專利名稱：使用生物標記譜診斷膿毒或者sirs的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及診斷或者預測個體中膿毒或者其發(fā)展階段的方法。本發(fā)明還涉及診斷個體中系統(tǒng)性炎性應答綜合癥的方法。
背景技術：
疾病狀態(tài)的早期檢出通常容許更有效的治療性治療和相應的更有利的臨床結果。然而，在許多情況中，疾病癥狀的早期檢出存在問題；所以，在可能診斷之前疾病可能變成相對的晚期。系統(tǒng)性炎性病癥代表一類這種疾病。這些病癥，尤其是膿毒，通常由病原微生物和宿主的防御系統(tǒng)的相互作用引起，該相互作用在宿主中引發(fā)過度且調節(jié)異常的炎性反應。系統(tǒng)性炎性反應期間宿主應答的復雜性使得針對理解疾病病理的努力錯綜復雜(Healy，Annul.Pharmacother.36648-54(2002)中的綜述)。疾病病理的不完全理解又使發(fā)現(xiàn)診斷性生物標記變得困難。然而，由于膿毒非常快地發(fā)展成威脅生命的病癥，所以迫切需要早期并且可靠的診斷。
膿毒遵循一種明確的時間歷程，從系統(tǒng)性炎性應答綜合癥(“SIRS”)陰性到SIRS陽性到膿毒，然后膿毒發(fā)展成嚴重膿毒、膿毒性休克、多種器官功能異常(“MOD”)，最終死亡。當受感染的個體隨后發(fā)生SIRS時，該個體中也可以出現(xiàn)膿毒。“SIRS”通常被定義為存在下面參數(shù)的兩種或多種體溫大于38℃或者小于36℃；心率大于每分鐘90次；呼吸率大于每分鐘20次呼吸；PCO2小于32mm Hg；和白細胞數(shù)小于4.0×109個細胞/L或者大于12.0×109個細胞/L，或者具有大于10％不成熟帶形?！澳摱尽蓖ǔ１欢x為具有確定的感染過程的SIRS?！皣乐啬摱尽迸cMOD、低血壓、彌漫性血管內(nèi)凝血(“DIC”)或者灌注不足異常，其包括乳酸中毒癥、少尿、和精神狀態(tài)的改變。“膿毒性休克”通常被定義為膿毒誘導的低血壓，其抗液體復蘇并且還存在灌注不足異常。
記載臨床上對膿毒重要的病原微生物的存在已經(jīng)被證明是困難的。通常通過培養(yǎng)患者的血液、痰、尿、傷口分泌物、內(nèi)在的線導管表面，等等來檢測致病微生物。然而，致病微生物可能僅存在于某些身體的微環(huán)境中，從而所培養(yǎng)的具體材料可能不含有污染性微生物?？梢杂捎诟腥静课淮嬖诘奈⑸飻?shù)目少而使得檢測更加復雜。血樣中病原數(shù)目少給通過培養(yǎng)血液診斷膿毒帶來了特別的問題。在一個研究中，例如，僅在17％的具有膿毒臨床表現(xiàn)的患者中得到陽性培養(yǎng)結果(Rangel-Frausto等人，JAMA 273117-23(1995).)。非病原微生物污染樣品可以使診斷進一步復雜化。例如，僅12.4％的被檢測的微生物在707名敗血病患者的研究中是臨床上重要的。(Weinstein等人，Clinical Infectious Diseases 24584-602(1997).)膿毒的早期診斷的困難可以由與該疾病相關的高發(fā)病和高死亡率反映。當前膿毒是美國第十位主要的死亡原因并且在非冠狀重病監(jiān)護室(ICUs)的住院患者中特別普遍，重病監(jiān)護室中膿毒是最常見的死亡原因。總死亡率高達35％，估計僅在美國每年就發(fā)生750,000例。僅美國治療膿毒的年花費就為數(shù)十美元。
因此，需要足夠早地診斷并且允許有效干預和防止膿毒的方法。大多數(shù)現(xiàn)有的膿毒打分系統(tǒng)或者預測模型僅預測已經(jīng)被認為是膿毒的患者中晚期并發(fā)癥(包括死亡)的危險。然而，這些系統(tǒng)和模型不預測膿毒自身的發(fā)展。尤其需要將那些患者分成將患膿毒或者不患膿毒的SIRS患者的方法。當前，研究人員通常定義單一的生物標記，該生物標記在膿毒患者組和患者的正常(即，非膿毒)對照組中的表達水平不同。2003年3月26日提交的美國專利申請序號10/400,275(其完整內(nèi)容被并入作為參考)公開了通過分析各種生物標記的表達水平中的依賴時間的變化揭示早期膿毒的方法。因此，診斷早期膿毒的最佳方法當前需要檢測多種生物標記和監(jiān)視一段時間內(nèi)這些生物標記的表達。
本領域中持續(xù)迫切需要特異且靈敏地診斷膿毒，而不需要隨時間監(jiān)視患者。理想地，通過一種技術進行診斷，該技術準確、快速并且在一個時間點同時檢測多種生物標記，從而使在診斷所需的時間內(nèi)疾病的發(fā)展最小化。
發(fā)明概述本發(fā)明通過在一個時間點內(nèi)檢測來自生物樣品的一種以上的生物標記而允許準確、快速和靈敏地預測和診斷膿毒。通過分子診斷方法實現(xiàn)該預測和診斷，在該分子診斷方法中，通過在一個時間點從個體，尤其具有患膿毒危險、患有膿毒，或者被懷疑患有膿毒的個體得到生物標記譜，并將來自該個體的生物標記譜與參比生物標記譜相比較?？梢詮囊蝗簜€體(“參比群體”)得到參比生物標記譜，這些個體例如，受到膿毒的折磨或者遭受膿毒發(fā)作或者處于膿毒發(fā)展的特定階段。如果來自該個體的生物標記譜含有來自參比群體的生物標記譜的適宜的特征性特征，那么該個體被診斷為更可能與參比群體一樣發(fā)展成膿毒、受到膿毒的折磨或者處于膿毒發(fā)展的特定階段。從各種個體群體也可以得到參比生物標記譜，這些群體包括患有SIRS或者受到感染但是沒有SIRS的那些個體。因此，本發(fā)明允許臨床醫(yī)生確定哪些患者不患有SIRS，哪些患有SIRS但是不可能在研究的期限內(nèi)發(fā)展為膿毒，哪些患者患有膿毒，或者哪些處于最終患膿毒的危險中。
盡管本發(fā)明的方法尤其可用于檢測或預測SIRS患者中膿毒的發(fā)作，但是本領域技術人員將理解本發(fā)明的方法可以用于任一患者，該患者包括，但不限于，被懷疑患有SIRS或者處于膿毒的任一階段的患者。例如，可以從患者采集生物樣品，并且可以將該樣品中的生物標記譜與幾種不同的參比生物標記譜相比較，這些參比生物標記譜的每一種來自例如患有SIRS或者處于膿毒的特定階段的患者。將該患者的生物標記譜分類為相應于來自特定參比群體的圖可以預測該患者屬于該參比群體中?；趶谋景l(fā)明的方法所得的診斷，可以啟動適宜的治療方案。
用于診斷或者預測SIRS、膿毒或者膿毒發(fā)展的階段的現(xiàn)有方法是基于非特異的臨床病征和癥狀；因此，所得診斷通常具有有限的臨床效用。因為本發(fā)明的方法準確地檢測膿毒的各種階段，所以這些方法可用于鑒定可能適宜地參加治療研究的那些個體。因為可以從單個時間點所得的生物樣品中生物標記表達的“快照”預測或診斷膿毒，所以該治療研究可以在嚴重的臨床癥狀出現(xiàn)之前開始。因為測定生物樣品的生物標記譜，所以不必鑒定具體生物標記。然而，本發(fā)明提供了鑒定膿毒或者膿毒發(fā)展的特定階段的特征性圖譜的特定生物標記的方法。這些生物標記自身將是預測或者診斷膿毒的有用工具。
為此，本發(fā)明提供了多種核酸生物標記或者核酸生物標記的組合。從來自個體的生物樣品(例如，血樣)鑒定核酸生物標記。不被理論所束縛，編碼與宿主對SIRS或者膿毒的多個階段(包括使用常規(guī)技術對膿毒的臨床懷疑之前膿毒的發(fā)作)有關的蛋白的某些mRNA的表達水平可以預測或者診斷膿毒的階段或者診斷SIRS。該生物樣品中的細胞表達編碼這些蛋白的mRNA，并且這些mRNA的表達水平的檢測可用于確定該個體中膿毒的狀態(tài)或者診斷SIRS。本發(fā)明的核酸生物標記包括，但不限于，mRNA、從這些mRNA制備的核酸，和能夠與mRNA形成雙鏈體的核酸。本發(fā)明的核酸生物標記被稱為“宿主應答生物標記”。
因此，本發(fā)明還提供了試劑盒，其含有選自表2-10任一個中所列核酸的至少1、2、3、4、5、10或更多種宿主應答生物標記。表2-10中所列核酸通過它們所編碼的蛋白質識別。用于本發(fā)明目的的宿主應答生物標記包括，但不限于，編碼所鑒定的蛋白的mRNA、從該mRNA制備的cDNA、和能夠與編碼所鑒定的蛋白的mRNA形成特異復合物(例如，雜交的雙鏈體)的DNA或者其他分子。在一個實施方案中，該試劑盒含有DNA探針(例如，cDNA或者寡核苷酸)，該探針能夠與相應于表2-10中所列的生物標記的mRNA形成雙鏈體。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了一種方法，該方法包括使用DNA探針構建核酸陣列，通過檢測個體的生物樣品中存在的mRNA生物標記，該核酸陣列能夠確定個體中膿毒的狀態(tài)或者診斷SIRS。
本發(fā)明還提供了宿主應答生物標記譜，該圖含有至少2、3、4、5、10或20或更多種特征，這些特征是核酸的可檢測的特征并且有助于參比群體中個體的分類，該分類的準確度為至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％、至少約95％、或約100％。參比群體選自正常參比群體、SIRS陽性參比群體、受感染的/SIRS-陰性參比群體、膿毒陽性參比群體、處于膿毒發(fā)展的特定階段的參比群體、通過常規(guī)技術在約0-36小時后證實患有膿毒的SIRS-陽性參比群體、通過常規(guī)技術在約36-60小時后證實患有膿毒的SIRS-陽性參比群體、和通過常規(guī)技術在約60-84小時后證實患有膿毒的SIRS-陽性參比群體。
本發(fā)明還提供了分離宿主應答生物標記的方法，其中該生物標記能夠被用于確定個體中膿毒狀態(tài)或者診斷SIRS的方法。該方法包括從來自個體的群體的生物樣品得到宿主應答生物標記的參比生物標記譜并鑒定參比生物標記譜中能夠確定個體中膿毒狀態(tài)或者診斷SIRS的特征。然后鑒定并分離相應于該特征的宿主應答生物標記。
附圖簡述

圖1圖解了SIRS向膿毒的發(fā)展。膿毒的病癥由至少三個階段組成，膿毒患者從嚴重膿毒發(fā)展到膿毒性休克到多種器官功能異常。
圖2顯示了膿毒和SIRS之間的關系。維恩(Venn)圖中所示的多個集合相應于具有所示的病癥的個體的群體。
優(yōu)選實施方案詳述本發(fā)明允許利用在一個時間點(“快照”)或者在疾病發(fā)展的過程中從個體得到的一種或多種生物樣品快速、靈敏和準確地診斷或預測膿毒。有利地，可以在臨床癥狀發(fā)作前診斷或者預測膿毒，從而允許更有效的治療干預。
“系統(tǒng)性炎性應答綜合癥”或者“ISRS”指對多種嚴重的臨床損傷的臨床應答，其表現(xiàn)為24小時內(nèi)下面的狀況的兩種或多種*體溫大于38℃(100.4°F)或者小于36℃(96.8°F)；*心率(HR)大于90次/分鐘；*呼吸率(RR)大于20次呼吸/分鐘，或者PCO2小于32mm Hg，或者需要機械通氣；和*白細胞數(shù)(WBC)大于12.0×109/L或者小于4.0×109/L或者大于10％未成熟形式(帶)。
SIRS的這些癥狀代表SIRS的一致定義，該定義在將來可以被修改或者由改良的定義代替。本定義用于闡明當前的臨床實踐并且不代表本發(fā)明的關鍵方面。
患有SIRS的患者具有臨床表現(xiàn)，其被歸為如上面定義的SIRS，但是在臨床上不被認為是膿毒的。處于發(fā)生膿毒的危險中的個體包括ICU中的患者和遭受生理創(chuàng)傷，如燒傷或者其他損傷的患者?！澳摱尽敝概c證實的感染過程相關的SIRS-陽性病癥。膿毒的臨床懷疑由感染過程導致的SIRS患者的SIRS-陽性病癥的懷疑引起。本文中，“膿毒”包括膿毒的所有階段，包括，但不限于，膿毒的發(fā)作、嚴重膿毒和與膿毒的末期相關的MOD。
“膿毒的發(fā)作”指膿毒的早期，即，臨床表現(xiàn)足夠支持膿毒的臨床懷疑之前的階段。因為本發(fā)明的方法用于檢測使用常規(guī)技術懷疑膿毒的時間之前的膿毒，所以只能在膿毒的表現(xiàn)在臨床上更明顯的時候回顧地證實早期膿毒時該患者的疾病狀態(tài)。患者形成膿毒的確切機理不是本發(fā)明的關鍵方面。本發(fā)明的方法可獨立于感染過程的起源檢測生物標記譜中的變化。不管膿毒怎樣產(chǎn)生，本發(fā)明的方法都允許確定患有或者懷疑患有通過前面所用的標準分類的膿毒或者SIR的患者的狀態(tài)。
“嚴重膿毒”指與器官功能異常、灌注不足異常、或者膿毒誘導的低血壓有關的膿毒。灌注不足異常包括，但不限于，乳酸中毒、少尿或者精神狀態(tài)的急劇改變?！澳摱拘孕菘恕敝改摱菊T導的低血壓，其對于足夠的靜脈內(nèi)液體刺激不響應并且表現(xiàn)為外周低血壓?！稗D變患者”指SIRS陽性患者，該患者在被監(jiān)視期間，通常在ICU停留期間發(fā)展成膿毒的臨床懷疑。“非轉變患者”指SIRS陽性患者，該患者在被監(jiān)視期間，通常在ICU停留期間不發(fā)展成膿毒的臨床懷疑。
“生物標記”是存在于生物樣品并且可以從該生物樣品分離或者在該生物樣品中檢測的幾乎任一種生物化合物，如蛋白質或者其片段、肽、多肽、蛋白聚糖、糖蛋白、脂蛋白、糖、脂質、核酸、有機或無機化學品、天然聚合物，和小分子。此外，生物標記可以是完整分子，或者其可以是該完整分子的部分，該部分可以具有部分功能或者可以被例如，抗體或者其他特異結合蛋白質識別。如果生物標記的可檢測方面與該患者的給定狀態(tài)，如膿毒的特定階段有關，那么認為該生物標記物是可提供信息的。這種可檢測的方面可以包括，例如，來自該個體的生物樣品中該生物標記的存在、缺乏，或者濃度，和/或該生物標記作為生物標記譜的一部分存在。生物標記的這種可檢測的方面在本文中被定義為“特征”。特征還可以是生物標記的兩個或多個可檢測方面的比例，這些生物標記例如，可以具有或者不具有公知的同一性。“生物標記譜”包括至少兩種這些特征，其中這些特征可以相應于相同的或者不同類別的生物標記，如核酸和糖。生物標記譜還可以含有至少3、4、5、10、20、30或者更多種特征。在一個實施方案中，生物標記譜含有數(shù)百，或者甚至數(shù)千種特征。在另一實施方案中，生物標記譜含有至少一種內(nèi)標的至少一個可檢測的方面。
“表型變化”是與患者的給定狀態(tài)有關的參數(shù)的可檢測的變化。例如，表型變化可以包括體液中生物標記的增加或者減少，其中該變化與膿毒或者膿毒的發(fā)作有關。表型變化可以還包括該患者的給定狀態(tài)的可檢測方面的變化，該變化不是生物標記的可檢測方面的變化。例如，表型中的變化可以包括體溫、呼吸率、脈搏、血壓、或者其他生理參數(shù)中的可檢測的變化。這些變化可通過臨床觀察和使用技術人員熟知的常規(guī)技術檢測來確定。本文中，“常規(guī)技術“是基于表型變化對個體分類的技術，這些技術不得到根據(jù)本發(fā)明的生物標記譜。
“決策規(guī)則(decision rule)”是用于將患者分類的方法。該規(guī)則可以采取本領域中公知的一種或多種形式，如Hastie等人，“TheElements of Statistical Learning，”Springer-Verlag(Springer，New York(2001))中所例證的形式，該文獻被完整并入本文作為參考。對樣品內(nèi)分子的復雜混合物的生物標記分析產(chǎn)生了數(shù)據(jù)集中的特征?？梢杂脹Q策規(guī)則作用于特征的數(shù)據(jù)集以預測膿毒的發(fā)作、確定膿毒的發(fā)展、診斷膿毒，或者診斷SIRS。
決策規(guī)則的應用不需要完美分類。在一個實施方案中，分類可以具有至少約90％或者甚至更高的確定性。在其他實施方案中，該確定性為至少約80％、至少約70％、或至少約60％。，確定性的有用的程度可以根據(jù)本發(fā)明的具體方法而變?！按_定性”被定義為被準確分類的個體的總數(shù)與被分類的個體總數(shù)的商。本文中，“確定性”指“準確度”。分類的特征還在于其“靈敏性”。分類的“靈敏性”涉及當前被鑒定患有膿毒的膿毒患者的百分數(shù)?！办`敏性”在本領域中被定義為真陽性數(shù)與真陽性和假陰性之和的商。相比，該方法的“特異性”被定義為被正確鑒定為不患有膿毒的患者的百分數(shù)。即，“特異性”涉及真陰性與真陰性和假陽性之和的商。在一個實施方案中，靈敏性和/或特異性為至少約90％、至少約80％、至少約70％或至少約60％。可以用于以足夠的確定性對個體分類的特征的數(shù)目通常為約4個。然而，根據(jù)所尋找的確定性的程度，特征數(shù)可以更多或更少，但是在所有情況中，特征數(shù)為至少1個。在一個實施方案中，用于分類個體的特征數(shù)被優(yōu)化而允許以高確定性對個體分類。
患者中膿毒或者SIRS的“狀態(tài)確定”包括對患者的生物標記譜分類以(1)檢測該患者中膿毒或者SIRS的存在，(2)預測該患者中膿毒或者SIRS的發(fā)作，或(3)檢測患者中膿毒的發(fā)展?！霸\斷”膿毒或者SIRS指鑒定或者檢測患者中的膿毒或者SIRS。因為本發(fā)明能夠在明顯可觀察到的臨床表現(xiàn)之前更靈敏地檢測膿毒，所以膿毒的鑒定或者檢測包括檢測如上定義的膿毒的發(fā)作。即，“預測膿毒的發(fā)作”指將該患者的生物標記譜歸類為相應于來自一些個體的生物標記譜，這些個體正從SIRS的特定階段發(fā)展到膿毒或者從被感染狀態(tài)到膿毒(即，從感染到具有相伴的SIRS的感染)。膿毒或者SIRS的“發(fā)展檢測”或者“發(fā)展確定”指對已經(jīng)被診斷患有膿毒或者SIRS的患者的生物標記譜分類。例如，將已經(jīng)被診斷為患有膿毒的患者的生物標記分類可以包括檢測或者確定該患者從膿毒到嚴重膿毒或者到具有MOD的膿毒的發(fā)展。
根據(jù)本發(fā)明，通過從個體得到的樣品得到生物標記譜可以診斷或者預測膿毒。本文中，“得到”指“擁有”。本發(fā)明尤其可用于預測和診斷個體中的膿毒，其中該個體患有感染，或者甚至膿毒，但是該患者還沒有被診斷為患有膿毒、懷疑患有膿毒，或者處于發(fā)生膿毒的危險中。本發(fā)明以相同的方式可用于檢測和診斷個體中SIRS。即，本發(fā)明可以用于證實SIRS的臨床懷疑。本發(fā)明還可用于檢測膿毒過程的多個階段，諸如感染、菌血癥、膿毒、嚴重膿毒、膿毒性休克，等等。
將從個體得到的生物標記譜，即，受試生物標記譜與參比生物標記譜相比較。該生物標記譜可以從一個個體或者兩個或多個個體的群體產(chǎn)生。該群體例如，可以含有3、4、5、10、15、20、30、40、50或更多個體。此外，如果受試和參比生物標記譜從在不同時間點采集的生物樣品產(chǎn)生并且相互比較，那么在本發(fā)明方法中被比較的參比生物標記譜和個體的(受試)生物標記譜可以從相同個體產(chǎn)生。例如，可以在研究期開始時從個體得到樣品。然后從該樣品得到的參比生物標記譜可以與從該同一個體的隨后樣品產(chǎn)生的生物標記譜相比較。這種比較可用于，例如，通過隨時間重復分類確定該個體的膿毒狀態(tài)。
參比群體可以選自沒有SIRS(“SIRS-陰性”)的個體、沒有SIRS但是經(jīng)歷感染過程的個體、患有SIRS但是不存在膿毒(“SIRS-陽性”)的個體、患有膿毒的發(fā)作的個體、膿毒陽性并且處于膿毒發(fā)展的階段之一的個體，或者具有增加發(fā)生膿毒的危險性的生理創(chuàng)傷的個體。此外，參比群體可以是SIRS-陽性的并隨后用常規(guī)技術診斷膿毒。例如，用于產(chǎn)生參比圖的SIRS-陽性患者的群體可以在為了產(chǎn)生參比生物標記譜而從這些患者采集生物樣品之后約24、48、72、96或更多小時后被診斷為膿毒。在一個實施方案中，使用常規(guī)技術在生物樣品采集后約0-36小時、約36-60小時、約60-84小時、或約84-108小時后將SIRS-陽性個體的群體診斷為膿毒。如果該生物標記譜可以預示膿毒或者其發(fā)展階段之一，那么臨床醫(yī)生就可以在膿毒的臨床癥狀表現(xiàn)之前開始治療。治療通常包括檢查該患者以確定感染源。一旦定位了感染源，臨床醫(yī)生通常將從感染部位得到培養(yǎng)物，這優(yōu)選在開始相關的經(jīng)驗性抗微生物治療和可能額外的輔助性治療措施，如排出膿腫或者除去受感染的導管之前。膿毒的療法在Healy(如前)中綜述。
本發(fā)明的方法包括將個體的生物標記譜與參比生物標記譜比較。本文中，“比較”包括辨別個體和參比生物標記譜中至少一處不同的方法。從而，比較可以包括通過視覺檢查層析譜，并且比較可以包括分配給譜的特征的值的算術上的和統(tǒng)計學的比較。這種統(tǒng)計學比較包括，但不限于，應用決策規(guī)則。如果生物標記譜含有至少一種內(nèi)標，那么用以辨別生物標記譜中的差異的比較還可以包括這些內(nèi)標的特征，從而生物標記的特征與內(nèi)標的特征相關。該比較可以預測獲得膿毒或者SIRS的機會；或者該比較可以證實存在或者不存在膿毒或者SIRS；或者該比較可以指出個體所處的膿毒的階段。
因此，本發(fā)明不需要在監(jiān)視期內(nèi)實施時間-密集的測定，也不需要鑒定每種生物標記。盡管本發(fā)明不需要監(jiān)視期來對個體分類，但是應該理解對該個體的重復分類，即重復快照，可以隨時間進行直到該個體不再處于危險中。備選地，從該個體得到的生物標記譜可以與在不同時間點從該相同個體得到的一個或多個生物標記譜相比較。技術人員將明白在重復分類過程中做出的每次比較都能夠將該個體歸類為屬于或者不屬于參比群體。
通過特征性生物標記譜可以區(qū)分具有相應于從無膿毒到MOD的膿毒發(fā)展的多個階段的多種生理狀況的個體。本文中，“個體”是動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人或者非人靈長類。術語“個體”、“受試者”和“患者”在本文中可互換使用。個體可以是正常的、被懷疑患有SIRS或者膿毒、處于患SIRS或者膿毒的危險中，或者被證實患有SIRS或者膿毒。盡管有許多公知的生物標記與膿毒的發(fā)展有關，但是并不是所有這些標記都在最初的臨床前階段出現(xiàn)。實際上，僅能通過從最終表現(xiàn)膿毒的臨床癥狀的個體所得樣品的回顧分析確定早期膿毒的特征性生物標記的子集。不被理論所束縛，即使導致膿毒的最初病理感染也可以引起生理變化，這些生理變化在生物標記表達的特定變化中體現(xiàn)。例如，一旦確定了膿毒階段的特征性生物標記譜，就可以將從個體得到的生物樣品的生物標記譜與該參比譜相比較以確定該受試者是否也處于膿毒的那一特定階段。
群體從膿毒的一個階段發(fā)展到另一階段，或者從常態(tài)(即，特征是不患有膿毒或者SIRS的狀態(tài))到膿毒或者SIRS和反之亦然的特征是生物標記譜中的改變，因為某些生物標記譜以更高的水平表達并且其他生物標記的表達被下調。生物標記譜中的這些變化可以反映參比群體對例如感染和/或炎癥的生理應答中的漸進性建立。技術人員將明白隨著生理應答的消退，參比群體的生物標記譜也將變化。如上所述，本發(fā)明的一個優(yōu)點是能夠使用來自單個生物樣品的生物標記譜將個體歸類為特定群體中的成員。然而，技術人員將明白通過對該個體的隨后分類可以有助于確定特定生理應答正在被建立或者正在消退。為此，本發(fā)明提供了多種生物標記，在對膿毒或者SIRS的生理應答被建立或者消退時這些生物標記的表達水平有的增加，有的降低。例如，研究人員可以選擇個體的生物標記譜的一種特征，公知隨著對膿毒的生理應答的建立該特征的強度改變。來自該個體的隨后的生物樣品的譜中相同特征的比較可以確定該個體是否正在向更嚴重的膿毒發(fā)展或者正在向常態(tài)發(fā)展。
生物標記的分子身份不是本發(fā)明必需的。實際上，本發(fā)明不應局限于以前已經(jīng)鑒定的生物標記(見美國專利申請序號10/400,275，2003年3月26日提交)。因此，預期將鑒定新的生物標記，這些生物標記是給定個體群體，特別膿毒早期之一的群體所特有的。在本發(fā)明的一個實施方案中，鑒定并分離生物標記。然后該生物標記被用于產(chǎn)生特異結合的抗體，該抗體可以促進多種診斷測定中的生物標記檢測。為此，任一免疫測定可以使用能夠結合生物標記分子的任何抗體、抗體片段或者衍生物(例如，F(xiàn)ab、Fv、或scFv片段)。這些免疫測定是本領域中熟知的。如果該生物標記是蛋白，那么可以用成熟的技術將其測序并且克隆其編碼基因。
本發(fā)明的方法可以用于篩選，例如，ICU所接納的患者。當接納時立即采集生物樣品，例如，血。血中蛋白質和其他分子的復雜混合物被分解成生物標記譜。這可以通過使用任一技術或技術的組合實現(xiàn)，該技術可以基于某種物理或者化學性質可再現(xiàn)地區(qū)分這些分子。在一個實施方案中，分子被固定在基質上，然后通過激光解吸/電離飛行時間質譜分離和區(qū)分這些分子。通過特征性解吸模式產(chǎn)生波譜，該解析模式反映了每個分子或者其片段的質量/電荷比。在另一實施方案中，生物標記選自從細胞提取物得到的多種mRNA種類，并通過將該個體的mRNA種類與cDNAs陣列雜交得到生物標記譜。cDNA陣列的診斷用途是本領域中熟知的(見，例如，Zou，等人，Oncogene214855-4862(2002))。在再一個實施方案中，聯(lián)合使用蛋白質和核酸分離方法可以得到圖譜。
本發(fā)明還提供了試劑盒，該試劑盒可用于確定個體中膿毒的狀態(tài)或者診斷SIRS。本發(fā)明的試劑盒含有至少一種生物標記。用于本發(fā)明的特定生物標記在本文中給出。該試劑盒的生物標記可用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的生物標記譜。通常，試劑盒中的生物標記將至少以一定的特異性結合生物樣品中所含的生物標記分子，其中該生物標記譜從該生物樣品產(chǎn)生。試劑盒中化合物類別的實例包括，但不限于，蛋白質、其片段、肽、多肽、蛋白聚糖、糖蛋白、脂蛋白、糖類、脂質、核酸、有機和無機化學品，和天然和合成的聚合物。該生物標記可以是陣列的部分，或者該生物標記可以被分開和/或單獨地包裝。該試劑盒可以還含有至少一種內(nèi)標，該內(nèi)標用于產(chǎn)生本發(fā)明的生物標記譜。同樣，內(nèi)標可以是上述任一種化合物類別。本發(fā)明的試劑盒可以還含有試劑，該試劑可用于可檢測地標記生物樣品中所含的生物標記，其中生物標記譜從該生物樣品產(chǎn)生。為此，試劑盒可以含有一組抗體或者它們的功能片段，這些抗體或者它們的功能片段結合下面列出生物標記的表的任一個表中所給出的生物標記的至少2、3、4、5、10、20或更多種?？贵w自身可以被可檢測地標記。試劑盒可以還含有特異生物標記結合組分，如適合體(aptamer)。如果生物標記含有核酸，那么試劑盒可以提供寡核苷酸探針，該探針能夠與該生物標記或者生物標記的互補鏈形成雙鏈體。寡核苷酸探針可被可檢測地標記。
當生物標記被用于產(chǎn)生抗體時，本發(fā)明的試劑盒可以還包括藥物賦形劑、稀釋劑和/或佐劑。藥物佐劑的實例包括，但不限于，防腐劑、增濕劑、乳化劑，和分散劑。通過包括多種抗細菌和抗真菌劑，例如，對羥基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等等可以確保防止微生物的作用?？赡苓€希望包括等滲劑，如糖、氯化鈉，等等。通過包括延緩吸收的試劑如單硬脂酸鋁和明膠，可以延長可注射的藥物形式的吸收。
產(chǎn)生生物標記譜根據(jù)一個實施方案，本發(fā)明的方法包括從從個體采集的生物樣品得到生物標記譜。生物樣品可以是血液、血漿、血清、唾液、痰、尿、腦脊液、細胞、細胞提取物、組織樣品、組織活檢、糞便樣品，等等。例如，從個體的群體可以得到參比生物標記譜，這些個體選自SIRS-陰性個體、SIRS-陽性個體、患有膿毒發(fā)作的個體和已經(jīng)患有膿毒的個體。可以在膿毒發(fā)展的任一階段，如感染、菌血癥、嚴重膿毒、膿毒性休克或者MOD，得到已經(jīng)患有膿毒的個體的參比生物標記譜。
在一個實施方案中，可以用分離方法產(chǎn)生生物標記譜，從而僅分析樣品中生物標記的子集。例如，在樣品中分析的生物標記可以由來自細胞提取物的mRNA種類組成，該細胞提取物已經(jīng)被分級分離而僅獲得樣品中的核酸生物標記，或者生物標記可以由樣品中蛋白質的總補體的一部分組成，所述蛋白質已經(jīng)通過層析技術被分級分離。備選地，可以不用分離方法而產(chǎn)生生物標記譜。例如，可以用標記化合物詢問(interrogate)生物樣品，該標記化合物與樣品的中的生物標記形成特異復合物，其中該特異復合物中標記的強度是該生物標記的可檢測的特征。適于形成這種特異復合物的化合物是被標記的抗體。在一個實施方案中，使用具有可擴增的核酸作為標記的抗體檢測生物標記。在再一個實施方案中，當兩種抗體(每種綴合到核酸標記的一條鏈)與生物標記相互作用時，該核酸標記變得可被擴增，從而，兩條核酸鏈形成可擴增的核酸。
在另一個實施方案中，生物標記譜可來自測定，如核酸的測定，其中生物標記是核酸或者它們的互補物。例如，生物標記可以是核糖核酸。使用選自核磁共振、核酸陣列、點印跡、狹線印跡、反轉錄擴增和RNA印跡分析的方法可以得到生物標記譜。在另一個實施方案中，通過對該生物標記特異的反應性抗體，或者該抗體的功能片段通過免疫學檢測該生物標記譜?？贵w的功能片段是抗體的片段，其至少保留結合完整抗體所結合的抗原的一定能力。該片段包括，但不限于，scFv片段、Fab片段和F(ab)2片段，這些片段可以通過重組方法或者酶產(chǎn)生。在另一實施方案中，不同于抗體的特異結合分子，如適合體，可用于結合該生物標記。在再一個實施方案中，生物標記譜可以含有感染物或者其組分的可檢測方面。在再一個實施方案中，生物標記譜可以含有小分子的可檢測方面，這些小分子可以包括蛋白質或者核酸的片段，或者可以包括代謝物。
使用一種或多種分離方法可以產(chǎn)生生物標記譜。例如，適宜的分離方法可以包括質譜方法，如電噴霧電離質譜(ESI-MS)、ESI-MS/MS、ESI-MS/(MS)(n是大于0的整數(shù))、基質輔助的激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)、表面增強的激光解吸/電離飛行時間質譜(SELDI-TOF-MS)、硅上解吸/電離(DIOS)、二級離子質譜(SIMS)、四極飛行時間(Q-TOF)、大氣壓化學電離質譜(APCI-MS)n、APCI-MS/MS、APCI-(MS)、大氣壓光電離質譜(APPI-MS)、APPI-MS/MS，和APPI-(MS)n。其他質譜方法可以包括四極、傅立葉變換質譜(FTMS)和離子阱。其他適宜的分離方法可包括化學萃取分配、柱層析、離子交換層析、疏水(反相)液體層析、等電聚焦、一維聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-PAGE)或者其他層析，如薄層、氣相或液相層析，或者它們的組合。在一個實施方案中，生物樣品可以在應用分離方法前被分級分離。
通過不需要生物標記自身的物理分離的方法也可以產(chǎn)生生物標記譜。例如，可以用核磁共振(NMR)波譜學從分子的復雜混合物分辨生物標記譜。用NMR對腫瘤分類的類似用途在例如Hagberg，NMRBiomed.11148-56(1998)中公開。額外的方法包括核酸擴增技術，這些技術可用于產(chǎn)生生物標記譜而不用物理分離各個生物標記。(見例如，Stordeur等人，J.Immunol.，Methods 25955-64(202)和Tan等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 9911387-11392(2002))。
在一個實施方案中，使用激光解吸/電離飛行時間質譜產(chǎn)生生物標記譜，其中生物標記是蛋白質或者蛋白質片段，它們已經(jīng)被入射激光輻射電離或者從固定支持物蒸發(fā)。通過每種蛋白的特征性飛行時間產(chǎn)生圖譜，該特征性飛行時間取決于其質荷比(“m/z”)。多種激光解吸/電離技術也是本領域中公知的。(見，例如，Guttman等人，Anal.Chem.731252-62(2001)和Wei等人，Nature 399243-46(1999))。
激光解吸/電離飛行時間質譜允許在相對短的期限內(nèi)產(chǎn)生大量信息。生物樣品被應用于多種支持體之一，該支持體結合樣品中的所有生物標記，或者這些生物標記的子集。細胞裂解物或者樣品以少至0.5μL的體積被直接應用于這些表面，這些細胞裂解物或者樣品被或者不被預先純化或者分級分離。裂解物或樣品在應用于支持體表面上時可以被濃縮或稀釋。然后用激光解吸/電離在少至3個小時內(nèi)產(chǎn)生樣品的質譜。
在另一實施方案中，測定了來自該個體的細胞提取物的總mRNA，并且將從該生物樣品所得多種mRNA種類用作生物標記。例如，使用本領域中公知的標準方法，通過將這些mRNA與探針陣列雜交可以得到圖譜，該探針陣列可以含有寡核苷酸或者cDNA。備選地，可以將mRNA實施凝膠電泳或者印跡方法，如點印跡、狹線印跡或者RNA印跡分析，所有這些方法都是本領域中公知的(見，例如，Sambrook等人，“Molecular Cloning，第三版”，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(2001))。通過逆轉錄，然后如Stordeur等人(如前)公開的擴增并檢測所得cDNA也可以得到mRNA圖。在另一實施方案中，使用組合方法，如核酸陣列與質譜的組合，可以得到該圖。
數(shù)據(jù)分析算法的使用在一個實施方案中，個體生物標記譜與參比生物標記譜的比較包括應用決策規(guī)則。該決策規(guī)則可以包括數(shù)據(jù)分析算法，如計算機模式識別算法。其他適宜的算法包括，但不限于，可以檢測特征值的分布中的差異的邏輯回歸或者非參數(shù)算法(例如，Wilcoxon有符號的秩檢驗)。決策規(guī)則可以基于1、2、3、4、5、10、20或更多種特征。在一個實施方案中，決策規(guī)則基于數(shù)百或者更多特征。應用決策規(guī)則也可以包括使用分類樹算法。例如，參比生物標記譜可以含有至少三種特征，其中這些特征是分類樹算法中的預測值。數(shù)據(jù)分析算法預測群體(或者類)中的成員，其準確度為至少約60％、至少約70％、至少約80％和至少約90％。
適宜的算法是本領域中公知的，一些算法在Hastie等(如前)中綜述。這些算法將來自生物材料，如血樣的復雜光譜分類以將個體區(qū)分為正常的或者具有特定病態(tài)的特征性生物標記表達水平。盡管這些算法可用于增加應用決策規(guī)則的速度和效率并避免研究人員偏倚，但是本領域技術人員將認識到不需要基于計算機的算法來實施本發(fā)明的方法。
不管用于產(chǎn)生生物標記譜的方法，都可以應用算法比較生物標記譜。例如，適宜的算法可應用于使用氣相色譜產(chǎn)生的生物標記譜，如Harper，“Pyrolysis and GC in Polymer Analysis”Dekker，New York(1985)中所討論的。此外，Wagner等人，Anal.Chem 741824-35(2002)公開了一種算法，該算法提高了基于通過靜態(tài)飛行時間二級離子質譜(TOF-SIMS)得到的光譜對個體分類的能力。此外，Bright等人，J.Microbiol.Methods 48127-38(2002)公開了通過分析MALDI-TOF-MS光譜以高確定性(79-89％正確分類率)區(qū)分細菌株系的方法。Dalluge，F(xiàn)resenius J.Anal.Chem.366701-11(2000)討論了使用MALDI-TOF-MS和液相色譜-電噴霧電離質譜(LC/ESI-MS)對復雜生物樣品中生物標記譜分類。
生物標記通過產(chǎn)生生物標記譜可以實施本發(fā)明的方法，這些生物標記譜可以診斷或者預測膿毒或者SIRS。因為圖譜產(chǎn)生足夠實施本發(fā)明，所以組成該圖譜的生物標記不必已知或者被隨后鑒定。
可用于根據(jù)本發(fā)明的方法確定個體中膿毒狀態(tài)或者診斷SIRS的內(nèi)源生物標記在本文中被統(tǒng)稱為“宿主應答生物標記”?？捎糜诋a(chǎn)生本發(fā)明的生物標記譜的生物標記可以包括公知提供關于應答感染中免疫系統(tǒng)的狀態(tài)的信息的那些生物標記；然而，這些生物標記不總是同等地提供信息。這些生物標記可以包括激素、自身抗體、可溶的和不可溶的受體、生長因子、轉錄因子、細胞表面標記和可溶的標記，這些生物標記來自宿主或者來自病原自身，如外殼蛋白、脂多糖(內(nèi)毒素)、脂磷壁酸，等等。其他生物標記包括，但不限于，細胞表面蛋白，如CD64蛋白；CD11b蛋白；HLA II類分子，包括HLA-DR蛋白和HLA-DQ蛋白；CD54蛋白；CD71蛋白；CD86蛋白；表面結合的腫瘤壞死因子受體(TNF-R)；模式識別受體如Toll樣受體；可溶的標記如白介素IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、和IL-18；腫瘤壞死因子α(TNF-α)；新喋呤；C-反應蛋白(CRP)；原降鈣素(PCT)；6-酮F1α；血栓烷B2；白三烯B4、C3、C4、C5、D4和E4；γ干擾素(IFNγ)；α/β干擾素(IFNα/β)；α淋巴毒素(LTα)；補體組分(C′)；血小板活化因子(PAF)；緩激肽、一氧化氮(NO)；粒細胞巨噬細胞-集落刺激因子(GM-CSF)；巨噬細胞抑制因子(MIF)；白介素-1受體拮抗劑(IL-1ra)；可溶性腫瘤壞死因子受體(sTNFr)；可溶性白介素受體sIL-lr和sIL-2r；轉化生長因子β(TGFβ)；前列腺素E2(PGE2)；粒細胞-集落刺激因子(G-CSF)；和其他炎癥介質。(在Oberholzer等人，Shock 1683-96(2001)和Vincent等人，“The Sepsis Text，”Carlet等人，編者，(Kluwer AcademicPublishers，2002)中綜述)。通常和在臨床上與菌血癥有關的生物標記也是用于本發(fā)明的生物標記的候選者，條件是這些生物標記在生物樣品中通常和經(jīng)常發(fā)生。生物標記可以包括低分子量化合物，它們可以是蛋白質或者核酸的片段，或者它們可以包括代謝物。低分子量化合物，如代謝物的存在或者濃度可以反映與膿毒和/或SIRS有關的表型變化。具體地，小分子量生物標記的濃度的變化與應答SIRS和/或膿毒過程中任何生理變化產(chǎn)生的細胞代謝的變化相關，這些生理變化為諸如低體溫或者高體溫、心率或者呼吸率增加、組織低氧、代謝性酸中毒或者MOD。生物標記還可以包括編碼蛋白質生物標記的RNA和DNA分子。
生物標記還可以包括與白細胞調節(jié)，如嗜中性粒細胞活化或者單核細胞失活有關的至少一種分子。CD64和CD11b的表達增加被認為是嗜中性粒細胞和單核細胞活化的信號。(Oberholzer等人，如前和Vincent等人，如前中綜述)?？捎糜诒景l(fā)明的那些生物標記包括與巨噬細胞裂解產(chǎn)物相關的生物標記，如細胞因子代謝變化的標記(見，Gognon等人，Cell 110119-31(2002)；Oberholzer，等人，如前；Vincent，等人，如前)。
生物標記可以還包括公知參與或者被發(fā)現(xiàn)參與炎癥過程的信號因子。信號因子可以啟動細胞內(nèi)事件級聯(lián)，包括受體結合、受體活化、細胞內(nèi)激酶的活化、轉錄因子的活化、基因轉錄和/或翻譯水平的變化，和代謝過程的變化，等。為了本發(fā)明的目的，這些分子活化的信號分子和過程被全體定義為“與膿毒途徑有關的生物分子”。相關的預測性生物標記可以包括與膿毒途徑有關的生物分子。
因此，盡管本發(fā)明的方法可以使用無偏的方法鑒定預測性生物標記，但是技術人員清楚與生理應答或者與多種信號途徑相關的生物標記的特定組可以是具體關注的主題。這對于如下情況尤其是如此來自生物樣品的生物標記與陣列(例如，抗體陣列或核酸陣列)接觸，其中該陣列可通過與生物標記的直接和特異相互作用用于檢測多種生物標記的量。在該情況中，陣列組分的選擇可基于如下提示，即具體途徑與個體中膿毒或者SIRS的狀態(tài)的確定有關。特定生物分子具有可以預測或者診斷膿毒或SIRS的特征的指示可以導致預期在生理上以一致方式被調節(jié)的其他生物分子同樣可以提供預測或者診斷特征。然而，技術人員將明白，由于生物系統(tǒng)的復雜性這種預期可能不被實現(xiàn)。例如，如果特定mRNA生物標記的量是預測性特征，如果另一生物標記的表達在翻譯后水平上被調節(jié)，那么該另一生物標記的mRNA表達中的一致變化可能不能被檢測。此外，生物標記的mRNA表達水平可以受到多種會聚途徑的影響，這些途徑可以與對膿毒的生理應答有關或者無關。
可以從任一生物樣品得到生物標記，作為實例但不限制，該生物樣品可以是血液、血漿、唾液、血清、尿、腦脊液、痰、糞便、細胞和細胞提取物，或者其他生物流體樣品、來自宿主或患者的組織樣品或者組織活檢樣品。從個體所得的確切的生物樣品可以不同，但是采樣優(yōu)選侵入性最小并且容易通過常規(guī)技術實施。
通過任一常規(guī)技術可以實施表型變化的檢測。通過臨床觀察和檢測可以實現(xiàn)體溫、呼吸率、脈搏、血壓、或其他生理參數(shù)的檢測。生物標記分子的檢測可以包括，例如，指出存在、濃度、表達水平、或者任何其他與生物標記分子相關的值的檢測。生物標記分子的檢測形式通常取決于用于從生物樣品形成這些生物標記譜的方法。例如，通過考馬斯藍染色或者通過銀染可以檢測通過2D-PAGE分開的生物標記，所述染色方法是本領域中成熟的。
分離有用的生物標記預期有用的生物標記將包括還沒有鑒定或者與相關生理狀態(tài)有關的生物標記。在本發(fā)明的一方面，有用的生物標記被鑒定為來自生物樣品的生物標記譜的組分。這種鑒定可以通過本領域中任一種熟知的方法實施，該方法包括免疫測定或者自動化微測序。
一旦鑒定了有用的生物標記，就可以通過許多熟知的分離方法之一分離該生物標記。因此，本發(fā)明提供了分離可以診斷或者預測膿毒的生物標記的方法，該方法包括從個體的群體得到參比生物標記譜，鑒定可以預測或者診斷膿毒或者膿毒發(fā)展階段之一的參比生物標記譜的一種特征，鑒定與該特征相應的生物標記，并分離該生物標記。一旦分離，例如，如果該生物標記是蛋白，那么該生物標記就可用于產(chǎn)生結合該標記的抗體，如果該生物標記是核酸，那么該生物標記可用于開發(fā)特異寡核苷酸探針。
技術人員將容易明白可以進一步表征有用的特征以確定該生物標記的分子結構。以這種方式表征生物分子的方法是本領域中熟知的并且包括高分辨率質譜、紅外光譜、紫外分光法和核磁共振。確定核酸生物標記的核苷酸序列、多肽生物標記的氨基酸序列，和糖生物標記的組成和序列的方法是本領域中熟知的。
本發(fā)明應用于SIRS患者在一個實施方案中，當前描述的方法被用于篩選尤其處于患膿毒的危險中的SIRS患者。從SIRS陽性患者采集生物樣品，并將該樣品中生物標記譜與來自最終發(fā)展成膿毒的SIRS-陽性患者的參比圖相比較。將該患者的生物標記譜歸類成相應于發(fā)展成膿毒的SIRS-陽性群體的參比圖可以診斷該SIRS-陽性患者將同樣發(fā)展成膿毒。然后可以啟動治療方案以阻止或者防止膿毒的發(fā)展。
在另一實施方案中，當前描述的方法被用于證實患者患有SIRS的臨床懷疑。在該情況中，將樣品中生物標記譜與患有SIRS或者不患有SIRS的個體的參比群體比較。將該患者的生物標記譜歸類為相應于一個群體或者另一群體可以用于診斷該個體患有SIRS或者不患有SIRS。
實施例下面的實施例是本發(fā)明所包括的實施方案的代表并且絕不限制本發(fā)明所包括的主題。
1.1接受和分析的生物樣品為患者志愿者的兩個群體建立參比生物標記譜。第一個群體(“SIRS組”)代表患有SIRS并且在“天1”進入本研究但是在它們的住院期間沒有發(fā)展成膿毒的患者。第二個群體(“膿毒組”)代表同樣患有SIRS并且在天1進入本研究但是在進入研究至少數(shù)天后通常發(fā)展成膿毒的患者。約每24小時從每個研究組采集血樣。膿毒組中膿毒的臨床懷疑在“時間0”發(fā)生?！皶r間-24小時”和“時間-48小時”分別代表膿毒組中膿毒發(fā)作的臨床懷疑前24小時和48小時采集的樣品。即，來自膿毒組的樣品包括在進入研究當天(天1)、膿毒的臨床懷疑前48小時(時間-48小時)、膿毒的臨床懷疑前24小時(時間-24小時)、和膿毒發(fā)作的臨床懷疑當天(時間0)采集的樣品。
1.2分析來自生物樣品的mRNA使用本領域中普通技術人員公知的方法對從患者分離的血樣進行提取以除去mRNA。適宜的RNA分離方法在例如，RNAMETHODOLOGIES，A LABORATORY GUIDE FOR ISOLATIONAND CHARACTERIZATION，第二版，R.E.Farrell，Jr.，編者，Academic Press(1998)55-104頁中發(fā)現(xiàn)?？梢匀鏡NA queousTM系統(tǒng)(無苯酚總RNA分離試劑盒，目錄號1912，版本9908；Austin，Texas)所描述的使用基于過濾的總RNA分離方法。用于RNA分離和隨后操作的步驟在被轉讓給Source Precision Medicine的WO 03/040404中進一步描述。
所選RNA種類一旦被分離，就可以使用信使特異引物或隨機引物擴增。從來自公開數(shù)據(jù)庫如Unigene(National Center for BiotechnologyInformation，National Library of Medicine，Bethesda，Maryland)的數(shù)據(jù)設計特異引物。使用本領域普通技術人員公知的原理，利用RT-PCR(見WO 03/040404，22頁，24-32行)，用所設計的引物特異擴增樣品中存在的特異RNA序列?？梢允褂煤銣鼗蛘邿嵫h(huán)儀，如ABI9600、9700、或7700循環(huán)儀(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，California.)擴增RNA序列。然后使用例如，如TaqManTM系統(tǒng)(PCRReagent Kit，Protocol，部分編號402823，修訂A(1996)，AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City，California)中描述的熒光-標記的檢測引物檢測所擴增的RNA。通過本領域中熟知的技術(見，例如，WO03/040404，23頁，5-13行)實施RNA檢測和定量。
從患者的血液分離RNA并純化該RNA后，用下面的方案擴增該RNA并將其與72-元基因表達陣列反應，該陣列具有表1中闡明的核酸探針。
材料1.Applied Biosystems TaqMan逆轉錄試劑盒(P/N 808-0234)。試劑盒組分10×TaqMan RT緩沖液，25mM氯化鎂，脫氧NTP混合物，隨機六聚體，RNA酶抑制劑，MultiScribe逆轉錄酶(50U/mL)，和無RNA酶/DNA酶的水(來自Ambion的DEPC處理的水(產(chǎn)品號9915G)或者等價物)。
方法2.從-80℃制冷機取出RNA樣品，室溫解凍并立即置于冰上。
3.對于每次RT反應制備下面的逆轉錄酶試劑混合物每次反應(mL)10×RT緩沖液10.025mM MgCl222.0dNTPs 20.0隨機六聚體 5.0RNA酶抑制劑 2.0逆轉錄酶2.5水 18.5總的80.0mL4.在1.5mL微量離心管中使每種RNA樣品達到總體積20mL并加入80mL RT反應混合物。通過上下吸液混合該溶液。
5.將該樣品在室溫孵育10分鐘。
6.然后將樣品在37℃孵育1小時。
7.最后將樣品在90℃孵育10分鐘。
8.將樣品在微量離心機中短時間離心。
9.如果將立即實施PCR，將樣品置于冰上。否則將樣品保存在-20℃?zhèn)溆谩?br> 10.使用18sRNA和β-肌動蛋白mRNA作為對照對所有RT樣品運行PCR質量對照。
如上面描述的使用引物探針和第一條鏈cDNA。根據(jù)下面的步驟實施檢測結合到72元基因表達陣列的擴增的RNAs材料1.每種目的基因的20×引物/探針混合物；18S內(nèi)源對照的20×引物/探針混合物；2X TaqMan Universal PCR Master混合物；從血樣提取的RNA轉錄的cDNA；Applied Biosystems 96-孔光學反應板；AppliedBiosystems Optical Caps，或者光學透明膜；和Applied Biosystem Prism7700序列檢測器。
方法2.制備每種引物/探針混合物的原液，該原液含有目的基因的引物/探針、18S內(nèi)源對照的引物/探針，和2×PCR Master混合物。下面的實施例闡明了對于一種基因使用一式四份樣品試驗兩種條件(2個板)的典型設置。
1×(每孔)2×Master混合物12.5020×18S引物/探針混合物 1.2520×目的基因引物/探針混合物1.25總的 15.00μL3.通過將95μL cDNA稀釋到2000μL水中制備cDNA靶標的原液。調節(jié)cDNA的量使得Ct值為10到18，通常12到13。
4.將15μL引物/探針混合物移液到Applied Biosystems 96-光學反應板的適宜的孔中。
5.將10μL cDNA儲存液移液到Applied Biosystems 96-光學反應板的每個孔中。
6.用Applied Biosystems Optical Caps，或者光學透明膜密封板。
7.用AB Prism 7700序列檢測器分析該板。
當使用TaqMan形式時，產(chǎn)生熒光的閾值水平所需的擴增循環(huán)數(shù)提供了對相應于樣品中每種基因的mRNA的量的半定量估計。當以這種方式實施時，檢測的平均變異系數(shù)(SD/平均值×100)通常小于5％，并且可以小于2％。在例如Hirayama等人，Blood 9246-52(1998)中描述了定量實時PCR擴增的方法。在例如WO 03/040404的20-23頁中描述了定量實時擴增的額外的方面，并且這些方法的修改方案是本領域中熟知的。
1.3數(shù)據(jù)分析和結果對于每個樣品，檢測了結合到表達陣列上的72種不同的cDNA探針的mRNA的濃度。在該實例中，每種mRNA是一種生物標記，并且樣品中每種mRNA的濃度是該標記的一種特征。通過這些生物標記與陣列的多種cDNA探針形成特異雙鏈體的能力確定生物標記的濃度。該陣列的cDNA探針相應于編碼蛋白的基因，所述蛋白包括如表1中所示的多種細胞因子、趨化因子或者生長因子、細胞標記、蛋白酶或蛋白酶抑制劑、受體、轉錄調節(jié)劑，和酶。用星號指出的陣列上存在的探針在WO 03/040404的46-52頁描述。
表1
1.3.1交叉驗證可以用多種方法鑒定特征，這些特征可提供將個體分成SIRS或者膿毒組的決策規(guī)則的信息，這些方法在下文描述。當決策規(guī)則是基于來自相對少的生物標記譜的大量特征時，選擇偏倚可以影響為決策規(guī)則提供信息的特征的鑒定。(見Ambroise等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 996562-66(2002))。當數(shù)據(jù)被用于選擇特征，并且對所選的特征實施有條件的估計性能而不考慮選擇過程中的變異性時，將發(fā)生選擇偏倚。結果是對分類準確度的過高估計。如果不對選擇偏移調整，那么分類準確度可以達到100％，甚至決策規(guī)則是基于隨機輸入?yún)?shù)時也是如此(Id.)?？梢栽谛阅芄烙嬤^程中包括特征選擇來避免選擇偏倚，而不管該性能估計過程是10倍交叉驗證或者一種自舉方法(見，例如，Hastie等人，如前，7.10-7.11，被并入本文作為參考)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，通過10倍交叉驗證檢測模型性能。通過將數(shù)據(jù)隨機分配到10個排他性組進行10倍交叉驗證。然后依次將每組排除，并用模型擬合剩下的9組。將所擬合的模型應用于被排除的組，產(chǎn)生所預測的類別概率。通過簡單地產(chǎn)生預測類別可以將預測的類別概率與實際的類別成員資格比較。例如，如果膿毒的概率為，例如，大于0.5，那么該預測的類別是膿毒。
偏差(Deviance)是比較概率與實際結果的一種量度。本文中，“偏差”被定義為 其中P為特定類別的類別概率。當對于實際的類別類別概率高時，偏差減小。兩種模型可以對給定數(shù)據(jù)做出相同預測，然而優(yōu)選的模型將具有更小的預測偏差。對于10倍交叉驗證中的10次迭代的每一次迭代，對于該迭代期間模型擬合之外的病例計算預測偏差。結果是10個無偏偏差。通常，將這10個偏差相加產(chǎn)生對總數(shù)據(jù)集的模型性能(即，準確度)的概括。因為實際上10種不同的模型適合時，交叉驗證不能證明特定模型的性能。相反，通過通常的建模方法產(chǎn)生10種模型，并且交叉驗證證明了該方法的性能。從該方法得到的第11種模型將具有頭10個的預測性能。使用10倍交叉驗證通常導致模型的性能小于100％，但是當決策規(guī)則應用于訓練組之外的樣品得到的生物標記時，預期10倍交叉驗證后所得性能更準確地反映該決策規(guī)則的生物學上有意義的預測準確度。
分類樹分析分析該數(shù)據(jù)的一種方法是使用分類樹算法，該算法研究大數(shù)據(jù)集中的模式和關系。“分類樹”是使用一系列問題將特定患者分類到特定類別(例如，膿毒或者SIRS)的遞歸劃分，這些問題被設計使得將該患者準確置于一個類別中。每個問題詢問患者的條件是否滿足給定預測值，每個問題被用于使用者沿著分類樹下降直到可以確定該患者進入的類別。本文中，“預測值”是一系列特征的值的范圍。在該實例中，特征是核酸生物標記的濃度。核酸生物標記可選自表2-10中任一個所列的那些生物標記，但是技術人員將明白其他核酸生物標記也可以用于本發(fā)明?！皸l件”是在個體的生物標記譜中檢測特征的單一的、特定值。在該實例中，“類別名”是膿毒和SIRS。從而，分類樹使用者將首先提問在該個體的生物標記譜中檢測的第一種核酸生物標記濃度是否在第一個特征的預測范圍的給定范圍內(nèi)。第一個問題的回答將在確定該個體為SIRS或者膿毒中是決定性的。另一方面，對第一個問題的回答還可以指導使用者詢問在該個體的生物標記譜中檢測的第二種核酸生物標記濃度是否在第二個特征的預測范圍的給定范圍內(nèi)。再次，對該第二個問題的回答可以決定或者指導使用者進一步沿著分類樹向下直到患者的分類被最終確定。
1.3.3多重累加回歸樹使用一種自動化的靈活的建模技術將特征的集合歸類為屬于兩個群體之一，該技術使用多重累加回歸樹(MART)。MART模型使用最初偏移量，該偏移量指定應用于所有預測的常數(shù)，然后指定一系列回歸樹。該模型的擬合由每種樹中決定點的數(shù)目指定、用于擬合的樹的數(shù)目、和指定特定樹怎樣根本地影響MART模型的“粒度常數(shù)”指定。對于每次迭代，回歸樹被擬合以估計擬合標準的最陡峭的下降的方向。在該方向采取具有該粒度常數(shù)指定的長度的步驟。這樣MART模型由最初的偏移量加上回歸樹提供的步驟組成。再次計算觀察值和預測值之間的差異，并繼續(xù)進行該循環(huán)，導致預測的不斷完善。該過程持續(xù)預定的循環(huán)數(shù)或者直到引發(fā)停止規(guī)則。
每棵樹中分枝的數(shù)目是尤其有意義的擬合參數(shù)。如果每個樹僅有一個分枝，那么該模型僅考慮一個特征并且不能組合兩個預測值。如果每棵樹有兩個分枝，那么該模型可以容納特征之間的二路相互作用。使用三棵樹，該模型可以容納三路相互作用，等等。
使用特征和公知的類別狀態(tài)(例如，膿毒或SIRS)為數(shù)據(jù)集確定預測類別狀態(tài)中特征集的值。MART提供了個體特征對分類決策規(guī)則的貢獻或者重要性的量度。具體地，可以檢測對給定樹分枝單個特征的選擇時該單個特征對該決策規(guī)則的貢獻程度以通過這些特征對決定最終的決策規(guī)則的重要性對這些特征排序。對同一數(shù)據(jù)集重復MART分析可以產(chǎn)生特征的稍微不同的排序，特別是關于對于建立決策規(guī)則較不重要的那些特征?？捎糜诒景l(fā)明的預測性特征和它們的相應生物標記的集合可以隨著本文提出的那些集合而稍微改變。
MART技術的一個實現(xiàn)在R統(tǒng)計編程環(huán)境中的一個模塊，或者“包”中發(fā)現(xiàn)(見Venables等人，Modern Applied Statistics with S，第四版(Springer，2002)；www.r-project.org)。使用R版本1.7.0和1.7.1計算該文件中的報導的結果。實現(xiàn)MART的模塊(Greg Ridgeway編寫)被稱為“gbm”并且可以免費下載(見www.r-project.org)。該MART算法被修改以適于十倍交叉驗證。粒度參數(shù)被設置為0.05，gbm包的內(nèi)部停止規(guī)則是基于在每個標記的迭代處忽略20％的數(shù)據(jù)組。迭代的程度被設為1，因此不考慮這些特征之間的相互作用。Gbm包基于百分數(shù)估計每個特征的相對重要性，對于生物標記的所有特征，相對重要性的累積等于100％。具有最高重要性的特征占總重要性的至少90％，該具有最高重要性的特征被報告為可能具有預測值。注意到在擬合每個MART模型中停止規(guī)則為模型擬合和特征選擇貢獻了一個隨機組分。因此，基于相同數(shù)據(jù)的多個MART建模運行可以選擇稍微不同，或者可能完全不同的特征集合。這些不同的集合傳達相同的預測信息；因此，所有集合都可用于本發(fā)明。預期給MART模型擬合足夠的次數(shù)將產(chǎn)生生物標記譜內(nèi)的預測特征的所有可能的集合。因此，公開的預測值的集合僅代表可用于將個體分類到群體的那些特征的集合。
使用上述MART分析從多種樣品得到的核酸生物標記譜的數(shù)據(jù)。在該分析中，時間0小時膿毒群體由23名患者組成，SIRS群體由24名患者組成，而時間-24小時和時間-48小時群體分別由24名膿毒個體和21名SIRS個體組成。分析了相應于表1中所列的所有72種生物標記的特征。
對于時間0小時群體，擬合模型包括23棵樹，并且該模型不允許特征間的相互作用。使用10倍交叉驗證，該模型正確地分類了24名SIRS患者中的19名和23名膿毒患者中的15名，模型靈敏度為65％，特異性為79％。這些生物標記以重要性在表2中排列，該重要性通過該模型確定。排除0重要性的所有特征。用符號“-1”指出的標記隨著膿毒的發(fā)展在膿毒陽性群體中以漸高的水平表達，而具有符號“1”的那些生物標記以漸低的水平表達。
表2通過MART分析得到的特征重要性時間0小時樣品
對于時間-24小時群體，擬合模型包括12棵樹，并且該模型不允許特征間的相互作用。使用10倍交叉驗證，該模型正確地分類了21名SIRS患者中的15名和24名膿毒患者中的17名，模型靈敏度為71％，特異性為71％。這些生物標記以重要性在表3中排列，該重要性通過該模型確定。
表3通過MART分析得到的特征重要性時間-24小時樣品
對于時間-48小時群體，擬合模型包括9棵樹，并且該模型不允許特征間的相互作用。使用10倍交叉驗證，該模型正確地分類了21名SIRS患者中的8名和24名膿毒患者中的20名，模型靈敏度為83％，特異性為38％，準確度為62％。這些生物標記以重要性在表4中排列，該重要性通過該模型確定。
表4通過MART分析得到的特征重要性時間-48小時樣品
1.3.4邏輯回歸分析邏輯回歸分析提供來自上述分析的數(shù)據(jù)流的另一種方法?！靶盘枏姸取毕喈斢谔囟ê怂嵘飿擞浀臐舛取＝o定核酸生物標記的信號的缺乏導致分配的信號強度為“0”。然后從合并的SIRS和膿毒群體的圖譜得到給定核酸生物標記的信號強度的標準差(SD)。如果SIRS和膿毒群體之間信號強度沒有變化(即SD＝0)，那么不進一步考慮信號強度。在回歸分析前，使用本領域中熟知的方法檢測信號強度。檢測算法通常在Hastie等人，如前，11章中描述。
1.3.5Wilcoxon帶符號的秩檢驗分析在再一個方法中，可以用非參數(shù)檢驗如Wilcoxon帶符號的秩檢驗鑒定單個目標生物標記。生物標記譜中的特征被分配“p值”，其表示生物標記可被用于將個體分類為特定參比群體的確定性程度。通常，具有預測值的p值低于約0.05。具有低p值的生物標記可被自身用于分類個體。備選地，兩種或多種生物標記的組合可用于分類個體，其中基于生物標記的相對p值選擇組合。通常，對于生物標記的給定組合，優(yōu)選具有更低p值的那些生物標記。也可以以這種方式用至少3、4、5、6、10、20、30或更多種生物標記的組合對個體分類。技術人員將明白任一給定生物標記的相對p-值可以根據(jù)參比群體的大小而變。
使用Wilcoxon帶符號的秩檢驗，與具有表1中所列探針的表達陣列形成特異雙鏈體(即，雜交)的生物標記通過與給定時間的膿毒和SIRS群體比較而被分配p值。即，p值被分配給來自從時間0小時、時間-24小時、和時間-48小時所得生物樣品得到的生物標記譜的特征。這些p值分別在表5、6和7中列出。根據(jù)該分析，在時間0(表5)的膿毒和SIRS群體分別含有23和24名患者；在時間-24小時和時間-48小時(表6和7)的膿毒和SIRS群體分別含有24和21名患者。
表5特征的p值時間0小時
表6特征的p值時間-24小時
表7特征的p值時間-48小時
備選地，非參數(shù)檢驗(例如，Wilcoxon帶符號的秩檢驗)可用于基于正向膿毒發(fā)展的群體中特征的漸進性出現(xiàn)或者消失發(fā)現(xiàn)特征的p值。在該檢驗形式中，首先檢測給定特征的基線值，該檢測使用膿毒和SIRS組進入研究(天1樣品)時的數(shù)據(jù)。然后將膿毒和SIRS樣品中特征強度與例如，-48小時樣品中的特征強度比較以確定該特征強度是否從其基線值增加或者減少了。最后，將p值分配給膿毒群體和SIRS群體中特征強度與基線的不同。當檢測p值中與基線的這些不同時得到了下面表8-10中所列的p值。
表8與基線不同的特征的p值時間0小時
表9與基線不同的特征的p值時間-24小時
表10與基線不同的特征的p值時間-48小時
現(xiàn)在參考某些代表性實施方案和細節(jié)完全描述了本發(fā)明，對本領域中技術人員顯而易見的是，可以對這些本發(fā)明進行更改和修飾而不背離本文中提出的本發(fā)明的精神或范圍。
權利要求
1.試劑盒，其含有選自表2-10任一個中所列的核酸群的至少兩種核酸宿主應答生物標記和它們的互補序列。
2.權利要求1的試劑盒，其中該至少兩種核酸宿主應答生物標記選自表2中所列的核酸群和它們的互補序列。
3.權利要求1的試劑盒，其中該至少兩種核酸宿主應答生物標記選自表3中所列的核酸群和它們的互補序列。
4.權利要求1的試劑盒，其中該至少兩種核酸宿主應答生物標記選自表4中所列的核酸群和它們的互補序列。
5.權利要求1的試劑盒，其中該至少兩種核酸宿主應答生物標記選自表5中所列的核酸群和它們的互補序列。
6.權利要求1的試劑盒，其中該至少兩種核酸宿主應答生物標記選自表6中所列的核酸群和它們的互補序列。
7.權利要求1的試劑盒，其中該至少兩種核酸宿主應答生物標記選自表7中所列的核酸群和它們的互補序列。
8.權利要求1的試劑盒，其中該至少兩種核酸宿主應答生物標記選自表8中所列的核酸群和它們的互補序列。
9.權利要求1的試劑盒，其中該至少兩種核酸宿主應答生物標記選自表9中所列的核酸群和它們的互補序列。
10.權利要求1的試劑盒，其中該至少兩種核酸宿主應答生物標記選自表10中所列的核酸群和它們的互補序列。
11.試劑盒，其含有能夠與選自表2-10任一個中所列的核酸群的至少兩種宿主應答生物標記雜交的至少兩種寡核苷酸探針。
12.生物標記譜，其含有至少兩種特征，該至少兩種特征有助于以至少約60％的準確度預測個體包括在參比群體中，其中所述特征是核酸的可檢測的特征，并且其中參比群體選自正常參比群體、SIRS-陽性參比群體、受感染的/SIRS-陰性參比群體、膿毒陽性參比群體、處于膿毒發(fā)展階段的參比群體、通過常規(guī)技術在約0-36小時后證實患有膿毒的SIRS-陽性參比群體、通過常規(guī)技術在約36-60小時后證實患有膿毒的SIRS-陽性參比群體、和通過常規(guī)技術在約60-84小時后證實患有膿毒的SIRS-陽性參比群體。
13.分離宿主應答生物標記的方法，該方法包括(a)從個體的群體得到參比生物標記譜；(b)鑒定所述參比生物標記譜的特征，該特征可以預測或者診斷膿毒或者膿毒的一個階段，其中該特征相應于一種核酸；(c)鑒定與所述特征相應的宿主應答生物標記；和(d)分離所述宿主應答生物標記。
全文摘要
膿毒的早期預測或診斷有利地允許在該疾病從最初階段快速發(fā)展到與高死亡率有關的更嚴重的階段如嚴重膿毒或者膿毒性休克之前實施臨床干預。使用分子診斷方法實現(xiàn)早期預測或診斷，該方法將個體的生物標記表達譜與從一種或多種對照或者參比群體得到的圖譜比較，該參比群體可以包括患膿毒的群體。認識該個體的生物標記譜中膿毒發(fā)作的特征性特征使得臨床醫(yī)生可以從一個時間點從個體分離的體液診斷膿毒的發(fā)作。因此，在一段時間內(nèi)監(jiān)視患者的必要性被避免了，有利地允許在膿毒的嚴重癥狀發(fā)作前實施臨床干預。
文檔編號C12Q1/70GK1829730SQ200380108646
公開日2006年9月6日 申請日期2003年11月12日 優(yōu)先權日2002年11月12日
發(fā)明者R·艾維, T·根特爾, R·穆爾, M·湯斯, N·巴丘爾, R·羅森斯坦, P·戈登鮑姆, S·施, D·科珀蒂諾, J·加雷特, G·泰斯 申請人:貝克頓迪金森公司