專利名稱：使用花粉特異性的鋅指轉(zhuǎn)錄因子基因降低花粉受育性的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及在雄性花蕊花粉形成組織中特異性表達的基因及其應用。本發(fā)明尤其是涉及在小孢子中特異性表達、來自矮牽?；ǖ匿\指型轉(zhuǎn)錄因子組(ZPT2-5、ZPT3-1和ZPT4-1)的基因及其應用。
背景技術：
花粉的受育性成為農(nóng)業(yè)、園藝不同領域中的問題。例如，在雜交育種進行交配時，為了避免自花受粉，需要很多人力進行除雄作業(yè)(除去雄蕊)。在種苗產(chǎn)業(yè)中，從商業(yè)保護通過雜交育種得到的優(yōu)秀品種的立場來看，要求沒有花粉受育性的性狀。為滿足這樣的要求，強烈需要控制花粉受育性的技術(pollination control)。以往，對于特定的作物，雜交育種時使用細胞質(zhì)雄性不育性系統(tǒng)，并取得了一些成功。不過在很多時候，細胞質(zhì)不育性狀伴隨有抗病性低下等不良副效應，并且產(chǎn)生性狀不穩(wěn)定，難以大規(guī)模生產(chǎn)種子等問題。也研究過通過化學藥品處理降低受育性的方法，但由于安全性評價和作用機理的闡明進展較慢，所以尚未達到實用化程度。因此，需要使用基因工程的優(yōu)良雄性不育技術。
花粉是種子植物的雄性配子體。以被支持體組織花藥圍繞的狀態(tài)進行的花粉發(fā)育過程分為以下各階段。在緊隨小孢子形成細胞(花粉母細胞)的減數(shù)分裂之后出現(xiàn)的四分體時期，四分體的小孢子釋放期，以花粉細胞的擴大和形成空泡為特征的單核期，通過有絲分裂分化為營養(yǎng)細胞和生殖細胞的細胞有絲分裂期，其后的雙核期。經(jīng)過這些階段，花藥最終開裂，釋放出成熟的花粉粒。因此，可以說小孢子是阻礙花粉發(fā)育，使花粉失去繁殖力的人為控制最適宜靶組織。
如上所述，應用基因工程手段的雄性不育技術被寄予了很大的希望。特別是，如果能夠利用在小孢子等花粉細胞的直接前體中特異表達的基因的話，則極有可能做到不賦予植物不良性狀，并達到雄性不育的目的。目前已報道了數(shù)個雄蕊各種組織的特異性啟動子，以及含有這些啟動子并導致雄性不育的基因構建物的例子(Shivanna和Sawhney編，Pollen biotechnology for crop production andimprovement，劍橋大學出版，pp.237-257，1997)。但對于表達的組織特異性和時間特異性高，可用于控制花粉受育性的新型基因仍然具有很大的需求。
最近，作為來自矮牽?；ǖ男滦娃D(zhuǎn)錄因子，本發(fā)明人等鑒定了包括PEThyZPT2-5、PEThyZPT3-1以及PEThyZPT4-1(以下，分別略作ZPT2-5、ZPT3-1以及ZPT4-1)在內(nèi)的7個鋅指(ZF)型轉(zhuǎn)錄因子的cDNA序列。并且，從Northern blot分析結果來看，各個轉(zhuǎn)錄因子表現(xiàn)出花藥特異性的、在花藥不同發(fā)育階段的瞬時表達性(Kobayashi等，Plant J.13571，1998)?？墒牵瑢τ谶@些轉(zhuǎn)錄因子在植物中的生理功能和作用，以及對于轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的正確表達部位和表達調(diào)控機制還不是很清楚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種對改變雄性不育等植物性狀有用的、利用花粉特異性基因的基因工程學方法。
本發(fā)明人等將以前從矮牽?；ㄖ蟹蛛x的、編碼花藥特異性轉(zhuǎn)錄因子組(ZPT2-5、ZPT3-1和ZPT4-1)的基因再導入了矮牽牛花。其結果，發(fā)現(xiàn)花粉的正常發(fā)育受到阻礙，花粉的受育性顯著降低(ZPT2-5和ZPT4-1)或者幾乎完全喪失(ZPT3-1)。進而，本發(fā)明人等從ZPT3-1和ZPT4-1基因組基因分離了各自的上游區(qū)域，并研究了其啟動子活性的組織特異性。其結果，發(fā)現(xiàn)在單核期至雙核期的小孢子中，啟動子活性的表達顯示出組織特異性和時期特異性。本發(fā)明是基于這些認識完成的。
本發(fā)明的第一部分涉及制備雄性不育植物的方法，該方法包括以下步驟。提供含有(i)具有序列號1所示堿基序列中第1位到第777位序列的DNA，(ii)在嚴格條件下與具有(i)堿基序列的DNA雜交，并編碼控制花粉發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子的DNA，或(iii)(i)或(ii)的DNA片段中任一核酸，以及與上述核酸有效連接的啟動子的植物表達序列組合的步驟；提供具有控制花粉發(fā)育的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的植物細胞的步驟，其中，編碼該內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的基因與上述核酸在嚴格條件下雜交；將表達序列組合導入植物細胞的步驟；將導入表達序列組合的植物細胞再生為植物體的步驟；以及對于再生的植物體，通過上述核酸的表達，篩選內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的表達受到抑制的植物體的步驟。
本發(fā)明的第二部分涉及制備雄性不育植物的方法，該方法包括以下步驟。提供含有(i’)具有序列號3所示堿基序列中第1位到第1640位序列的DNA，(ii’)在嚴格條件下與具有(i’)堿基序列的DNA雜交，并編碼控制花粉發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子的DNA，或(iii’)(i’)或(ii’)的DNA片段中任一核酸，以及與上述核酸有效連接的啟動子的植物表達序列組合的步驟；提供具有控制花粉發(fā)育的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的植物細胞的步驟，其中，編碼內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的基因與上述核酸在嚴格條件下雜交；將表達序列組合導入植物細胞的步驟；將導入表達序列組合的植物細胞再生為植物體的步驟；以及對于再生的植物體，通過上述核酸的表達，篩選內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的表達受到抑制的植物體的步驟。
本發(fā)明的第三部分涉及制備雄性不育植物的方法，該方法包括以下步驟。提供含有(i”)具有序列號5所示堿基序列中第1位到第1948位序列的DNA，(ii”)在嚴格條件下與具有(i”)堿基序列的DNA雜交，并編碼控制花粉發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子的DNA，或(iii”)(i”)或(ii”)的DNA片段中任一核酸，以及與上述核酸有效連接的啟動子的植物表達序列組合的步驟；提供具有控制花粉發(fā)育的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的植物細胞的步驟，其中，編碼內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的基因與上述核酸在嚴格條件下雜交；將表達序列組合導入植物細胞的步驟；將導入表達序列組合的植物細胞再生為植物體的步驟；以及對于再生的植物體，通過上述核酸的表達，篩選內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的表達受到抑制的植物體的步驟。
但是，上述(ii)、(ii’)以及(ii”)的DNA均不包括(iv)與具有序列號13所示堿基序列中第1到第1886位序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼控制花粉發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子的DNA。序列號13所示的堿基序列是編碼從矮牽?；ㄖ蟹蛛x的其他轉(zhuǎn)錄因子ZPT3-2的cDNA序列(Kobayashi等，同上)。
本發(fā)明的上述第一到第三部分中的方法，可以作為賦予植物雄性不育性的方法加以利用。
在上述第一到第三部分的一個實施方式中，上述核酸相對于上述啟動子正向連接，在上述植物體的細胞內(nèi)可按有義方向轉(zhuǎn)錄。
在上述第一到第三部分的一個實施方式中，上述核酸相對于上述啟動子反向連接，在上述植物體的細胞內(nèi)可按反義方向轉(zhuǎn)錄。
在上述第一到第三部分的一個實施方式中，上述植物是雙子葉植物。雙子葉植物優(yōu)選茄科植物，更優(yōu)選矮牽牛屬植物。
在上述第一到第三部分的一個實施方式中，上述表達序列組合整合到植物表達載體中。
根據(jù)本發(fā)明的第一到第三部分，本發(fā)明還可提供采用上述任一項所述方法制備的雄性不育性植物。
本發(fā)明的第四部分涉及制備性狀改變的植物的方法，該方法包括以下步驟。提供包括含有(a’)具有序列號7所示堿基序列中第1位到第2624位序列的DNA，或(b’)具有(a’)的部分序列，并顯示小孢子特異性啟動子活性的DNA中任一DNA的啟動子，以及與上述啟動子有效連接的外源基因的植物表達序列組合的步驟；將表達序列組合導入植物細胞的步驟；以及將導入表達序列組合的植物細胞再生為植物體的步驟。
本發(fā)明的第五部分涉及制備性狀改變的植物的方法，該方法包括以下步驟。提供包括含有(a”)具有序列號8所示堿基序列中第1位到第3631位序列的DNA，或(b”)具有(a”)的部分序列，并顯示小孢子及任一花藥開裂組織特異性啟動子活性的DNA中任一DNA的啟動子，以及與上述啟動子有效連接的外源基因的植物表達序列組合的步驟；將表達序列組合導入植物細胞的步驟；以及將導入表達序列組合的植物細胞再生為植物體的步驟。
在上述第四到第五部分的一個實施方式中，上述的性狀是受育性，性狀改變的植物是雄性不育植物。因此，本發(fā)明的上述方法可以作為賦予植物雄性不育性的方法加以利用。
在上述第四到第五部分的一個實施方式中，上述性狀是親和性，性狀改變的植物是自交不親和性植物。因此，本發(fā)明的上述方法可以作為賦予植物自交不親和性的方法加以利用。
在上述第四到第五部分的一個實施方式中，上述植物是雙子葉植物。雙子葉植物優(yōu)選茄科植物，更優(yōu)選矮牽牛屬植物。
在上述第四到第五部分的一個實施方式中，上述表達序列組合整合到植物表達載體中。
根據(jù)本發(fā)明的第四和第五部分，本發(fā)明還可提供采用上述任一項所述方法制備的性狀改變的植物。
本發(fā)明的第六部分涉及含有以下(I’)或(II’)DNA的啟動子；(I’)具有序列號7所示堿基序列中第1位到第2624位序列的DNA，或(II’)具有(I’)的部分序列，并顯示小孢子特異性啟動子活性的DNA。
本發(fā)明的第七部分涉及含有以下(I”)或(II”)DNA的啟動子；(I”)具有序列號8所示堿基序列中第1位到第3631位序列的DNA，或(II”)具有(I”)的部分序列，并顯示小孢子及任一花藥開裂組織特異性啟動子活性的DNA。
本發(fā)明的第八部分涉及包括上述小孢子特異性的任一啟動子、以及與上述啟動子有效連接的外源基因的，用于賦予植物雄性不育性的植物表達序列組合。
附圖的簡單說明

圖1示出ZPT2-5編碼基因(以下，有時略做“ZPT2-5基因”)的cDNA序列，以及對應的氨基酸序列。2個鋅指基序及DLNL序列(氨基酸145位到155位)用下劃線示出。
圖2示出ZPT3-1編碼基因(以下，有時略做“ZPT3-1基因”)的cDNA序列，以及對應的氨基酸序列。3個鋅指基序及DLNL序列(氨基酸408位到417位)用下劃線示出。
圖3示出ZPT4-1編碼基因(以下，有時略做“ZPT4-1基因”)的cDNA序列，以及對應的氨基酸序列。4個鋅指基序及DLNL序列(氨基酸438位到449位)用下劃線示出。
圖4是用于表達ZPT2-5、ZPT3-1和ZPT4-1各cDNA序列的植物表達載體(pBIN-35S-ZPT2-5，pBIN-35S-ZPT3-1及pBIN-35S-ZPT4-1)的結構概略圖。
圖5示出ZPT3-1基因編碼區(qū)域的上游序列。轉(zhuǎn)錄起始位點(2567位)用粗箭頭示出，翻譯起始密碼(ATG)用粗下劃線示出。
圖6示出ZPT4-1基因編碼區(qū)域的上游序列。轉(zhuǎn)錄起始位點(3503位)用粗箭頭示出，翻譯起始密碼(ATG)用粗下劃線示出。
圖7是用于分析ZPT3-1和ZPT4-1基因啟動子的植物表達載體(pBIN-ZPT3-1-GUS及pBIN-ZPT3-1-GUS)的結構概略圖。
圖8是拍攝野生型矮牽?；ɑǚ酆蛯雙BIN-35S-ZPT2-5的矮牽?；?產(chǎn)生共抑制的轉(zhuǎn)化體)花粉得到的顯示生物形態(tài)的照片(倍率為400倍)。圖8(a)～(b)示出野生型矮牽?；ǖ幕ɡ僭诓煌L階段的花粉，圖8(e)～(h)示出共抑制轉(zhuǎn)化矮牽?；ǖ幕ɡ僭诓煌L階段的花粉?；ǚ劬凑粘Ｒ?guī)方法用DAPI(4’，6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride n-hydrate)進行染色。
圖9是拍攝野生型的矮牽?；ɑǚ酆蛯雙BIN-35S-ZPT3-1的矮牽?；ɑǚ鄣玫降娘@示生物形態(tài)的照片(倍率為700倍)。圖9(a)和(c)示出野生型矮牽?；ㄔ谒姆煮w期及小孢子期的花粉，圖9(b)和(d)示出轉(zhuǎn)化矮牽?；ㄔ谒姆煮w期及小孢子期的花粉。四分體期的花粉用DAPI，小孢子期的花粉用番紅，分別按照常規(guī)方法染色。此外，觀察到導入pBIN-35S-ZPT4-1的矮牽?；ɑǚ垡诧@示出和圖9(b)及(d)完全相同的形態(tài)。
圖10是拍攝導入pBIN-ZPT3-1-GUS和pBIN-ZPT4-1-GUS的矮牽牛花經(jīng)GUS染色后的花的器官得到的顯示生物形態(tài)的照片。拍攝對象均為花藥在單核期的花(花蕾)。圖10(a)和(d)示出的是花蕾的外觀實際尺寸，圖10(b)和(e)示出的是花藥在低倍率(40倍)時的截面圖、圖6(c)和(f)示出的是小孢子(圖6(c)的倍率為700倍)或花藥的開裂組織周圍(圖6(f)的倍率為200倍)在高倍率時的截面圖。
實施發(fā)明的最佳方式以下，對本發(fā)明進行更詳細的說明。(源自ZPT3-2、ZPT3-1和ZPT4-1基因的轉(zhuǎn)錄因子)本發(fā)明的第一到第三部分的制備雄性不育植物的方法中有用的核酸，為以下所示DNA中任意一種。
(i)具有序列號1所示堿基序列中第1位到777位序列的DNA，(i’)具有序列號3所示堿基序列中第1位到1640位序列的DNA，(ii’)具有序列號5所示堿基序列中第1位到1948位序列的DNA，或與具有(1)～(ii’)任一堿基序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼控制花粉發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子的DNA(即，(ii)、(ii’)或(ii”))，或上述任一DNA的片段(即，(iii)、(iii’)以及(iii”))。
本發(fā)明中上述核酸優(yōu)選(i)、(i’)或(i”)的DNA，即，編碼ZPT2-5、ZPT3-1或ZPT4-1的DNA或其片段，更優(yōu)選(i)、(i’)或(i”)的DNA。
本說明書中“轉(zhuǎn)錄因子”是指與基因的調(diào)節(jié)區(qū)域結合，并控制mRNA的合成的蛋白質(zhì)。已知某些轉(zhuǎn)錄因子在其DNA結合功能域具有稱之為鋅指(ZF)基序的保守性高的氨基酸序列。ZPT2-5是Cys2/His2型(EPF家族)的鋅指(ZF)蛋白質(zhì)，由176個氨基酸組成的全長氨基酸序列中含有2個ZF基序，并且是含有稱之為DLNL序列的疏水區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子。ZPT3-1同樣是EPF家族的ZF蛋白質(zhì)，由437個氨基酸組成的全長氨基酸序列中含有3個ZF基序，并且是含有DLNL序列的轉(zhuǎn)錄因子。ZPT4-1同樣也是EPF家族的ZF蛋白質(zhì)，由474國氨基酸組成的全長氨基酸序列中含有4個ZF基序，并且也是含有DLNL序列的轉(zhuǎn)錄因子。上述轉(zhuǎn)錄因子均可參照Kobayashi等的文獻(同上)。編碼ZPT2-5、ZPT3-1和ZPT4-1的cDNA序列(序列號1、3和5)，及與它們分別對應的推測氨基酸序列(序列號2、4和6)均示于圖1、2和3中。
本說明書中核酸或DNA的“片段”是指導入植物體中，并以適當?shù)男问奖磉_時，能夠抑制該植物的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的表達的片段。這類片段從上述(i)、(i’)、(i”)、(ii)、(ii’)或(ii”)DNA的鋅指基序編碼區(qū)域以外的區(qū)域選出，具有至少約40個堿基對以上，優(yōu)選約50個堿基對以上，更優(yōu)選約70個堿基對以上，最優(yōu)選約100個堿基對以上的長度。
本說明書雜交的“嚴格條件”是指與特定的堿基序列(例如，編碼來自矮牽?；ǖ腪PT2-5、ZPT3-1或ZPT4-1的DNA)、或與上述堿基序列同源性高的其他堿基序列(例如，存在于矮牽?；ㄒ酝庵参镏械?，編碼ZPT2-5、ZPT3-1或ZPT4-1同源物的DNA)形成寡核苷酸雙鏈所需的充分條件。作為本發(fā)明中適用的嚴格條件的代表例子，列如以下條件在含有1M NaCl、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、32P標記探針DNA(1×107cpm)及50μg/ml鮭魚精子DNA的溶液中，60℃雜交16小時后，用2×SSC/1％SDS反復2次在60℃、30分鐘的洗滌。
本發(fā)明中，為了分離編碼ZPT2-5、ZPT3-1或ZPT4-1的DNA，以及為了分離與上述DNA在嚴格條件下雜交，并編碼控制花粉發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子的DNA，可以用與已知轉(zhuǎn)錄因子基因編碼的氨基酸序列的保守區(qū)域相對應的簡并引物對。用此引物對，以植物的cDNA和基因組DNA為模板進行PCR后，將得到的擴增DNA片段用作探針，可以對相同植物的cDNA文庫或基因組文庫進行篩選。作為這種引物對的例子，例如5’-CARGCNYTNGGNGGNCAY-3’(序列號9)和5’-RTGNCCNCCNARNGCYTG-3’(序列號10)的組合(這里，N是肌苷，R是G或A，Y是C或T)。上述引物序列分別與上述ZPT轉(zhuǎn)錄因子組的鋅指基序中所含的氨基酸序列QALGGH對應。
進而，本發(fā)明中適用的嚴格雜交條件還可用作PCR的條件，代表性的例子中，可以應用上述簡并引物(序列號9和10)。此時的PCR反應條件可以是94℃變性5分鐘后，于94℃30秒、50℃30秒、然后72℃1分鐘共進行30個循環(huán)，最后在72℃保溫7分鐘。
PCR可以按照市售試劑盒及儀器制造商的指導進行，也可以按照業(yè)內(nèi)人士已知的辦法進行?；蛭膸斓闹苽浞椒ê突蚩寺》椒ǖ纫彩菢I(yè)內(nèi)人士所已知的方法。例如，參照Sambrook等的《分子克隆實驗指南》第2版(冷泉港實驗室，1989)。所得基因的堿基序列可以采用該領域內(nèi)公知的核苷酸序列分析方法或市售的自動測序儀進行確定。
本說明書中，轉(zhuǎn)錄因子“控制花粉發(fā)育”的代表性例子為該轉(zhuǎn)錄因子的表達受到抑制時，可以觀察到花粉的形態(tài)或功能產(chǎn)生明顯的改變。本發(fā)明中轉(zhuǎn)錄因子的代表性功能為，其編碼基因的表達受到抑制時，促使優(yōu)選約75％以上、更優(yōu)選約90％以上、進而優(yōu)選約95％以上的花粉細胞在成熟前死亡。其中，轉(zhuǎn)錄因子的表達受到抑制是指用Northern blot方法進行測定時，mRNA量與野生型對照植物相比為約1/10以下。
由上述篩選方法分離鑒定的基因所編碼的轉(zhuǎn)錄因子(即，ZPT2-5、ZPT3-1和ZPT4-1，以及它們的同源物)對花粉發(fā)育的控制，可以按照本說明書的內(nèi)容制備轉(zhuǎn)化植物，并通過觀察其花粉特性來進行確認。
本發(fā)明中，利用編碼控制花粉發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子的DNA，可以抑制植物細胞中含有該DNA同一或相同堿基序列的內(nèi)源性基因的表達。此時，成為標靶的內(nèi)源性基因也是控制花粉發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子。根據(jù)本發(fā)明的方法，優(yōu)選基本上不抑制控制花粉發(fā)育的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子以外的基因表達，而是僅選擇性地抑制內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的表達，進而賦予植物雄性不育性。
即，本發(fā)明中表達抑制技術適用的植物細胞是具有控制花粉發(fā)育的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的植物細胞。編碼此內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的基因的定義為，在嚴格條件下能夠和上述ZPT2-5、ZPT3-1或ZPT4-1，或者和它們的同源DNA雜交的基因。這里，“嚴格條件”的定義和上述ZPT2-5、ZPT3-1和ZPT4-1的同源物鑒定相關條件相同。通過上述方法賦予雄性不育性的植物最好是和分離出上述ZPT基因組的矮牽?；?、或分離出編碼上述ZPT同源物的基因的植物在進化系統(tǒng)學上近源的植物，但本發(fā)明并不局限于此。這里，進化系統(tǒng)學上近源的代表性例子是分類上歸于同一目，優(yōu)選歸于同一科，更優(yōu)選歸于同一屬，進而優(yōu)選歸于同一種的植物。進而，考慮到花粉發(fā)育為種子植物生殖所不可欠缺的因素，則很容易理解起到和ZPT2-5、ZPT3-1和ZPT4-1類似或相同功能的轉(zhuǎn)錄因子在其他植物中也是廣泛存在的。
抑制內(nèi)源性基因的表達的方法，代表性的可以利用共抑制或反義技術。共抑制是向植物細胞中導入重組基因時，抑制該基因本身和含有與該基因一部分相同的序列的內(nèi)源性基因兩者的表達。應用共抑制時，本發(fā)明的表達序列組合以相對于啟動子正向連接的形式含有編碼轉(zhuǎn)錄因子的DNA或其片段。編碼轉(zhuǎn)錄因子的DNA或其片段，以表達序列組合形式導入植物細胞后，在啟動子的控制下按有義方向進行轉(zhuǎn)錄。在該導入DNA的作用下，有可能抑制靶基因的表達。共抑制很多時候可在轉(zhuǎn)化植物的一部分個體中觀察到，而在其他個體中沒有充分起作用。因此，將基因表達按照所意愿的方式進行抑制的個體，通?？梢酝ㄟ^常規(guī)的程序進行篩選。
反義是指向植物細胞中導入重組基因時，導入基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(mRNA)與內(nèi)源性基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(mRNA)的互補序列形成雜交體，并阻礙內(nèi)源性基因編碼的蛋白質(zhì)的翻譯。應用反義技術時，本發(fā)明的表達序列組合以相對于啟動子反向連接的形式含有編碼轉(zhuǎn)錄因子的DNA或其片段。編碼轉(zhuǎn)錄因子的DNA或其片段，以表達序列組合形式導入植物細胞后，在啟動子的控制下按反義方向進行轉(zhuǎn)錄。在此反義轉(zhuǎn)錄物的作用下，有可能抑制靶基因的表達。(源自ZPT3-1和ZPT4-1基因的啟動子)本發(fā)明第四和第五部分的制備性狀改變的植物方法中有用的啟動子是含有(a’)具有序列號7所示堿基序列中第1位到第2624位序列的DNA，(a”)具有序列號8所示堿基序列中第1位到第3631位序列的DNA，或具有(a’)或(a”)的一部分序列，并顯示小孢子特異性啟動子活性的DNA中任一DNA的啟動子。本發(fā)明中上述啟動子優(yōu)選(a’)或(a”)啟動子，即，ZPT3-1或ZPT4-1基因的啟動子。
將ZPT3-1和ZPT4-1基因啟動子區(qū)域中對組織特異性表達活性非必需的序列除去后得到的、具有小孢子特異性啟動子活性的序列，包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這種序列可以按照常規(guī)方法進行啟動子的缺失實驗而得到。簡潔的方法為，可以使用融合了ZPT3-1或ZPT4-1基因啟動子區(qū)域的各種缺失變異體(例如，ZPT3-1或ZPT4-1基因啟動子區(qū)域從5’上游端起缺失各種長度的變異體)和適當?shù)膱蟾婊?例如，GUS基因)的質(zhì)粒，通過測定缺失變異體的組織特異性的啟動子活性來鑒定其活性所必須的區(qū)域。
鑒定出啟動子活性所必須的區(qū)域后，可再改變其區(qū)域內(nèi)的序列或相鄰序列來提高啟動子的表達活性程度。只要顯示出小孢子特異性的啟動子活性，這樣得到的改變體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明中“顯示小孢子特異性的啟動子活性”是指啟動子在天然植物中、或以與任一結構基因相連接的表達序列組合形式導入植物時，通過引發(fā)DNA的轉(zhuǎn)錄來指導基因表達的能力在小孢子中顯示出特異性。這里，“特異性”是指與同一植物體的花的其他所有組織(包括絨氈層、花絲、花柱、花序、花瓣、花萼等，但花藥的開裂組織除外)相比啟動子的表達活性高。上述特異性的啟動子優(yōu)選與相同植物體的花的其他所有組織和花以外的部分(根、莖、葉等)相比啟動子的表達活性高，更優(yōu)選在相同植物體的花的其他所有組織和花以外的部分基本上不顯示出活性?！帮@示花藥開裂組織的特異性啟動子活性”也和上述定義相同。表達活性的程度可以按照常規(guī)方法，通過比較小孢子中啟動子的表達水平和花的其他組織中同一啟動子的表達水平來進行評價。啟動子的表達水平，通常根據(jù)在此啟動子控制下表達的基因產(chǎn)物的產(chǎn)量來進行測定。
應用上述特異性啟動子的本發(fā)明的方法，其目的是改變與植物生殖相關的性狀。這里，“改變”是指轉(zhuǎn)化后的植物的至少一部分生殖器官，失去了轉(zhuǎn)化前的植物(野生種或者是園藝品種)所具備的功能、或獲得了轉(zhuǎn)化前的植物所不具備的功能、或與轉(zhuǎn)化前的植物相比特定功能的程度得到了增強或降低。這種性狀改變可作為與本發(fā)明啟動子有效連接的任意異源基因在導入該基因的轉(zhuǎn)化植物中，在啟動子的控制下特異性表達在小孢子中的結果而產(chǎn)生。已知很多組織特異性啟動子的組織特異性在不同種之間均可以得到保留，因此很容易理解本發(fā)明的啟動子也可以適用于廣泛的植物物種。性狀改變的程度，可以通過比較轉(zhuǎn)化后植物的性狀和轉(zhuǎn)化前植物的性狀來進行評價。作為優(yōu)選的性狀改變，例如雌性不育和自交不親合性，但并不僅限于此。
本發(fā)明的啟動子，例如通過將已知cDNA用作探針篩選植物的基因組文庫，然后從對應的基因組克隆分離編碼區(qū)上游序列來得到。作為cDNA的例子，例如上述源自矮牽?；ǖ霓D(zhuǎn)錄因子ZPT3-1和ZPT4-1的cDNA。
本發(fā)明的啟動子不僅限于天然分離得到的，也包括合成的多核苷酸。合成的多核苷酸，例如可以將上述序列已確定的啟動子序列或其活性區(qū)域通過業(yè)內(nèi)人士已知的方法進行合成或改變來得到。(表達序列組合和表達載體的構建)本發(fā)明中編碼轉(zhuǎn)錄因子的DNA可以采用業(yè)內(nèi)人士已知的方法，以與適宜的啟動子有效連接的表達序列組合形式，通過已知的基因重組技術導入植物細胞。同樣，本發(fā)明中小孢子特異性啟動子能夠以與與目的外源基因有效連接的表達序列組合形式導入植細胞。
能夠連接在上述轉(zhuǎn)錄因子的“啟動子”是指在植物中可進行表達的任一啟動子，包括組成型啟動子、組織特異性啟動子、誘導性啟動子等。
“組成型啟動子”是指與植物細胞內(nèi)外的刺激無關，以一定水平表達結構基因的啟動子。外源基因在植物的其他組織或器官中表達不會給植物帶來所不期望的性狀時，使用組成型啟動子較為簡便且理想。作為組成型啟動子的例子，例如花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子(P35S)、以及胭脂堿合成酶的啟動子(Tnos)，但不僅限于此。
“組織特異性啟動子”在本發(fā)明中指的是至少在小孢子中使結構基因特異性表達的啟動子。這種組織特異性啟動子除了本發(fā)明的ZPT3-1和ZPT4-1基因的啟動子之外，還包括顯示花藥特異性表達活性的其他已知的啟動子。因此，將含有小孢子特異性啟動子和轉(zhuǎn)錄因子編碼序列的天然ZPT3-1和ZPT4-1基因的表達序列組合本身根據(jù)需要與其他調(diào)節(jié)元件組合后使用的情況，也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
“誘導性啟動子”是指在給予化學試劑、物理應力等特定刺激時表達結構基因，在刺激不存在時不顯示表達活性的啟動子。作為誘導性啟動子的例子，例如用生長素可誘導的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)啟動子(van der Kop，D.A.等，Plant Mol.Biol.，39979，1999)，但不僅限于此。
本說明書，用語“表達序列組合”或“植物表達序列組合”是指含有本發(fā)明中編碼轉(zhuǎn)錄因子的DNA和與其有效(即，以能夠控制該DNA的表達的方式)連接的植物表達啟動子的核酸序列，以及含有本發(fā)明中小孢子特異性啟動子和與其有效(即，符合閱讀框)連接的外源基因的核酸序列。
能夠與上述小孢子特異性啟動子連接的“外源基因”是ZPT3-1和ZPT4-1基因以外的矮牽?；▋?nèi)源性基因、或在矮牽?；ㄒ酝庵参锏膬?nèi)源性基因、或植物以外的基因(例如，源自動物、昆蟲、細菌及真菌的基因)，即，其基因產(chǎn)物的表達是小孢子所期望的任一基因。本發(fā)明中外源基因的優(yōu)選例子，例如編碼的基因產(chǎn)物顯示細胞毒性，其表達導致花粉發(fā)育受到抑制的基因。這種基因的具體例子，例如barnase基因(Beals，T.P.和Goldberg，R.B.，Plant Cell 91527，1997)，但不僅限于此。
“植物表達載體”是指除了表達序列組合之外，還以在宿主植物細胞中可發(fā)揮作用的形式連接了各種調(diào)節(jié)元件的核酸序列。優(yōu)選包括終止子、抗藥性基因、增強子。植物表達載體的類型和使用的調(diào)節(jié)元件的種類可根據(jù)宿主細胞進行相應改變是業(yè)內(nèi)人士所熟知的事情。本發(fā)明中所用的植物表達載體還可含有T-DNA區(qū)域。T-DNA區(qū)域尤其是在用土壤桿菌屬轉(zhuǎn)化植物過程中，能夠提高基因的導入效率。
“終止子”是位于基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)域的下游，并參與DNA轉(zhuǎn)錄mRNA時的轉(zhuǎn)錄終止及附加多聚A序列過程的序列。已知終止子對維持mRNA穩(wěn)定性有用，而且還影響基因的表達量。作為終止子的例子，例如胭脂堿合成酶的終止子(Tnos)、花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S終止子，但并不僅限于此。
“抗藥性基因”是使轉(zhuǎn)化植物的篩選更容易進行的基因。優(yōu)選應用可賦予卡那霉素抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(NPTH)基因，以及可賦予潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因等，但不僅限于此。
本發(fā)明的植物表達載體可以使用業(yè)內(nèi)人士公知的基因重組技術制備。在植物表達載體的構建中，例如，可以優(yōu)選使用pBI系列的載體或pUC系列的載體，但不僅限于此。(轉(zhuǎn)化植物的制作)
象上述那樣構建的表達序列組合或含有表達序列組合的載體，可用公知的基因重組技術導入目的植物細胞。導入的表達序列組合整合在植物細胞的DNA中。這里，植物細胞中的DNA不僅包括染色體DNA，也包括植物細胞的各種器官(如線粒體、葉綠體)中含有的DNA。
在本說明書中，用語“植物”既包括單子葉植物，也包括雙子葉植物。優(yōu)選的植物是雙子葉植物。雙子葉植物可以包括分瓣花亞綱和合瓣花亞綱中任意一種。優(yōu)選的亞綱是合瓣花亞綱。合瓣花亞綱包括龍膽目、茄目、紫蘇目、朱櫻花目、車前目、風鈴草目、玄參目、茜草目、川續(xù)斷目和紫菀目中的任意一種。優(yōu)選的目是茄目。茄目包括茄科、田基麻科、花蔥科、菟絲子亞科和旋花科中的任意一種。優(yōu)選的科是茄科。茄科包括矮牽牛屬、曼陀羅屬、煙草屬、茄屬、番茄屬、辣椒屬、酸漿屬、枸杞屬等。優(yōu)選的屬是矮牽牛屬、曼陀羅屬和煙草屬，更優(yōu)選的屬是矮牽牛屬。矮牽牛屬包括P.hybrida種、P.axillaries種、P.inflata種和P.violacea種等。優(yōu)選的種是P.hybrida種。只要不特別說明，“植物”是指從帶有花的植物體和植物體得到的種子。
作為“植物細胞”的例子，如花、葉和根等植物器官中各個組織的細胞、愈傷組織以及懸浮培養(yǎng)細胞。
將植物表達載體導入植物細胞時，可以使用業(yè)內(nèi)人士公知的方法，例如借助于土壤桿菌的方法以及直接導入細胞的方法。作為借助于土壤桿菌的方法，例如可以使用Nagel等的方法(FEMS Microbiol.Lett.，67325(1990))。該方法是首先用植物表達載體(例如，通過電穿孔)轉(zhuǎn)化土壤桿菌，然后通過leaf disk法等已知的方法將被轉(zhuǎn)化的土壤桿菌導入植物細胞的方法。作為直接將植物表達載體導入細胞的方法，例如電穿孔法、土壤桿菌法、磷酸鈣法和聚乙二醇法等。這些方法在該領域內(nèi)是已知的，適于轉(zhuǎn)化植物的方法可由操作者適宜選擇。
導入了植物表達載體的細胞，例如能夠以卡那霉素抗性等抗藥性作為標準進行篩選。篩選出的細胞可以通過常規(guī)方法再生成植物體。
導入的植物表達載體是否能在再生的植物體中起作用，可以利用業(yè)內(nèi)人士公知的手法加以確認。例如，以抑制內(nèi)源性基因的表達為目的時，可通過利用Northern blot解析的轉(zhuǎn)錄水平測定來進行確認。這樣就可以篩選出內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子表達受到抑制的目的轉(zhuǎn)化植物體。在利用組織特異性啟動子表達外源基因時，通常也可以從靶組織提取RNA作為樣品，并通過Northern blot解析對外源基因的表達加以確認。
通過本發(fā)明的方法抑制內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的表達以及降低花粉的受育性，例如可以用含有編碼轉(zhuǎn)錄因子的DNA的表達載體轉(zhuǎn)化后，將所得植物的花粉形態(tài)根據(jù)需要進行組織化學染色，然后進行顯微鏡觀察來確認。
另外，通過本發(fā)明的方法使啟動子在小孢子中特異表達，例如可以通過用啟動子與GUS基因有效連接的表達載體轉(zhuǎn)化植物后，對于轉(zhuǎn)化所得植物包括花藥在內(nèi)的花的組織中GUS活性的分布，通過常規(guī)方法進行組織化學染色來進行確認。
實施例以下根據(jù)實施例對本發(fā)明進行說明。本發(fā)明的范圍并不限定在實施例。實施例中使用的限制酶、質(zhì)粒等可以由商業(yè)供給源獲得。實施例1含有編碼ZPT轉(zhuǎn)最因子組的多核苷酸的植物表達載體的構建將以往報道過的花藥特異性ZF基因(Kobayashi等，同上)中PEThyZPT2-5(ZPT2-5)、PEThyZPT3-1(ZPT3-1)及PEThyZPT4-1(ZPT4-1)的cDNA分別連接在花椰菜花葉病毒35S啟動子的下游，構建植物表達載體。具體的過程如下所述。(實施例1-1)將pBI221質(zhì)粒(由CLONTECH Laboratories Inc.購入)中含有花椰菜花葉病毒35S啟動子的DNA片段(HindIII-XbaI片段)及含有NOS終止子的DNA片段(SacI-EcoRI片段)依次插入到質(zhì)粒pUCAP(van Engelen，F(xiàn).A.等，Transgenic Res.，4288，1995)的多克隆位點中，制成pUCAP35S。另一方面，將含有ZPT2-5 cDNA的pBluescript載體在KpnI位點和SacI位點(均為載體中的位點)切斷，插入到上述pUCAP35S的KpnI和SacI位點之間。進而將該重組質(zhì)粒在EcoRI和HindIII位點切斷，將編碼ZPT2-5的DNA片段導入到二元載體pBINPLUS(van Engelen F.A.等，同上)的EcoRI和HindIII位點。構建的ZPT2-5基因如圖4(a)所示，由花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子區(qū)域(P35S，0.9kb)、編碼本發(fā)明ZPT2-5的多核苷酸(ZPT2-5，約0.8kb)及胭脂堿合成酶的終止子區(qū)域(Tnos，0.3kb)構成。圖4中的Pnos是胭脂堿合成酶的啟動子區(qū)域，NPTII是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II基因。(實施例1-2)將含有ZPT3-1 cDNA的pBluescript載體在KpnI位點和SacI位點(均為載體中的位點)切斷，插入到pUCAP35S的KpnI和SacI位點之間。進而將該重組質(zhì)粒在EcoRI和HindIII位點切斷，將編碼ZPT3-1的DNA片段導入到二元載體pBINPLUS的EcoRI和HindIII位點。構建的ZPT3-1基因如圖4(b)所示，由花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子區(qū)域(P35S，0.9kb)、編碼本發(fā)明ZPT3-1的多核苷酸(ZPT3-1，約1.7kb)及胭脂堿合成酶的終止子區(qū)域(Tnos，0.3kb)構成。(實施例1-3)將含有ZPT4-1 cDNA的pBluescript載體在KpnI位點和SacI位點(均為載體中的位點)切斷，插入到上述pUCAP35S的KpnI和SacI位點之間。進而將該重組質(zhì)粒在EcoRI和HindIII位點切斷，將編碼ZPT4-1的DNA片段導入到二元載體pBINPLUS的EcoRI和HindIII位點。構建的ZPT34-1基因如圖4(c)所示，由花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子區(qū)域(P35S，0.9kb)、編碼本發(fā)明ZPT4-1的多核苷酸(ZPT4-1，約2.0kb)及胭脂堿合成酶的終止子區(qū)域(Tnos，0.3kb)構成。實施例2ZPT3-1及ZPT4-1啟動子區(qū)域的分離、以及與GUS報告基因的連接將ZPT3-1及ZPT4-1 cDNA作為探針，從矮牽?；ǖ幕蚪MDNA文庫中分離出對應的基因組克隆，將轉(zhuǎn)錄起始點上游的DNA片段(啟動子區(qū)域，約2.7kb和約3.6kb)進行亞克隆。分別將各DNA片段連接到GUS報告基因的上游，并克隆到二元載體中。具體過程如下所述。(實施例2-1)
將ZPT3-1的cDNA用常規(guī)的隨機引物法(Sambrook等，同上)標記上[α-32P]dCTP，制作放射性標記探針。用此探針篩選在EMBL3載體(Stratagene制)中制作的矮牽?；?Petunia hybridavar.Mitchell)的基因組文庫。將得到的克隆中含有基因上游區(qū)域的約2.7kb的基因組DNA片段(PstI-SacI)亞克隆到pBluescriptSK載體的PstI-SacI位點中(pBS-ZPT3-1-PS)，進行堿基序列的測定(圖5)。接著，以此質(zhì)粒為模板，用含有SalI識別序列的引物(3’-TATGGAGCTCGTCGACAGTTGATGGTTCATTTTTCTGGCTATTGTC-5’，序列號11)和市售的M13-20引物進行PCR擴增，在ZPT3-1蛋白質(zhì)翻譯起始點的緊下游(堿基序號2661)導入SalI位點。然后，將在PstI和SalI切斷得到的DAN片段插入到pUCAPGUSNT的GUS編碼區(qū)域的上游(pUCAP-ZPT3-1-GUSNT)。由此，按照正確的閱讀框架在ZPT3-1基因編碼區(qū)的N末端附近區(qū)域連接上GUS編碼區(qū)。進而用AscI和PacI位點切斷pUCAP-ZPT3-1-GUSNT，將得到的DNA片段(含有ZPT3-1啟動子、GUS編碼區(qū)及NOS終止子)插入到pBINPLUS載體中，得到pBIN-ZPT3-1-GUS(圖7(a))。(實施例2-2)對于ZPT4-1也同樣分離基因組DNA，將含有ZPT4-1基因上游區(qū)域的約3.6kb的DNA片段(EcoRI-EcoRI)亞克隆到pBluescriptSK載體的EcoRI-EcoRI位點(pBS-ZPT4-1-EE)，進行堿基序列的測定(圖6)。以此質(zhì)粒為模板，用含有BamHI識別序列(3’-CATGGATATAGGATCCTATATC-5’，序列號12)的引物和M13-20引物進行PCR，在ZPT4-1蛋白質(zhì)翻譯起始點的緊下游(堿基序號3641)導入BamHI位點。然后，將用EcoRI和BamHI切斷得到的DAN片段插入到pUCAPGUSNT的GUS編碼區(qū)的上游(pUCAP-ZPT4-1-GUSNT)。由此，按照正確的閱讀框架在ZPT4-1基因編碼區(qū)的N末端附近區(qū)域連接上GUS編碼區(qū)。進而與上述同樣將DNA片段(AscI-PacI)插入到pBINPLUS載體中，得到pBIN-ZPT4-1-GUS(圖7(b))。實施例3各融合基因向矮牽牛花細胞中的導入上述各個表達載體按照以下順序，通過土壤桿菌的介導導入到矮牽?；?Petunia hybrida var.Mitchell)中。
(1)將根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404株(由CLONTECH Laboratories Inc.購入)在含有250mg/mL鏈霉素和50mg/mL利福平的L培養(yǎng)基中，于28℃進行培養(yǎng)，根據(jù)Nagel等(1990，同上)的方法調(diào)制細胞懸浮液，將實施例1和2中構建的質(zhì)粒載體用電穿孔法導入到上述菌株中。
(2)將編碼各融合基因的多核苷酸按照以下的方法導入到矮牽?；毎?。將上述(1)中得到的根癌土壤桿菌LBA4404株在YEB培養(yǎng)基(《DNA克隆第2卷》78頁，Glover D.M.編，IRL Press，1985)中振蕩培養(yǎng)(28℃，200rpm)。得到的培養(yǎng)液用滅菌水稀釋20倍，與矮牽牛花(Petunia hybrida var.Mitchell)的葉片共存培養(yǎng)。2～3天后，用含有抗生素的培養(yǎng)基除去上述細菌，每隔2周在選擇培養(yǎng)基中進行傳代培養(yǎng)，根據(jù)是否有來自上述5種融合基因一起導入的pBINPLUS的、NPTII基因表達產(chǎn)生的卡那霉素抗性，篩選出轉(zhuǎn)化的矮牽?；毎⒑Y選出的細胞按照常規(guī)方法誘導出愈傷組織后，再分化成植物體(Jorgensen R.A.等，Plant Mol.Biol.，31957，1996)。實施例4導入ZPT基因組的轉(zhuǎn)化矮牽?；ǖ谋硇陀脤雽嵤├?的載體得到的轉(zhuǎn)化體，通過觀察控制ZPT2-5、ZPT3-1及ZPT4-1的表達時產(chǎn)生的形態(tài)變化，研究了這些ZPT基因組cDNA的導入對植物產(chǎn)生的影響。具體的如下所述。(實施例4-1)由將ZPT2-5 cDNA在35S啟動子調(diào)控下導入的轉(zhuǎn)化體(14個個體)，通過Northern blot分析篩選出因共抑制導致基因表達受到抑制的個體(3個個體，另外，觀察到14個個體中其他4個個體產(chǎn)生了導入的ZPT2-5基因的過表達現(xiàn)象)。Northern blot分析的條件如下在含有7％SDS、50％甲酰胺、5×SSC、2％封閉試劑(Boehringer Mannheim制)、50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)、0.1％十二烷基硫酸鈉、50μg/mL酵母tRNA、及32P標記探針DNA(1×107cpm)溶液中，于68℃雜交16個小時后，用2×SSC/0.1％SDS在68℃洗滌30分鐘。
在上述共抑制轉(zhuǎn)化體3個個體中，觀察到了以下所示的表型(圖8)。
在四分體期之前產(chǎn)生的減數(shù)分裂過程中，正常的(野生型的)矮牽?；ㄓ捎谌旧|(zhì)的濃縮形成細絲狀結構(前期I的細線期)，接著同源染色體聯(lián)會(前期I的偶線期)。隨后進入中期I(metaphaseI)，4分體染色體排列在細胞赤道面上，然后，通過紡錘體同源染色體均等地分配到細胞的兩極。另一方面，在引起ZPT2-5基因共抑制的轉(zhuǎn)化體中，中期I時4分體染色體沒有準確地排列在細胞赤道面上，就進行了染色體的極分離。這時，向染色體兩極的分配明顯不均等。
在正常的減數(shù)分裂過程中，上述第一次染色體分離后，通過第二次染色體分離形成4個單倍體組，之后產(chǎn)生細胞質(zhì)分離。另一方面，在上述引起共抑制的轉(zhuǎn)化體中，第一次染色體分離之后立刻產(chǎn)生細胞質(zhì)分離和細胞分裂。此外，這種不均等的細胞分裂不僅進行1次，至少還要反復2次，并最多形成8個小孢子細胞。由于染色體的不均等分離，這些小孢子細胞中所含有的染色體數(shù)是不均一的，由此，細胞的大小也會顯著不均等。其結果，在正常矮牽?；ㄟM入到四分體期時，這些轉(zhuǎn)化體中形成比正常情況多的小孢子(最多8個)(圖8(f)，花蕾大小6mm時的ZPT2-5共抑制轉(zhuǎn)化體花粉細胞的照片。此外，也可參照圖9(b)四分體期的轉(zhuǎn)化體花粉細胞的照片)。
在共抑制轉(zhuǎn)化體中，小孢子的一部分(10％-20％)在隨后也會繼續(xù)發(fā)育，但大部分的小孢子細胞在包裹它們的胼胝質(zhì)層分解前就破裂了。在該階段不破裂繼續(xù)殘存的小孢子顯示出近乎于六面體的異常形態(tài)，與正常小孢子的4面體形態(tài)相比明顯不同。隨后，異常形態(tài)的小孢子通過表面看起來正常的有絲分裂，分裂成雙核并形成花粉粒，但這些花粉粒的受育性幾乎喪失。即，這些轉(zhuǎn)化體的花粉粒加到正常矮牽?；ǖ拇迫锷蠒r，顯示共抑制的3個系統(tǒng)的花粉完全不能形成種子，或只形成很少的種子(最多也只是10％，即，1株矮牽?；óa(chǎn)生的種子數(shù)以約10朵花的平均計，相當于對照組的1/10)。不顯示共抑制的轉(zhuǎn)化體3個系統(tǒng)的花粉中，經(jīng)確認可以形成與野生型對照植物同樣的正常種子。
上述共抑制轉(zhuǎn)化體形成雌性配子體時也表現(xiàn)異常，雌性受育性降低至正常個體的25-35％。即，胚珠(雌性配子體)的發(fā)育盡管在外觀上是正常的，但以野生型的花粉進行授粉后，過半數(shù)的胚珠不能受精，受精后的在以后的發(fā)育過程中也表現(xiàn)異常，多數(shù)死亡(abort)。但此時，也可觀察到不顯示共抑制的轉(zhuǎn)化體能夠形成和野生型對照植物同樣的正常雌性配子體。(實施例4-2)將ZPT3-1 cDNA在35S啟動子調(diào)控下導入時，15個個體中有3個個體表現(xiàn)出和導入ZPT2-5基因時同樣的性狀變化(圖9)。即，發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)化體在減數(shù)分裂過程中表現(xiàn)出和ZPT2-5完全相同的異常。并且，能夠發(fā)育至小孢子期的細胞數(shù)非常少，殘存的小孢子顯示出形態(tài)異常(6面體)。再者，成熟的花粉粒失去受育性。不過，與ZPT2-5的情況不同，這些個體的雌性受育性沒有受到影響。
在與實施例4-1相同的條件下進行Northern blot并分析基因表達的情況，結果在導入ZPT3-1基因的個體中，觀察到了ZPT3-1和ZPT4-1二者的基因表達受到抑制。兩個基因的結構類似性較高。即，編碼區(qū)所有堿基序列的同源性為37％，且在包括近鄰序列以使同源性最大化的前提下，將ZPT3-1的第2個ZF區(qū)域和ZPT4-1的第3個ZF區(qū)域、以及ZPT3-1的第3個ZF區(qū)域和ZPT4-1的第4個ZF區(qū)域在堿基序列水平分別進行比較時，同源性的平均值是86％(通過Clustal V程序進行序列比較)。因此，上述表達抑制現(xiàn)象極有可能是由于導入1個基因引起了2個基因的表達受到抑制(共抑制)而導致的。該結果說明這2個基因的功能重復，且與分別導入2基因后發(fā)生相同的表型變化結果是一致的。(實施例4-3)將ZPT4-1 cDNA在35S啟動子調(diào)控下導入時，13個個體中有2個表現(xiàn)出和導入ZPT2-5同樣的性狀變化。即，這些轉(zhuǎn)化體在減數(shù)分裂過程中表現(xiàn)出和ZPT2-5完全相同的異常。并且，能夠發(fā)育至小孢子期的細胞數(shù)非常少，殘存的小孢子顯示出形態(tài)異常(6面體)。再者，成熟的花粉粒幾乎完全失去受育性。但與ZPT3-1的情況相同，這些個體的雌性受育性沒有受到影響。根據(jù)上述的理由，在本實施例中也極有可能引起了ZPT3-1和ZPT4-1二者基因的表達抑制(共抑制)。
如上所述，通過導入編碼ZPT2-5、ZPT3-1或ZPT4-1的基因，能夠以極高的效率抑制花粉的發(fā)育，并使其受育性喪失(ZPT3-1為99％以上、ZPT2-5及ZPT4-1為90％以上)。此外，這些基因組的導入，其效應對于花粉(ZPT2-5的對象為花粉和雌性配子體)是特異性的，而從對植物的其他性狀沒有影響的特點出發(fā)，可以作為選擇性的性狀改變技術加以應用。實施例5ZPT3-1及ZPT4-1啟動子活性的組織特異性用導入實施例2的載體得到的轉(zhuǎn)化體，通過GUS活性進行組織化學性染色，檢測上述DNA片段具有的組織特異性啟動子活性。具體過程如下所述。(實施例5-1)采用將ZPT3-1基因上游區(qū)域和GUS的融合基因?qū)牒蟮玫降霓D(zhuǎn)化體的花，以X-GUS為底物研究GUS活性的分布(Gallagher，S.R.編，GUS protocolsusing the GUS gene as a reporter of gene expression，Academic Press，Inc.，pp.103-114，1992)。其結果，在單核期的小孢子中特異性地檢測到了GUS活性(圖10(a)～(c))。(實施例5-2)采用將ZPT4-1基因上游區(qū)域和GUS的融合基因?qū)牒蟮玫降霓D(zhuǎn)化體的花，按照上述同樣的方法研究GUS活性的分布。其結果，在單核期到雙核期的小孢子中及花藥開裂組織中特異性地檢測到了GUS活性(圖10(d)～(f)，花藥開裂組織在圖10(e)及(f)中用箭頭示出)。
如上所述，ZPT3-1及ZPT4-1基因啟動子在單核期的小孢子(ZPT3-1)中及在單核期到雙核期的小孢子(ZPT4-1)中分別顯示出了特異性的活性。ZPT4-1基因啟動子在單核期到雙核期的花藥開裂組織中也顯示出特異性活性。
小孢子是成熟后生成花粉粒的前體細胞。因此，這些啟動子可以作為與花粉發(fā)育相關的詳細研究中的有用的工具。并且，通過這些啟動子或其活性片段，將具有細胞毒性的基因等在小孢子中特異性表達，并促使花粉細胞死亡或使之喪失功能，可直接且有效地控制花粉的發(fā)育。
產(chǎn)業(yè)上的實用性利用編碼來自ZPT2-5、ZPT3-1及ZPT4-1基因的轉(zhuǎn)錄因子的DNA、以及來自ZPT3-1及ZPT4-1基因的啟動子的本發(fā)明方法作為采用基因工程學方法選擇性改變植物性狀的技術，特別是作為賦予雄性不育性狀的技術是極為有用的。
序列表<110>獨立行政法人農(nóng)業(yè)生物資源研究所(DIRECTOR GENERAL OF NATIONAL INSTITUTE OF AGROBIOLOGICAL RESOURCES，MINISTRYOF AGRICULTURE，F(xiàn)ORESTRY AND FISHERIES)<120>使用花粉特異性的鋅指轉(zhuǎn)錄因子基因降低花粉受育性的方法<130>AR019<140><141><160>14<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>777<212>DNA<213>雜交矮牽?；?Petunia hybrida)<220><221>CDS<222>(58)..(588)<400>1atcaaaacca aaattccttt ttcacaccga agaacagcct tagtatttca agaaaac57atg gtg gct cta tca acg aag aga gaa aga gaa gaa gat aac ttt tac 105Met Val Ala Leu Ser Thr Lys Arg Glu Arg Glu Glu Asp Asn Phe Tyr1 5 10 15agc ata aca acc atg gca aat tac ttg atg tta ctc tcg cgc caa gca 153Ser Ile Thr Thr Met Ala Asn Tyr Leu Met Leu Leu Ser Arg Gln Ala20 25 30aat gaa cat ttt gac aag aaa atg aac aac tca agt act agt cga gtt 201Asn Glu His Phe Asp Lys Lys Met Asn Asn Ser Ser Thr Ser Arg Val35 40 45ttc gag tgc aag act tgt aat cgc cag ttt tca tct ttt caa gca cta 249Phe Glu Cys Lys Thr Cys Asn Arg Gln Phe Ser Ser Phe Gln Ala Leu50 55 60ggt ggc cat aga gca agt cac aag aag cca aga tta atg gga gaa ttg 297Gly Gly His Arg Ala Ser His Lys Lys Pro Arg Leu Met Gly Glu Leu65 70 75 80cat aac ttg caa tta ttt cat gaa ttg cct aaa cgt aaa act cac gag 345His Asn Leu Gln Leu Phe His Glu Leu Pro Lys Arg Lys Thr His Glu85 90 95tgc tcc att tgt ggg ctt gag ttc gcc att ggg caa gct tta gga gga 393Cys Ser Ile Cys Gly Leu Glu Phe Ala Ile Gly Gln Ala Leu Gly Gly100 105 110cat atg aga agg cat aga gct gtg ata aat gat aaa aat ctt caa gct 441His Met Arg Arg His Arg Ala Val Ile Asn Asp Lys Asn Leu Gln Ala115 120 125cct gat gat caa cat gct cct gtc gtc aaa aaa gca aat ggt cgg aga 489Pro Asp Asp Gln His Ala Pro Val Val Lys Lys Ala Asn Gly Arg Arg130 135 140att ttg tcc ttg gat ttg aac ttg acg cca ttg gaa aat gac tta gag 537Ile Leu Ser Leu Asp Leu Asn Leu Thr Pro Leu Glu Asn Asp Leu Glu145 150 155 160ttt gat ttg cga aag agt aat act gct cct atg gtc gat tgc ttt tta 585Phe Asp Leu Arg Lys Ser Asn Thr Ala Pro Met Val Asp Cys Phe Leu165 170 175tga ttgaactttc cgtttcctta ttcttttctc ttcttctttt ggatattgta638tttattcatt aattgtagga gggataggaa gtcttatctt gtgtattagt actacatttt 698gcagattgta gaacgattag tttgtaactt atcatgatac ccgaaataca atactattta 758tatgattatt atactacac 777<210>2<211>176<212>PRT<213>雜交矮牽?；?Petunia hybrida)<400>2Met Val Ala Leu Ser Thr Lys Arg Glu Arg Glu Glu Asp Asn Phe Tyr1 5 10 15Ser Ile Thr Thr Met Ala Asn Tyr Leu Met Leu Leu Ser Arg Gln Ala20 25 30Asn Glu His Phe Asp Lys Lys Met Asn Asn Ser Ser Thr Ser Arg Val35 40 45Phe Glu Cys Lys Thr Cys Asn Arg Gln Phe Ser Ser Phe Gln Ala Leu50 55 60Gly Gly His Arg Ala Ser His Lys Lys Pro Arg Leu Met Gly Glu Leu65 70 75 80His Asn Leu Gln Leu Phe His Glu Leu Pro Lys Arg Lys Thr His Glu85 90 95Cys Ser Ile Cys Gly Leu Glu Phe Ala Ile Gly Gln Ala Leu Gly Gly100 105 110His Met Arg Arg His Arg Ala Val Ile Asn Asp Lys Asn Leu Gln Ala115 120 125Pro Asp Asp Gln His Ala Pro Val Val Lys Lys Ala Asn Gly Arg Arg130 135 140Ile Leu Ser Leu Asp Leu Asn Leu Thr Pro Leu Glu Asn Asp Leu Glu145 150 155 160Phe Asp Leu Arg Lys Ser Asn Thr Ala Pro Met VaI Asp Cys Phe Leu165 170 175<210>3<211>1640<212>DNA<213>雜交矮牽牛花(Petunia hybrida)<220><221>CDS<222>(95)..(1408)<400>3accggtccgg aattcccggg tcgacccacg cgtccggaaa ctttccttgt tgcactttaa 60tttatgttct agtgagtata ttagagagtg agaa atg gtg gac aat agc cag aaa 115Met Val Asp Asn Ser Gln Lys1 5aat gaa cca tca act gtt ata cac tat tgt aga gta tgt aaa agg gga 163Asn Glu Pro Ser Thr Val Ile His Tyr Cys Arg Val Cys Lys Arg Gly
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Pro Ile435 440
權利要求
1.制備雄性不育性植物的方法，該方法包括以下步驟提供含有(i)具有序列號1所示堿基序列中第1位到第777位序列的DNA，(ii)在嚴格條件下與具有(i)堿基序列的DNA雜交，并編碼控制花粉發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子的DNA，或(iii)(i)或(ii)的DNA片段中任一核酸，以及與該核酸有效連接的啟動子的植物表達序列組合的步驟；提供具有控制花粉發(fā)育的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的植物細胞的步驟，其中，編碼該內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的基因與該核酸在嚴格條件下雜交；將該表達序列組合導入該植物細胞的步驟；將該導入表達序列組合的植物細胞再生為植物體的步驟；以及對于該再生的植物體，通過該核酸的表達，篩選該內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的表達受到抑制的植物體的步驟；其中，上述(ii)的DNA不包括(iv)與具有序列號13所示堿基序列中第1位到第1886位序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼控制花粉發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子的DNA。
2.制備雄性不育性植物的方法，該方法包括以下步驟提供含有(i’)具有序列號3所示堿基序列中第1位到第1640位序列的DNA，(ii’)在嚴格條件下與具有(i’)堿基序列的DNA雜交，并編碼控制花粉發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子的DNA，或(iii’)(i′)或(ii’)的DNA片段中任一核酸，以及與該核酸有效連接的啟動子的植物表達序列組合的步驟；提供具有控制花粉發(fā)育的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的植物細胞的步驟，其中，編碼該內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的基因與該核酸在嚴格條件下雜交；將該表達序列組合導入該植物細胞的步驟；將該導入表達序列組合的植物細胞再生為植物體的步驟；以及對于該再生的植物體，通過該核酸的表達，篩選該內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的表達受到抑制的植物體的步驟；其中，上述(ii’)的DNA不包括(iv)與具有序列號13所示堿基序列中第1位到第1886位序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼控制花粉發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子的DNA。
3.制備雄性不育性植物的方法，該方法包括以下步驟提供含有(i”)具有序列號5所示堿基序列中第1位到第1948位序列的DNA，(ii”)在嚴格條件下與具有(i”)堿基序列的DNA雜交，并編碼控制花粉發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子的DNA，或(iii”)(i”)或(ii”)的DNA片段中任一核酸，以及與該核酸有效連接的啟動子的植物表達序列組合的步驟；提供具有控制花粉發(fā)育的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的植物細胞的步驟，其中，編碼該內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的基因與該核酸在嚴格條件下雜交；將該表達序列組合導入該植物細胞的步驟；將該導入表達序列組合的植物細胞再生為植物體的步驟；以及對于該再生的植物體，通過該核酸的表達，篩選該內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的表達受到抑制的植物體的步驟；其中，上述(ii’)的DNA不包括(iv)與具有序列號13所示堿基序列中第1位到第1886位序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼控制花粉發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子的DNA。
4.權利要求1至3任一項所述的方法，其中，上述核酸相對于上述啟動子正向連接，在上述植物體的細胞內(nèi)可按有義方向轉(zhuǎn)錄。
5.權利要求1至3任一項所述的方法，其中，上述核酸相對于上述啟動子反向連接，在上述植物體的細胞內(nèi)可按反義方向轉(zhuǎn)錄。
6.權利要求1至3任一項所述的方法，其中，上述植物為雙子葉植物。
7.權利要求6所述的方法，其中，上述植物為茄科植物。
8.權利要求7所述的方法，其中，上述植物為矮牽牛屬植物。
9.權利要求1至3任一項所述的方法，其中，上述表達序列組合整合到植物表達載體中。
10.雄性不育植物，它是由權利要求1至9任一項所述的方法制備的。
11.賦予植物雄性不育性的方法，該方法包括以下步驟提供含有(i)具有序列號1所示堿基序列中第1位到第777位序列的DNA，(ii)在嚴格條件下與具有(i)堿基序列的DNA雜交，并編碼控制花粉發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子的DNA，或(iii)(i)或(ii)的DNA片段中任一核酸，以及與該核酸有效連接的啟動子的植物表達序列組合的步驟；提供具有控制花粉發(fā)育的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的植物細胞的步驟，其中，編碼該內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的基因與該核酸在嚴格條件下雜交；將該表達序列組合導入該植物細胞的步驟；將該導入表達序列組合的植物細胞再生為植物體的步驟；以及對于該再生的植物體，通過該核酸的表達，篩選該內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的表達受到抑制的植物體的步驟；其中，上述(ii)的DNA不包括(iv)與具有序列號13所示堿基序列中第1位到第1886位序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼控制花粉發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子的DNA。
12.賦予植物雄性不育性的方法該方法包括以下步驟提供含有(i’)具有序列號3所示堿基序列中第1位到第1640位序列的DNA，(ii’)在嚴格條件下與具有(i’)堿基序列的DNA雜交，并編碼控制花粉發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子的DNA，或(iii’)(i’)或(ii’)的DNA片段中任一核酸，以及與該核酸有效連接的啟動子的植物表達序列組合的步驟；提供具有控制花粉發(fā)育的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的植物細胞的步驟，其中，編碼該內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的基因與該核酸在嚴格條件下雜交；將該表達序列組合導入該植物細胞的步驟；將該導入表達序列組合的植物細胞再生為植物體的步驟；以及對于該再生的植物體，通過該核酸的表達，篩選該內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的表達受到抑制的植物體的步驟；其中，上述(ii’)的DNA不包括(iv)與具有序列號13所示堿基序列中第1位到第1886位序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼控制花粉表達的轉(zhuǎn)錄因子的DNA。
13.賦予植物雄性不育性的方法該方法包括以下步驟提供含有(i”)具有序列號5所示堿基序列中第1位到第1948位序列的DNA，(ii”)在嚴格條件下與具有(i”)堿基序列的DNA雜交，并編碼控制花粉發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子的DNA，或(iii”)(i”)或(ii”)的DNA片段中任一核酸，以及與該核酸有效連接的啟動子的植物表達序列組合的步驟；提供具有控制花粉發(fā)育的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的植物細胞的步驟，其中，編碼該內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的基因與該核酸在嚴格條件下雜交；將該表達序列組合導入該植物細胞的步驟；將該導入表達序列組合的植物細胞再生為植物體的步驟；以及對于該再生的植物體，通過該核酸的表達，篩選該內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的表達受到抑制的植物體的步驟；其中，上述(ii”)的DNA不包括(iv)與具有序列號13所示堿基序列中第1位到第1886位序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼控制花粉發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子的DNA。
14.制備性狀改變的植物的方法，該方法包括以下步驟提供包括含有(a’)具有序列號7所示堿基序列中第1位到第2624位序列的DNA，或(b’)具有(a’)的部分序列，并顯示小孢子特異性啟動子活性的DNA中任一DNA的啟動子，以及與該啟動子有效連接的外源基因的植物表達序列組合的步驟；將該表達序列組合導入植物細胞的步驟；以及將該導入表達序列組合的植物細胞再生為植物體的步驟。
15.制備性狀改變的植物的方法，該方法包括以下步驟提供包括含有(a”)具有序列號8所示堿基序列中第1位到第3631位序列的DNA，或(b”)具有(a”)的部分序列，并顯示小孢子及任一花藥開裂組織特異性啟動子活性的DNA中任一DNA的啟動子，以及與該啟動子有效連接的外源基因的植物表達序列組合的步驟；將該表達序列組合導入植物細胞的步驟；以及將該導入表達序列組合的植物細胞再生為植物體的步驟。
16.權利要求14或15所述的方法，其中，上述性狀為受育性，性狀改變的植物為雄性不育植物。
17.權利要求14或15所述的方法，其中，上述性狀為親和性，性狀改變的植物為自交不親和性植物。
18.權利要求14或15所述的方法，其中，上述植物為雙子葉植物。
19.權利要求18所述的方法，其中，上述植物為茄科植物。
20.權利要求19所述的方法，其中，上述植物為矮牽牛屬植物。
21.權利要求14或15所述的方法，其中，上述表達序列組合整合到植物表達載體中。
22.性狀改變的植物，它是由權利要求14至21任一項所述的方法制備的。
23.賦子植物雄性不育性的方法，該方法包括以下步驟提供包括含有(a’)具有序列號7所示堿基序列中第1位到第2624位序列的DNA，或(b’)具有(a’)的部分序列，并顯示小孢子特異性啟動子活性的DNA中任一DNA的啟動子，以及與該啟動子有效連接的外源基因的植物表達序列組合的步驟；將該表達序列組合導入植物細胞的步驟；以及將該導入表達序列組合的植物細胞再生為植物體的步驟。
24.賦予植物雄性不育性的方法，該方法包括以下步驟提供包括含有(a”)具有序列號8所示堿基序列中第1位到第3631位序列的DNA，或(b”)具有(a”)的部分序列，并顯示小孢子及任一花藥開裂組織特異性啟動子活性的DNA中任一DNA的啟動子，以及與該啟動子有效連接的外源基因的植物表達序列組合的步驟；將該表達序列組合導入植物細胞的步驟；以及將該導入表達序列組合的植物細胞再生為植物體的步驟。
25.含有以下(I’)或(II’)DNA的啟動子(I’)具有序列號7所示堿基序列中第1位到第2624位序列的DNA，或(II’)具有(I’)的部分序列，并顯示小孢子特異性啟動子活性的DNA。
26.含有以下(I”)或(II”)DNA的啟動子(I”)具有序列號8所示堿基序列中第1位到第3631位序列的DNA，或(II”)具有(I”)的部分序列，并顯示小孢子及任一花藥開裂組織特異性啟動子活性的DNA。
27.包括權利要求25或26所述的啟動子、以及與該啟動子有效連接的外源基因的，用于賦予植物雄性不育性的植物表達序列組合。
全文摘要
本發(fā)明提供制備雄性不育性植物的方法，該方法是利用含有作為編碼源自矮牽?；ǖ匿\指型轉(zhuǎn)錄因子組(ZPT2－5、ZPT3－1和ZPT4－1)的DNA的核酸、以及與該核酸有效連接的啟動子的植物表達序列組合制備雄性不育植物的方法。此外，本發(fā)明還提供利用含有源自ZPT3－1和ZPT4－1基因的啟動子、以及與該啟動子有效連接的外源基因的植物表達序列組合制備性狀改變的植物的方法。
文檔編號C12N15/82GK1461187SQ99817080
公開日2003年12月10日 申請日期1999年11月19日 優(yōu)先權日1999年11月19日
發(fā)明者S·卡普爾, 小林晃, 高辻博志 申請人:獨立行政法人農(nóng)業(yè)生物資源研究所, 生物系特定產(chǎn)業(yè)技術研究推進機構