專利名稱：一種植物基因重組表達載體的構建方法
技術領域：
本發(fā)明一種植物基因重組表達載體的構建方法，屬于三角葉濱藜甜菜堿醛脫氫酶基因植物表達載體的構建方法，專用于利用三角葉濱藜甜菜堿醛脫氫酶基因進行植物表達，創(chuàng)造耐鹽新種質(zhì)。
二、技術背景三角葉濱藜(Atriplex triangularis)是藜科濱藜屬植物，自然分布于沿海沼澤邊緣，可以經(jīng)受海水直接澆灌的一年生多葉植物，葉可食用，且具有較強的耐鹽耐干旱能力。生物對非生物脅迫的普遍反應是積累與細胞代謝相容的低分子量有機溶質(zhì)，如蔗糖、甘露醇、脯氨酸、海藻糖以及季胺類化合物。甜菜堿是一類季胺類化合物。
甘氨酸甜菜堿是植物的一個重要的滲透保護劑，BADH是甘氨酸甜菜堿合成的關鍵酶。但很多主要的農(nóng)作物如水稻、油菜、馬鈴薯和蕃茄等卻沒有甜菜堿積累。據(jù)報道，在植物中，甘氨酸甜菜堿(GB)是經(jīng)兩步催化合成，乙酰膽堿→甘氨酸甜菜堿醛→甘氨酸甜菜堿，第二步是由甜菜堿醛脫氫酶(BADH)所催化。GB作為參與調(diào)滲的小分子，它的積累與鹽脅迫和缺水的嚴重程度成比例，在生物合成水平上受到調(diào)控。自從Elizabeth A.等于1990年首次從菠菜中克隆出BADH基因。目前，人們已對藜科、禾本科和莧科的BADH有所了解。BADH基因已從山菠菜、豬莧菜、甜菜、大麥等中得到分離和鑒定。并有將菠菜和山菠菜甜菜堿醛脫氫酶基因轉(zhuǎn)入煙草、小麥、草莓等中的報道，使轉(zhuǎn)化植株的耐鹽性有所提高。而三角葉濱藜海水澆灌亦能開花結實，表明其有較強的耐鹽性?，F(xiàn)有技術已從三角葉濱藜中克隆得到BADH cDNA的拼接序列(GenBank注冊號AY256971)，但未能克隆到植物表達載體上，以便創(chuàng)造耐鹽新種質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
技術問題 本發(fā)明的目的在于提供一種植物基因重組表達載體的構建方法，構建三角葉濱藜甜菜堿醛脫氫酶基因的植物表達載體，以期將三角葉濱藜中BADH基因克隆到植物表達載體上，從而達到利用該基因進行植物表達以及創(chuàng)造耐鹽新種質(zhì)的要求。
技術方案一種植物基因重組表達載體的構建方法，包括
1)三角葉濱藜RNA提取用Trizol法抽提三角葉濱藜總RNA；2)引物設計及目的基因的擴增根據(jù)本實驗室克隆的三角葉濱藜甜菜堿醛脫氫酶基因BADH cDNA拼接序列，設計下列引物，TBf5’-TTCAG↓GATCCATGGCGTTTCCTATGCC-3’BamHITBr5’-TCAGAGCT↓CTAAGGAGACTTGTACCAG-3’Sacl以三角葉濱藜總RNA為模板，參照TakaRa RNA PCR kit(AMV)ver21提供方法進行cDNA合成及PCR擴增；3)BADH基因克隆和DNA序列測定PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％(g/100ml，下文同)瓊脂糖凝膠電泳檢測，用DNA gelextraction回收純化，將回收的DNA片段插入pMD18-T載體，構建重組質(zhì)粒pBADH，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，根據(jù)α互補原理，酶切電泳法以及PCR法篩選重組子pBADH，DNA測序三角葉濱藜BADH基因核苷酸序列為SEQ IDNO.1和推測的氨基酸序列為SEQ ID NO.2；4)植物重組表達質(zhì)粒的構建用BamHI和SacI雙酶切消化pBADH以及pCAMBIA2301，1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，用DNA gel extraction Kit回收純化BADH基因片段以及線性載體片段，并用T4DNA連接酶連接兩片段，然后將35S啟動子和nos終止子分別構建于重組載體的BADH區(qū)段上下游多克隆位點上，獲植物重組表達質(zhì)粒pCAMATBADH；5)轉(zhuǎn)化植物重組表達質(zhì)粒pCAMATBADH轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布于在含100mg/L Kan的LB平板上，于37℃培養(yǎng)14個小時；挑取單菌落，分別接種于3mL含100mg/L Kan的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃下，200rpm/min振蕩培養(yǎng)過夜；用3S plasmid Miniprep Kit V3.1抽提質(zhì)粒，并進行瓊脂糖凝膠電泳檢驗和PCR及酶切鑒定；確認外源片段已插入到pCAMBIA2301的多克隆位點上，其中35S和nos插入片段的PCR檢測及酶切分析未顯示，即獲得植物重組表達載體。
有益效果1、本發(fā)明一種植物基因重組表達載體的構建方法，根據(jù)從三角葉濱藜中克隆到的BADH cDNA的拼接序列設計引物，從鹽生植物三角葉濱藜總RNA中分離了BADH基因，并將其克隆到植物表達載體上，以便對該基因進行植物表達研究以及為進一步闡明植物耐鹽分子機理及創(chuàng)造耐鹽新種質(zhì)。
2、本發(fā)明利用RT-PCR技術從鹽生植物三角葉濱藜總RNA中，擴增并克隆了BADH基因。該基因全序列顯示，核苷酸序列長1520bp，12～1515bp為一個開放閱讀框架，推測的氨基酸序列全長500個氨基酸殘基與菠菜和山菠菜的同源性分別為89％和95％。
3、利用BamHI和SacI酶切位點將BADH基因連接到pCAMBIA2301的多克隆位點，并把35S啟動子和nos終止子分別連接到BADH基因的上游和下游的多克隆位點上，獲重組植物表達載體pCBAMATBADH682，并轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中，用于農(nóng)桿菌介導。
4、所克隆的BADH基因核苷酸序列和推測的氨基酸序列與原三角葉濱藜BADHcDNA拼接序列的相同性分別為99％和96％，在核苷酸序列和推測的氨基酸序列的多個位點存在差異。對PCR產(chǎn)物進行多個克隆的測序分析，去除少數(shù)突變產(chǎn)物克隆，可以降低PCR產(chǎn)物直接用于基因表達等后期工作的難度。
5、三角葉濱藜海水澆灌亦能開花結實，表明其有較強的耐鹽性。本發(fā)明三角葉濱藜BADH基因成功構建到pCAMBIA2301載體上，獲得pCAMATBADH682植物重組表達載體，并將其轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中，目前課題組正在用于農(nóng)桿菌介導法將三角葉濱藜BADH基因轉(zhuǎn)化油菜。希望通過轉(zhuǎn)基因技術獲得耐鹽油菜新種質(zhì)。
四

圖1瓊脂糖電泳分析a.以三角葉濱藜cDNA為模板，PCR擴增BADH基因分析M.GeneRulerTMDNA Ladder Mix；A.cDNA的PCR產(chǎn)物圖2瓊脂糖電泳分析a.pCAMATBADH的BamHI和SacI酶切鑒定；b.LBA4404(pCAMATBADH)的PCR鑒定。
M1.λDNA/HindIII marker；M2.GeneRulerTMDNA Ladder Mix；A為pCAMATBADH682酶切產(chǎn)物；CK.PCR的LBA4404空菌株對照；E-G為LBA4404(pCAMATBADH682)的PCR產(chǎn)物。
五具體實施例方式
1.材料和方法1.1材料1.1.1植物材料三角葉濱藜三角葉濱藜播種于蛭石中，經(jīng)Hongland營養(yǎng)液培養(yǎng)，待幼苗長出2片真葉，部分幼苗進行鹽處理，處理起始濃度為50mM NaCl，每隔3天提高50mM，直至500mM，并使苗在500mM NaCl的溶液中生長一周。
1.1.2菌種和質(zhì)粒pMD18-T Vector為TakaRa公司產(chǎn)品。PCAMBIA2301(Hajdukiewicz P，Svab Z，Maliga P(1994)The small，versatile Ppzp family of Agrobacteriumbinary vectors forplant transformation.Plant Mol.Biol.25989-994)和JM109(目前生化公司有售)為本實驗室所保存。LBA4404(目前生化公司有售)為南京農(nóng)業(yè)大學王華忠博士提供。
1.1.3主要化學試劑和酶Trizol kit和3S plasmid Miniprep Kit V3.1為上海申能博彩公司產(chǎn)品；TakaRaRNA PCR kit(AMV)ver21、RNase H、T4 DNA連接酶、LA-Taq以及BamHI和SacI等為TakaRA公司產(chǎn)品。DNA gel extraction Kit為Vitagene公司產(chǎn)品。
1.2方法1.2.1三角葉濱藜RNA提取取經(jīng)鹽處理后的三角葉濱藜幼嫩展開葉，用Trizol法抽提總RNA(參照Trizol kit說明書的方法)。
1.2.2引物設計及目的基因的擴增根據(jù)本實驗室克隆的三角葉濱藜BADH cDNA拼接序列，設計下列引物，TBf5’-TTCAG↓GATCCATGGCGTTTCCTATGCC-3’BamHITBr5’-TCAGAGCT↓CTAAGGAGACTTGTACCAG-3’Sacl以三角葉濱藜總RNA為模板，參照TakaRa RNA PCR kit(AMV)ver21提供方法進行cDNA合成及PCR擴增。
1.2.3BADH基因克隆和DNA序列測定PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，用DNA gel extraction Kit回收純化，將回收的DNA片段插入pMD18-T載體，構建重組質(zhì)粒pBADH，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，根據(jù)α互補原理，酶切電泳法以及PCR法篩選重組子。DNA測序由上海申能博彩公司測定，三角葉濱藜BADH基因核苷酸序列為SEQ ID NO.1和推測的氨基酸序列為SEQ ID NO.2；。
1.2.4植物重組表達質(zhì)粒的構建用BamHI和SacI雙酶切消化pBADH以及pCAMBIA2301，1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，用DNA gel extraction Kit回收純化BADH基因片段以及線性載體片段，并用T4DNA連接酶連接兩片段，然后將35S啟動子和nos終止子分別構建于重組載體的BADH區(qū)段上下游多克隆位點上，獲植物重組表達質(zhì)粒pCAMATBADH。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布于在含100mg/L Kan的LB平板上，于37℃培養(yǎng)14個小時。挑取單菌落，分別接種于3mL含100mg/L Kan的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃下，200rpm/min振蕩培養(yǎng)過夜；用3S plasmid Miniprep Kit V3.1抽提質(zhì)粒，并進行瓊脂糖凝膠電泳檢驗和PCR及酶切鑒定。
1.2.5植物重組表達質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化用凍融法，將植物重組表達質(zhì)粒pCAMATBADH轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404，涂布于含100mg/L Kan和200mg/L Rif的YEB平板上，于28℃培養(yǎng)36小時。挑取單菌落，分別接種于3mL含100mg/L Kan和200mg/L Rif的YEB液體培養(yǎng)基中，于28℃下，250rpm/min振蕩培養(yǎng)過夜，并進行PCR檢測。
2.結果2.1三角葉濱藜BADH基因的克隆以本實驗室克隆的三角葉濱藜BADH cDNA拼接序列設計的引物TBf和TBr，對三角葉濱藜cDNA進行PCR擴增，獲得長近1.5kb特異條帶(圖2)。將純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18-T連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。單克隆的BamHI限制性內(nèi)切酶酶切鑒定以及用TBf和TBr引物的PCR檢測表明，已獲得插有近1.5kb的外源DNA片段的克隆pBADH(圖2)。測序結果顯示該外源片段全長為1520bp，含有一個1501bp的ORF(表1)。其核苷酸序列和推測的氨基酸序列與菠菜和山菠菜的相同性分別為89％和95％與86％和93％與本實驗室原克隆的BADH cDNA序列亦在55、239、322、327、579、706、715、1053以及1367位點存在差異，同源性為99％。
2.2三角葉濱藜BADH基因植物表達載體的構建將上述重組質(zhì)粒pBADH經(jīng)Bam和Sacl酶切，將1520bp片段分別連接到pCAMBIA2301的多克隆位點BamI和SacI之間，然后將35S啟動子和nos終止子分別構建于重組載體的BADH區(qū)段上下游多克隆位點上。轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109。單克隆的限制性內(nèi)切酶BamI和SacI的酶切鑒定以及用TBf和TBr引物的PCR檢測，確認外源片段已插入到pCAMBI2301的多克隆位點上(圖3)，其中35S和nos插入片段的PCR檢測及酶切分析未顯示。獲植物重組表達質(zhì)粒pCAMATBADH682。
2.3植物重組表達載體的根癌農(nóng)桿菌LBA4404的轉(zhuǎn)化用凍融法將植物重組表達質(zhì)粒pCAMATBADH682轉(zhuǎn)入感受態(tài)根癌農(nóng)桿菌LBA4404，挑取3個單克隆，用TBf和TBr引物進行PCR檢測，得到與BADH基因大小相同的PCR產(chǎn)物(圖3)。表明植物重組表達質(zhì)粒pCAMATBADH682已轉(zhuǎn)入LBA4404，命名為LBA4404(PCAMATBADH682)。
3.討論本發(fā)明所克隆的BADH基因核苷酸序列和推測的氨基酸序列與原三角葉濱藜BADH cDNA拼接序列的相同性分別為99％和96％，在核苷酸序列和推測的氨基酸序列的多個位點存在差異，其可能原因是BADH基因是一個多基因家族成員，這在高梁、紅樹、豬莧菜等上已有報道。其二是PCR擴增引入突變。采取高保真的pfu酶進行PCR擴增等措施可降低PCR的突變率。另外，對PCR產(chǎn)物進行多個克隆的測序分析，去除少數(shù)突變產(chǎn)物克隆，可以降低PCR產(chǎn)物直接用于基因表達等后期工作的難度。
目前梁崢、郭北海、劉鳳華、何鍶潔以及李銀心等已分別將菠菜和山菠菜BADH基因轉(zhuǎn)入煙草、小麥、草莓、水稻、玉米以及豆瓣菜中，并證明了轉(zhuǎn)基因植物的BADH活性及耐鹽性均高于對照。而三角葉濱藜海水澆灌亦能開花結實，表明其有較強的耐鹽性。我們從三角葉濱藜中克隆的BADH基因，其推測的氨基酸序列與菠菜和山菠菜有一定的差異。本研究把三角葉濱藜BADH基因成功構建到pCAMBIA2301載體上，獲得pCAMATBADH植物重組表達質(zhì)粒pCAMATBADH682，并將其轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中，獲重組表達載體LBA4404(pCAMATBADH682)。油菜中亦存在BADH基因，但油菜在干旱和鹽誘導下不積累BADH。因此本實驗室已建立了完善的油菜不定芽再生體系及轉(zhuǎn)化體系。目前正通過農(nóng)桿菌介導法將三角葉濱藜BADH基因轉(zhuǎn)化油菜。希望通過轉(zhuǎn)基因技術獲得耐鹽油菜新種質(zhì)。
BADH.ST25SEQUENCE LISTING<110>江蘇省農(nóng)業(yè)科學院<120>一種植物基因重組表達載體的構建方法<130>00<140>00<141>2003-12-08<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1520<212>DNA<213>三角葉濱藜BADHgene<220>
<221>三角葉濱藜BADHgene<222>(1)..(1520)<223>
<400>1ttcaggatcc atggcgtttc ctatgcctgt tcgtcaactc ttcatcgatg gggagtggag 60agaacccctt ttaaaaaatc gcattcccat catcaaccct tctactgaag aaatcatcgg 120tgatattcct gctgcaactg cagaggatgt agaggttgca gtagtagcag ctagaaaagc 180atttaagagg aacaaaggta gagattgggc tgcaacttct ggtgctcatc gtgctaaata 240tttgcgtgct attgctgcta agataacaga aagaaaagat catttcgtta aactggaaac 300ccttgattct ggaaaaccat tcgatgaagc cgtgttggac attgatgatg ttgcttcatg 360ctttgaatac tttgctggtc aagcagaagc tctggatgct aaacaaaagg ctccagtcac 420cctgcctatg gacagattta aaagtcatgt tctcaggcag cccattggtg ttgttggatt 480aatatcccca tggaattatc cacttctaat ggctacatgg aaagttgctc ccgcacttgc 540tgctggatgc acagctgtac ttaaaccatc agaatcggca tctgtgactt gtctagaatt 600tggtgaagtg tgtaacgaag tgggacttcc tccaggtgtg ttgaatattt tgacaggatt 660aggtcctgat gctggtgccc caatagtatc tcatcctgat attgataaga ttgcatttac 720
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<221>三角葉濱藜BADH<222>(1)..(500)<223>
<400>2Met Ala Phe Pro Met Pro Val Arg Gln Leu Phe Ile Asp Gly Glu Trp1 5 10 15Arg Glu Pro Leu Leu Lys Asn Arg Ile Pro Ile Ile Asn Pro Ser Thr20 25 30Glu Glu Ile Ile Gly Asp Ile Pro Ala Ala Thr Ala Glu Asp Val Glu35 40 45Val Ala Val Val Ala Ala Arg Lys Ala Phe Lys Arg Asn Lys Gly Arg50 55 60Asp Trp Ala Ala Thr Ser Gly Ala His Arg Ala Lys Tyr Leu Arg Ala65 70 75 80Ile Ala Ala Lys Ile Thr Glu Arg Lys Asp His Phe Val Lys Leu Glu85 90 95
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權利要求
1.一種植物基因重組表達載體的構建方法，包括1)三角葉濱藜RNA提取用Trizol法抽提三角葉濱藜總RNA；2)引物設計及目的基因的擴增根據(jù)本實驗室克隆的三角葉濱藜甜菜堿醛脫氫酶基因BADH cDNA拼接序列，設計下列引物，TBf 5’-TTCAG↓GATCCATGGCGTTTCCTATGCC-3’BamHITBr 5’-TCAGAGCT↓CTAAGGAGACTTGTACCAG-3’Sacl以三角葉濱藜總RNA為模板，參照TakaRa RNA PCR kit(AMV)ver21提供方法進行cDNA合成及PCR擴增；3)BADH基因克隆和DNA序列測定PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％(g/100ml，下文同)瓊脂糖凝膠電泳檢測，用DNA gelextraction Kit回收純化，將回收的DNA片段插入pMD18-T載體，構建重組質(zhì)粒pBADH，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，根據(jù)α互補原理，酶切電泳法以及PCR法篩選重組子pBADH，DNA測序，三角葉濱藜BADH基因核苷酸序列為SEQID NO.1和推測的氨基酸序列為SEQ ID NO.2；4)植物重組表達質(zhì)粒的構建用BamHI和SacI雙酶切消化pBADH以及pCAMBIA2301，1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，用DNA gel extraction Kit回收純化BADH基因片段以及線性載體片段，并用T4DNA連接酶連接兩片段，然后將35S啟動子和nos終止子分別構建于重組載體的BADH區(qū)段上下游多克隆位點上，獲植物重組表達質(zhì)粒pCAMATBADH；5)轉(zhuǎn)化植物重組表達質(zhì)粒pCAMATBADH轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布于在含100mg/L Kan的LB平板上，于37℃培養(yǎng)14個小時；挑取單菌落，分別接種于3mL含100mg/L Kan的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃下，200rpm/min振蕩培養(yǎng)過夜；用3S plasmid Miniprep Kit V3.1抽提質(zhì)粒，并進行瓊脂糖凝膠電泳檢驗和PCR及酶切鑒定，確認外源片段已插入到pCAMBIA2301的多克隆位點上，其中35S和nos插入片段的PCR檢測及酶切分析未顯示，即獲得植物基因重組表達載體。
全文摘要
本發(fā)明一種植物基因重組表達載體的構建方法，屬于三角葉濱藜甜菜堿醛脫氫酶基因表達載體的構建。利用RT－PCR技術從鹽生植物三角葉濱藜總RNA中，擴增并克隆了BADH基因。該基因全序列顯示，核苷酸序列長1520bp，推測的氨基酸序列全長500個氨基酸殘基。利用BamHI和SacI酶切位點將BADH基因連接到pCAMBIA2301的多克隆位點，并把35S啟動子和nos終止子分別連接到BADH基因的上游和下游的多克隆位點上，獲表達載體pCBAMATBADH682，正用于農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化油菜，希望通過轉(zhuǎn)基因技術獲得耐鹽油菜新種質(zhì)。
文檔編號C12N15/70GK1546672SQ200310106560
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月9日 優(yōu)先權日2003年12月9日
發(fā)明者何曉蘭, 劉桂華, 朱衛(wèi)民, 張保龍, 倪萬潮, 欽佩, 侯喜林 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學院