的差異，并繼續(xù)進(jìn)行該循環(huán)，導(dǎo)致預(yù)測(cè)的不斷完善。該過(guò)程持續(xù)預(yù)定的循環(huán)數(shù)或者直到引發(fā)停止規(guī)則。
每棵樹(shù)中分枝的數(shù)目是尤其有意義的擬合參數(shù)。如果每個(gè)樹(shù)僅有一個(gè)分枝，那么該模型僅考慮一個(gè)特征并且不能組合兩個(gè)預(yù)測(cè)值。如果每棵樹(shù)有兩個(gè)分枝，那么該模型可以容納特征之間的二路相互作用。使用三棵樹(shù)，該模型可以容納三路相互作用，等等。
使用特征和公知的類別狀態(tài)(例如，膿毒或SIRS)為數(shù)據(jù)集確定預(yù)測(cè)類別狀態(tài)中特征集的值。MART提供了個(gè)體特征對(duì)分類決策規(guī)則的貢獻(xiàn)或者重要性的量度。具體地，可以檢測(cè)對(duì)給定樹(shù)分枝單個(gè)特征的選擇時(shí)該單個(gè)特征對(duì)該決策規(guī)則的貢獻(xiàn)程度以通過(guò)這些特征對(duì)決定最終的決策規(guī)則的重要性對(duì)這些特征排序。對(duì)同一數(shù)據(jù)集重復(fù)MART分析可以產(chǎn)生特征的稍微不同的排序，特別是關(guān)于對(duì)于建立決策規(guī)則較不重要的那些特征?？捎糜诒景l(fā)明的預(yù)測(cè)性特征和它們的相應(yīng)生物標(biāo)記的集合可以隨著本文提出的那些集合而稍微改變。
MART技術(shù)的一個(gè)實(shí)現(xiàn)在R統(tǒng)計(jì)編程環(huán)境中的一個(gè)模塊，或者“包”中發(fā)現(xiàn)(見(jiàn)Venables等人，Modern Applied Statistics with S，第四版(Springer，2002)；www.r-project.org)。使用R版本1.7.0和1.7.1計(jì)算該文件中的報(bào)導(dǎo)的結(jié)果。實(shí)現(xiàn)MART的模塊(Greg Ridgeway編寫)被稱為“gbm”并且可以免費(fèi)下載(見(jiàn)www.r-project.org)。該MART算法被修改以適于十倍交叉驗(yàn)證。粒度參數(shù)被設(shè)置為0.05，gbm包的內(nèi)部停止規(guī)則是基于在每個(gè)標(biāo)記的迭代處忽略20％的數(shù)據(jù)組。迭代的程度被設(shè)為1，因此不考慮這些特征之間的相互作用。Gbm包基于百分?jǐn)?shù)估計(jì)每個(gè)特征的相對(duì)重要性，對(duì)于生物標(biāo)記的所有特征，相對(duì)重要性的累積等于100％。具有最高重要性的特征占總重要性的至少90％，該具有最高重要性的特征被報(bào)告為可能具有預(yù)測(cè)值。注意到在擬合每個(gè)MART模型中停止規(guī)則為模型擬合和特征選擇貢獻(xiàn)了一個(gè)隨機(jī)組分。因此，基于相同數(shù)據(jù)運(yùn)行的多個(gè)MART建模運(yùn)行可以選擇稍微不同，或者可能完全不同的特征集合。這些不同的集合傳達(dá)相同的預(yù)測(cè)信息；因此，所有集合都可用于本發(fā)明。預(yù)期給MART模型擬合足夠的次數(shù)將產(chǎn)生生物標(biāo)記譜內(nèi)的預(yù)測(cè)特征的所有可能的集合。因此，公開(kāi)的預(yù)測(cè)值的集合僅代表可用于將個(gè)體分類到群體的那些特征的集合。
1.3.4邏輯回歸分析邏輯回歸分析提供來(lái)自上述LC/MS分析的數(shù)據(jù)流的另一種方法。通過(guò)在給定m/z位置處光譜中出現(xiàn)的峰的高度檢測(cè)“峰強(qiáng)度”。在給定m/z位置缺少峰導(dǎo)致給該峰強(qiáng)度分配“0”。然后從合并的SIRS和膿毒群體的光譜得到給定m/z位置的峰強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。如果SIRS和膿毒群體之間峰強(qiáng)度沒(méi)有變化(即SD＝0)，那么不進(jìn)一步考慮峰強(qiáng)度。在回歸分析前，使用本領(lǐng)域中熟知的方法檢測(cè)峰強(qiáng)度。檢測(cè)算法通常在Hastie等人，如前，11章中描述。
該特征選擇方法從時(shí)間0生物標(biāo)記譜鑒定了26個(gè)輸入?yún)?shù)(即，生物標(biāo)記)，它們?cè)诒?中列出。盡管輸入?yún)?shù)以統(tǒng)計(jì)學(xué)重要性排列，但是仍然可以證明較低級(jí)別的輸入?yún)?shù)仍然是有臨床價(jià)值的并且可用于本發(fā)明。此外，技術(shù)人員將理解，如果參比群體以任何方式改變，那么給定輸入?yún)?shù)的排列的重要性可以改變。
表6時(shí)間0樣品的輸入?yún)?shù)
使用該相同的邏輯回歸分析，可以按照使用在時(shí)間-48小時(shí)采集的樣品預(yù)測(cè)膿毒的發(fā)作中的重要性排列生物標(biāo)記。該特征選擇方法為時(shí)間-48小時(shí)樣品產(chǎn)生了37個(gè)輸入?yún)?shù)，如表7中所示。
表7來(lái)自時(shí)間-48小時(shí)樣品的輸入?yún)?shù)
1.4.7Wilcoxon帶符號(hào)的秩檢驗(yàn)分析在再一個(gè)方法中，可以用非參數(shù)檢驗(yàn)如Wilcoxon帶符號(hào)的秩檢驗(yàn)鑒定單個(gè)目標(biāo)生物標(biāo)記。生物標(biāo)記譜中的特征被分配“p值”，其表示生物標(biāo)記可用于將個(gè)體分類為特定參比群體的確定性程度。通常，具有預(yù)測(cè)價(jià)值的p值低于約0.05。具有低p值的生物標(biāo)記可被自身用于分類個(gè)體。備選地，兩種或多種生物標(biāo)記的組合可用于分類個(gè)體，其中基于生物標(biāo)記的相對(duì)p值選擇組合。通常，對(duì)于生物標(biāo)記的給定組合，優(yōu)選具有更低p-值的那些生物標(biāo)記。也可以以這種方式用至少3、4、5、6、10、20、30或更多種生物標(biāo)記的組合對(duì)個(gè)體分類。技術(shù)人員將明白任一給定生物標(biāo)記的相對(duì)p-值可以根據(jù)參比群體的大小而變。
使用Wilcoxon帶符號(hào)的秩檢驗(yàn)，對(duì)從在時(shí)間0、時(shí)間-24小時(shí)和時(shí)間-48小時(shí)采集的生物樣品得到的生物標(biāo)記譜的特征分配p值。這些p值分別在表8、9和10中列出。
表8時(shí)間0小時(shí)樣品的p值
表9時(shí)間24小時(shí)樣品的p值
表10時(shí)間48小時(shí)樣品的p值
備選地，非參數(shù)檢驗(yàn)(例如，Wilcoxon帶符號(hào)的秩檢驗(yàn))可用于基于正向膿毒發(fā)展的群體中特征的漸進(jìn)性出現(xiàn)或者消失發(fā)現(xiàn)特征的p值。在該檢驗(yàn)形式中，首先檢測(cè)給定特征的基線值，該檢測(cè)使用膿毒和SIRS組進(jìn)入研究(天1樣品)時(shí)的數(shù)據(jù)。然后將膿毒和SIRS樣品中特征強(qiáng)度與例如，-48小時(shí)樣品中的特征強(qiáng)度比較以確定該特征強(qiáng)度是否從其基線值增加或者減少了。最后，將p值分配給膿毒群體和SIRS群體中特征強(qiáng)度與基線的不同。當(dāng)檢測(cè)p值中與基線的這些不同時(shí)得到了下面表11-13中所列的p-值。
表11與基線不同的特征的p值時(shí)間0樣品
表12與基線不同的特征的p值時(shí)間-24小時(shí)樣品
表13與基線不同的特征的p值時(shí)間-48小時(shí)樣品
實(shí)施例2使用定量液相層析-質(zhì)譜/質(zhì)譜(LC-MS/MS)鑒定蛋白生物標(biāo)記2.1接受和分析的樣品如上面，從由15名患者組成的第一個(gè)群體(“SIRS組”)和由患SIRS并且發(fā)展到膿毒的15名患者組成的第二個(gè)群體(“膿毒組”)得到參比生物標(biāo)記譜。在天1、時(shí)間0、時(shí)間-48小時(shí)從患者抽血。在該情況中，將來(lái)自患者的50-75μL血漿樣品合并成四批兩批分別由5和10名個(gè)體組成，這些個(gè)體都是SIRS陽(yáng)性，兩批由5和10名個(gè)體組成，這些個(gè)體都是膿毒陽(yáng)性。進(jìn)一步分析來(lái)自每個(gè)合并的批的6個(gè)樣品。
2.2樣品制備首先將血漿樣品免疫耗竭以除去過(guò)多的蛋白，特別是白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、觸珠蛋白、抗-胰蛋白酶、IgG、和IgA，它們一起組成樣品中蛋白質(zhì)的約85％(wt％)。用Multiple Affinity Removal System柱(Agilent Technologies，Palo Alto，California)實(shí)施免疫耗竭，根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明使用該柱子。使用該系統(tǒng)從血漿樣品除去上述6種蛋白質(zhì)的至少95％。例如，僅約0.1％的白蛋白保留在耗竭的樣品中。并且估計(jì)樣品中所剩的僅約8％代表剩余的高豐度蛋白，如IgM和α-2巨球蛋白。然后使用本領(lǐng)域中公知的方法將分級(jí)分離的血漿樣品變性、還原、烷基化并用胰蛋白酶消化。從每個(gè)合并的樣品得到約2mg消化的蛋白。
2.3多維LC/MS然后將胰蛋白酶消化后的肽混合物用LC柱分級(jí)分離并通過(guò)以LC/MS/MS排列配置的Agilent MSD/阱ESI-離子阱質(zhì)譜進(jìn)行分析。將1mg消化蛋白以10μL/分鐘應(yīng)用于微流C18反相(RP1)柱。RP1柱串聯(lián)偶聯(lián)到強(qiáng)陽(yáng)離子交換(SCX)分級(jí)分離柱，該柱子又反過(guò)來(lái)連接到C18反相捕獲柱。樣品以0-10％ACN的第一個(gè)梯度應(yīng)用于RP1柱以在RP1柱上分級(jí)分離肽。ACN梯度后接著是10mM鹽緩沖液洗脫，其將肽進(jìn)一步分級(jí)分離成結(jié)合到SCX柱的部分和固定在捕獲柱的洗脫級(jí)分。然后將捕獲柱從其與SCX柱的可操作的連接除去并與另一C18反相柱(RP2)可操作連接。用0-10％ACN以300nL/分鐘將捕獲柱中固定的級(jí)分從該捕獲柱洗脫到RP2柱上。該RP柱可操作地連接到AgilentMSD/trap ESI離子阱質(zhì)譜儀，該質(zhì)譜儀以1000-1500V的噴霧電壓運(yùn)行。使用總ACN％3從0-80％和高達(dá)1M的鹽濃度重復(fù)該循環(huán)(PR1-SCX-Trap-RP2)以分級(jí)分離并分開(kāi)剩余的肽。LC/MS/MS的其他適宜的配置可用于產(chǎn)生可用于本發(fā)明的生物標(biāo)記譜。產(chǎn)生的質(zhì)譜的m/z范圍為200-2200Da。應(yīng)用依賴數(shù)據(jù)的掃描和動(dòng)態(tài)排除以實(shí)現(xiàn)更高的動(dòng)態(tài)范圍。圖6顯示了用LC/MS和LC/MS/MS產(chǎn)生的代表性生物標(biāo)記譜。
2.4數(shù)據(jù)分析和結(jié)果對(duì)于以MS/MS模式分析的每種樣品，得到約150,000種光譜，相當(dāng)于約1.5千兆字節(jié)信息。共收集了約50千兆字節(jié)信息。用SpectrumMill v 2.7軟件(Copyright 2003 Agilent Technologies，Inc.)分析光譜。用MS-Tag數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋算法(Millennium Pharmaceuticals)針對(duì)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)人非冗余蛋白的數(shù)據(jù)庫(kù)匹配MS/MS光譜。用相當(dāng)于95％置信度的截?cái)嗟梅肿C實(shí)所匹配的肽，然后將所述肽裝配以鑒定樣品中存在的蛋白。用本發(fā)明方法可檢測(cè)的蛋白質(zhì)以～1ng/mL的濃度存在于血漿中，覆蓋血漿濃度的動(dòng)態(tài)范圍為約6個(gè)數(shù)量級(jí)。
通過(guò)確定對(duì)蛋白“陽(yáng)性”的質(zhì)譜數(shù)得到血漿中所檢測(cè)到的蛋白質(zhì)豐度的半定量估計(jì)。為了為正，離子特征的強(qiáng)度可檢測(cè)地高于光譜中給定m/z值處的噪聲。通常，在血漿中以較高水平表達(dá)的蛋白質(zhì)作為正離子特征或者更多光譜中的一組離子特征將是可檢測(cè)地。通過(guò)該蛋白質(zhì)濃度的量度，很明顯在SIRS組對(duì)膿毒組中多種蛋白質(zhì)差別表達(dá)。在圖7A和7B中顯示了被“上調(diào)”的多種可檢測(cè)的蛋白，其中被上調(diào)的蛋白在膿毒組中比在SIRS組以更高水平表達(dá)。從圖7A可清楚地看出蛋白質(zhì)隨時(shí)間表達(dá)的水平可以以和離子#21(437.2Da，1.42min)相同的方式變化，離子#21在圖4中顯示。例如，具有GenBank登錄號(hào)AAH15642和NP_000286的蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上都與絲氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制劑相似，兩者都在膿毒陽(yáng)性群體中隨時(shí)間以漸增的水平表達(dá)，而它們?cè)赟IRS-陽(yáng)性群體中以相對(duì)恒定的量表達(dá)。隨時(shí)間在個(gè)體中出現(xiàn)高水平的這些蛋白，尤其這些蛋白的不斷升高的表達(dá)，被預(yù)期是膿毒發(fā)作的預(yù)測(cè)者。在圖8A和8B中顯示了隨時(shí)間在膿毒陽(yáng)性群體中被下調(diào)的多種蛋白。這些蛋白的某些，像具有GenBank登錄號(hào)NP_079216中所示序列的未命名的蛋白質(zhì)的表達(dá)在SIRS患者中似乎漸增或者保持在相對(duì)高的水平，而在膿毒患者中該表達(dá)減小。預(yù)期這些蛋白質(zhì)將是尤其可用于診斷SIRS，以及預(yù)測(cè)膿毒發(fā)作的生物標(biāo)記。
現(xiàn)在參考某些代表性實(shí)施方案和細(xì)節(jié)完全描述了本發(fā)明，對(duì)本領(lǐng)域中技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，可以對(duì)這些本發(fā)明進(jìn)行更改和修飾而不背離本文中提出的本發(fā)明的精神或范圍。
權(quán)利要求
1.確定個(gè)體中膿毒狀態(tài)的方法，該方法包括(a)從自該個(gè)體得到的第一生物樣品得到第一生物標(biāo)記譜；和(b)將所述個(gè)體的第一生物標(biāo)記譜與從參比群體得到的參比生物標(biāo)記譜比較；其中一次這種比較就能夠?qū)⒃搨€(gè)體歸為屬于或者不屬于該參比群體；其中所述個(gè)體的第一生物標(biāo)記譜和所述參比生物標(biāo)記譜含有至少一種低分子量化合物的可檢測(cè)的方面，所述至少一種低分子量化合物的質(zhì)量-電荷比為約100道爾頓到約1000道爾頓；并且其中該比較確定該個(gè)體中的膿毒狀態(tài)。
2.確定個(gè)體中膿毒狀態(tài)的方法，該方法包括(a)從在單個(gè)時(shí)間點(diǎn)從該個(gè)體得到的生物樣品得到第一生物標(biāo)記譜；和(b)將所述個(gè)體的第一生物標(biāo)記譜與從參比群體得到的參比生物標(biāo)記譜比較；其中所述個(gè)體的第一生物標(biāo)記譜和所述參比生物標(biāo)記譜含有至少一種低分子量化合物的可檢測(cè)的方面，所述至少一種低分子量化合物的質(zhì)量-電荷比為約100道爾頓到約1000道爾頓；并且其中該生物標(biāo)記譜的比較以至少約60％的準(zhǔn)確度確定該個(gè)體中的膿毒狀態(tài)。
3.確定個(gè)體中膿毒狀態(tài)的方法，該方法包括將(i)從在單個(gè)時(shí)間點(diǎn)從該個(gè)體得到的第一生物樣品產(chǎn)生的第一生物標(biāo)記譜與(ii)從參比群體產(chǎn)生的生物標(biāo)記譜比較，其中所述個(gè)體的第一生物標(biāo)記譜和所述參比生物標(biāo)記譜含有至少一種低分子量化合物的可檢測(cè)的方面，所述至少一種低分子量化合物的質(zhì)量-電荷比為約100道爾頓到約1000道爾頓，并且其中該比較包括應(yīng)用決策規(guī)則，該決策規(guī)則確定該個(gè)體中的膿毒狀態(tài)。
4.確定個(gè)體中膿毒狀態(tài)的方法，該方法包括(a)從自該個(gè)體得到的第一生物樣品得到第一生物標(biāo)記譜；和(b)將所述個(gè)體的第一生物標(biāo)記譜與從參比群體的生物樣品得到的參比生物標(biāo)記譜比較；其中參比群體選自正常參比群體、SIRS-陽(yáng)性參比群體、受感染的/SIRS-陰性參比群體、膿毒陽(yáng)性參比群體、處于膿毒發(fā)展階段的參比群體、通過(guò)常規(guī)技術(shù)在約0-36小時(shí)后證實(shí)患有膿毒的SIRS-陽(yáng)性參比群體、通過(guò)常規(guī)技術(shù)在約36-60小時(shí)后證實(shí)患有膿毒的SIRS-陽(yáng)性參比群體、通過(guò)常規(guī)技術(shù)在約60-84小時(shí)后證實(shí)患有膿毒的SIRS-陽(yáng)性參比群體；其中一次這種比較就能夠?qū)⒃搨€(gè)體歸為屬于或者不屬于該參比群體；其中所述個(gè)體的第一生物標(biāo)記譜和所述參比生物標(biāo)記譜含有至少一種低分子量化合物的可檢測(cè)的方面，所述至少一種低分子量化合物的質(zhì)量-電荷比為約100道爾頓到約1000道爾頓；并且其中該比較確定該個(gè)體中的膿毒狀態(tài)。
5.確定個(gè)體中膿毒狀態(tài)的方法，該方法包括將(i)從自該個(gè)體得到的第一生物樣品產(chǎn)生的第一生物標(biāo)記譜與(ii)從參比群體的生物樣品得到的生物標(biāo)記譜之間的至少一種生物標(biāo)記的可檢測(cè)特征相比較，其中該比較將該個(gè)體歸為屬于或者不屬于該參比群體，其中所述個(gè)體的第一生物標(biāo)記譜和所述參比生物標(biāo)記譜含有至少一種低分子量化合物的可檢測(cè)的方面，所述至少一種低分子量化合物的質(zhì)量-電荷比為約100道爾頓到約1000道爾頓，并且其中該比較確定該個(gè)體中的膿毒狀態(tài)。
6.確定個(gè)體中膿毒狀態(tài)的方法，該方法包括(a)從來(lái)自該個(gè)體的第一生物樣品產(chǎn)生的第一生物標(biāo)記譜中的一組生物標(biāo)記中選擇至少兩種特征；和(b)將該特征與從來(lái)自參比群體的生物樣品產(chǎn)生的參比生物標(biāo)記譜中的一組相同生物標(biāo)記相比較，其中一次這樣的比較能夠以至少約60％的準(zhǔn)確度將該個(gè)體歸為屬于或者不屬于該參比群體；其中所述個(gè)體的第一生物標(biāo)記譜和所述參比生物標(biāo)記譜含有至少一種低分子量化合物的可檢測(cè)的方面，所述至少一種低分子量化合物的質(zhì)量-電荷比為約100道爾頓到約1000道爾頓；并且其中該比較確定該個(gè)體中的膿毒狀態(tài)。
7.確定個(gè)體中膿毒狀態(tài)的方法，該方法包括(a)確定在從來(lái)自該個(gè)體的第一生物樣品得到的第一生物標(biāo)記譜中至少兩種生物標(biāo)記的豐度或者豐度的變化；和(b)將該個(gè)體的第一生物標(biāo)記譜中該至少兩種生物標(biāo)記的豐度或者豐度的變化與來(lái)自參比群體生物樣品的參比生物標(biāo)記譜中這些生物標(biāo)記的豐度或者豐度的變化相比較，其中該比較能夠?qū)⒃搨€(gè)體歸為屬于或者不屬于該參比群體；其中所述個(gè)體的第一生物標(biāo)記譜和所述參比生物標(biāo)記譜中的所述生物標(biāo)記具有的質(zhì)量-電荷比為約100道爾頓到約1000道爾頓；并且其中該比較確定該個(gè)體中的膿毒狀態(tài)。
8.確定個(gè)體中膿毒狀態(tài)的方法，該方法包括與來(lái)自(i)患膿毒的SIRS-陽(yáng)性參比群體和(ii)不患膿毒的SIRS-陽(yáng)性參比群體的生物樣品的至少一種生物標(biāo)記的豐度或者豐度變化相比較，確定從來(lái)自該個(gè)體的第一生物樣品得到的第一生物標(biāo)記譜中至少一種生物標(biāo)記的豐度或者豐度變化，其中生物標(biāo)記選自表2-13的任一表中所列的生物標(biāo)記。
9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法，其中生物樣品選自血液、唾液、血清、血漿、尿、腦脊液、細(xì)胞、細(xì)胞提取物、組織樣品、糞便、和組織活檢。
10.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法，其還包括重復(fù)該方法至少一次，其中從每次該方法重復(fù)時(shí)采集的分離的生物樣品得到該個(gè)體的生物標(biāo)記譜。
11.權(quán)利要求10的方法，其中來(lái)自該個(gè)體的生物樣品采集的時(shí)間相隔約24小時(shí)。
12.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法，其中確定個(gè)體中膿毒的狀態(tài)包括預(yù)測(cè)該個(gè)體中膿毒的發(fā)作。
13.權(quán)利要求12的方法，其中在使用常規(guī)技術(shù)確定個(gè)體中膿毒前至少約24小時(shí)預(yù)測(cè)膿毒的發(fā)作。
14.權(quán)利要求12的方法，其中在使用常規(guī)技術(shù)確定個(gè)體中膿毒前至少約48小時(shí)預(yù)測(cè)膿毒的發(fā)作。
15.權(quán)利要求12的方法，其中在使用常規(guī)技術(shù)確定個(gè)體中膿毒前至少約96小時(shí)預(yù)測(cè)膿毒的發(fā)作。
16.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法，其中確定個(gè)體中膿毒的狀態(tài)包括確定該個(gè)體中膿毒的發(fā)展。
17.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法，其中確定個(gè)體中膿毒的狀態(tài)包括診斷該個(gè)體中的膿毒。
18.權(quán)利要求1-2和4-8任一項(xiàng)的方法，其中該比較包括應(yīng)用決策規(guī)則。
19.權(quán)利要求18的方法，其中應(yīng)用決策規(guī)則包括使用數(shù)據(jù)分析算法。
20.權(quán)利要求19的方法，其中數(shù)據(jù)分析算法包括使用分類樹(shù)。
21.權(quán)利要求19的方法，其中數(shù)據(jù)分析算法是非參數(shù)的。
22.權(quán)利要求21的方法，其中數(shù)據(jù)分析算法檢測(cè)特征值分布中的差異。
23.權(quán)利要求22的方法，其中非參數(shù)算法包括使用Wilcoxon帶符號(hào)的秩檢驗(yàn)。
24.權(quán)利要求19的方法，其中數(shù)據(jù)分析算法包括使用多重累加回歸樹(shù)。
25.權(quán)利要求19的方法，其中數(shù)據(jù)分析算法是邏輯回歸。
26.權(quán)利要求19的方法，其中數(shù)據(jù)分析算法包括至少兩個(gè)輸入?yún)?shù)。
27.權(quán)利要求26的方法，其中數(shù)據(jù)分析算法包括至少五個(gè)輸入?yún)?shù)。
28.權(quán)利要求27的方法，其中數(shù)據(jù)分析算法包括至少十個(gè)輸入?yún)?shù)。
29.權(quán)利要求28的方法，其中數(shù)據(jù)分析算法包括至少20個(gè)輸入?yún)?shù)。
30.權(quán)利要求19的方法，其中數(shù)據(jù)分析算法使用表2-13之一中所列的至少兩種特征作為輸入?yún)?shù)。
31.權(quán)利要求18的方法，其中決策規(guī)則以至少約60％的準(zhǔn)確度確定個(gè)體中膿毒的狀態(tài)。
32.權(quán)利要求31的方法，其中決策規(guī)則以至少約70％的準(zhǔn)確度確定個(gè)體中膿毒的狀態(tài)。
33.權(quán)利要求32的方法，其中決策規(guī)則以至少約80％的準(zhǔn)確度確定個(gè)體中膿毒的狀態(tài)。
34.權(quán)利要求33的方法，其中決策規(guī)則以至少約90％的準(zhǔn)確度確定個(gè)體中膿毒的狀態(tài)。
35.權(quán)利要求31的方法，其中在使用常規(guī)技術(shù)確定該個(gè)體患有膿毒的臨床懷疑前至少約48小時(shí)確定該個(gè)體中膿毒的狀態(tài)。
36.權(quán)利要求31的方法，其中決策規(guī)則受到十倍交叉驗(yàn)證。
37.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法，其中參比生物標(biāo)記譜從含有單個(gè)個(gè)體的群體得到。
38.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法，其中參比生物標(biāo)記譜從含有至少兩個(gè)個(gè)體的群體得到。
39.權(quán)利要求38的方法，其中從含有至少20個(gè)個(gè)體的群體得到參比生物標(biāo)記譜。
40.權(quán)利要求1-3和5-8任一項(xiàng)的方法，其中參比生物標(biāo)記譜從選自正常參比群體、SIRS-陽(yáng)性參比群體、受感染的/SIRS-陰性參比群體、膿毒陽(yáng)性參比群體、處于膿毒發(fā)展階段的參比群體、通過(guò)常規(guī)技術(shù)在約0-36小時(shí)后證實(shí)患有膿毒的SIRS-陽(yáng)性參比群體、通過(guò)常規(guī)技術(shù)在約36-60小時(shí)后證實(shí)患有膿毒的SIRS-陽(yáng)性參比群體、通過(guò)常規(guī)技術(shù)在約60-84小時(shí)后證實(shí)患有膿毒的SIRS-陽(yáng)性參比群體的群體得到。
41.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法，其還包括將來(lái)自個(gè)體的第二生物標(biāo)記譜與參比生物標(biāo)記譜比較，其中該第二生物標(biāo)記譜從采自該個(gè)體的第二生物樣品得到。
42.權(quán)利要求41的方法，其中在從該個(gè)體采集第一生物樣品后約24小時(shí)采集該第二生物樣品。
43.權(quán)利要求41的方法，其中將第二生物標(biāo)記譜與不同于第一生物標(biāo)記譜的參比生物標(biāo)記譜比較。
44.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法，其中所述至少一種低分子量化合物包含至少一種多肽。
45.權(quán)利要求44的方法，其中至少一種多肽存在于血漿。
46.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法，其中所述至少一種低分子量化合物選自質(zhì)量-電荷比(m/z)為約100道爾頓到約1000道爾頓的離子，其中通過(guò)電噴霧電離質(zhì)譜以陽(yáng)性模式檢測(cè)所述離子。
47.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法，其中所述至少一種低分子量化合物是選自表2-13任一個(gè)中所列出的離子組的離子。
48.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法，其中在所述得到所述個(gè)體的第一生物標(biāo)記譜之前將所述生物樣品分級(jí)分離。
49.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法，其中至少一種分離方法被用于得到所述個(gè)體的第一生物標(biāo)記譜。
50.權(quán)利要求49的方法，其中至少兩種分離方法被用于得到所述個(gè)體的第一生物標(biāo)記譜。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述至少兩種分離方法包括質(zhì)譜。
52.權(quán)利要求51的方法，其中所述質(zhì)譜選自電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)、ESI-MS/MS、ESI-MS/(MS)n、基質(zhì)輔助的激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)、表面增強(qiáng)的激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)、硅上解吸/電離(DIOS)、二級(jí)離子質(zhì)譜(SIMS)、四極飛行時(shí)間(Q-TOF)、大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜(APCI-MS)、APCI-MS/MS、APCI-(MS)n、大氣壓光電離質(zhì)譜(APPI-MS)、APPI-MS/MS，和APPI-(MS)n、四極質(zhì)譜、傅立葉變換質(zhì)譜(FTMS)和離子阱質(zhì)譜，其中n是大于0的整數(shù)。
53.權(quán)利要求50的方法，其中所述至少兩種分離方法包括選自化學(xué)萃取分配、離子交換層析、反相液體層析、等電聚焦、一維聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-PAGE)、薄層層析、氣相層析、液相層析，和它們的任一組合的至少一種方法。
54.權(quán)利要求49的方法，其中所述至少一種分離方法是LC/MS。
55.權(quán)利要求54的方法，其還包括分級(jí)分離所述生物樣品。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所述分離分級(jí)包括用冰冷的甲醇提取所述生物樣品。
57.權(quán)利要求56的方法，其中所述提取包括(i)加入所述冰冷的甲醇以形成甲醇的最終體積百分比約67％的混合物，(ii)將該混合物在4℃孵育20分鐘，(iii)通過(guò)以12,000rpm離心10分鐘沉淀蛋白質(zhì)，和(iv)除去上清液以得到所述個(gè)體的第一生物標(biāo)記譜。
58.預(yù)測(cè)個(gè)體中膿毒發(fā)作的方法，該方法包括(a)檢測(cè)生物標(biāo)記譜中的至少兩種特征的一個(gè)方面，其中該生物標(biāo)記譜含有選自表2-13之一中所列的生物標(biāo)記組的至少兩種生物標(biāo)記；和(b)將所述至少兩種特征的所檢測(cè)的方面與參比群體中相同的至少兩種特征的相應(yīng)方面的值比較，其中一次這種比較就能夠?qū)⒃搨€(gè)體歸為屬于或者不屬于該參比群體，并且其中該比較預(yù)測(cè)該個(gè)體中膿毒的發(fā)作。
59.權(quán)利要求58的方法，其中所述膿毒發(fā)作的預(yù)測(cè)在膿毒發(fā)作前約12-36小時(shí)作出，其中膿毒的發(fā)作通過(guò)常規(guī)技術(shù)確定。
60.權(quán)利要求58的方法，其中所述膿毒發(fā)作的預(yù)測(cè)在膿毒發(fā)作前約36-60小時(shí)作出，其中膿毒的發(fā)作通過(guò)常規(guī)技術(shù)確定。
61.權(quán)利要求58的方法，其中所述膿毒發(fā)作的預(yù)測(cè)在膿毒發(fā)作前約60-84小時(shí)作出，其中膿毒的發(fā)作通過(guò)常規(guī)技術(shù)確定。
62.診斷個(gè)體中SIRS的方法，該方法包括(a)從自該個(gè)體得到的第一生物樣品得到第一生物標(biāo)記譜；和(b)將所述個(gè)體的第一生物標(biāo)記譜與從參比群體得到的參比生物標(biāo)記譜比較，其中一次這種比較就能夠?qū)⒃搨€(gè)體歸為屬于或者不屬于該參比群體；其中所述個(gè)體的第一生物標(biāo)記譜和所述參比生物標(biāo)記譜含有至少一種低分子量化合物的可檢測(cè)的方面，所述至少一種低分子量化合物的質(zhì)量-電荷比為約100道爾頓到約1000道爾頓；并且其中該比較診斷該個(gè)體中的SIRS。
63.診斷個(gè)體中SIRS的方法，該方法包括(a)從在單個(gè)時(shí)間點(diǎn)從該個(gè)體得到的生物樣品得到生物標(biāo)記譜；和(b)將所述個(gè)體的生物標(biāo)記譜與參比生物標(biāo)記譜比較，其中所述個(gè)體的生物標(biāo)記譜和所述參比生物標(biāo)記譜含有至少一種低分子量化合物的可檢測(cè)的方面，所述至少一種低分子量化合物的質(zhì)量-電荷比為約100道爾頓到約1000道爾頓；并且其中生物標(biāo)記譜的比較可以至少約60％的準(zhǔn)確度診斷個(gè)體中的SIRS。
64.診斷個(gè)體中SIRS的方法，該方法包括將(i)在單個(gè)時(shí)間點(diǎn)從該個(gè)體采集的第一生物樣品產(chǎn)生的第一生物標(biāo)記譜與(ii)從參比群體產(chǎn)生的參比生物標(biāo)記譜比較，其中所述個(gè)體的第一生物標(biāo)記譜和所述參比生物標(biāo)記譜含有至少一種低分子量化合物的可檢測(cè)的方面，所述至少一種低分子量化合物的質(zhì)量-電荷比為約100道爾頓到約1000道爾頓；并且其中該比較包括應(yīng)用決策規(guī)則，該決策規(guī)則診斷該個(gè)體中的SIRS。
全文摘要
膿毒的早期預(yù)測(cè)或診斷有利地允許在該疾病從最初階段快速發(fā)展到與高死亡率有關(guān)的更嚴(yán)重的階段如嚴(yán)重膿毒或者膿毒性休克之前實(shí)施臨床干預(yù)。使用分子診斷方法實(shí)現(xiàn)早期預(yù)測(cè)或診斷，該方法將個(gè)體的生物標(biāo)記表達(dá)譜與從一種或多種對(duì)照或者參比群體得到的圖譜比較，該參比群體可以包括患膿毒的群體。認(rèn)識(shí)該個(gè)體的生物標(biāo)記譜中膿毒發(fā)作的特征性特征使得臨床醫(yī)生可以從一個(gè)時(shí)間點(diǎn)從個(gè)體分離的體液診斷膿毒的發(fā)作。因此，在一段時(shí)間內(nèi)監(jiān)視患者的必要性被避免了，有利地允許在膿毒的嚴(yán)重癥狀發(fā)作前實(shí)施臨床干預(yù)。
文檔編號(hào)C12P19/34GK1738908SQ200380108647
公開(kāi)日2006年2月22日 申請(qǐng)日期2003年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月12日
發(fā)明者R·艾維, T·根特爾, R·穆?tīng)? M·湯斯, G·休茲達(dá)克, E·萬(wàn)特, Z·沈, N·巴丘爾, R·羅森斯坦, J·納多, P·戈登鮑姆, S·施, D·科珀蒂諾, J·加雷特, G·泰斯 申請(qǐng)人:貝克頓迪金森公司