專利名稱：在酵母中生產(chǎn)l－乳酸的方法與材料的制作方法
本申請(qǐng)要求對(duì)2002年5月30提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/384,333的優(yōu)先權(quán)。
本發(fā)明得到了美國(guó)政府的支持，由能源部資助，合同號(hào)為DE-FC-36-00GO10598。美國(guó)政府在本發(fā)明中有一定的權(quán)利。
背景技術(shù)：
乳酸具有廣泛的工業(yè)適用性，包括在化學(xué)加工和合成、化妝品、制藥、塑料和食品生產(chǎn)中的用途。大多數(shù)工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)乳酸的方法都是發(fā)酵法。這些發(fā)酵方法使用不同的產(chǎn)乳酸細(xì)菌。
最近的研究探索了重組酵母株在乳酸發(fā)酵方法中的用途。重組酵母與細(xì)菌發(fā)酵相比可能有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。一些酵母株更能耐受較高的溫度。這可能允許更高溫度的發(fā)酵，這可以翻譯成更快的發(fā)酵速度。對(duì)高溫的更好的耐受性能夠使清除發(fā)酵培養(yǎng)基的污染微生物變得更加容易，因?yàn)橹恍鑼⑴囵B(yǎng)基加熱到希望的種能夠耐受而不希望的種死亡的溫度。產(chǎn)乳酸細(xì)菌，如乳酸桿菌，其高效生產(chǎn)需要復(fù)雜的發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基的復(fù)雜性增加了原料的成本，并且使得從培養(yǎng)基中分離乳酸更加困難且昂貴。使用重組酵母，通過使用簡(jiǎn)化的發(fā)酵培養(yǎng)基，提供了降低成本的可能性。
另外，有些酵母株比產(chǎn)乳酸細(xì)菌更能耐受降低的pH條件。這可能是一個(gè)非常重要的特征，因?yàn)楫?dāng)乳酸產(chǎn)生時(shí)，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH自然下降。在常規(guī)方法中，必須使用一種堿，如氫氧化鈣或碳酸鈣，來緩沖培養(yǎng)基，使其pH約為5-8。它中和酸，形成一種乳酸鹽。這種乳酸鹽在隨后的步驟中必須分開，以便以希望的酸的形式回收乳酸鹽。因此，需要緩沖發(fā)酵培養(yǎng)基導(dǎo)致增加原材料(緩沖劑，一般是硫酸，用來分解乳酸鹽)、其它處理步驟(再生游離酸)和廢物(最常見的是鹽分解步驟產(chǎn)生的碳酸鈣)處理等明顯的額外費(fèi)用。如果發(fā)酵能夠在低pH下進(jìn)行，則這些費(fèi)用能夠明顯減少。因此，成功開發(fā)能夠耐受低pH培養(yǎng)基的產(chǎn)乳酸株是非常希望的。
Porro及同事構(gòu)建了一種產(chǎn)乳酸酵母，構(gòu)建方法是將一種外源LDH(乳酸脫氫酶)基因插入釀酒酵母(S.cerevisiae)、乳酸克魯維酵母(K.lactic)、T.delbrueckii和Z.bailii種的酵母細(xì)胞內(nèi)，并破壞細(xì)胞的天然丙酮酸途徑。參見Porro等人，“用于生產(chǎn)乳酸的代謝工程釀酒酵母細(xì)胞的研發(fā)”，Biotechnol.Prog.1995 May-Jun；11(3)294-8；Porro等人，“為了由工程酵母大規(guī)模生產(chǎn)乳酸，一種代謝途徑的替換”，App.Environ.Microbiol.1999 Sep65(9)4211-5；Bianchi等人，“用異源LDH基因轉(zhuǎn)化的丙酮酸利用缺陷的乳酸克魯維酵母株的高效同型乳酸發(fā)酵”，App.Environ.Microbiol.2001 Dec；67(12)5621-5。Porro能夠生產(chǎn)一種產(chǎn)乳酸的重組酵母，但是該菌株的表現(xiàn)幾乎不足以在任何工業(yè)化生產(chǎn)過程中使用。為了獲準(zhǔn)在工業(yè)環(huán)境中使用，該菌株必須有良好的乳酸收率(即底物向乳酸的高轉(zhuǎn)化率)和高生產(chǎn)率(即底物向乳酸的快速代謝)。該酵母優(yōu)選地能夠耐受含有高滴度乳酸的培養(yǎng)基。
最近，Rajgarhia及同事生產(chǎn)了比Porro的酵母顯示更高收率和生產(chǎn)率的重組酵母。參見，例如WO 00/71738、WO 02/42471和PCT/US02/16223。然而，希望產(chǎn)生收率和/或生產(chǎn)率進(jìn)一步提高的重組酵母。具體而言，希望產(chǎn)生一種重組酵母株，它在有利于乳酸生產(chǎn)的厭氧和/或微需氧條件下以良好的收率和生產(chǎn)率產(chǎn)生乳酸。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明是將外源乳酸脫氫酶基因整合到酵母細(xì)胞內(nèi)的一種方法，其中在整合之前，該細(xì)胞在其基因組的一個(gè)基因座處具有一個(gè)靶定的基因，該方法包括下列步驟(a)用一種重組核酸轉(zhuǎn)化該細(xì)胞，該核酸含有乳酸脫氫酶(LDH)基因、LDH基因上游(即5’)和下游(即3’)的側(cè)翼序列和至少一個(gè)選擇性標(biāo)記基因，該側(cè)翼序列與靶定的基因上游和下游的側(cè)翼序列同源，其中LDH基因插入細(xì)胞基因組內(nèi)，與靶定的基因的基因座相鄰，(b)通過在選擇劑存在下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，獲得第一種轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其含有LDH基因和選擇性標(biāo)記基因，(c)在非選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述第一種轉(zhuǎn)化細(xì)胞，和(d)由所述第一種轉(zhuǎn)化細(xì)胞獲得第二種轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其含有LDH基因，但是刪除了選擇性標(biāo)記基因和靶定的基因。在優(yōu)選的酵母細(xì)胞中，靶定的基因有利地是丙酮酸脫羧酶(PDC)、醇脫氫酶(ADH)、乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶(ura3)和3-異丙基蘋果酸脫氫酶(leu2)。
在本發(fā)明的這一方面，選擇性標(biāo)記基因和靶定的基因的刪除在一定比例的第一種轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)自發(fā)發(fā)生。結(jié)果，插入的LDH與功能啟動(dòng)子和終止序列有效連接，后者與靶基因的啟動(dòng)子和終止序列同源。
本發(fā)明的第二方面是用于轉(zhuǎn)化一個(gè)酵母種的細(xì)胞的一種重組核酸，它含有至少一個(gè)選擇性標(biāo)記和對(duì)于該酵母種外源的LDH基因，其與LDH基因上游(5’)和下游(3’)的側(cè)翼序列連接，該側(cè)翼序列分別與對(duì)于該酵母種天然的一種基因的上游和下游側(cè)翼序列同源。
本發(fā)明的第三方面是一個(gè)酵母種的一種重組細(xì)胞，其中該酵母種在其基因組的一個(gè)基因座處含有一個(gè)天然的靶定的基因。該重組細(xì)胞含有外源乳酸脫氫酶(LDH)基因，該基因整合到基因組內(nèi)的靶定的基因位點(diǎn)處，且該靶定的基因已經(jīng)刪除。整合的LDH基因與功能啟動(dòng)子和終止序列有效連接，后者與靶定的基因的啟動(dòng)子和終止序列同源。這些重組酵母細(xì)胞在發(fā)酵方法中使用時(shí)，顯示出人意料地高的由碳水化合物底物產(chǎn)生乳酸的收率，以及高生產(chǎn)率。該重組細(xì)胞也能夠產(chǎn)生高滴度的乳酸。盡管本發(fā)明不局限于任何理論，但是認(rèn)為在天然基因的基因座處插入LDH基因，以及使用如此處所述的天然啟動(dòng)子和終止子，能夠使細(xì)胞利用現(xiàn)有的基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)，并且使插入的LDH基因起作用。眾所周知，當(dāng)細(xì)胞處于厭氧或微需氧發(fā)酵條件下時(shí)，非常有利于產(chǎn)生乳酸的代謝途徑。因此，本發(fā)明的第四方面是將碳水化合物發(fā)酵為乳酸的一種方法，包括在發(fā)酵條件下在含有可被該細(xì)胞發(fā)酵的碳水化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生的細(xì)胞。
本發(fā)明的第五方面是馬克斯克魯維酵母種的一種細(xì)胞，其具有整合到其基因組內(nèi)的多個(gè)外源乳酸脫氫酶基因，每個(gè)基因都在功能啟動(dòng)子和終止序列的控制之下，其中該馬克斯克魯維酵母細(xì)胞的基因組還含有一個(gè)功能丙酮酸脫羧酶基因。令人驚訝的是，使用這種細(xì)胞獲得極高的乳酸生產(chǎn)率和收率，以及出乎意料地低的乙醇收率，甚至在低pH發(fā)酵條件下仍然如此。本發(fā)明不局限于任何理論，認(rèn)為通過使PDC途徑保持完整，該細(xì)胞能夠更好地利用現(xiàn)有的代謝途徑使其代謝過程保持平衡，有利于細(xì)胞的總體健康和生存力。因此，本發(fā)明的第六方面是將碳水化合物發(fā)酵為乳酸的一種方法，包括在發(fā)酵條件下在含有可被該細(xì)胞發(fā)酵的碳水化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得的細(xì)胞。
根據(jù)以下某些優(yōu)選實(shí)施方案和權(quán)利要求書的更詳細(xì)描述，本發(fā)明的具體的優(yōu)選實(shí)施方案將易于理解。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是顯示pNC2質(zhì)粒的圖。
圖2是顯示pNC4質(zhì)粒的圖。
圖3是顯示pVR22質(zhì)粒的圖。
圖4是顯示pVR29質(zhì)粒的圖。
圖5是顯示由pPS1質(zhì)粒和pNC14質(zhì)粒構(gòu)建pPS9質(zhì)粒的圖。
圖6是顯示pVR39質(zhì)粒的圖，其含有瑞士乳桿菌L-LDH基因和G418抗性標(biāo)記。
圖7是顯示pVR1質(zhì)粒的圖，其含有瑞士乳桿菌L-LDH編碼基因序列、釀酒酵母pTEF1啟動(dòng)子和大腸桿菌EM7啟動(dòng)子。
圖8是顯示pSO18質(zhì)粒的圖。
圖9是顯示pSO19質(zhì)粒的圖。
圖10是顯示pSO20質(zhì)粒的圖。
圖11是顯示pVR41質(zhì)粒的圖，其含有瑞士乳桿菌L-LDH基因和G418抗性標(biāo)記。
圖12是顯示pCA3質(zhì)粒的圖，其含有巨大芽孢桿菌L-LDH基因和G418選擇性標(biāo)記。
圖13是顯示pVR24質(zhì)粒的圖。
圖14是顯示pVR38質(zhì)粒的圖，其含有巨大芽孢桿菌L-LDH基因和潮霉素抗性基因。
圖15a是顯示pBH5a質(zhì)粒構(gòu)建的圖。
圖15b是顯示由pVR29和pBH5a質(zhì)粒構(gòu)建pBH5b質(zhì)粒的圖。
圖16是顯示pBH8質(zhì)粒的圖。
圖17A和17B是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，可能與外源LDH基因定向整合到酵母染色體內(nèi)有關(guān)的遺傳事件的示意圖。
發(fā)明詳述在本發(fā)明的前兩個(gè)方面，一種外源LDH基因整合到酵母細(xì)胞的基因組內(nèi)，位于靶定的天然基因的基因座處，且該靶定的天然基因已經(jīng)刪除。該外源LDH基因與一個(gè)啟動(dòng)子序列和一個(gè)終止序列有效連接，這兩種序列分別與該靶定的基因的啟動(dòng)子和終止序列同源。
對(duì)于本發(fā)明，如果一種基因、啟動(dòng)子或終止子(1)未在未修飾細(xì)胞的基因組內(nèi)發(fā)現(xiàn)，并且(2)不與未修飾細(xì)胞的基因組內(nèi)存在的遺傳物質(zhì)同源，則認(rèn)為它們是“外源的”。在此使用時(shí)，一種基因、終止子或啟動(dòng)子如果在該酵母種的未修飾細(xì)胞的基因組內(nèi)發(fā)現(xiàn)(除了不影響其功能的個(gè)體-個(gè)體突變之外)，則它們對(duì)于該酵母種是“天然的”。
一種基因、啟動(dòng)子、終止子或其它基因組物質(zhì)，如果在核苷酸序列上與其它遺傳物質(zhì)相同，即具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或約99％的同一性，或者如果不同，而是與之足夠相似，從而保持其功能，則認(rèn)為該基因、啟動(dòng)子、終止子或其它基因組物質(zhì)與其它遺傳物質(zhì)“同源”。因此，甚至如果遺傳物質(zhì)例如由于點(diǎn)突變、堿基對(duì)的缺失或添加而含有不同，只要這些突變、缺失或添加不影響該遺傳物質(zhì)的功能，則認(rèn)為它們是“同源的”。對(duì)于側(cè)翼序列，如果該序列與天然基因的側(cè)翼序列足夠相似，以致側(cè)翼序列均能夠參與與天然基因側(cè)翼序列的單交換事件，則同源性是確定的。
如本領(lǐng)域所知，術(shù)語(yǔ)“同一性”是指兩種或多種多肽分子或兩種或多種核酸分子的序列之間的關(guān)系，通過比較它們的序列確定。在本領(lǐng)域中，“同一性”也指核酸分子或多肽之間的序列相關(guān)性(relatedness)的程度，視情況不同，根據(jù)兩種或多種核苷酸串或兩種或多種氨基酸序列之間的匹配確定。“同一性”決定兩種或多種序列中的較小序列與通過具體數(shù)學(xué)模型或計(jì)算機(jī)程序(即“算法”)進(jìn)行的缺口比對(duì)(如果有的話)之間相同匹配的百分比。
術(shù)語(yǔ)“相似性”在本領(lǐng)域中用于一種相關(guān)的概念，但是與“同一性”不同，“相似性”是指相關(guān)性的量度，包括相同的匹配和保守置換匹配。如果兩種多肽序列例如有10/20個(gè)相同的氨基酸，并且其余的都是非保守置換，則百分同一性和相似性都是50％。如果在同一個(gè)實(shí)例中，有5個(gè)以上的位點(diǎn)是保守置換，則百分同一性仍為50％，但是百分相似性將是75％(15/20)。因此，在保守置換的情況下，兩種多肽之間的百分相似性將高于這兩種多肽之間的百分同一性。
相關(guān)核酸和多肽的同一性和相似性能夠用已知的方法容易地計(jì)算。這些方法包括但不限于以下所述《計(jì)算分子生物學(xué)》(Lesk，A.M.編著)，1988，Oxford University Press，New York；《生物計(jì)算信息學(xué)和基因組計(jì)劃》(Smith，D.W.編著)，1993，Academic Press，New York；《序列數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)分析》，第1部分(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.編著)，1994，Humana Press，New Jersey；von Heinje，G.，《分子生物學(xué)中的序列分析》，1987，Academic Press；《序列分析引物》(Gribskov，M.和Devereux，J.編著)，1991，M.Stockton Press，New York；Carillo等人，1988，SIAMJ.Applied Math.，481073；Durbin等人，1998，《生物序列分析》，Cambridge University Press。
確定同一性的優(yōu)選方法是用來獲得所測(cè)序列之間的最大匹配。確定同一性的方法在可以公開獲得的計(jì)算機(jī)程序中描述。測(cè)定兩種序列之間同一性的優(yōu)選計(jì)算機(jī)程序方法包括但不限于GCG程序包，包括GAP(Devereux等人，1984，Nucl.Acid.Res.，12387；遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)小組(Genetics Computer Group)，University of Wisconsin，Madison，WI)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.，215403-410)。BLASTX程序可以從國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)和其它來源(BLAST手冊(cè)，Altschul等人.NCB/NLM/NIH Bethesda，MD20894；Altschul等人，1990，同上)公開獲得。也可以利用眾所周知的Smith Waterman算法確定同一性。
用于比對(duì)兩種氨基酸或多核苷酸序列的某些算法可以使兩個(gè)序列只有一個(gè)短區(qū)匹配，這個(gè)小比對(duì)區(qū)可能具有極高的序列同一性，盡管這兩個(gè)全長(zhǎng)序列之間沒有明顯的關(guān)系。因此，在某些實(shí)施方案中，選擇的比對(duì)方法(GAP程序)將使比對(duì)覆蓋靶多肽的至少50個(gè)連續(xù)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，這種比對(duì)能夠包含靶多肽的至少60、70、80、90、100、110或120個(gè)氨基酸。如果利用GAP比對(duì)多核苷酸，則這種比對(duì)能夠覆蓋至少約100、150或200個(gè)核苷酸，它們可能是連續(xù)的。
例如，利用計(jì)算機(jī)算法GAP(遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)小組，University ofWisconsin，Madison，WI)，比對(duì)將要測(cè)定百分序列同一性的兩種多肽的各自氨基酸的最佳匹配(“匹配范圍”，取決于算法)。在某些實(shí)施方案中，開放空位罰分(計(jì)算為平均對(duì)角線的三倍；其中“平均對(duì)角線”是使用的比較矩陣的對(duì)角線的平均值；“對(duì)角線”是通過具體比對(duì)矩陣歸屬每個(gè)完美氨基酸匹配的得分或數(shù)字)和延伸空位罰分(通常為開放空位罰分的十分之一)，以及比較矩陣，如PAM250或BLOSUM 62，與該算法一起使用。在某些實(shí)施方案中，該算法也使用一種標(biāo)準(zhǔn)比較矩陣(關(guān)于PAM250比較矩陣，參見Dayhoff等人，1978，Atlas of Protein Sequence andStructure，5345-352；關(guān)于BLOSUM 62比較矩陣，參見Henikoff等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci USA，8910915-10919)。
在某些實(shí)施方案中，一種多肽序列比較的參數(shù)包括下列參數(shù)算法Needleman等人，1970，J.Mol.Biol.，48443-453；比較矩陣BLOSUM 62，來自Henikoff等人，1992，同上；空位罰分12空位長(zhǎng)度罰分4相似性閾值0
GAP程序可以使用上述參數(shù)。對(duì)于核苷酸序列，參數(shù)可能包括50的空位罰分和3的空位長(zhǎng)度罰分，每個(gè)空位中每個(gè)符號(hào)的罰分為3。在某些實(shí)施方案中，為了利用GAP算法進(jìn)行多肽比較(末端空位無罰分)，上述參數(shù)是缺省參數(shù)。
“側(cè)翼序列”是一種基因的上游(即5’)或下游(即3’)的堿基對(duì)序列。側(cè)翼序列可以與該基因直接相鄰，或者與該基因分開一段適中的堿基對(duì)序列，如1-1000個(gè)，優(yōu)選地1-100個(gè)堿基對(duì)。本發(fā)明的重組核酸中使用的側(cè)翼序列與靶基因的相應(yīng)側(cè)翼序列同源。側(cè)翼序列的長(zhǎng)度足以使其參與與天然基因的相應(yīng)側(cè)翼序列的單交換事件。有用的側(cè)翼序列的長(zhǎng)度為約50-約4000個(gè)堿基對(duì)，優(yōu)選地約100-約2000個(gè)堿基對(duì)，特別是可達(dá)約1200個(gè)堿基對(duì)。上游側(cè)翼序列優(yōu)選地含有靶基因的一個(gè)啟動(dòng)子，下游側(cè)翼序列優(yōu)選地含有一個(gè)終止序列。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，側(cè)翼序列分別與天然酵母的啟動(dòng)子和終止序列同源或者包含后者。最優(yōu)選地，重組核酸向酵母基因組染色體DNA中靶基因的基因座內(nèi)的整合使得它們編碼的外源LDH基因處于包含該側(cè)翼序列的天然基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列的轉(zhuǎn)錄控制之下。
如此處所用的術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”是指未轉(zhuǎn)錄的序列，它位于一種結(jié)構(gòu)基因的翻譯起始密碼子的上游(即5′)(通常在約1-1000bp以內(nèi)，優(yōu)選地在1-500bp以內(nèi)，特別是1-100bp以內(nèi))，控制一種結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄起始，或者以其它方式控制該基因的轉(zhuǎn)錄。
類似地，術(shù)語(yǔ)“終止子”是指未轉(zhuǎn)錄的序列，它位于一種結(jié)構(gòu)基因的翻譯終止密碼子的下游(即3′)(通常在約1-1000bp以內(nèi)，更一般地在1-500個(gè)堿基對(duì)以內(nèi)，特別是在1-100個(gè)堿基對(duì)以內(nèi))，控制該結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄終止，或者以其它方式控制該基因的轉(zhuǎn)錄。
在本發(fā)明內(nèi)，視情況而定，如果一種啟動(dòng)子或終止子在整合到酵母基因組內(nèi)后起作用，控制一種結(jié)構(gòu)基因(例如LDH基因或選擇性標(biāo)記基因)的轉(zhuǎn)錄，則該結(jié)構(gòu)基因與該啟動(dòng)子或終止子“有效連接”。
如此處所用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”是指細(xì)胞遺傳特征的一種變化，當(dāng)一種細(xì)胞被修飾而含有新的核酸時(shí)，該細(xì)胞被轉(zhuǎn)化。因此，當(dāng)一種細(xì)胞由其天然狀態(tài)遺傳修飾時(shí)，該細(xì)胞被轉(zhuǎn)化。例如，在轉(zhuǎn)染后，轉(zhuǎn)化的DNA優(yōu)選地通過物理整合到細(xì)胞染色體內(nèi)與細(xì)胞基因組DNA重組。此外，至少是瞬時(shí)地(即在細(xì)胞轉(zhuǎn)化48-96小時(shí)內(nèi))，核酸能夠作為一種附加體元件短暫保持，而不復(fù)制，或者可以作為質(zhì)粒獨(dú)立地復(fù)制。當(dāng)DNA整合到染色體內(nèi)并且隨著細(xì)胞分裂而復(fù)制時(shí)，則認(rèn)為該細(xì)胞已經(jīng)被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化。
術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染”用來指細(xì)胞攝取外來或外源DNA，當(dāng)外源DNA被導(dǎo)入細(xì)胞膜內(nèi)時(shí)，該細(xì)胞被“轉(zhuǎn)染”。本領(lǐng)域公知大量轉(zhuǎn)染技術(shù)。參見，例如Graham等人，1973，Virology 52456；Sambrook等人，2001，《分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，Cold Spring Harbor Laboratories；Davis等人，1986，《分子生物學(xué)基本方法》，Elsevier；Chu等人，1981，Gene 13197。這些技術(shù)能夠用來將一種或多種外源DNA種導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，產(chǎn)生一種重組核酸，其含有與側(cè)翼序列連接的一個(gè)外源LDH基因和至少一種選擇性標(biāo)記。術(shù)語(yǔ)“重組核酸”在此是指用來向宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)編碼信息的任何分子(例如核酸片段、質(zhì)?；虿《?。合適的側(cè)翼序列能夠如下獲得確定目標(biāo)整合位點(diǎn)，如酵母細(xì)胞基因組中的靶基因，獲得位于該位點(diǎn)側(cè)翼的序列(使用任何一種適當(dāng)?shù)姆椒?，包括但不限于化學(xué)合成、重組遺傳技術(shù)或體外擴(kuò)增)，將這些序列摻入重組核酸中希望的位點(diǎn)處(例如，通過共價(jià)連接分別位于LDH編碼序列5’和3’的側(cè)翼序列)。然后利用任何適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化技術(shù)，用該重組核酸轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。這樣獲得細(xì)胞，其中至少一個(gè)含有LDH基因的重組核酸片段整合到酵母細(xì)胞的基因組內(nèi)。
該重組核酸包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，它們更優(yōu)選地處于其自身啟動(dòng)子和終止序列的轉(zhuǎn)錄控制之下。標(biāo)記基因的啟動(dòng)子和終止序列優(yōu)選地不與靶基因的啟動(dòng)子和終止序列同源。選擇性標(biāo)記基因及其各自的啟動(dòng)子和終止子優(yōu)選地不打斷上游側(cè)翼序列-LDH基因-下游側(cè)翼序列的序列。選擇性標(biāo)記基因及其各自的啟動(dòng)子和終止子優(yōu)選地位于載體上LDH啟動(dòng)子序列(和其它側(cè)翼序列，如果存在的話)的上游(5’)。
在生產(chǎn)本發(fā)明的重組核酸和細(xì)胞中以及在實(shí)施本發(fā)明的方法中有用的含有LDH基因的優(yōu)選酵母種包括瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)、乳酸片球菌(Pediococcus acidolactici)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、耐熱克魯維酵母(Kluyveromyces thermotolerans)、戴爾有孢圓酵母(Torulaspora delbrueckii)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombii)、米根霉(Rhizopus oryzae)和巨大芽孢桿菌(B.megaterium)。具體而言，能夠分離含有適當(dāng)L-乳酸脫氫酶基因的菌株，用來生產(chǎn)本發(fā)明的重組核酸。兩種優(yōu)選的L-乳酸脫氫酶基因是瑞士乳桿菌和巨大芽孢桿菌L-乳酸脫氫酶。
典型的選擇性標(biāo)記基因編碼的蛋白質(zhì)(a)為宿主細(xì)胞提供對(duì)抗生素或其它毒素如zeocin(印度斯坦鏈異壁菌(Streptoalloteichus hindustanus)的ble博來霉素抗性基因)、G418(Tn903的卡那霉素抗性基因)、潮霉素(來自大腸桿菌的氨基糖甙類抗生素抗性基因)、氨芐青霉素、四環(huán)素或卡那霉素的抗性；(b)補(bǔ)充細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)缺陷，如亮氨酸缺陷(Leu2)；或(c)提供無法從簡(jiǎn)單培養(yǎng)基中獲得的重要養(yǎng)分，例如ura3。優(yōu)選的選擇性標(biāo)記包括Zeocin抗性基因、G418抗性基因和潮霉素抗性基因等非限制性實(shí)例。
本發(fā)明的重組核酸也可以含有一個(gè)或多個(gè)限制性酶切位點(diǎn)，它們可以使該分子被酶切，形成含有LDH基因、啟動(dòng)子和側(cè)翼序列、標(biāo)記基因和有關(guān)啟動(dòng)子和終止子等的線性片段，用于向酵母細(xì)胞的基因組內(nèi)插入。
本發(fā)明的重組核酸還可以含有一個(gè)骨架部分。骨架部分有利地含有復(fù)制起點(diǎn)(在酵母或細(xì)菌中有效，允許產(chǎn)生有用的量的核酸)和其它有用的特征，方便地由可商品獲得的酵母載體獲得。
用本發(fā)明的重組核酸轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域中公知，可包括如電穿孔、基于氯化鈣或乙酸鋰的方法等非限制性實(shí)例。轉(zhuǎn)化中使用的本發(fā)明的重組核酸能夠在使用前用具體限制性內(nèi)切酶消化，或者不消化。因?yàn)長(zhǎng)DH基因的側(cè)翼序列顯示與位于靶基因側(cè)翼的序列高度同源，上游側(cè)翼序列/LDH基因/下游側(cè)翼序列片段的插入可能在靶基因的基因座處發(fā)生。
靶基因是希望用LDH基因替換的任何基因。一種優(yōu)選的靶基因是丙酮酸脫羧酶基因，因?yàn)樘鎿Q該基因可破壞產(chǎn)生乙醇的一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)途徑。另外，丙酮酸基因在酵母種中傾向于具有活性，因此在PDC啟動(dòng)子和終止子控制下向基因組內(nèi)插入LDH基因有助于產(chǎn)生一種良好地表達(dá)LDH的突變體。其它優(yōu)選的靶基因有ADH、Leu2和Ura3。
由于用本發(fā)明的重組核酸轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，通過在針對(duì)選擇性標(biāo)記的選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)選擇的重組細(xì)胞，并且在非選擇性條件下進(jìn)一步培養(yǎng)選擇的轉(zhuǎn)化子，獲得含有外源LDH基因的重組酵母細(xì)胞，該基因中含有整合到酵母染色體靶基因的基因座內(nèi)的重組核酸。如根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的，這些細(xì)胞已經(jīng)刪除了靶基因，并且整合的外源D-LDH基因插入靶基因的基因座內(nèi)，使其與靶基因的表達(dá)控制序列(如啟動(dòng)子和終止序列)有效連接，并且處于后者的轉(zhuǎn)錄控制下。當(dāng)靶基因是一種PDC基因時(shí)，發(fā)生PDC刪除的細(xì)胞在厭氧條件下不能良好地生長(zhǎng)。因此，通過暴露于厭氧條件下能夠篩選鑒定并選擇的細(xì)胞的菌落。不能生長(zhǎng)的菌落被鑒定為已經(jīng)發(fā)生PDC刪除的菌落。類似地，根據(jù)與每種靶基因缺失有關(guān)的表型能夠鑒定向其它任何靶基因內(nèi)的定向整合。
圖17A和17B顯示可以產(chǎn)生這種結(jié)果的遺傳事件的示意圖。如圖17B所示，選擇性標(biāo)記基因能夠與靶基因的刪除一起自發(fā)地刪除。篩選選擇性標(biāo)記基因已經(jīng)刪除的轉(zhuǎn)化子是優(yōu)選的，因?yàn)榫哂心承┨匦裕缒退幮蕴岣叩倪z傳工程酵母細(xì)胞可能產(chǎn)生不希望的環(huán)境危險(xiǎn)。
產(chǎn)生的酵母細(xì)胞丟失了靶基因，含有整合到酵母細(xì)胞基因組內(nèi)，位于靶基因的基因座處的一個(gè)外源D-LDH基因。LDH基因處于一個(gè)啟動(dòng)子序列和一個(gè)終止序列的轉(zhuǎn)錄控制下，這兩個(gè)序列與靶基因的啟動(dòng)子和終止序列同源。
如圖17B所見，LDH啟動(dòng)子和終止序列可以是在用來轉(zhuǎn)化細(xì)胞的重組核酸所含側(cè)翼序列中存在的序列，或者可以是最初存在于細(xì)胞基因組整合位點(diǎn)處的序列。靶基因的終止子保留而整合載體中存在的終止序列缺失也是可能的。
適于在本發(fā)明的第一和第二方面進(jìn)行轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞包括來自下列屬的酵母細(xì)胞假絲酵母屬(Candida)、酵母屬(Saccharomyces)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、漢森酵母屬(Hansenula)。優(yōu)選不能積累丙酮酸(鹽)，即可將丙酮酸(鹽)自然代謝為乙醇或其它代謝產(chǎn)物的酵母細(xì)胞。來自假絲酵母屬和克魯維酵母屬的細(xì)胞是特別優(yōu)選的。特別優(yōu)選的細(xì)胞是C.sonorensis和馬克斯克魯維酵母。
本發(fā)明第五方面的細(xì)胞是馬克斯克魯維酵母種的重組細(xì)胞。這些細(xì)胞一般通過略微不同的轉(zhuǎn)化方法制備，但是上述方法是合適的，只要靶基因不是PDC基因。在此情況下，重組核酸并非用于在酵母細(xì)胞的天然PDC基因的基因座處定向插入。因此，用來轉(zhuǎn)化細(xì)胞的載體一般不含與酵母細(xì)胞的天然PDC基因的側(cè)翼序列高度同源的側(cè)翼序列。
第五方面的細(xì)胞一般通過兩次或多次轉(zhuǎn)化制備，每次引入一個(gè)拷貝的LDH基因。然而，也能夠構(gòu)建含有多個(gè)LDH基因的重組核酸，從而使得多個(gè)LDH基因能夠一步插入。因此，用來轉(zhuǎn)化細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)載體含有一個(gè)或多個(gè)LDH基因，每個(gè)均與一個(gè)啟動(dòng)子和一個(gè)終止子有效連接。如前所述，該一個(gè)或多個(gè)重組核酸也可以含有多個(gè)標(biāo)記基因，每一個(gè)均處于啟動(dòng)子和終止序列的控制之下，它們優(yōu)選地不是對(duì)于酵母細(xì)胞天然的PDC啟動(dòng)子和終止序列。
合適的LDH基因包括以上關(guān)于本發(fā)明的前三個(gè)方面所述的基因。優(yōu)選瑞士乳桿菌L-LDH和巨大芽孢桿菌基因L-LDH基因。用多個(gè)LDH基因，即至少兩個(gè)這樣的基因，優(yōu)選地約2-10個(gè)這樣的基因，更優(yōu)選地2-5個(gè)這樣的基因轉(zhuǎn)化這些細(xì)胞。插入的LDH基因可以全部是相同的基因，或者可以由兩種或多種不同類型的LDH基因(即來自一個(gè)以上的種的基因)組成。優(yōu)選含有兩個(gè)或多個(gè)拷貝的瑞士乳桿菌L-LDH基因的重組酵母細(xì)胞，含有兩個(gè)或多個(gè)拷貝的巨大芽孢桿菌L-LDH基因的重組酵母細(xì)胞，以及含有瑞士乳桿菌和巨大芽孢桿菌L-LDH基因各至少一個(gè)拷貝的重組酵母細(xì)胞。
在形成第五方面的細(xì)胞中供LDH使用的適當(dāng)啟動(dòng)子包括用于酵母基因磷酸甘油酸激酶(PGK)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(TDH)、丙酮酸脫羧酶(PDC)(來自馬克斯克魯維酵母以外的種)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子-1(TEF)、嘌呤-胞嘧啶通透酶(PCPL3)和醇脫氫酶(ADH)的啟動(dòng)子。本發(fā)明優(yōu)選的啟動(dòng)子包括釀酒酵母PGK啟動(dòng)子和釀酒酵母PDC1啟動(dòng)子。
合適的終止子包括來自釀酒酵母或其它酵母種的GAL10和CYC-1終止子。
合適的選擇性標(biāo)記如本發(fā)明前三方面所述。
當(dāng)以多個(gè)步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，細(xì)胞首先用至少含有一個(gè)LDH基因的第一種載體轉(zhuǎn)化。然后通常利用存在選擇性標(biāo)記產(chǎn)生的特性，篩選成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。成功的轉(zhuǎn)化子然后另外轉(zhuǎn)化一次或多次，直到獲得最終的細(xì)胞，其含有希望的數(shù)量和類型的外源LDH基因。
轉(zhuǎn)化的本發(fā)明的酵母細(xì)胞可用于利用一種發(fā)酵方法由碳水化合物生產(chǎn)乳酸。發(fā)酵能夠用任何適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵方法進(jìn)行。這些細(xì)胞一般使用一種含有能夠被該細(xì)胞代謝為丙酮酸(鹽)的碳水化合物的發(fā)酵培養(yǎng)基，并且暴露于可以發(fā)生發(fā)酵的條件下。發(fā)酵培養(yǎng)基也含有提高細(xì)胞生存力的養(yǎng)分(如氮、磷、硫、痕量無機(jī)物等的來源)。
能夠使用的具體碳水化合物取決于具體的宿主細(xì)胞，以及該宿主細(xì)胞是否工程改造為能夠?qū)⑷魏我环N具體碳水化合物代謝為丙酮酸(鹽)。優(yōu)選己糖，如葡萄糖和果糖，葡萄糖寡聚體，如麥芽糖、異麥芽糖、麥芽三糖、淀粉和蔗糖，麥芽糊精和木糖(一種戊糖)。次優(yōu)選的碳水化合物包括半乳糖、甘露糖和阿拉伯糖。
發(fā)酵過程中的溫度可以是從大約室溫，更優(yōu)選地從大約30℃，更優(yōu)選地從大約35℃，到大約55℃，更優(yōu)選地大約50℃，更優(yōu)選地大約45℃。最高溫度在一定程度上取決于具體的宿主細(xì)胞。例如，當(dāng)宿主細(xì)胞是馬克斯克魯維酵母時(shí)，(本發(fā)明任一方面的)重組細(xì)胞能夠耐受相對(duì)較高的溫度(如40℃以上，可達(dá)50℃，特別是可達(dá)45℃)。另外一個(gè)優(yōu)選的宿主種是C.sonorensis，它能夠耐受可達(dá)約40℃的溫度。這一溫度范圍提供了在較高溫度下進(jìn)行發(fā)酵的可能性(從而降低了冷卻成本)，而沒有明顯的生產(chǎn)率損失。良好的高溫耐受的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，如果發(fā)酵被一種不希望的微生物污染，則在許多情況下，能夠通過將發(fā)酵培養(yǎng)基加熱到40℃或以上，特別是45℃或以上，選擇性地殺死這種不希望的微生物，而不會(huì)明顯損傷本發(fā)明的重組細(xì)胞。
在發(fā)酵過程中，發(fā)酵培養(yǎng)基中的細(xì)胞濃度一般是約1-150克干細(xì)胞/升發(fā)酵培養(yǎng)基，優(yōu)選地約3-10克干細(xì)胞/升發(fā)酵培養(yǎng)基，更優(yōu)選地約3-6克干細(xì)胞/升發(fā)酵培養(yǎng)基。
在發(fā)酵的生產(chǎn)階段，在某些情況下優(yōu)選地可以微需氧操作，而不是嚴(yán)格厭氧操作。能夠?yàn)槊糠N微生物建立最佳通氣條件，方法是測(cè)量氧吸收比速度(OUR)，并將該速度與收率、底物消耗率和希望的發(fā)酵產(chǎn)物的生產(chǎn)率相關(guān)聯(lián)。在許多情況下，在具體OUR范圍內(nèi)優(yōu)化收率和生產(chǎn)率。對(duì)于含有PDC破壞的酵母，最佳OUR值傾向于在約0.8-約3.5mmol O2/干重細(xì)胞/小時(shí)的范圍內(nèi)。OUR是指發(fā)酵過程中細(xì)胞消耗氧氣的速度，表示為每單位時(shí)間每細(xì)胞干重的氧氣單位(摩爾或克)，如mmol O2/干重細(xì)胞/小時(shí)。通過測(cè)量向發(fā)酵中導(dǎo)入的氧氣以及從發(fā)酵中排出的氧氣，可以方便地測(cè)定耗氧量。為了使OUR保持在對(duì)于具體生物最佳的范圍內(nèi)，能夠利用OUR測(cè)量作為在發(fā)酵的生產(chǎn)階段控制通氣條件(特別是通氣速度、攪拌、通氣氣體中氧的比例等)的基礎(chǔ)。同時(shí)培養(yǎng)液中溶解氧的濃度保持在不到飽和量的1％，特別是不到10微摩爾O2/L。在一個(gè)特別優(yōu)選的方法中，進(jìn)行發(fā)酵的生長(zhǎng)階段，使得培養(yǎng)液中溶解氧的濃度減少至不到飽和量的1％，特別是不到10微摩爾O2/L，保持一段時(shí)間，如大約15-90分鐘，之后開始生產(chǎn)階段(即從生長(zhǎng)階段的需氧條件轉(zhuǎn)換為生產(chǎn)階段的微需氧條件)。
當(dāng)生產(chǎn)乳酸時(shí)，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH趨于降低，除非加入一種堿來中和形成的全部或部分酸。在發(fā)酵方法的一個(gè)實(shí)施方案中，向培養(yǎng)液中加入一種中和劑，如碳酸鈣、氫氧化鈣、碳酸鈉、氫氧化鈉、氨、氫氧化銨等，使pH保持在希望的范圍內(nèi)，一般是約5.0-約8.0，特別是約5.5-約7.5。當(dāng)加入這種堿時(shí)，形成相應(yīng)的乳酸鹽。因此，乳酸的回收包括再生游離乳酸。實(shí)現(xiàn)方法一般包括分離細(xì)胞，并用一種強(qiáng)酸(如硫酸)酸化發(fā)酵培養(yǎng)液。形成一種鹽副產(chǎn)物(如果一種鈣鹽是中和劑，硫酸是酸化劑，則為石膏)，它與乳酸分離。然后通過如液液提取、蒸餾、吸附等技術(shù)回收乳酸，如下所述T.B.Vickroy，《綜合生物技術(shù)》，第3卷，第38章(M.Moo-Young編著)，Pergamon，Oxford，1985；R.Datta等人，F(xiàn)EMS Microbiol.Rev.，1995；16221-231；美國(guó)專利號(hào)4,275,234、4,771,001、5,132,456、5,420,304、5,510,526、5,641,406和5,831,122和國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩O 93/00440。
此外，細(xì)胞產(chǎn)生乳酸也可以使發(fā)酵pH降低。因此，由于乳酸的產(chǎn)生，發(fā)酵培養(yǎng)液的pH可以處于約1.5-約5.0，優(yōu)選地約1.5-約4.2，更優(yōu)選地約1.5-約3.86(乳酸的pKa)，特別是約2.0-不到3.86的范圍內(nèi)。如果達(dá)到可以接受的生產(chǎn)率和收率，則這樣進(jìn)行發(fā)酵可能具有幾個(gè)好處。中和劑的成本降低或消除。如果發(fā)酵pH(在發(fā)酵結(jié)束時(shí))低于乳酸的pKa，則乳酸主要以酸的形式存在。這可以取消酸化步驟，從而可以省略額外的加工步驟，節(jié)約了酸化成本和鹽副產(chǎn)物的處理成本。因此，一種特別優(yōu)選的方法包括繼續(xù)發(fā)酵，直到發(fā)酵培養(yǎng)液的pH下降到3.86以下。能夠利用如WO 99/19290公開的方法，從獲得的發(fā)酵培養(yǎng)液中分離乳酸。
細(xì)胞耐受低pH環(huán)境的能力提供了另外一種機(jī)制，通過這種機(jī)制能夠清除不希望的微生物的污染?？梢詫⒑斜景l(fā)明的細(xì)胞的培養(yǎng)物置于降低的pH條件下，如約1.5-4.2，優(yōu)選地約2.0-3.86的pH，保持足以殺死不耐酸的污染微生物的一段時(shí)間。
為了在商業(yè)上有用，本發(fā)明的重組酵母應(yīng)當(dāng)顯示幾個(gè)特征。該酵母應(yīng)當(dāng)能夠?qū)⑾喈?dāng)比例的碳水化合物轉(zhuǎn)化為乳酸(即產(chǎn)生高產(chǎn)量的產(chǎn)物)。這些酵母細(xì)胞應(yīng)當(dāng)顯示高比生產(chǎn)率，即每單位時(shí)間每細(xì)胞重量產(chǎn)生大量的乳酸。這些酵母細(xì)胞優(yōu)選地能夠耐受低于約5.0、優(yōu)選地約1.5-4.2、特別是2.0-3.86的發(fā)酵pH，而在這些條件下達(dá)到良好的收率和生產(chǎn)率。在5.0-8.0的pH值，優(yōu)選地1.5-5.0、優(yōu)選地1.5-4.2、特別是2.0-3.86的pH值下，這些細(xì)胞優(yōu)選地也能耐受高濃度的乳酸。這最后一個(gè)特性可以使該發(fā)酵方法使用高濃度的起始碳水化合物。
通常希望使用本發(fā)明的重組細(xì)胞的發(fā)酵方法具有下列某些或全部特征A.收率至少為30克乳酸/克碳水化合物，優(yōu)選地至少40克乳酸/克碳水化合物，更優(yōu)選地至少60克乳酸/克碳水化合物，更優(yōu)選地至少75克乳酸/克碳水化合物。希望的理論收率為100％，但是收率的實(shí)際上限約為95％。
B.比生產(chǎn)率至少為0.1，優(yōu)選地至少0.3，更優(yōu)選地至少約0.4，特別是至少約0.5克乳酸/克細(xì)胞/小時(shí)。比生產(chǎn)率希望盡可能高。
C.滴度(乳酸的最大濃度)至少為15克/升發(fā)酵培養(yǎng)基，優(yōu)選地至少20g/L，更優(yōu)選地至少40g/L，更優(yōu)選地至少80g/L，可達(dá)150g/L，優(yōu)選地可達(dá)約120g/L。發(fā)酵培養(yǎng)基的溫度在一定程度上影響容易達(dá)到的滴度的最大范圍，因?yàn)楦叨葷饪s的乳酸溶液(即高于約150g/L)在低于約35℃的溫度下傾向于變得極為粘稠或者成為凝膠。使用較高的發(fā)酵溫度，如約35-50℃，可以獲得更高的滴度，而不會(huì)凝膠化或有不當(dāng)?shù)恼承园l(fā)生(build-up)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)對(duì)葡萄糖進(jìn)行中性(pH5.0-8.0)發(fā)酵時(shí)，本發(fā)明第三方面的細(xì)胞可以達(dá)到85-95％的收率，0.5-2g/g/小時(shí)的比生產(chǎn)率，和80-120g/L的滴度。在使pH降至約2.8-3.0的低pH發(fā)酵時(shí)，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明第三方面的細(xì)胞達(dá)到75-81％或更高的收率，和0.1-0.4g/g/小時(shí)的比生產(chǎn)率和14-40g/L的滴度。在所有情況下，不需優(yōu)化發(fā)酵條件即可獲得這些結(jié)果。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對(duì)葡萄糖進(jìn)行中性pH(5.0-8.0)發(fā)酵時(shí)，本發(fā)明第五方面的細(xì)胞(含有多個(gè)拷貝的外源LDH基因，并且含有一個(gè)完整的天然PDC基因)達(dá)到40％以上的收率，0.4-0.9g/g/小時(shí)的比生產(chǎn)率，和40-75g/L的滴度。對(duì)葡萄糖進(jìn)行低pH(終pH為2.8-3.0)發(fā)酵時(shí)，本發(fā)明第五方面的細(xì)胞達(dá)到30％以上的收率，0.3-0.5g/g/小時(shí)的比生產(chǎn)率，和20-35g/L的滴度。因此，第五方面的細(xì)胞保持在低pH條件下良好發(fā)酵的能力。如前所述，不需優(yōu)化發(fā)酵條件即可獲得這些結(jié)果。
另外，本發(fā)明的發(fā)酵方法優(yōu)選地達(dá)到高容積生產(chǎn)率。“容積生產(chǎn)率”表示為每單位時(shí)間每單位體積發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)生的產(chǎn)物量，一般是克產(chǎn)物/升培養(yǎng)基/小時(shí)。至少1.5g/L/小時(shí)，優(yōu)選地至少2.0g/L/小時(shí)，更優(yōu)選地至少2.5g/L/小時(shí)的容積生產(chǎn)率是希望的。在可達(dá)3-6克細(xì)胞/升發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)選細(xì)胞密度時(shí)，最大生產(chǎn)率趨于可達(dá)約5.0g/L/小時(shí)，更一般地可達(dá)約4.0g/L/小時(shí)。非常優(yōu)選的是進(jìn)行發(fā)酵，使得當(dāng)培養(yǎng)基的pH、溫度或這兩者都處于上段所述范圍內(nèi)時(shí)，達(dá)到這些容積生產(chǎn)率。
根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的乳酸可以用來生產(chǎn)丙交酯，即兩個(gè)乳酸分子的一種環(huán)酐。根據(jù)乳酸的立體異構(gòu)體不同，丙交酯可以是D-丙交酯(由兩個(gè)D-乳酸分子組成)、L-丙交酯(由兩個(gè)L-乳酸分子組成)或D-L-丙交酯(由L-乳酸和D-乳酸分子各一個(gè)組成)。由乳酸生產(chǎn)丙交酯的一種適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ峭ㄟ^聚合/解聚方法，如授予Gruber等人的USP 5,142,023所述。
丙交酯又特別可以作為一種單體用來生產(chǎn)聚丙交酯聚合物(PLA)和共聚物。制備這些聚合物的方法在授予Gruber等人的USP 5,142,023中也有描述。優(yōu)選的PLA產(chǎn)物是如授予Gruber等人的USP 5,338,822所述的熔解穩(wěn)定的聚合物。PLA可以是半晶體或非晶體。
下列實(shí)施例用來說明本發(fā)明的某些實(shí)施方案，并非限制其范圍或精神。
實(shí)施例1A基于釀酒酵母ScPGK1啟動(dòng)子的表達(dá)載體pNC2和基于釀酒酵母PDC1啟動(dòng)子的pNC4的構(gòu)建表達(dá)載體pNC2(圖1)通過在pGEM5Z(+)(Promega，Wisconsin)骨架載體上組合釀酒酵母ScPGK1啟動(dòng)子和釀酒酵母GAL10終止子產(chǎn)生。釀酒酵母ScPGK1啟動(dòng)子和ScGAL10終止子由一個(gè)多接頭區(qū)隔開，該接頭區(qū)含有限制酶切位點(diǎn)XbaI、EcoRI和BamHI，用于在酵母啟動(dòng)子與終止子之間插入將要表達(dá)的具體基因。
使用的釀酒酵母ScPGK1啟動(dòng)子含有下列序列(SEQ ID No.1)5’-GCGGCCGCGG ATCGCTCTTC CGCTATCGAT TAATTTTTTT TTCTTTCCTCTTTTTATTAA CCTTAATTTT TATTTTAGAT TCCTGACTTC AACTCAAGACGCACAGATAT TATAACATCT GCACAATAGG CATTTGCAAG AATTACTCGTGAGTAAGGAA AGAGTGAGGA ACTATCGCAT ACCTGCATTTAAAGATGCCG
ATTTGGGCGC GAATCCTTTA TTTTGGCTTC ACCCTCATAC TATTATCAGGGCCAGAAAAA GGAAGTGTTT CCCTCCTTCT TGAATTGATG TTACCCTCATAAAGCACGTG GCCTCTTATC GAGAAAGAAA TTACCGTCGC TCGTGATTTGTTTGCAAAAA GAACAAAACT GAAAAAACCC AGACACGCTC GACTTCCTGTCTTCCTATTG ATTGCAGCTT CCAATTTCGT CACACAACAA GGTCCTAGCGACGGCTCACA GGTTTTGTAA CAAGCAATCG AAGGTTCTGGAATGGCGGGAAAGGGTTTAG TACCACATGC TATGATGCCC ACTGTGATCT CCAGAGCAAAGTTCGTTCGA TCGTACTGTT ACTCTCTCTC TTTCAAACAG AATTGTCCGAATCGTGTGAC AACAACAGCC TGTTCTCACA CACTCTTTTC TTCTAACCAAGGGGGTGGTT TAGTTTAGTA GAACCTCGTG AAACTTACAT TTACATATATATAAACTTGC ATAAATTGGT CAATGCAAGA AATACATATT TGGTCTTTTCTAATTCGTAG TTTTTCAAGT TCTTAGATGC TTTCTTTTTC TCTTTTTTACAGATCATCAA GGAAGTAATT ATCTACTTTT TACAACAAAT CTAGAATT-3′該序列作為來自被命名為pBFY004的專利質(zhì)粒的一條限制酶切片段獲得。此外，也能夠以釀酒酵母染色體DNA為模板，使用根據(jù)SEQID NO1設(shè)計(jì)的引物，通過PCR擴(kuò)增獲得。
使用的釀酒酵母GAL10終止子含有下列序列(SEQ ID NO2)5’-GTAGATACAT TGATGCTATC AATCCAGAGA ACTGGAAAGA TTGTGTAGCCTTGAAAAACG GTGAAACTTA CGGGTCCAAG ATTGTCTACA GATTTTCCTGATTTGCCAGC TTACTATCCT TCTTGAAAAT ATGCACTCTA TATCTTTTAGTTCTTAATTG CAACACATAG ATTTGCTGTA TAACGAATTT TATGCTATTTTTTAAATTTG GAGTTCAGTG ATAAAAGTGT CACAGCGAAT TTCCTCACATGTAGGGACCG AATTGTTTAC AAGTTCTCTG TACCACCATG GAGACATCAAAAATTGAAAA TCTATGGAAA GATATGGACG GTAGCAACAA GAATATAGCACGAGCCGCGG ATTTATTTCG TTACGC-3’該序列作為被命名為pBFY004的專利質(zhì)粒的一條限制酶切片段獲得。此外，也能夠以釀酒酵母染色體DNA為模板，使用根據(jù)SEQ IDNO2設(shè)計(jì)的引物，通過PCR擴(kuò)增獲得。
構(gòu)建載體pNC4，其含有基于釀酒酵母PDC1啟動(dòng)子和ScGAL10終止子的表達(dá)盒，用該質(zhì)粒作為一種通用表達(dá)載體。pNC4載體在圖2中顯示。
pNC4的載體骨架是pGEM5Z(+)(Promega Corporation；Madison，WI)。以來源于釀酒酵母GY5098株的染色體DNA為模板(ATCC4005098)，使用引物PSPDCS1(5′-CCA TCG ATA ACA AGC TCATGCAAA GAG-3′；SEQ ID No3)和PSPDCAS2(5′-GCT CTA GATTTG ACT GTGTTA TTT TGCG-3′；SEQ ID No4)，PCR擴(kuò)增釀酒酵母PDC1啟動(dòng)子。使用Pfu Turbo DNA聚合酶(Stratagene)進(jìn)行熱循環(huán)94℃1min，56℃ 1min，72℃ 1min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃溫育7min。
釀酒酵母GAL10終止子如上所述獲得。圖2a(SEQ ID No37)和2b(SEQ ID No38)顯示了含有ScPGK1啟動(dòng)子和ScGAL10終止子以及多克隆位點(diǎn)，和含有ScPDC1啟動(dòng)子和ScGAL10終止子以及多克隆位點(diǎn)的片段。
實(shí)施例1BpVR22載體的構(gòu)建，其含有與釀酒酵母PDC1啟動(dòng)子和ScGAL10終止子有效連接的G418抗性基因克隆G418抗性標(biāo)記(一種細(xì)菌neoR基因)，將其置于釀酒酵母PDC1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下；這些構(gòu)建體被命名為pVR22(圖3)。以質(zhì)粒pPIC9K(Invitrogen，Carlsbad，CA)為模板，使用引物5′-GCT CTAGAT GAG CCA TAT TCA ACG GGA AAC(5′G片段；SEQ ID No5)和5′-ATG GAT CCT TAG AAA AAC TCA TCG AGC ATC(3′G片段；SEQ ID No6)，使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)，PCR擴(kuò)增G418抗性基因。熱循環(huán)如下進(jìn)行開始時(shí)反應(yīng)混合物95℃溫育5min，然后95℃ 30sec，49℃ 30sec，72℃ 2min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃溫育10min。PCR產(chǎn)物用BamHI和XbaI消化，分離到一條821bp的片段，將其與pNC2的4303bp的BamHI-XbaI片段連接(實(shí)施例1A)。獲得的質(zhì)粒(pVR22；圖3)含有與G418抗性基因有效連接的ScPGK1啟動(dòng)子和ScGAL10終止子。
實(shí)施例1CpVR29質(zhì)粒的構(gòu)建，其含有與釀酒酵母ScPGK1啟動(dòng)子和ScGAL10終止子(pVR29)功能連接的G418抗性基因?qū)418抗性標(biāo)記(pVR22；實(shí)施例1B)克隆到pNC2(實(shí)施例1A)內(nèi)，該構(gòu)建體被命名為pVR29(圖4)。用釀酒酵母ScPGK1啟動(dòng)子和釀酒酵母GAL10終止子表達(dá)該G418抗性基因。以質(zhì)粒pVR22(實(shí)施例1B)為模板，使用引物5′-GCT CTA GAT GAG CCA TAT TCA ACG GGAAAC(5′G片段；SEQ.ID NO5)和5′-ATG GAT CCT TAG AAA AACTCA TCG AGC ATC(3′G片段；SEQ.ID NO6)，用Pfu聚合酶(Stratagene，Madison，WI)PCR擴(kuò)增該G418抗性基因。此外，質(zhì)粒pPIC9K(Invitrogen，Carlsbad，CA)也能夠作為模板。熱循環(huán)如下進(jìn)行開始時(shí)反應(yīng)混合物95℃溫育5min，然后95℃ 30sec，49℃ 30sec，72℃2min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃溫育10min。PCR產(chǎn)物用BamHI和XbaI消化，分離一條821bp的片段，將其與pNC2的4303bpBamHI-XbaI片段連接。產(chǎn)生的質(zhì)粒pVR29(圖4)含有與G418抗性基因有效連接的ScPGK1啟動(dòng)子和ScGAL10終止子。
實(shí)施例1D質(zhì)粒pPS1(潮霉素抗性盒)、pNC14(Lh-L-LDH表達(dá)盒)和pPS9(用于向基因組內(nèi)整合Lh-L-LDH的載體，用于生產(chǎn)L-乳酸，使用潮霉素抗性作為選擇性標(biāo)記)的構(gòu)建制備一種重組核酸，它使轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞具有潮霉素抗性，從而允許篩選含有一種重組核酸構(gòu)建體的酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化子，該構(gòu)建體編碼可用于合成乳酸的蛋白質(zhì)。能夠利用載體pPS9(圖5)，通過選擇潮霉素抗性，將瑞士乳桿菌L-LDH基因整合到酵母基因組內(nèi)。
克隆潮霉素抗性標(biāo)記(大腸桿菌hph)，使其處于釀酒酵母PDC1(丙酮酸脫羧酶)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下。以質(zhì)粒pRLMex30為模板，使用引物5′HYGXBA1(5′-AAG CTC TAG ATG AAA AAG CCT GAA CTCAC-3′；SEQ ID No7)和3′HYGBAMH1(5′-CGC GGA TCC CTA TTCCTT TGC CCT CGG AC-3′；SEQ ID No8)，PCR擴(kuò)增提供潮霉素B抗性的大腸桿菌hph基因(Mach等人.1994，Curr.Genet.25，567-570；Rajgarhia等人，美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0/154,360，2002年5月23日提交，在此全文引用作為參考)。也能夠以大腸桿菌染色體DNA為模板，使用相同的引物，獲得hph基因。使用Pfu Turbo DNA聚合酶(Stratagene)進(jìn)行熱循環(huán)94℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 3min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃溫育7min。在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳分離PCR產(chǎn)物，分離到1026bp的產(chǎn)物。該1026bp片段然后用XbaI和BamHI消化，將其連接到含有釀酒酵母ScPDC1啟動(dòng)子和ScGAL10終止子的pNC4(實(shí)施例1A)的XbaI-BamHI片段內(nèi)，產(chǎn)生質(zhì)粒pPS1(圖5)。
克隆編碼L-乳酸脫氫酶的瑞士乳桿菌L-LDH基因，使其處于釀酒酵母ScPDC1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下。以質(zhì)粒pSO20(實(shí)施例1H；圖10)為模板，使用引物PS15S(5′-GCT CTA GAA TTA TGG CAA GAGAGG AAAAAC-3′；SEQ.ID NO.9)和PS16AS(5′-CGG GAT CCT CATTGA CGA ACC TTAACG-3′；SEQ.ID NO.10)，PCR擴(kuò)增編碼L-乳酸脫氫酶的瑞士乳桿菌L-LDH基因。此外，也能夠以瑞士乳桿菌染色體DNA為模板，使用相同的引物，獲得LDH基因。使用Pfu Turbo DNA聚合酶(Stratagene)進(jìn)行熱循環(huán)94℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 3min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃溫育7min。在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳分離990bp的產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物用XbaI和BamHI消化，將其連接到XbaI和BamHI消化的載體pNC2中(實(shí)施例1A)，產(chǎn)生質(zhì)粒pNC14(圖5)。pNC14用SalI和BsaHI消化，產(chǎn)生LhLDH表達(dá)盒。分離該LhLDH表達(dá)盒，將其連接到pPS1的SalI-ClaI片段內(nèi)，產(chǎn)生質(zhì)粒pPS9(圖5)。
實(shí)施例1EPVR39質(zhì)粒的構(gòu)建，其含有瑞士乳桿菌L-LDH基因和G418標(biāo)記pPS9(實(shí)施例1H；圖5)用SphI消化，用河蝦堿性磷酸酶(RocheDiagnostics，Indianapolis，IN)按照廠商所述方案去磷酸化，產(chǎn)生含有瑞士乳桿菌LDH表達(dá)盒的片段。pVR29(實(shí)施例1C；圖4)用SphI消化，利用0.8％瓊脂糖凝膠分離含有G418抗性基因盒的2048bp片段。連接這些片段，獲得的質(zhì)粒pVR39(圖6)含有彼此相鄰的瑞士乳桿菌L-LDH基因和G418抗性基因標(biāo)記(圖6)。
實(shí)施例1FpHES和pSEH質(zhì)粒的構(gòu)建按照PCT申請(qǐng)PCT/US/44041所述，用0.5μg質(zhì)粒pGAD424(如Chien等人，1991，Proc.Natl Acad.Sci.USA 889578-9582所述)構(gòu)建pHES和pSEH質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶HindIII消化。消化的混合物在TBE緩沖液(Biorad，USA)中通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離。然后如Sambrook等人(1989，《分子克隆》，第二版，Cold Spring HarborLaboratory，Plainview，NY)所述，從凝膠中純化5.9kbp片段。設(shè)計(jì)含有多個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的92bp合成寡聚物的互補(bǔ)對(duì)。第一個(gè)被命名為“fwd HES”oligo，含有下列序列5′-CCCAAGCTTGAATTCCCCGG GGGATCCCTGCAGGGTACCACGCGTAGATC TACTAGTGCG GCCGCCTCGAGTCTAGAGGGCCCAAGCTTG GG-3′(SEQ.ID NO11)。第二個(gè)被命名為“comp(SO1)(CMA2)hes”oligo，含有下列序列5′-CCAAGCTTGGGCCCTCTAGA CTCGAGGCGG CCGCACTAGTAGATCTACGC GTGGTACCCT GCAGGGATCC CCCGGGGAATTCAAGCTTG GG-3′(SEQ.ID NO12)。通過將兩種oligos在水浴中煮沸10分鐘(100℃)，并逐漸冷卻到室溫，使500nmoles兩種互補(bǔ)寡聚物彼此退火。雙鏈92bp DNA用HindIII消化，將其與HindIII消化的pGAD424(Clontech，USA)的5.9kbp片段連接。如Sambrook等人(同上)所述，通過電穿孔，用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B(electromaxcells，Life Technologies，Rockville，MD)。將重組大腸桿菌接種于Luria-Bertani培養(yǎng)基平板(Difco，USA)上，利用100μg/ml氨芐青霉素(Sigma Chemicals，USA)篩選含有該質(zhì)粒的細(xì)胞。從氨芐青霉素抗性大腸桿菌克隆中篩選質(zhì)粒DNA，獲得兩種質(zhì)粒pHES和pSEH。這兩種質(zhì)粒在載體上多克隆位點(diǎn)-合成雙鏈寡聚物相對(duì)于醇脫氫酶啟動(dòng)子(ADH1)的方向上不同。
實(shí)施例1G含有瑞士乳桿菌L-LDH的pVR1質(zhì)粒的構(gòu)建，用于進(jìn)一步構(gòu)建pSO20和pPS9瑞士乳桿菌L-LDH如下所述分離。瑞士乳桿菌細(xì)胞從美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏中心獲得(ATCC保藏號(hào)10797)，并在標(biāo)準(zhǔn)條件下生長(zhǎng)。然后使用下列方案從這些細(xì)胞中純化基因組DNA用來自細(xì)菌甘油貯存液的單菌落(或5mL)接種兩個(gè)250mL無菌搖瓶，其中各含有50mL無菌MRS培養(yǎng)液(Difco，USA)。培養(yǎng)物在37℃和170rpm充分?jǐn)嚢柘屡囵B(yǎng)48小時(shí)。將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到50mL無菌藍(lán)帽試管中，以3000rpm離心10分鐘。將沉淀懸浮于50mL 12.5％w/v蔗糖溶液中，再次以3000rpm離心10分鐘。將新形成的沉淀在50mL無菌藍(lán)帽試管中重懸浮于5mL 12.5％w/v蔗糖中。向試管中加入5mLTES溶液(200ml TES2ml 1.0M Tris(pH 8.0)，[10mM Tris(pH 8.0)]，20ml 500mM EDTA(pH 8.0)，[50mM EDTA(pH 8.0)]，0.584g NaCl[50mM NaCl]，使用前過濾除菌)。向試管中加入12.5％w/v蔗糖溶液，混合。加入300mg溶菌酶粉末(Sigma Chemicals，USA)，混合物以2000rpm振蕩1分鐘。向混合物中加入25μL變?nèi)芫厝芤?Sigma)(濃度為2.2mg/mL)，該混合物在37℃下溫育過夜(～10-12小時(shí))。
向混合物中加入2.5mL 20％SDS溶液(Biorad，USA)和168μL蛋白酶K溶液(濃度＝28mg/1.4mL)(Sigma)，獲得的混合物通過顛倒混合，在50℃下溫育1小時(shí)。細(xì)胞膜物質(zhì)較好地破裂，溶液變?yōu)榘胪该?。在試管中用NaCl稀釋該混合物，達(dá)到0.15M的濃度。
將該混合物轉(zhuǎn)移到一個(gè)50mL Oakridge管中，用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)溶液處理。振蕩獲得的混合物，以10,000rpm離心10分鐘。將水層轉(zhuǎn)移到一個(gè)清潔的Oakridge管中，加入等體積的氯仿。然后充分振蕩該混合物，以5000rpm離心10分鐘。將水層吸到一個(gè)新試管中，加入25μL RNAse(100mg/mL)，顛倒混合。獲得的混合物在37℃下溫育15分鐘。
沿試管壁向混合物中加入2.5倍體積的EtOH，但是不混合。收集在界面處形成的DNA，在70％EtOH中洗滌，混合物以10000rpm離心10分鐘。在底部形成的沉淀是DNA，使其風(fēng)干，在微量離心管中重懸浮于10mM Tris-HCl，pH 8.5中。該混合物在試管中50℃溫育，直到DNA進(jìn)入溶液(～2-3小時(shí))。
根據(jù)Genbank中可以獲得的瑞士乳桿菌L-LDH的序列(Genbank保藏號(hào)Z81318)設(shè)計(jì)引物。使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene，WI，USA)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。每個(gè)反應(yīng)體系含有濃度為500ng的瑞士乳桿菌基因組DNA，濃度各為0.2mM的4種dNTP，和濃度各為1μM的擴(kuò)增引物SO22 5′-CCG GGA TCC ATG GCA AGA GAG GAA AAA CCTC(SEQ.ID NO.13)和SO23 5′-CCA AGA TCT TTA TTG ACG AACCTT AAC GCC AG(SEQ.ID NO.14)。熱循環(huán)如下進(jìn)行開始時(shí)95℃溫育10min，隨后95℃ 30sec，41℃ 30sec，72℃ 60sec，共35個(gè)循環(huán)。利用常規(guī)方法凝膠純化該反應(yīng)產(chǎn)生的990bp片段，用限制性內(nèi)切酶BamHI和BglII消化，然后將其克隆到BamHI和BglII消化的pHES(實(shí)施例1F)中，產(chǎn)生質(zhì)粒pLhLDH-HES。獲得的序列能夠被翻譯為一種多肽，該多肽顯示與Genbank中已知的瑞士乳桿菌L-LDH編碼基因序列(保藏號(hào)Z81318)有極高的同源性。
設(shè)計(jì)其它引物，以在瑞士乳桿菌L-LD基因的5’端和3’端分別引入NcoI和DraIII限制酶切位點(diǎn)。使用Pfu聚合酶(Stratagene，Wisconsin，USA)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。每個(gè)反應(yīng)體系含有濃度為5ng的pLH-LDH/HES，濃度各為0.2mM的4種dNTP，和濃度各為1μM的擴(kuò)增引物VR1 5′-ATC CAT GGC AAG TAT TAC GGA TAA GGATCA CCAA(SEQ.ID NO.15)和VR2 5′-ATC ACG AAG TGT CACGTA CGG GTT TCG ATG TC(SEQ.ID NO.16)。熱循環(huán)如下進(jìn)行開始時(shí)95℃溫育10min，隨后95℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 60sec，共35個(gè)循環(huán)。利用常規(guī)方法凝膠純化該反應(yīng)產(chǎn)生的982bp片段，用NcoI和DraIII限制性內(nèi)切酶消化，將其克隆到NcoI和DraIII消化的pTEF1/Zeo(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，產(chǎn)生的質(zhì)粒pVR1(圖7)證實(shí)含有瑞士乳桿菌L-LDH編碼基因序列，處于釀酒酵母pTEF1啟動(dòng)子控制下。存在大腸桿菌EM7啟動(dòng)子，但是它不是本發(fā)明的整合載體的一個(gè)必要成分。
實(shí)施例1H質(zhì)粒pSO20的構(gòu)建，其用于在馬克斯克魯維酵母中表達(dá)瑞士乳桿菌L-LDH質(zhì)粒質(zhì)粒pSO20如下構(gòu)建將BamHI(NEB)消化的、河蝦堿性磷酸酶處理的(Roche Diagnostics，USA)pUC19質(zhì)粒(Life Technologies，USA)與消化pVRl(實(shí)施例1F)獲得的含有瑞士乳桿菌L-LDH基因+相鄰的啟動(dòng)子和終止序列的BamHI片段相連接。產(chǎn)生的質(zhì)粒為pSO18(圖8)。然后用SphI消化pSO18，與pSPHI構(gòu)建體(Chen等人，1986，“來自酵母果蠅克魯維酵母(Kluyveromyces drosphilarum)的環(huán)形質(zhì)粒pKD1的序列組織”，Nucleic acids Res.144471-4481)的含有pKD1骨架的SphI片段相連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pSO19(圖9)。
pTEF1/Zeo(Invitrogen，Inc)用XhoI/XbaI消化，產(chǎn)生釀酒酵母TEF1啟動(dòng)子、Zeocin抗性基因和釀酒酵母GAL10終止子。該1195bp片段的末端然后用Pfu DNA聚合酶(Stratagene，Madison，WI)補(bǔ)平。構(gòu)建體pSO19用AatII消化，用Pfu DNA聚合酶產(chǎn)生平端，用河蝦堿性磷酸酶處理獲得的片段。然后將該9.3kbp與含有釀酒酵母TEF1啟動(dòng)子、Zeocin抗性基因和釀酒酵母GAL10終止子的1195bp pTEF/Zeo片段相連接。產(chǎn)生的構(gòu)建體是pSO20(圖10)。
實(shí)施例1I通過轉(zhuǎn)化的DNA向馬克斯克魯維酵母基因組內(nèi)的隨機(jī)整合，瑞士乳桿菌L-LDH基因的引入通過用SstI和ApaI消化pVR39，從該質(zhì)粒中分離含有瑞士乳桿菌L-LDH:G418抗性基因盒的4.28kbp片段。用0.8％瓊脂糖凝膠分離該片段，利用如下所述的電穿孔方案，用該片段轉(zhuǎn)化馬克斯克魯維酵母(CD21)用馬克斯克魯維酵母的一個(gè)單菌落接種50mL YPD培養(yǎng)基(在250mL帶擋板的搖瓶中含有10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，和20g/L葡萄糖，至OD600＝0.1)。培養(yǎng)物在30℃和250rpm下溫育16小時(shí)，直到終OD600＝10。從10mL培養(yǎng)物中離心收集細(xì)胞，用電穿孔緩沖液(10mM Tris-Cl，270mM蔗糖，1mM MgCl2，pH 7.5)洗滌一次。然后將細(xì)胞重懸浮于溫育緩沖液(YPD+25mM DTT，20mM HEPES，pH 8.0)中，在30℃和250rpm下溫育30分鐘。離心收集細(xì)胞，用電穿孔緩沖液洗滌一次，將其重懸浮于1mL電穿孔緩沖液中。然后將400μL細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個(gè)0.4cm的電穿孔杯(BioRad；USA)中。
用SstI和ApaI消化pVR39，將2μg獲得的4.3kbp片段加入杯中。然后這些細(xì)胞以1.8kV，1000Ω，25μF電穿孔。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50mL螺帽Falcon管中的1mL YPD中，在30℃和250rpm下溫育4小時(shí)，之后選擇性接種于含有300μg/mL G418的YPD上。這些轉(zhuǎn)化子在37℃下生長(zhǎng)3天。將G418抗性轉(zhuǎn)化子在含有300μg/mL G418的新鮮選擇平板上重新劃線。
使用與瑞士乳桿菌L-LDH基因同源的PCR引物和與G418抗性基因同源的反向引物證實(shí)該片段向馬克斯克魯維酵母基因組內(nèi)的整合。
VR146 5′-GCT GAG TAC CCA GAT TGT AAGGATG-3′(SEQ.ID NO.17)和VR143 5′CTG CCA GCG CAT CAA CAA TAT TTTCAC-3′(SEQ.ID NO.18)用來在含有該盒的菌株中擴(kuò)增位于瑞士乳桿菌L-LDH與G418抗性基因之間的2.3kb的產(chǎn)物。在不含該盒的菌株中，這些引物不能擴(kuò)增任何片段。
使用Taq DNA聚合酶(Qiagen，USA)對(duì)轉(zhuǎn)化子菌落進(jìn)行熱循環(huán)開始時(shí)反應(yīng)混合物94℃溫育2min，隨后94℃ 30sec，53℃ 30sec，72℃ 3min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃溫育7min。分析的10個(gè)轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生預(yù)期的2.3kb PCR產(chǎn)物。使用可與作為探針的瑞士乳桿菌L-LDH基因雜交的10個(gè)菌株的基因組DNA進(jìn)行Southern印跡分析，所分析的10個(gè)轉(zhuǎn)化子中有2個(gè)顯示適當(dāng)?shù)膸?，與來自pVR39的一個(gè)拷貝的瑞士乳桿菌L-LDH基因的整合相一致。兩個(gè)菌株中的一個(gè)被鑒定為CD484。
實(shí)施例1J通過轉(zhuǎn)化的DNA向馬克斯克魯維酵母基因組內(nèi)的隨機(jī)整合，另外一個(gè)拷貝的瑞士乳桿菌L-LDH基因的導(dǎo)入通過用SstI和ApaI消化pPS9，從該質(zhì)粒中分離含有瑞士乳桿菌L-LDH:HPH抗性基因盒的4.7kbp片段。用0.8％瓊脂糖凝膠分離該片段，通過電穿孔用來轉(zhuǎn)化馬克斯克魯維酵母CD484用馬克斯克魯維酵母CD484的一個(gè)單菌落接種50mL YPD培養(yǎng)基(在250mL帶擋板的搖瓶中含有10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，和20g/L葡萄糖和2％瓊脂，至OD600＝0.1)。培養(yǎng)物在30℃和250rpm下溫育16小時(shí)，至終OD600＝10。從10mL培養(yǎng)物中離心收集細(xì)胞，用電穿孔緩沖液(10mM Tris-Cl，270mM蔗糖，1mM MgCl2，pH 7.5)洗滌一次。然后將細(xì)胞重懸浮于溫育緩沖液(YPD+25mM DTT，20mMHEPES，pH 8.0)中，在30℃和250rpm下溫育30分鐘。離心收集細(xì)胞，用電穿孔緩沖液洗滌一次，將其重懸浮于1mL電穿孔緩沖液中。然后將400μL細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個(gè)0.4cm的電穿孔杯(BioRad；USA)中。
用SstI和ApaI消化pPS9，將5μg獲得的4.7kbp片段加入杯中。然后這些細(xì)胞以1.8kV，1000Ω，25μF電穿孔。將電穿孔的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50mL螺帽Falcon管中的1mL YPD中，在30℃和250rpm下溫育4小時(shí)，之后選擇性接種于含有200μg/mL潮霉素(Invitrogen，Carlsbad，CA)的YPD上。潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子在37℃下生長(zhǎng)3天。將這些轉(zhuǎn)化子在含有300μg/mL G418的新鮮選擇平板上重新劃線，以確保該菌株含有兩種抗性基因。
使用與瑞士乳桿菌L-LDH基因同源的PCR引物以及與潮霉素抗性基因同源的反向引物，證實(shí)瑞士乳桿菌L-LDH:G418盒的新4.7kbp片段的整合。VR146(SEQ ID NO.17)和VR142 5′-GTG ACA CCC TGTGCA CGG CGG GAG ATG-3′(SEQ.ID NO.19)用來在含有該盒的菌株中擴(kuò)增位于瑞士乳桿菌L-LDH與潮霉素抗性基因之間的2.3kb產(chǎn)物。在不含該盒的菌株中，這些引物不能擴(kuò)增任何片段。
使用Taq DNA聚合酶(Qiagen，USA)進(jìn)行熱循環(huán)開始時(shí)反應(yīng)混合物94℃溫育2min，隨后94℃ 30sec，53℃ 30sec，72℃ 3min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃溫育7min。使用上述PCR分析的4個(gè)轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生預(yù)期的1.76kb PCR產(chǎn)物。
利用與瑞士乳桿菌L-LDH基因同源的PCR引物以及與G418抗性基因同源的反向引物，證實(shí)來自馬克斯克魯維酵母CD484的4288bp瑞士乳桿菌L-LDH:G418基因的存在。VR146(SEQ ID NO.17)和VR143(SEQ.ID NO.18)用來在含有該盒的菌株中擴(kuò)增位于瑞士乳桿菌L-LDH與G418抗性基因之間的2.3kb產(chǎn)物。在不含該盒的菌株中，這些引物不能擴(kuò)增任何片段。
使用Taq DNA聚合酶(Qiagen，USA)進(jìn)行熱循環(huán)開始時(shí)反應(yīng)混合物94℃溫育2min，隨后94℃ 30sec，53℃ 30sec，72℃ 3min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃溫育7min。所有4個(gè)菌株都產(chǎn)生預(yù)期的2.3kb PCR產(chǎn)物。
與瑞士乳桿菌L-LDH探針雜交的菌株基因組DNA的Southern印跡分析證明，對(duì)于G418和潮霉素盒產(chǎn)生陽(yáng)性PCR結(jié)果的4個(gè)轉(zhuǎn)化子也含有插入基因組內(nèi)的兩個(gè)拷貝的瑞士乳桿菌L-LDH基因。該菌株被鑒定為馬克斯克魯維酵母CD492，進(jìn)一步分析L-乳酸的產(chǎn)生。
實(shí)施例1K搖瓶培養(yǎng)物在YPD+葡萄糖培養(yǎng)基中的L-乳酸產(chǎn)生重組菌株CD492在一個(gè)250mL帶擋板的搖瓶中培養(yǎng)，其中含有補(bǔ)充了100g/L葡萄糖的50mL YPD。來自于YPD瓊脂平板的細(xì)胞在30℃和250rpm下溫育16小時(shí)，至OD600＝0.1。然后利用YSI分析檢測(cè)搖瓶的殘余葡萄糖，以確保細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期。離心收集4g/L細(xì)胞干重(“gcdw”)當(dāng)量，將其重懸浮于一個(gè)250mL帶擋板的搖瓶中，其中含有補(bǔ)充了約100g/L葡萄糖和55g/L CaCO3的50mL YPD。該培養(yǎng)物然后在30℃和70rpm下溫育。在0、12、24小時(shí)的時(shí)間間隔后采樣。通過過濾從樣品中除去細(xì)胞，通過HPLC分析上清液的葡萄糖、乳酸鹽、丙酮酸鹽和乙醇。在這些條件下，CD492株產(chǎn)生對(duì)映體純度大于99％的L-乳酸。終滴度為69g/L。容積生產(chǎn)率為3.6g/L/小時(shí)。
為了比較，CD484株(實(shí)施例1)在相同條件下培養(yǎng)。與CD492所見相比，L-乳酸產(chǎn)量較低，乙醇產(chǎn)量較高。
實(shí)施例1L搖瓶培養(yǎng)物在YPD+葡萄糖培養(yǎng)基中的L-乳酸產(chǎn)生492株在一個(gè)250mL帶擋板的搖瓶中培養(yǎng)，其中含有補(bǔ)充了100g/L葡萄糖的50mL YPD。細(xì)胞接種到搖瓶中，至OD600＝0.1，搖瓶在30℃和250rpm下溫育16小時(shí)。終pH＜3.1。然后利用YSI分析檢測(cè)搖瓶的殘余葡萄糖，以確保細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期。離心收集4g/L細(xì)胞干重當(dāng)量，將其重懸浮于一個(gè)250mL帶擋板的搖瓶中，其中含有補(bǔ)充了約25g/L葡萄糖的50mL YPD。培養(yǎng)物然后在30℃和70rpm下溫育。以不同時(shí)間間隔采樣，過濾除去細(xì)胞。通過HPLC分析培養(yǎng)上清液的葡萄糖、乳酸鹽、丙酮酸(鹽)和乙醇。
產(chǎn)生的L-乳酸對(duì)映體純度大于99％。L-乳酸滴度為15g/L，容積生產(chǎn)率為2g/L/hr。當(dāng)在相同條件下檢測(cè)CD484株時(shí)，乳酸產(chǎn)量較低，而乙醇產(chǎn)量較高。
在一個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)中，含有100mL YPD+100g/L葡萄糖的一個(gè)500mL帶擋板的搖瓶接種CD492株，至OD600＝0.1。搖瓶在37℃和250rpm下培養(yǎng)約16小時(shí)。在確保細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期后，收集4g/L細(xì)胞干重當(dāng)量。將細(xì)胞沉淀重懸浮于50mL YPD+40g/L葡萄糖中，將其轉(zhuǎn)移到一個(gè)250mL帶擋板的搖瓶中。該搖瓶置于37℃和70rpm下。在生物質(zhì)生長(zhǎng)結(jié)束時(shí)，以及進(jìn)入生產(chǎn)階段0、15、18.5、23小時(shí)，直到所有葡萄糖消耗光，采樣進(jìn)行HPLC分析。在生產(chǎn)開始和結(jié)束時(shí)測(cè)量pH。終pH為3.00+/-0.06。
CD 492株在15-23小時(shí)內(nèi)消耗葡萄糖。在生產(chǎn)結(jié)束時(shí)(當(dāng)葡萄糖完全消耗光時(shí))采樣進(jìn)行游離酸分析，并分析總?cè)樗?、乙酸鹽、乙醇和丙酮酸鹽。CD492株產(chǎn)生32g/L游離乳酸、32g/L乙醇和各＜1g/L的乙酸鹽和丙酮酸鹽。游離乳酸為32g/L。在所有情況下，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，質(zhì)子化形式的酸的百分比至少為97％?；谄咸烟堑娜樗崾章蕿?9％。
在類似的條件下評(píng)價(jià)CD 484株。它產(chǎn)生26-28g/L游離乳酸，基于葡萄糖的收率為46-58％。
實(shí)施例2ApVR24質(zhì)粒的構(gòu)建，其含有巨大芽孢桿菌L-LDH，用于在釀酒酵母ScPGK1啟動(dòng)子控制下表達(dá)L-LDH編碼L-LDH基因的巨大芽孢桿菌DNA如下分離。巨大芽孢桿菌從美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏中心獲得(ATCC保藏號(hào)6458)，在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)。使用Invitrogen的“Easy-DNA”試劑盒，按照廠商方案，從這些細(xì)胞中純化基因組DNA。以可從Genbank獲得的巨大芽孢桿菌L-LDH的序列(Genbank保藏號(hào)M22305)為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物。使用Perkin Elmer緩沖液II(1.5mM MgCl2)和AmpliTaq Gold聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。每個(gè)反應(yīng)體系含有濃度為6ng/μL的巨大芽孢桿菌基因組DNA、濃度各為0.2mM的4種dNTP和濃度各為1μM的兩種擴(kuò)增引物BM1270和BM179(5’-CCT GAG TCC ACG TCA TTA TTC-3’；SEQ.ID NO.20)(5’-TGA AGC TAT TTA TTC TTG TTAC-3’；SEQ.ID NO.21)熱循環(huán)如下進(jìn)行開始時(shí)95℃溫育10min，隨后95℃ 30sec，50℃30sec，72℃ 60sec，共35個(gè)循環(huán)。利用常規(guī)方法凝膠純化該反應(yīng)產(chǎn)生的1100bp片段，克隆，測(cè)序。獲得的序列能夠被翻譯為一種多肽，該多肽顯示與已知L-LDH編碼基因的同源性，其中兩種序列之間的同源程度至少為75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大約99％的序列同一性。
巨大芽孢桿菌LDH的編碼序列與來自質(zhì)粒pNC2(實(shí)施例1A)的釀酒酵母ScPGK1啟動(dòng)子和ScGAL10轉(zhuǎn)錄終止子有效連接。兩種寡核苷酸引物，被命名為Bmeg5′和Bmeg3′，用來在該基因的編碼序列的末端引入限制酶切位點(diǎn)(5′-GCT CTA GAT GAA AAC ACA ATT TACACC-3；SEQ ID No22)和(5-ATGG ATC CTT ACA CAA AAG CTCTGT CGC-3′；SEQ ID No23)。
使用上述dNTP和引物濃度，使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)，在廠商提供的緩沖液中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。熱循環(huán)如下進(jìn)行開始時(shí)反應(yīng)混合物95℃溫育3min，隨后95℃ 30sec，50℃ 30sec，72℃ 60sec，共20個(gè)循環(huán)，最后72℃溫育9min。產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶XbaI和BamHI消化，然后將其連接到質(zhì)粒pNC2(實(shí)施例1A)的XbaI和BamHI片段內(nèi)。這種連接產(chǎn)生質(zhì)粒pVR24，其含有與巨大芽孢桿菌LDH編碼序列有效連接的ScPGK1啟動(dòng)子和ScGAL10終止子(圖12)。
實(shí)施例2B編碼巨大芽孢桿菌L-LDH的G418抗性標(biāo)記質(zhì)粒(pCA3)修飾從Invitrogen(Carlsbad，CA)獲得的G418抗生素選擇性標(biāo)記，將其與來自釀酒酵母的丙酮酸脫羧酶基因啟動(dòng)子和一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止子有效連接。在構(gòu)建該構(gòu)建體中，制備下列寡核苷酸，用來從含有G418抗性基因插入片段的質(zhì)粒中擴(kuò)增編碼序列。兩種oligo-寡核苷酸引物G5′和G3′根據(jù)該序列設(shè)計(jì)，用來在該基因編碼序列的末端引入限制酶切位點(diǎn)5′-AAA TCT AGA TGA GCC ATA TTCAAC GGGA-3′；(SEQ.IDNo.24)和5′-CCG GAT CCT TAG AAA AAC TCA TCG AGCAT3′；(SEQ.ID No.25)。
使用G5′和G3′引物和所有4種dNTP和Pfu Turbo聚合酶，PCR擴(kuò)增來自pPIC9K載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)的G418抗性基因。使用上述dNTP和引物濃度，使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)，在廠商提供的緩沖液中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。熱循環(huán)如下進(jìn)行開始時(shí)反應(yīng)混合物95℃溫育3min，隨后95℃ 30sec，50℃ 30sec，72℃ 60sec，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃溫育9min。產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶XbaI和BamHI消化，然后將其連接到質(zhì)粒pNC4(實(shí)施例1A)的XbaI和BamHI位點(diǎn)內(nèi)。
將與釀酒酵母ScPGK1啟動(dòng)子和ScGAL10終止子有效連接的巨大芽孢桿菌LDH基因引入該載體中，位于G418基因ScGAL10終止子的3’末端的SphI位點(diǎn)處，產(chǎn)生質(zhì)粒pCA3(圖13)。
實(shí)施例2CpVR38質(zhì)粒的構(gòu)建，其含有巨大芽孢桿菌LDH基因和潮霉素抗性標(biāo)記pVR24(實(shí)施例2A)用SphI消化，并用河蝦堿性磷酸酶(RocheDiagnostics，Indianapolis USA)按照廠商所述方案去磷酸化，產(chǎn)生含有巨大芽孢桿菌LDH表達(dá)盒的片段。pPSl(實(shí)施例1D)用SphI消化，利用0.8％瓊脂糖凝膠分離含有潮霉素抗性基因盒的2259bp片段，將其與去磷酸化的pVR24連接。產(chǎn)生的質(zhì)粒pVR38(圖14)含有彼此相鄰的巨大芽孢桿菌L-LDH基因和潮霉素抗性基因標(biāo)記。
實(shí)施例2D通過轉(zhuǎn)化的DNA向馬克斯克魯維酵母基因組內(nèi)的隨機(jī)整合，巨大芽孢桿菌LDH基因的引入通過用SstI和ApaI消化pCA3，從該質(zhì)粒中分離含有巨大芽孢桿菌L-LDH:G418抗性基因盒的4.2kbp片段。用0.8％瓊脂糖凝膠分離該片段，利用如下所述的電穿孔方案，用該片段轉(zhuǎn)化馬克斯克魯維酵母(CD21)。
用馬克斯克魯維酵母的一個(gè)單菌落接種50mL YPD培養(yǎng)基(在250mL帶擋板的搖瓶中含有10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，和2％瓊脂，至OD600＝0.1)。培養(yǎng)物在30℃和250rpm下溫育16小時(shí)，至終OD600＝10。從10mL培養(yǎng)物中離心收集細(xì)胞，用電穿孔緩沖液(10mM Tris-Cl，270mM蔗糖，1mM MgCl2，pH 7.5)洗滌一次。然后將細(xì)胞重懸浮于溫育緩沖液(YPD+25mM DTT，20mM HEPES，pH 8.0)中，在30℃和250rpm下溫育30分鐘。然后離心收集細(xì)胞，用電穿孔緩沖液洗滌一次。然后將細(xì)胞重懸浮于1mL電穿孔緩沖液中，將400μL細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個(gè)0.4cm的電穿孔杯(BioRad；USA)中。
將2μg來自pCA3的4.2kbp SstI/ApaI片段加入杯中，這些細(xì)胞以1.8kV，1000Ω，25μF電穿孔。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50mL螺帽Falcon管中的1mL YPD中，在30℃和250rpm下溫育4小時(shí)，之后選擇性接種于含有300μg/mL G418的YPD上。這些轉(zhuǎn)化子在37℃下生長(zhǎng)3天。將G418抗性轉(zhuǎn)化子在含有300μg/mL G418的新鮮選擇平板上重新劃線。
使用與巨大芽孢桿菌L-LDH基因同源的PCR引物和與G418抗性基因同源的反向引物證實(shí)該片段向馬克斯克魯維酵母基因組內(nèi)的整合。BmLDH3 5′-GTA CGC ATT ACC AAG GCT ATT TTA GAT-3′(SEQ.ID NO.26)和VR143(SEQ.ID NO.18)用來在含有該盒的菌株中擴(kuò)增位于巨大芽孢桿菌L-LDH與G418抗性基因之間的1.8kb產(chǎn)物。在不含該盒的菌株中，這些引物不能擴(kuò)增任何片段。
使用Taq DNA聚合酶(Qiagen，USA)對(duì)轉(zhuǎn)化子菌落進(jìn)行熱循環(huán)開始時(shí)反應(yīng)混合物94℃溫育2min，隨后94℃ 30sec，53℃ 30sec，72℃ 3min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃溫育7min。PCR分析的10個(gè)轉(zhuǎn)化子中有7個(gè)產(chǎn)生預(yù)期的1.8kb PCR產(chǎn)物。利用來自7個(gè)菌株的基因組DNA與作為探針的巨大芽孢桿菌L-LDH基因的Southern印跡雜交，所分析的7個(gè)PCR陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中有2個(gè)顯示適當(dāng)?shù)膸?，與來自pCA3的一個(gè)拷貝的巨大芽孢桿菌L-LDH基因的整合相一致。兩個(gè)菌株中的一個(gè)被鑒定為CD162。
實(shí)施例2E通過轉(zhuǎn)化的DNA向馬克斯克魯維酵母基因組內(nèi)的隨機(jī)整合，另外一個(gè)拷貝的巨大芽孢桿菌LDH基因的導(dǎo)入通過用SstI和ApaI消化pVR38，從該質(zhì)粒中分離含有巨大芽孢桿菌L-LDH:HPH抗性基因盒的4.5kbp片段。用0.8％瓊脂糖凝膠分離該片段，通過電穿孔用來轉(zhuǎn)化馬克斯克魯維酵母CD162株。
用馬克斯克魯維酵母CD162的一個(gè)單菌落接種50mL YPD培養(yǎng)基(在250mL帶擋板的搖瓶中含有10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，和20g/L葡萄糖和2％瓊脂，至OD600＝0.1)。培養(yǎng)物在30℃和250rpm下溫育16小時(shí)，至終OD600＝10。從10mL培養(yǎng)物中離心收集細(xì)胞，用電穿孔緩沖液(10mM Tris-Cl，270mM蔗糖，1mM MgCl2，pH 7.5)洗滌一次。然后將細(xì)胞重懸浮于溫育緩沖液(YPD+25mM DTT，20mMHEPES，pH 8.0)中，在30℃和250rpm下溫育30分鐘。離心收集細(xì)胞，用電穿孔緩沖液洗滌一次，將其重懸浮于1mL電穿孔緩沖液中。然后將一等份(400μL)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個(gè)0.4cm的電穿孔杯(BioRad；USA)中。
用SstI和ApaI消化pVR38，將5μg獲得的4.5kbp片段加入電穿孔杯中。然后這些細(xì)胞以1.8kV，1000Ω，25μF電穿孔。將電穿孔的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50mL螺帽Falcon管中的1mL YPD中，在30℃和250rpm下溫育4小時(shí)，之后選擇性接種于含有200μg/mL潮霉素(Invitrogen，Carlsbad，CA)的YPD上。這些轉(zhuǎn)化子在37℃下生長(zhǎng)3天。將潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子在含有300μg/mL G418的新鮮選擇平板上重新劃線，以確保該菌株含有兩種抗性基因。
使用與巨大芽孢桿菌L-LDH基因同源的PCR引物和與潮霉素抗性基因同源的反向引物證實(shí)含有巨大芽孢桿菌L-LDH:HPH盒的新4.5kbp片段的整合。BmLDH3(SEQ.ID NO.26)和VR142(SEQ.ID NO.19)用來在含有該盒的菌株中擴(kuò)增位于巨大芽孢桿菌L-LDH與潮霉素抗性基因之間的1.76kb產(chǎn)物。在不含該盒的菌株中，這些引物不能擴(kuò)增任何片段。
使用Taq DNA聚合酶(Qiagen，USA)對(duì)轉(zhuǎn)化子菌落進(jìn)行熱循環(huán)開始時(shí)反應(yīng)混合物94℃溫育2min，隨后94℃ 30sec，53℃ 30sec，72℃ 3min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃溫育7min。使用上述PCR法分析的9個(gè)轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生預(yù)期的1.76kb PCR產(chǎn)物。
使用與巨大芽孢桿菌L-LDH基因同源的PCR引物以及與G418抗性基因同源的反向引物證實(shí)馬克斯克魯維酵母CD162株中已經(jīng)存在的4.2kbp巨大芽孢桿菌L-LDH:G418基因的存在。BmLDH3(SEQ.ID NO.26)和VR143(SEQ.ID NO.18)用來在含有該盒的菌株中擴(kuò)增位于巨大芽孢桿菌L-LDH與G418抗性基因之間的1.8kb產(chǎn)物。在不含該盒的菌株中，這些引物不能擴(kuò)增任何片段。
使用Taq DNA聚合酶(Qiagen，USA)對(duì)轉(zhuǎn)化子菌落進(jìn)行熱循環(huán)開始時(shí)反應(yīng)混合物94℃溫育2min，隨后94℃ 30sec，53℃ 30sec，72℃ 3min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃溫育7min。所有9個(gè)菌株都產(chǎn)生預(yù)期的1.8kb PCR產(chǎn)物。來自這些菌株的基因組DNA與作為探針的巨大芽孢桿菌LDH雜交的Southern印跡分析表明，對(duì)于G418和潮霉素盒產(chǎn)生陽(yáng)性PCR結(jié)果的9個(gè)轉(zhuǎn)化子中有7個(gè)也含有插入基因組內(nèi)的兩個(gè)拷貝的巨大芽孢桿菌L-LDH基因。這些菌株中的一個(gè)被鑒定為CD355。
實(shí)施例2F搖瓶培養(yǎng)物在YPD+葡萄糖培養(yǎng)基中的L-乳酸產(chǎn)生重組菌株CD492以實(shí)施例1K所述的通用方法培養(yǎng)。在這些條件下，CD355株產(chǎn)生對(duì)映體純度大于99％的L-乳酸。終滴度為52g/L。容積生產(chǎn)率為1.5g/L/小時(shí)。
為了比較，CD162株在相同條件下培養(yǎng)。與CD162所見相比，L-乳酸產(chǎn)量較低，乙醇產(chǎn)量較高。
實(shí)施例2G搖瓶培養(yǎng)物在YPD+葡萄糖培養(yǎng)基中的L-乳酸產(chǎn)生355株在一個(gè)250mL帶擋板的搖瓶中培養(yǎng)，其中含有補(bǔ)充了100g/L葡萄糖的50mL YPD。這些細(xì)胞接種到搖瓶中，至OD600＝0.1，搖瓶在30℃和250rpm下溫育16小時(shí)。終pH＜3.1。然后利用YSI分析檢測(cè)搖瓶的殘余葡萄糖，以確保細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期。然后離心收集4g/L細(xì)胞干重當(dāng)量，將其重懸浮于一個(gè)250mL帶擋板的搖瓶中，其中含有補(bǔ)充了約25g/L葡萄糖的50mL YPD。培養(yǎng)物然后在30℃和70rpm下溫育。以不同時(shí)間間隔采樣，過濾除去細(xì)胞。通過HPLC分析培養(yǎng)上清液的葡萄糖、乳酸(鹽)、丙酮酸(鹽)和乙醇。
產(chǎn)生的L-乳酸對(duì)映體純度大于99％。L-乳酸滴度為12g/L，容積生產(chǎn)率為1.9g/L/小時(shí)。當(dāng)在相同條件下檢測(cè)CD162株時(shí)，乳酸產(chǎn)量較低，而乙醇產(chǎn)量較高。
實(shí)施例3ApBH5a/b質(zhì)粒的構(gòu)建，其用于將DNA定向整合到馬克斯克魯維酵母PDC1基因座內(nèi)將位于馬克斯克魯維酵母丙酮酸脫羧酶(KmPDC1)基因側(cè)翼的DNA克隆到載體pVR29(實(shí)施例1C)內(nèi)，產(chǎn)生一種載體，用于在KmPDC1基因座處進(jìn)行定向DNA整合。產(chǎn)生的構(gòu)建體被命名為pBH5b(圖15)。克隆到pBH5b的SbfI限制酶切位點(diǎn)內(nèi)的一個(gè)基因與馬克斯克魯維酵母啟動(dòng)子和終止子有效連接。
以質(zhì)粒pSO21為模板，使用引物5′-Flank5′5′-CAA GAA GGTACC CCT CTC TAA ACT TGA ACA-3′(SEQ.ID NO.27)和5′-Flank3′5′-GTA ATT CCT GCA GGT GCA ATT ATT TGG TTTGG-3′(SEQ.ID NO.28)，PCR擴(kuò)增位于馬克斯克魯維酵母PDC1直接上游的DNA的1254bp片段。熱循環(huán)如下進(jìn)行開始時(shí)反應(yīng)混合物94℃溫育2min，隨后94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 1.5min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃溫育7min。用0.8％瓊脂糖凝膠分離1254bp PCR產(chǎn)物。該P(yáng)CR產(chǎn)物和pVR29質(zhì)粒(實(shí)施例1C)均用KpnI和SbfI消化。消化的PCR產(chǎn)物與5067bp pVR29片段連接，產(chǎn)生6315bp pBH5a(圖15)。pBH5a質(zhì)粒含有與釀酒酵母ScPDC1啟動(dòng)子和ScGAL10終止子有效連接的G418抗性基因，和與馬克斯克魯維酵母PDC1基因直接上游的DNA同源的DNA的1240bp片段。
以質(zhì)粒pSO21為模板，使用引物3′-Flank 5′5′-CCA AGC CCTGCA GGA GAG GGA GAG GAT AAA GA-3′(SEQ.ID NO.29)和3′-Flank3′5′-CTC GTA ACG CGT GTA CAA GTT GTG GAACAA-3′(SEQ.ID NO.30)，PCR擴(kuò)增位于馬克斯克魯維酵母PDC1直接下游的DNA的535bp片段。熱循環(huán)如下進(jìn)行開始時(shí)反應(yīng)混合物94℃溫育2min，隨后94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 45sec，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃溫育4min。用0.8％瓊脂糖凝膠分離PCR產(chǎn)物，分離到535bp的產(chǎn)物。529bp PCR產(chǎn)物用SbfI和MluI消化，該片段與pBH5a的SbfI-MluI片段連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pBH5b(圖15)。pBH5b質(zhì)粒含有位于馬克斯克魯維酵母PDC1基因直接上游的1.2kb DNA和直接下游的0.5kb DNA，在側(cè)翼PDC1序列之間有一個(gè)唯一的SbfI位點(diǎn)，以及與釀酒酵母ScPDC1啟動(dòng)子和ScGAL10終止子有效連接的選擇性G418抗性標(biāo)記。
實(shí)施例3BpBH8質(zhì)粒的構(gòu)建，其用于將瑞士乳桿菌L-LDH基因定向整合到馬克斯克魯維酵母的KmPDC1基因座內(nèi)將來自瑞士乳桿菌的L-乳酸脫氫酶基因克隆到pBH5b(實(shí)施例3A)的SbfI位點(diǎn)內(nèi)，產(chǎn)生一種載體，該載體能夠?qū)⑷鹗咳闂U菌L-LDH整合到馬克斯克魯維酵母的KmPDC1基因座內(nèi)，并且使用內(nèi)源馬克斯克魯維酵母KmPDC1啟動(dòng)子和終止子表達(dá)瑞士乳桿菌L-LDH。
以pPS9(實(shí)施例1D)為模板，使用引物L(fēng)-LDH 5′5′-ACA AATCCT GCA GGA TGG CAA GAG AGG AAA AA-3′(SEQ.ID NO.31)和L-LDH 3′5′-TAT CTA CCT GCA GGT CAT TGA CGA ACC TTAAC-3′(SEQ.ID NO.32)，PCR擴(kuò)增瑞士乳桿菌L-LDH基因。使用Failsafe PCR系統(tǒng)(Epicentre，Madison，WI)進(jìn)行熱循環(huán)94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 1.5min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃溫育4min。用0.8％瓊脂糖凝膠分離971bp PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物用SbfI消化，將其與SbfI消化的pBH5b的6844bp片段連接，產(chǎn)生7824bp質(zhì)粒pBH8(圖16)。pBH8含有與馬克斯克魯維酵母KmPDC1啟動(dòng)子和終止子有效連接的瑞士乳桿菌L-LDH基因，以及與釀酒酵母ScPDC1啟動(dòng)子和ScGAL10終止子有效連接的G418抗性標(biāo)記。
實(shí)施例3C通過pBH8向KmPDC1基因座內(nèi)的整合，馬克斯克魯維酵母CD606株的構(gòu)建用pBH8質(zhì)粒(實(shí)施例3B)轉(zhuǎn)化野生型馬克斯克魯維酵母。將整個(gè)pBH8質(zhì)粒整合到CD21的KmPDC1基因座內(nèi)，位于pBH8的瑞士乳桿菌L-LDH基因直接上游的側(cè)翼KmPDC1 DNA與馬克斯克魯維酵母染色體上KmPDC1基因直接上游的DNA之間。產(chǎn)生的菌株被命名為CD606，含有野生型拷貝的KmPDC1以及在KmPDC1基因座處整合的一個(gè)拷貝的pBH8。
在一個(gè)250mL帶擋板的搖瓶中，用CD21接種補(bǔ)充了100g/L葡萄糖的50mL YPD培養(yǎng)基(含有10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖和2％瓊脂)，至OD600＝0.1。培養(yǎng)物在30℃和250rpm下溫育16小時(shí)，至終OD600＝12。從10mL培養(yǎng)物中離心收集細(xì)胞，用電穿孔緩沖液(電穿孔緩沖液10mM Tris-Cl，270mM蔗糖，1mM MgCl2，pH 7.5)洗滌一次。然后將細(xì)胞重懸浮于溫育緩沖液(YPD+25mM DTT，20mM HEPES，pH 8.0)中，在30℃和250rpm下溫育30分鐘。離心收集細(xì)胞，用電穿孔緩沖液洗滌一次，將其重懸浮于1mL電穿孔緩沖液中。然后將一等份(400μL)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個(gè)0.4cm的電穿孔杯中。將總體積為50μL的12μg未酶切的pBH8加入杯中，這些細(xì)胞以1.8kV，1000Ω，25μF電穿孔。將電穿孔的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50mL螺帽Falcon管中的1mL YPD中，在30℃和250rpm下溫育4小時(shí)，之后選擇性接種于含有300μg/mL G418的YPD上。這些轉(zhuǎn)化子在37℃下溫育2天，在新鮮選擇平板上重新劃線。
pBH8向位于pBH8的瑞士乳桿菌L-LDH基因直接上游的側(cè)翼KmPDC1 DNA與馬克斯克魯維酵母染色體上KmPDC1基因直接上游的DNA之間的KmPDC1基因座內(nèi)的適當(dāng)整合，用引物PDC1染色體5′5′-AAG CAC CAA GGC CTT CAA CAG-3′(SEQ.ID NO.33)和L-LDH 3′5′-TCG ATA TCG CTA AGG AAC GCG-3′(SEQ.ID NO.34)證實(shí)。這些引物用來擴(kuò)增2.7kb產(chǎn)物，其位于KmPDC1基因上游且摻入pBH8中的同源區(qū)之外的染色體DNA與瑞士乳桿菌L-LDH基因之間。熱循環(huán)如下進(jìn)行開始時(shí)反應(yīng)混合物94℃溫育2min，然后94℃30sec，55℃ 30sec，72℃ 3min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃溫育7min。PCR分析的10個(gè)轉(zhuǎn)化子中有4個(gè)產(chǎn)生預(yù)期的2.7kb PCR產(chǎn)物。
使用用來擴(kuò)增KmPDC1基因座的引物PDC1 5′5′-CGC AAA GAAAAG CTC CAC ACC-3′(SEQ.ID NO.35)和PDC1 3′5′-CCC ATACGC TTA TAA TCC CCC-3′(；SEQ.ID NO.36)進(jìn)行PCR，產(chǎn)生兩種產(chǎn)物。一種產(chǎn)物是對(duì)應(yīng)于馬克斯克魯維酵母PDC1的1.7kb片段，第二種產(chǎn)物是對(duì)應(yīng)于瑞士乳桿菌L-LDH的1.0kb片段。熱循環(huán)如下進(jìn)行開始時(shí)反應(yīng)混合物94℃溫育2min，然后94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃2min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃溫育5min。使用G418抗性基因編碼區(qū)作為探針，通過Southern印跡分析進(jìn)一步證實(shí)單拷貝整合。所分析的3個(gè)轉(zhuǎn)化子中有1個(gè)顯示與一個(gè)pBH8拷貝整合相一致的適當(dāng)帶型。通過PCR和Southern分析證實(shí)，在KmPDC1基因座處含有一個(gè)pBH8拷貝的菌株，被命名為CD606。
這些結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化的pBH8 DNA向CD21的KmPDC1基因座內(nèi)的定向整合在KmPDC1啟動(dòng)子序列之間發(fā)生。
實(shí)施例3D由馬克斯克魯維酵母CD606株構(gòu)建CD607株和CD608株CD606在非選擇性培養(yǎng)基上繁殖數(shù)輪，以利于靶PDC1基因的刪除。分離一種菌株，其中KmPDC1基因已經(jīng)被替換為瑞士乳桿菌L-LDH基因。該菌株也不含G418抗性標(biāo)記基因，顯示G418敏感表型，通過在G418存在下的生長(zhǎng)抑制得到證實(shí)；neoR基因的丟失通過Southern印跡分析證實(shí)。另外，該菌株也不能夠厭氧生長(zhǎng)。
將CD606接種于YPD瓊脂平板上，在37℃下培養(yǎng)過夜約16小時(shí)。將一個(gè)菌落拭子轉(zhuǎn)移到新鮮的YPD瓊脂平板上。該過程重復(fù)4次。在YPD瓊脂平板上進(jìn)行第5輪非選擇性培養(yǎng)后，由第5輪非選擇性生長(zhǎng)的CD606平板接種6個(gè)250mL帶擋板的搖瓶，至OD600＝0.1，搖瓶中含有補(bǔ)充了100g/L葡萄糖和42g/L CaCO3的50mL YPD。搖瓶在30℃和250rpm下溫育16小時(shí)。然后通過將豌豆大小的菌落拭子連續(xù)稀釋到PBS(磷酸緩沖液)中，稀釋培養(yǎng)物。豌豆大小的菌落拭子的最初懸液在1ml PBS中的10-5、10-6、10-7稀釋液在YPD瓊脂平板上使用。
將在YPD平板上第5輪非選擇性生長(zhǎng)的另外一個(gè)菌落拭子懸浮于1mL PBS(磷酸緩沖液；137mN NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4pH 7.4)中，隨后稀釋，用單菌落接種YPD瓊脂平板。將單菌落接種于YPD瓊脂上，置于一個(gè)厭氧培養(yǎng)室[Becton Dickinson，“GasPak System”，使用三個(gè)氣囊]中，按照廠商說明使用。在37℃下生長(zhǎng)2天后，打開厭氧培養(yǎng)室，標(biāo)記厭氧生長(zhǎng)的菌落。平板在37℃下再溫育一天。將需氧而不是厭氧生長(zhǎng)的菌落轉(zhuǎn)移到三份平板上進(jìn)行篩選。使用的篩選條件是需氧YPD平板、厭氧YPD平板和補(bǔ)充了300μg/mLG418的YPD平板。鑒定了兩個(gè)轉(zhuǎn)化子，其具有希望的G418敏感表型，不能厭氧生長(zhǎng)，被命名為CD607和CD608。
使用引物PDC1 5′(SEQ.ID NO.35)和PDC1 3′(SEQ.ID NO.36)證實(shí)KmPDC1被瑞士乳桿菌L-LDH的替換。以來自CD607和CD608的DNA為模板，用這些引物擴(kuò)增PDC1基因座。熱循環(huán)如下進(jìn)行開始時(shí)反應(yīng)混合物94℃溫育2min，隨后94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 2min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃溫育5min。兩個(gè)菌株的染色體DNA產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于瑞士乳桿菌L-LDH的1.0kb PCR產(chǎn)物。使用用來雜交G418基因的G418基因的完整編碼區(qū)作為探針進(jìn)行Southern印跡分析，表明PCR產(chǎn)物不含G418基因。使用KmPDC1編碼探針的Southern分析顯示沒有條帶，表明沒有用來雜交KmPDC1直接上游和下游區(qū)域的KmPDC1編碼序列探針。使用的探針是與PDC1基因直接上游和下游的染色體區(qū)域同源的DNA片段。用寡聚體5′探針＝CA110和CA111；3′探針＝CA112和CA113經(jīng)PCR擴(kuò)增探針，產(chǎn)生大小與KmPDC1被瑞士乳桿菌L-LDH置換相一致的條帶。
這些結(jié)果表明，CD606的染色體中丟失了KmPDC1基因以及含有與釀酒酵母ScPDC1啟動(dòng)子和ScGAL10終止子連接的G418抗性標(biāo)記的pBH8質(zhì)粒骨架，產(chǎn)生一種菌株，其中KmPDC1基因被側(cè)翼為SbfI位點(diǎn)的瑞士乳桿菌L-LDH基因準(zhǔn)確替換。
實(shí)施例3ECD607在復(fù)雜CaCO3緩沖培養(yǎng)基中的L-乳酸產(chǎn)生CD607株在一個(gè)250mL帶擋板的搖瓶中培養(yǎng)，其中含有補(bǔ)充了100g/L葡萄糖和50g/L CaCO3的50mL YPD培養(yǎng)基，由YPD瓊脂平板接種至OD600＝0.1，之后在30℃和250rpm下培養(yǎng)16小時(shí)。在確定搖瓶中含有殘余葡萄糖，因此細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期后，離心收集4g/L細(xì)胞干重當(dāng)量，將其重懸浮于一個(gè)250mL帶擋板的搖瓶中，其中含有補(bǔ)充了100g/L葡萄糖和50g/L CaCO3的50mL YPD。培養(yǎng)物在30℃和70rpm下溫育(48小時(shí))。在不同時(shí)間(0、8、24、48小時(shí)間隔)采樣，過濾除去細(xì)胞。通過HPLC分析培養(yǎng)上清液的葡萄糖、乳酸(鹽)、丙酮酸(鹽)和乙醇。
24小時(shí)后，CD607株消耗了59-61g/L葡萄糖，產(chǎn)生58-60g/L乳酸(鹽)和0.3g/L丙酮酸(鹽)。48小時(shí)后，CD607株消耗了101-104g/L葡萄糖，產(chǎn)生了94-99g/L乳酸(鹽)和0.4g/L丙酮酸(鹽)。這些乳酸滴度代表微需氧生產(chǎn)階段基于葡萄糖的90-98％的乳酸收率，和大于2.1g/L/hr的容積生產(chǎn)率。48小時(shí)后，由于培養(yǎng)物中產(chǎn)生高水平的乳酸鹽，形成一種不可溶的乳酸鈣沉淀(“結(jié)塊”)，妨礙了進(jìn)一步的分析。乳酸鹽酶分析顯示，乳酸(鹽)是對(duì)映體純度大于99％的L-乳酸(鹽)。在CD607的培養(yǎng)物中未檢測(cè)到乙醇，因此表明只有一個(gè)拷貝的PDC1被一個(gè)L-LDH替換。
與之相比，CD606株(含有PDC基因和瑞士乳桿菌L-LDH基因)在相同發(fā)酵條件下消耗了124g/L葡萄糖，產(chǎn)生83g/L乳酸(鹽)、20g/L乙醇和0.2g/L丙酮酸(鹽)。
實(shí)施例3F在不添加緩沖劑的復(fù)雜培養(yǎng)基中，游離L-乳酸的產(chǎn)生CD607株在一個(gè)250mL帶擋板的搖瓶中培養(yǎng)，其中含有補(bǔ)充了100g/L葡萄糖的50mL YPD培養(yǎng)基，由YPD瓊脂平板接種至OD600＝0.1，之后在30℃和250rpm下培養(yǎng)16小時(shí)。在確定搖瓶中含有殘余葡萄糖，因此細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期后，離心收集2g/L細(xì)胞干重當(dāng)量，將其重懸浮于一個(gè)250mL帶擋板的搖瓶中，其中含有補(bǔ)充了另外40g/L葡萄糖的50mL YPD。培養(yǎng)物在30℃和70rpm下溫育(72小時(shí))。在不同時(shí)間(在開始生產(chǎn)后0、24、47、72小時(shí))采樣。通過HPLC分析培養(yǎng)樣品的葡萄糖、乳酸(鹽)(總和游離酸)、丙酮酸(鹽)、甘油、乙酸(鹽)和乙醇。在生產(chǎn)開始和結(jié)束時(shí)測(cè)定pH。
72小時(shí)后，CD607株消耗了10.8g/L葡萄糖，產(chǎn)生9.1g/L乳酸(鹽)、0.5g/L乙酸(鹽)和1.2g/L丙酮酸(鹽)。這些乳酸滴度代表微需氧生產(chǎn)階段基于葡萄糖的84％的乳酸收率，和大于0.1g/L/hr的容積生產(chǎn)率。乳酸(鹽)酶分析顯示，乳酸(鹽)是對(duì)映體純度大于99％的L-乳酸(鹽)。在CD607株的培養(yǎng)物中未檢測(cè)到乙醇。另外，也未檢測(cè)到甘油。在生產(chǎn)階段，由于有機(jī)酸的產(chǎn)生，培養(yǎng)液的pH由6.50降為3.05。通過HPLC測(cè)定游離乳酸(質(zhì)子化乳酸)，發(fā)現(xiàn)9.1g/L游離乳酸，表明CD607產(chǎn)生的所有乳酸基本上都是質(zhì)子化形式。
應(yīng)當(dāng)理解，上述公開內(nèi)容強(qiáng)調(diào)了本發(fā)明的某些具體實(shí)施方案，與之相當(dāng)?shù)乃行揎椇透淖兌荚谌鐧?quán)利要求書所述的本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)。此處引用的所有參考文獻(xiàn)均全文引用作為參考。
序列表<110>Cargill Dow Polymers LLCHause，BenRajgarhia，VineetSuominen，Pirkko<120>在酵母中生產(chǎn)L-乳酸的方法和材料<130>00-1237-P<150>US 60/384,333<151>2002-05-30<160>38<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>848<212>DNA<213>釀酒酵母<400>1gcggccgcgg atcgctcttc cgctatcgat taattttttt ttctttcctc tttttattaa60ccttaatttt tattttagat tcctgacttc aactcaagac gcacagatat tataacatct120gcacaatagg catttgcaag aattactcgt gagtaaggaa agagtgagga actatcgcat180acctgcattt aaagatgccg atttgggcgc gaatccttta ttttggcttc accctcatac240tattatcagg gccagaaaaa ggaagtgttt ccctccttct tgaattgatg ttaccctcat300aaagcacgtg gcctcttatc gagaaagaaa ttaccgtcgc tcgtgatttg tttgcaaaaa360gaacaaaact gaaaaaaccc agacacgctc gacttcctgt cttcctattg attgcagctt420ccaatttcgt cacacaacaa ggtcctagcg acggctcaca ggttttgtaa caagcaatcg480aaggttctgg aatggcggga aagggtttag taccacatgc tatgatgccc actgtgatct540ccagagcaaa gttcgttcga tcgtactgtt actctctctc tttcaaacag aattgtccga600atcgtgtgac aacaacagcc tgttctcaca cactcttttc ttctaaccaa gggggtggtt660tagtttagta gaacctcgtg aaacttacat ttacatatat ataaacttgc ataaattggt720caatgcaaga aatacatatt tggtcttttc taattcgtag tttttcaagt tcttagatgc780tttctttttc tcttttttac agatcatcaa ggaagtaatt atctactttt tacaacaaat840ctagaatt 848<210>2<211>376<212>DNA<213>釀酒酵母<400>2gtagatacat tgatgctatc aatccagaga actggaaaga ttgtgtagcc ttgaaaaacg60gtgaaactta cgggtccaag attgtctaca gattttcctg atttgccagc ttactatcct120tcttgaaaat atgcactcta tatcttttag ttcttaattg caacacatag atttgctgta180
taacgaattt tatgctattt tttaaatttg gagttcagtg ataaaagtgt cacagcgaat240ttcctcacat gtagggaccg aattgtttac aagttctctg taccaccatg gagacatcaa300aaattgaaaa tctatggaaa gatatggacg gtagcaacaa gaatatagca cgagccgcgg360atttatttcg ttacgc376<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PSPDCS1引物<400>3ccatcgataa caagctcatg caaagag27<210>4<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PSPDCAS2 引物<400>4gctctagatt tgactgtgtt attttgcg 28<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5′G片段引物<400>5gctctagatg agccatattc aacgggaaac 30<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>3′G片段引物<400>6atggatcctt agaaaaactc atcgagcatc 30<210>7<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5′HYGXBA1引物<400>7aagctctaga tgaaaaagcc tgaactcac 29
<210>8<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>3′HYGBAMH1引物<400>8cgcggatccc tattcctttg ccctcggac 29<210>9<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PS15S引物<400>9gctctagaat tatggcaaga gaggaaaaac 30<210>10<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PS16AS引物<400>10cgggatcctc attgacgaac cttaacg27<210>11<211>92<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>fwd HES寡<400>11cccaagcttg aattccccgg gggatccctg cagggtacca cgcgtagatc tactagtgcg60gccgcctcga gtctagaggg cccaagcttg gg 92<210>12<211>91<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>[So1][CMA2]寡<400>12ccaagcttgg gccctctaga ctcgaggcgg ccgcactagt agatctacgc gtggtaccct60gcagggatcc cccggggaat tcaagcttgg g 91<210>13<211>31<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>so22引物<400>13ccgggatcca tggcaagaga ggaaaaacct c 31<210>14<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>so23引物<400>14ccaagatctt tattgacgaa ccttaacgcc ag 32<210>15<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>VR1引物<400>15atccatggca agtattacgg ataaggatca ccaa34<210>16<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>VR2引物<400>16atcacgaagt gtcacgtacg ggtttcgatg tc 32<210>17<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>VR146引物<400>17gctgactacc cagattgtaa ggatg 25<210>18<211>27<212>DNA<213>人工<220>
<223>VR143引物<400>18ctgccagcgc atcaacaata ttttcac27
<210>19<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>VR142引物<400>19ctgccagcgc atcaacaata ttttcac27<210>20<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>BM1270引物<400>20cctgagtcca cgtcattatt c 21<210>21<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>BM179引物<400>21tgaagctatt tattcttgtt ac 22<210>22<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Bmeg5′引物<400>22gctctagatg aaaacacaat ttacacc27<210>23<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Bmeg3′引物<400>23atggatcctt acacaaaagc tctgtcgc 28<210>24<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>G5′引物
<400>24aaatctagat gagccatatt caacggga 28<210>25<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>G3′引物<400>25ccggatcctt agaaaaactc atcgagcat 29<210>26<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>BmLDH3引物<400>26gtacgcatta ccaaggctat tttagat27<210>27<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5′-側(cè)翼5′引物<400>27caagaaggta cccctctcta aacttgaaca 30<210>28<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5′-側(cè)翼3′引物<400>28gtaattcctg caggtgcaat tatttggttt gg 32<210>29<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>3′-側(cè)翼5′引物<400>29ccaagccctg caggagaggg agaggataaa ga 32<210>30<211>30<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>3′-側(cè)翼3′引物<400>30ctcgtaacgc gtgtacaagt tgtggaacaa 30<210>31<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>1-LDH 5′引物<400>31acaaatcctg caggatggca agagaggaaa aa 32<210>32<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>1-LDH 3′引物<400>32tatctacctg caggtcattg acgaacctta ac 32<210>33<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PDC1引物<400>33aagcaccaag gccttcaaca g 21<210>34<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>1-LDH 3′引物<400>34tcgatatcgc taaggaacgc g 21<210>35<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PDC1 5′引物<400>35cgcaaagaaa agctccacac c 21
<210>36<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PDC1 3′引物<400>36cccatacgct tataatcccc c 21<210>37<211>1235<212>DNA<213>釀酒酵母ggccgcggat cgctcttccg ctatcgatta attttttttt ctttcctctt tttattaacc60ttaattttta ttttagattc ctgacttcaa ctcaagacgc acagatatta taacatctgc120acaataggca tttgcaagaa ttactcgtga gtaaggaaag agtgaggaac tatcgcatac180ctgcatttaa agatgccgat ttgggcgcga atcctttatt ttggcttcac cctcatacta240ttatcagggc cagaaaaagg aagtgtttcc ctccttcttg aattgatgtt accctcataa300agcacgtggc ctcttatcga gaaagaaatt accgtcgctc gtgatttgtt tgcaaaaaga360acaaaactga aaaaacccag acacgctcga cttcctgtct tcctattgat tgcagcttcc420aatttcgtca cacaacaagg tcctagcgac ggctcacagg ttttgtaaca agcaatcgaa480ggttctggaa tggcgggaaa gggtttagta ccacatgcta tgatgcccac tgtgatctcc540agagcaaagt tcgttcgatc gtactgttac tctctctctt tcaaacagaa ttgtccgaat600cgtgtgacaa caacagcctg ttctcacaca ctcttttctt ctaaccaagg gggtggttta660gtttagtaga acctcgtgaa acttacattt acatatatat aaacttgcat aaattggtca720atgcaagaaa tacatatttg gtcttttcta attcgtagtt tttcaagttc ttagatgctt780tctttttctc ttttttacag atcatcaagg aagtaattat ctacttttta caacaaatct840agaattcgga tccggtagat acattgatgc tatcaatcaa gagaactgga aagattgtgt900aaccttgaaa aacggtgaaa cttacgggtc caagaccctc tacagatttt cctgatttgc960cagcttacta tccttcttga aaatatgcac tctatatctt ttagttctta attgcaacac1020atagatttgc tgtataacga attttatgct attttttaaa tttggagttc agtgataaaa1080gtgtcacagc gaatttcctc acatgtagga ccgaattgtt tacaagttct ctgtaccacc1140atggagacat caaagattga aaatctatgg aaagatatgg acggtagcaa caagaatata1200gcacgagccg cggatttatt tcgttacgca tgcgc 1235<210>38<211>1314<212>DNA<213>釀酒酵母<400>38
ggccgcggat cgctcttccg ctatcgataa caagctcatg caaagaggtg gtacccgcac60gccgaaatgc atgcaagtaa cctattcaaa gtaatatctc atacatgttt catgagggta120acaacatgcg actgggtgag catatgttcc gctgatgtga tgtgcaagat aaacaagcaa180ggcagaaact aacttcttct tcatgtaata aacacacccc gcgtttattt acctatctct240aaacttcaac accttatatc ataactaata tttcttgaga taagcacact gcacccatac300cttccttaaa aacgtagctt ccagtttttg gtggttccgg cttccttccc gattccgccc360gctaaacgca tatttttgtt gcctggtggc atttgcaaaa tgcataacct atgcatttaa420aagattatgt atgctcttct gacttttcgt gtgatgaggc tcgtggaaaa aatgaataat480ttatgaattt gagaacaatt ttgtgttgtt acggtatttt actatggaat aatcaatcaa540ttgaggattt tatgcaaata tcgtttgaat atttttccga ccctttgagt acttttcttc600ataattgcat aatattgtcc gctgcccctt tttctgttag acggtgtctt gatctacttg660ctatcgttca acaccacctt attttctaac tatttttttt ttagctcatt tgaatcagct720tatggtgatg gcacattttt gcataaacct agctgtcctc gttgaacata ggaaaaaaaa780atatataaac aaggctcttt cactctcctt gcaatcagat ttgggtttgt tccctttatt840ttcatatttc ttgtcatatt cctttctcaa ttattatttt ctactcataa cctcacgcaa900aataacacag tcaaatctag aattcggatc cggtagatac attgatgcta tcaatccaga960gaactggaaa gattgtgtag ccttgaaaaa cggtgaaact tacgggtcca agattgtcta1020cagattttcc tgatttgcca gcttactatc cttcttgaaa atatgcactc tatatctttt1080agttcttaat tgcaacacat agatttgctg tataacgaat tttatgctat tttttaaatt1140tggagttcag tgataaaagt gtcacagcga atttcctcac atgtagggac cgaattgttt1200acaagttctc tgtaccacca tggagacatc aaaaattgaa aatctatgga aagatatgga1260cggtagcaac aagaatatag cacgagccgc ggatttattt cgttacgcat gcgc 131權(quán)利要求
1.一種用于轉(zhuǎn)化酵母種的細(xì)胞之重組核酸，其包含與LDH基因上游和下游側(cè)翼序列共價(jià)連接的對(duì)于該酵母種而言外源的LDH基因，該側(cè)翼序列分別與對(duì)于該酵母種天然的靶基因的上游和下游側(cè)翼序列同源，并且含有至少一個(gè)選擇性標(biāo)記。
2.權(quán)利要求1的重組核酸，其中所述LDH基因上游的側(cè)翼序列包括與靶基因啟動(dòng)子序列同源的啟動(dòng)子序列，該LDH基因下游的側(cè)翼序列包括靶基因的終止序列。
3.權(quán)利要求2的重組核酸，其中所述選擇性標(biāo)記與啟動(dòng)子和終止序列有效連接。
4.權(quán)利要求2的重組核酸，其中所述靶基因是PDC基因。
5.權(quán)利要求3的重組核酸，其中所述選擇性標(biāo)記不打斷上游側(cè)翼序列、LDH基因和下游側(cè)翼序列的序列。
6.權(quán)利要求1的重組核酸，其中所述外源乳酸脫氫酶基因來自于瑞士乳桿菌(L.helveticus)或巨大芽孢桿菌(B.megaterium)。
7.酵母種的一種重組細(xì)胞，其中該酵母種在其基因組的基因座內(nèi)含有靶基因，該細(xì)胞具有整合到其基因組內(nèi)的外源乳酸脫氫酶基因，其處于靶基因的啟動(dòng)子和終止序列的功能部分的轉(zhuǎn)錄控制之下，LDH基因在靶基因的基因座處整合，而該靶基因被從細(xì)胞基因組中刪除。
8.權(quán)利要求7的細(xì)胞，其中靶基因是丙酮酸脫羧酶基因。
9.權(quán)利要求7的細(xì)胞，它是酵母屬(Saccharomyces)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、假絲酵母屬(Candida)、畢赤酵母屬(Pichia)、漢森酵母屬(Hansenula)、球擬酵母屬(Torulopsis)或Yamadazyma之一的一個(gè)種。
10.權(quán)利要求9的細(xì)胞，其中所述酵母種是馬克斯克魯維酵母(K.marxianus)、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)、乳酸克魯維酵母(K.lactics)或C.sonorensis。
11.權(quán)利要求8的細(xì)胞，其中乳酸脫氫酶基因來源于瑞士乳桿菌或巨大芽孢桿菌。
12.一種將外源乳酸脫氫酶基因整合到細(xì)胞內(nèi)的方法，其中在整合之前，該細(xì)胞在其基因組的基因座處含有一個(gè)靶基因，該方法包括下列步驟(a)用一種重組核酸轉(zhuǎn)化該細(xì)胞，該核酸具有乳酸脫氫酶(LDH)基因、LDH基因上游和下游的側(cè)翼序列和至少一個(gè)選擇性標(biāo)記基因，該側(cè)翼序列與靶基因上游和下游的側(cè)翼序列同源，使得LDH基因在單交換事件中插入該細(xì)胞的基因組內(nèi)，與靶基因的基因座相鄰，(b)選擇含有LDH基因和選擇性標(biāo)記基因的第一種轉(zhuǎn)化子，(c)非選擇性培養(yǎng)所述第一種轉(zhuǎn)化子，和(d)在所述第一種轉(zhuǎn)化子中選擇含有LDH基因但是刪除了選擇性標(biāo)記基因和靶基因的第二種轉(zhuǎn)化子。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述LDH基因上游的側(cè)翼序列包括與靶基因的啟動(dòng)子序列同源的啟動(dòng)子序列，并且該LDH基因下游的側(cè)翼序列包括靶基因的終止序列。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述靶基因是丙酮酸脫氫酶基因。
15.權(quán)利要求12的方法，其中所述載體還包含與啟動(dòng)子和終止序列有效連接的標(biāo)記基因。
16.權(quán)利要求15的方法，其中與標(biāo)記基因有效連接的啟動(dòng)子和終止序列對(duì)于該酵母菌株而言不是天然的。
17.馬克斯克魯維酵母種的一種細(xì)胞，其具有整合到其基因組內(nèi)的多個(gè)外源乳酸脫氫酶基因，各自處于功能啟動(dòng)子和終止序列的控制之下，其中該馬克斯克魯維酵母細(xì)胞的基因組還含有功能丙酮酸脫羧酶基因。
18.權(quán)利要求17的細(xì)胞，其中所述功能丙酮酸脫羧酶基因?qū)τ隈R克斯克魯維酵母而言是天然的。
19.權(quán)利要求18的細(xì)胞，其中所述功能丙酮酸脫羧酶基因是PDC1基因。
20.權(quán)利要求19的細(xì)胞，其中所述外源乳酸脫氫酶基因來源于瑞士乳桿菌或巨大芽孢桿菌。
21.權(quán)利要求20的細(xì)胞，其含有多個(gè)拷貝的來源于瑞士乳桿菌的乳酸脫氫酶基因。
22.權(quán)利要求20的細(xì)胞，其含有來源于巨大芽孢桿菌的乳酸脫氫酶基因的多個(gè)拷貝。
23.權(quán)利要求20的細(xì)胞，其含有來源于瑞士乳桿菌的乳酸脫氫酶基因的至少一個(gè)拷貝和來源于巨大芽孢桿菌的乳酸脫氫酶基因的至少一個(gè)拷貝。
24.權(quán)利要求21的細(xì)胞，其中乳酸脫氫酶基因的至少一個(gè)拷貝處于TEF1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制之下。
25.權(quán)利要求22的細(xì)胞，其中乳酸脫氫酶基因的至少一個(gè)拷貝處于TEF1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制之下。
26.權(quán)利要求21的細(xì)胞，其中乳酸脫氫酶基因的至少一個(gè)拷貝處于PGK啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制之下。
27.權(quán)利要求22的細(xì)胞，其中乳酸脫氫酶基因的至少一個(gè)拷貝處于PGK啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制之下。
28.權(quán)利要求21的細(xì)胞，其中乳酸脫氫酶基因的至少一個(gè)拷貝處于GAL10終止子的轉(zhuǎn)錄控制之下。
29.權(quán)利要求22的細(xì)胞，其中乳酸脫氫酶基因的至少一個(gè)拷貝處于GAL10終止子的轉(zhuǎn)錄控制之下。
30.權(quán)利要求23的細(xì)胞，其中至少一個(gè)乳酸脫氫酶基因處于TEF1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制之下。
31.權(quán)利要求23的細(xì)胞，其中至少一個(gè)乳酸脫氫酶基因處于PGK啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制之下。
32.權(quán)利要求23的細(xì)胞，其中至少一個(gè)乳酸脫氫酶基因處于GAL10終止子的轉(zhuǎn)錄控制之下。
33.一種將糖發(fā)酵為乳酸的方法，其包括在發(fā)酵條件下在含有可被該細(xì)胞發(fā)酵的糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求7的細(xì)胞。
34.權(quán)利要求33的方法，其中在整個(gè)發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基的pH保持在約pH5-約pH8的范圍內(nèi)。
35.權(quán)利要求33的方法，其中在發(fā)酵過程中由于細(xì)胞產(chǎn)生乳酸，培養(yǎng)基的pH降到約2.5-約5.0。
36.權(quán)利要求34的方法，其中在發(fā)酵過程中由于細(xì)胞產(chǎn)生乳酸，培養(yǎng)基的pH降至約2.5-約3.8。
37.權(quán)利要求33的方法，它還包括將至少一部分乳酸轉(zhuǎn)化為與丙交酯的步驟。
38.權(quán)利要求37的方法，它還包括聚合丙交酯形成聚丙交酯聚合物或共聚物的步驟。
39.一種生產(chǎn)乳酸的方法，包括在發(fā)酵條件下在含有可被該細(xì)胞發(fā)酵的糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求7的細(xì)胞。
40.權(quán)利要求39的方法，其中在整個(gè)發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基的pH保持在約pH5-約pH8的范圍內(nèi)。
41.權(quán)利要求39的方法，其中在發(fā)酵過程中由于細(xì)胞產(chǎn)生乳酸，培養(yǎng)基的pH降至約2.5-約5.0。
42.權(quán)利要求41的方法，其中在發(fā)酵過程中由于細(xì)胞產(chǎn)生乳酸，培養(yǎng)基的pH降至約2.5-約3.8。
43.權(quán)利要求39的方法，它還包括將至少一部分乳酸轉(zhuǎn)化為丙交酯的步驟。
44.權(quán)利要求43的方法，它還包括聚合丙交酯形成聚丙交酯聚合物或共聚物的步驟。
45.一種將糖發(fā)酵為乳酸的方法，包括在發(fā)酵條件下在含有可被該細(xì)胞發(fā)酵的糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求17的細(xì)胞。
46.權(quán)利要求45的方法，其中在整個(gè)發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基的pH保持在約pH5-約pH8的范圍內(nèi)。
47.權(quán)利要求45的方法，其中在發(fā)酵過程中由于細(xì)胞產(chǎn)生乳酸，培養(yǎng)基的pH降至約2.5-約5.0。
48.權(quán)利要求47的方法，其中在發(fā)酵過程中由于細(xì)胞產(chǎn)生乳酸，培養(yǎng)基的pH降至約2.5-約3.8。
49.一種生產(chǎn)乳酸的方法，包括在發(fā)酵條件下在含有可被該細(xì)胞發(fā)酵的糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求17的細(xì)胞。
50.權(quán)利要求45的方法，它還包括將至少一部分乳酸轉(zhuǎn)化為丙交酯的步驟。
51.權(quán)利要求50的方法，它還包括聚合丙交酯形成聚丙交酯聚合物或共聚物的步驟。
52.權(quán)利要求49的方法，其中在整個(gè)發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基的pH保持在約pH5-約pH8的范圍內(nèi)。
53.權(quán)利要求49的方法，其中在發(fā)酵過程中由于細(xì)胞產(chǎn)生乳酸，培養(yǎng)基的pH降至約2.5-約5.0。
54.權(quán)利要求53的方法，其中在發(fā)酵過程中由于細(xì)胞產(chǎn)生乳酸，培養(yǎng)基的pH降至約2.5-約3.8。
55.權(quán)利要求49的方法，它還包括將至少一部分乳酸轉(zhuǎn)化為丙交酯的步驟。
56.權(quán)利要求55的方法，它還包括聚合丙交酯形成聚丙交酯聚合物或共聚物的步驟。
全文摘要
一方面，提供了重組酵母，其具有整合到基因組內(nèi)的多個(gè)外源LDH基因，而天然PDC基因保持完整。第二方面，提供了重組酵母，其具有整合到其基因組內(nèi)天然PDC基因的基因座處的一個(gè)外源LDH基因，而該天然PDC基因已經(jīng)刪除。該重組酵母在生產(chǎn)乳酸的發(fā)酵方法中有用。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1688703SQ03817291
公開日2005年10月26日 申請(qǐng)日期2003年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月30日
發(fā)明者B·豪斯, V·賴格里亞, P·索米寧 申請(qǐng)人:卡吉爾道有限責(zé)任公司