專利名稱：一種禽流感預(yù)防用病毒株及其動(dòng)物感染模型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及涉及微生物領(lǐng)域，特別是一種禽流感預(yù)防用病毒株及其動(dòng)物感染模型。
背景技術(shù)：
禽流感是由正粘科A型病毒引起的禽類呼吸道傳染病。禽流感病毒變異頻繁，血清亞型眾多，包括H1-H15，N1-N9，幾乎感染所有的鳥類。
禽流感于1878年首次發(fā)現(xiàn)于意大利，自報(bào)道100多年來，目前已遍布于世界上許多國家和地區(qū)，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在香港1997年3～5月間引起的一次3個(gè)雞場的禽流感暴發(fā)流行中，雞的死亡率達(dá)70％～100％，僅銷毀雞就損失6000余萬元。這些流感病毒基因變異可能導(dǎo)致其傳給人類。在1997年暴發(fā)的香港禽流感中，H5N1亞型流感病毒曾導(dǎo)致6位香港居民死亡。揭示禽流感病毒可能跨越種屬障礙而直接由鳥類傳給人。由于人類并不具備對(duì)這些病毒的免疫力，因此這類流感病毒致病力高，可在人群中傳播。人類應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)動(dòng)物病毒的監(jiān)測和預(yù)防。大多禽流感病毒株對(duì)鳥類的發(fā)病率高，致死性低，有時(shí)不表現(xiàn)癥狀，這使得病毒廣泛傳播。但高致病性的病毒死亡率達(dá)100％，一般為H5和H7型，絕大多數(shù)病毒也是溫和的。哺乳類感染禽流感通常不表現(xiàn)臨床特征，這對(duì)分離病毒，控制病情的發(fā)展提出了難題。而高致病性的禽流感H5N1型病毒致死率高，雞胚甚至不能擴(kuò)增，選作病毒株是不合適的，而且需要P3實(shí)驗(yàn)條件。
目前預(yù)防禽流感還沒有理想的疫苗，現(xiàn)有的疫苗有弱毒疫苗，滅活油乳佐劑疫苗和病毒載體疫苗。弱毒疫苗雖很快產(chǎn)生免疫保護(hù)作用，但培育眾多亞型且遺傳不穩(wěn)定的禽流感弱毒株并非易事，還存在著弱毒變強(qiáng)毒的重組可能性。滅活油乳佐劑疫苗安全性好，無重組危險(xiǎn)性，但用油乳佐劑后，雞40天內(nèi)不能供應(yīng)，而且免疫方式需要較大的勞動(dòng)力，還有可能影響免疫檢測。禽流感痘病毒載體疫苗通過穿刺注射免疫，強(qiáng)毒攻擊后仍能感染并排毒。禽流感DNA疫苗作為一種新型的疫苗，突出優(yōu)點(diǎn)是抗原蛋白由細(xì)胞內(nèi)部合成，可通過MHC-I和MHC-II類分子直接提呈給免疫系統(tǒng)，與病毒自然感染相似，不但可誘導(dǎo)體液免疫，還可誘導(dǎo)相應(yīng)的細(xì)胞免疫，既克服了滅活疫苗和普通的亞單位疫苗的缺點(diǎn)，同時(shí)又避免了弱毒苗潛在的危險(xiǎn)性和重組病毒疫苗的免疫原復(fù)雜性。更令人感興趣的是DNA疫苗抗原在機(jī)體內(nèi)的有效表達(dá)至少可以持續(xù)180d(DankoI，1994)。預(yù)防人類的禽流感病毒和禽類的禽流感，需要分離和選擇禽流感實(shí)驗(yàn)病毒株以及疫苗生產(chǎn)的病毒株，研究疫苗這對(duì)預(yù)防下一次禽流感的流行起著至關(guān)重要的作用。禽流感幾乎感染所有的鳥類，分離病毒時(shí)，一般采集雞、鴨的泄殖腔棉拭子，然后雞胚接種分離鑒定。
禽流感的預(yù)防傳統(tǒng)的觀點(diǎn)模型選擇肯定是禽類，而且也廣泛應(yīng)用來研究高致病性的H5N1病毒的感染和預(yù)防，但禽類模型存在個(gè)體大，養(yǎng)殖困難，實(shí)驗(yàn)需要人手多，個(gè)體差異太大，免疫系統(tǒng)不成熟等缺點(diǎn)。自從1997年香港發(fā)生了禽流感直接由禽類傳給人之后，科學(xué)家們一直在尋找哺乳類動(dòng)物模型，這對(duì)控制禽流感在人類傳播意義非凡。遺憾的是一般的禽流感病毒對(duì)哺乳類是溫和的，通常不表現(xiàn)臨床特征，甚至對(duì)鳥類的致病性也不強(qiáng)。而高致病性的禽流感H5N1型病毒致死率高，需要特定的實(shí)驗(yàn)條件(P3實(shí)驗(yàn)室)培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種禽流感預(yù)防用病毒株，并且為預(yù)防人類禽流感提供一種哺乳動(dòng)物模型。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下禽流感預(yù)防用病毒株由雞場泄殖腔拭子分離，在10日齡雞胚中擴(kuò)增得到，具體步驟包括a.分離禽流感病毒株為雞場采集泄殖腔拭子，放入1ml PBS+0.1％BSA+120mg/l的卡那霉素溶液中，充分混合，取出拭子擰干；病料-80℃凍存?zhèn)溆谩?br> b.病料接種10日齡雞胚，80-96小時(shí)后收集尿囊液，尿囊液病毒分裝-80℃凍存?zhèn)溆谩?br> c.提取從尿囊液病毒中提取病毒RNA，再經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到單鏈cDNA。
d.擴(kuò)增以單鏈cDNA為模板，對(duì)HA和NA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到禽流感預(yù)防用病毒株H9N2。
e.鑒定將禽流感預(yù)防用病毒株由血清學(xué)鑒定，再經(jīng)AB公司377 DNA測序儀測序確定。
禽流感預(yù)防用病毒株的動(dòng)物感染模型它是一種禽流感預(yù)防用病毒株的小鼠感染模型。該模型是用禽流感預(yù)防用病毒株H9N2或H5N1，攻擊6～8周齡小鼠，使之感染而建立的，本模型用于在禽類傳播的禽流感疫苗，或用于控制禽流感在人類傳播的禽流感疫苗的研究或藥物評(píng)價(jià)。
本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下主要優(yōu)點(diǎn)其一.用此病毒株攻擊小鼠，攻擊后小鼠有聳毛、體重丟失等癥狀，傳代癥狀更明顯。
其二.可作為禽流感疫苗候選株。
其三.可評(píng)價(jià)滅活疫苗、DNA疫苗免疫保護(hù)效果。
其四.具有明顯的應(yīng)用前景選擇BALB/C小鼠做模型，使禽流感病毒株成為小鼠的適應(yīng)株，對(duì)禽流感疫苗的開發(fā)有重要作用。對(duì)評(píng)價(jià)疫苗的效果提供了不同的選擇。對(duì)開發(fā)人類禽流感疫苗提供了一條有希望的途徑。
其五.工藝簡單，操作方便，利于推廣。


附圖是用ELISA法檢測小鼠血清中IgG抗體的效果示意圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
一.禽流感預(yù)防用病毒株禽流感預(yù)防用病毒株是禽流感預(yù)防用病毒株H9N2或H5N1。
禽流感病毒株為雞場采集泄殖腔拭子，放入1ml PBS+0.1％BSA+120mg/l的卡那霉素溶液中，充分混合，取出拭子擰干。病料-80℃凍存?zhèn)溆谩２×辖臃N10日齡雞胚，96小時(shí)后收集尿囊液，血凝實(shí)驗(yàn)表明病毒滴度為210。尿囊液病毒分裝-80℃凍存?zhèn)溆谩２《窘?jīng)血清學(xué)鑒定為禽流感H9N2型。病毒RNA是從在10日齡雞胚中增殖得到的病毒中提取。RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到單鏈cDNA。以cDNA為模板，對(duì)HA和NA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。經(jīng)ABI公司377DNA測序儀證實(shí)有99％的同源性。
二.禽流感預(yù)防用病毒株的動(dòng)物模型1.禽流感預(yù)防用病毒株的動(dòng)物模型是一種禽流感預(yù)防用病毒株的小鼠感染模型。
它是從雞場分離的禽流感病毒H9N2作為病毒株，用其攻擊6～8周齡BALA/C小鼠，使之感染而建立起來的。攻擊后小鼠有聳毛、體重丟失等癥狀。傳代癥狀更明顯，三代后攻毒小鼠死亡。肺部病毒經(jīng)雞胚擴(kuò)增證實(shí)為禽流感病毒。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，該模型可用于控制禽流感在禽類傳播的禽流感疫苗，或用于控制禽流感在人類傳播的流感疫苗。
2.禽流感小鼠模型的建立方法選擇6-8周BALB/C小鼠。腹腔注射麻醉藥(鹽酸氯胺酮、鹽酸洛貝林混合物)使小鼠全身麻醉，H9N2病毒滴鼻攻擊小鼠15只，攻擊三天后小鼠出現(xiàn)聳毛癥狀，體重下降10.5％，攻擊五天后，5只小鼠用氯仿麻醉小鼠，從心臟采血。使小鼠背臥于實(shí)驗(yàn)桌面，在劍狀軟骨下方微偏左處以15～20度角插入注射器針頭，緩慢的抽取心血直至血流停止。收集的血液置于室溫1小時(shí)左右。凝固后析出血清。8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。在無菌條件下吸出血清，-20度冰箱保存。取出小鼠的氣管和肺，PBS(含0.1％BSA)注洗三次。漂洗液離心去細(xì)胞碎片用于攻擊下一代小鼠。另5只小鼠取出氣管和肺用15％的福爾馬林保存，-80℃凍存用于電鏡觀察病毒顆粒。第一代小鼠攻擊后三天體重丟失為10.5％，第二代小鼠攻擊三天后體重丟失為11.4％，第三代小鼠攻擊三天后體重丟失為14.3％，第四代小鼠攻擊三天后體重丟失為12.6％。第二代小鼠攻擊后10天有40％的死亡，第三代和第四代小鼠攻擊后7-10天內(nèi)全部死亡。至此，禽流感病毒株H9N2可作為小鼠的攻毒株，建立一種禽流感哺乳動(dòng)物模型。
還有5只小鼠于攻毒后10天，20天尾部取血，凝固后析出血清。8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。在無菌條件下吸出血清，-20度冰箱保存。用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測H9N2型HA特異性IgG抗體。用10μg/mL的滅活疫苗包被96孔酶標(biāo)板，37℃2小時(shí)；PBS-T(1升溶液中含有NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO41.15g，KH2PO40.2g，Tween-20 0.454ml)洗三次后加入封閉液(1升溶液中含有NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO41.15g，KH2PO40.2g，1g牛血清白蛋白)，4℃過夜。用封閉液以2的倍數(shù)稀釋抗血清后，加入酶標(biāo)板，37℃溫育1小時(shí)。PBS-T洗三次后，加入用生物素(Biotin)標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗(γ-chain specific，Southern Biotechnology Associates，Inc.USA)，37℃溫育1小時(shí)，。PBS-T洗三次后，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈菌蛋白(Southern Biotechnology Associates，Inc.USA)，37℃溫育1小時(shí)。最后，PBS-T洗三次后，加入10mg/ml PNPP(Southern Biotechnology Associates，Inc.USA)顯色。在30分鐘內(nèi)，用酶標(biāo)儀(Labsystems Multiskan Ascent芬蘭產(chǎn))利用雙波長(414nm-405nm)測出OD值，最終確定抗體IgG的最高稀釋度，以此來確定抗體量的高低。
用血凝抑制(Hemagglutinin inhibition)實(shí)驗(yàn)測HI抗體。按照常規(guī)方法進(jìn)行。生理鹽水為0.09gNaCl溶于100ml的純水中，高壓滅菌-4℃保存。2％的檸檬酸鈉為2g檸檬酸鈉溶于100ml的純水中，高壓滅菌-4℃保存。1％的雞紅細(xì)胞為健康三黃公雞靜脈取血，按血液，2％的檸檬酸鈉4∶1混合，用前加50倍生理鹽水漂洗三次，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心去上清，配成1％的紅細(xì)胞-4℃保存?zhèn)溆?。?duì)照和樣品血清用生理鹽水按1∶12.5，1∶25，1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600稀釋，在96孔-V血凝反應(yīng)板每個(gè)樣品五個(gè)樣，每孔20ul樣品+20ul病毒(H9病毒10-2稀釋)靜置1小時(shí)后加40ul 1％的雞紅細(xì)胞，放37度1小時(shí)后觀察結(jié)果。HI抗體的滴度用完全抑制病毒的最高稀釋度來表示。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)用ELISA法測血清中的IgG抗體，其結(jié)果是攻擊后10天，20天產(chǎn)生了高滴度的針對(duì)H9 HA的IgG抗體(見附圖)。圖中橫坐標(biāo)第一組為對(duì)照組，第二組為實(shí)驗(yàn)組(攻擊后20天)?？v坐標(biāo)為1∶32倍稀釋血清的針對(duì)HA的IgG抗體量，小鼠攻擊后20天的抗體量與對(duì)照組相比有明顯的升高。
(2)用血凝抑制(Hemagglutinin inhibition)實(shí)驗(yàn)測HI抗體，第一代小鼠攻毒后20天的HI抗體與對(duì)照相比，有所上升第一組為對(duì)照組，第二組為實(shí)驗(yàn)組(攻擊后20天)。對(duì)照抑制病毒的最高稀釋度是1∶200，第一代小鼠攻毒后20天的抑制病毒的最高稀釋度為1∶800。
總之，用禽流感病毒株攻擊小鼠，攻擊后小鼠有聳毛、體重丟失等癥狀。傳代癥狀更明顯。經(jīng)雞胚擴(kuò)增證實(shí)為禽流感病毒。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明該病毒株可作為禽流感疫苗候選株，以此病毒株評(píng)價(jià)滅活疫苗、DNA疫苗免疫保護(hù)效果。
權(quán)利要求
1.一種禽流感預(yù)防用病毒株，其特征在于所述的禽流感預(yù)防用病毒株，由雞場泄殖腔拭子分離，在10日齡雞胚中擴(kuò)增得到，具體步驟包括a.分離禽流感病毒株為雞場采集泄殖腔拭子，放入1ml PBS+0.1％BSA+120mg/l的卡那霉素溶液中，充分混合，取出拭子擰干；病料-80℃凍存?zhèn)溆?，b.病料接種10日齡雞胚，80-96小時(shí)后收集尿囊液，尿囊液病毒分裝-80℃凍存?zhèn)溆茫琧.提取從尿囊液病毒中提取病毒RNA，再經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到單鏈cDNA，d.擴(kuò)增以單鏈cDNA為模板，對(duì)HA和NA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到禽流感預(yù)防用病毒株H9N2，e.鑒定將禽流感預(yù)防用病毒株由血清學(xué)鑒定，再經(jīng)AB公司377 DNA測序儀測序確定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的禽流感預(yù)防用病毒株，其特征在于所述的禽流感病毒株是禽流感預(yù)防用病毒株H9N2，或禽流感預(yù)防用病毒株H5N1。
3.一種禽流感預(yù)防用病毒株的動(dòng)物感染模型，其特征是一種禽流感預(yù)防用病毒株的小鼠感染模型，它是用禽流感預(yù)防用病毒株H9N2或H5N1，攻擊6～8周齡小鼠，使之感染而建立的，該模型用于在禽類傳播的禽流感疫苗，或用于控制禽流感在人類傳播的禽流感疫苗的研究或藥物評(píng)價(jià)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的禽流感預(yù)防用病毒株的動(dòng)物感染模型，其特征在于禽流感小鼠模型的建立步驟包括a.用腹腔注射麻醉藥鹽酸氯胺酮或鹽酸洛貝林混合物，使實(shí)驗(yàn)小鼠全身麻醉，H9N2或H5N1病毒滴鼻攻擊小鼠若干只，b.攻擊五天后，用氯仿麻醉5只小鼠，取出小鼠的氣管和肺，再用含0.1％BSA的PBS注洗三次，c.漂洗液離心去細(xì)胞碎片用于攻擊下一代小鼠，d.取出另外5只小鼠氣管和肺，用15％的福爾馬林保存，-80℃凍存，用于電鏡觀察病毒顆粒，e.觀察第一代、第二代、第三代和第四代小鼠受到攻擊三天后的體重丟失情況，f.繼續(xù)觀察攻擊10天后，有40％的第二代小鼠死亡；攻擊7-10天內(nèi)，第三代和第四代小鼠全部死亡，g.至此，禽流感病毒株H9N2或H5N1作為小鼠的攻毒株，已形成一種禽流感哺乳動(dòng)物模型。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的禽流感預(yù)防用病毒株的動(dòng)物感染模型，其特征在于實(shí)驗(yàn)小鼠采用BALB/C小鼠。
全文摘要
本發(fā)明是一種禽流感預(yù)防用病毒株及其動(dòng)物感染模型。本發(fā)明包括禽流感病毒株的分離、鑒定、擴(kuò)增，得到禽流感預(yù)防用病毒株；還包括建立了一種禽流感預(yù)防用病毒株的小鼠感染模型，它是用禽流感預(yù)防用病毒株H9N2或H5N1，攻擊6～8周齡小鼠，使之感染而建立的，該模型用于在禽類傳播的禽流感疫苗，或用于控制禽流感在人類傳播的禽流感疫苗的研究或藥物評(píng)價(jià)。本發(fā)明提供的病毒株可作為禽流感疫苗候選株，提供的哺乳動(dòng)物模型具有明顯的應(yīng)用前景，為評(píng)價(jià)各種疫苗的有效性提供了一種新方法，為人類禽流感疫苗提供了一條有希望的途徑。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK1618956SQ200310111418
公開日2005年5月25日 申請(qǐng)日期2003年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月20日
發(fā)明者陳則 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院武漢病毒研究所