專利名稱：在酵母中生產(chǎn)l-乳酸的方法與材料的制作方法
在酵母中生產(chǎn)L-乳酸的方法與材料本申請要求對2002年5月30提交的美國臨時專利申請?zhí)?60/384,333的優(yōu)先權(quán)。本發(fā)明得到了美國政府的支持，由能源部資助，合同號為 DE-FC-36-00GO10598。美國政府在本發(fā)明中有一定的權(quán)利。發(fā)明背景乳酸具有廣泛的工業(yè)適用性，包括在化學(xué)加工和合成、化妝品、制 藥、塑料和食品生產(chǎn)中的用途。大多數(shù)工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)乳酸的方法都是 發(fā)酵法。這些發(fā)酵方法使用不同的產(chǎn)乳酸細(xì)菌。最近的研究探索了重組酵母株在乳酸發(fā)酵方法中的用途。重組酵母 與細(xì)菌發(fā)酵相比可能有幾個優(yōu)點。 一些酵母抹更能耐受較高的溫度。這 可能允許更高溫度的發(fā)酵，這可以翻譯成更快的發(fā)酵速度。對高溫的更 好的耐受性能夠使清除發(fā)酵培養(yǎng)基的污染微生物變得更加容易，因為只 需將培養(yǎng)基加熱到希望的種能夠耐受而不希望的種死亡的溫度。產(chǎn)乳酸 細(xì)菌，如乳酸桿菌，其高效生產(chǎn)需要復(fù)雜的發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基的 復(fù)雜性增加了原料的成本，并且使得從培養(yǎng)基中分離乳酸更加困難且昂 貴。使用重組酵母，通過使用簡化的發(fā)酵培養(yǎng)基，提供了降低成本的可 能性。另外，有些酵母林比產(chǎn)乳酸細(xì)菌更能耐受降低的pH條件。這可能 是一個非常重要的特征，因為當(dāng)乳酸產(chǎn)生時，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH自然下 降。在常規(guī)方法中，必須使用一種堿，如氫氧化鈣或碳酸鈣，來緩沖培 養(yǎng)基，使其pH約為5-8。它中和酸，形成一種乳酸鹽。這種乳酸鹽在 隨后的步驟中必須分開，以便以希望的酸的形式回收乳酸鹽。因此，需 要緩沖發(fā)酵培養(yǎng)基導(dǎo)致增加原材料(緩沖劑， 一般是硫酸，用來分解乳 酸鹽)、其它處理步驟(再生游離酸)和廢物(最常見的是鹽分解步驟產(chǎn)生
的碳酸鈣)處理等明顯的額外費用。如果發(fā)酵能夠在低pH下進(jìn)行，則這 些費用能夠明顯減少。因此，成功開發(fā)能夠耐受低pH培養(yǎng)基的產(chǎn)乳酸 林是非常希望的。Porro及同事構(gòu)建了一種產(chǎn)乳酸酵母，構(gòu)建方法是將一種外源LDH (乳酸脫氫酶)基因插入釀酒酵母(X c^eWwVie)、乳酸克魯維酵母(K /atC/c)、 71. ^幼 "A:,7和Z. 6似7//種的酵母細(xì)胞內(nèi)，并破壞細(xì)胞的天然 丙酮酸途徑。參見Porro等人，"用于生產(chǎn)乳酸的代謝工程釀酒酵母細(xì) 胞的研發(fā)"，Biotechnol. Prog. 1995 May-Jun;ll(3):294-8; Porro等人， "為了由工程酵母大規(guī)模生產(chǎn)乳酸， 一種代謝途徑的替換"，App. Environ. Microbiol. 1999 Sep:65(9):4211國5; Bianchi等人，"用異源LDH 基因轉(zhuǎn)化的丙酮酸利用缺陷的乳酸克魯維酵母林的高效同型乳酸發(fā) 酵，，，App. Environ. Microbiol. 2001 Dec;67(12) 5621-5。 Porro能夠生產(chǎn) 一種產(chǎn)乳酸的重組酵母，但是該菌林的表現(xiàn)幾乎不足以在任何工業(yè)化生 產(chǎn)過程中使用。為了獲準(zhǔn)在工業(yè)環(huán)境中使用，該菌林必須有良好的乳酸 收率(即底物向乳酸的高轉(zhuǎn)化率)和高生產(chǎn)率(即底物向乳酸的快速代 謝)。該酵母優(yōu)選地能夠耐受含有高滴度乳酸的培養(yǎng)基。最近，Rajgarhia及同事生產(chǎn)了比Porro的酵母顯示更高收率和生 產(chǎn)率的重組酵母。參見，例如WO 00/71738、 WO 02/42471和 PCT/US02/16223。然而，希望產(chǎn)生收率和/或生產(chǎn)率進(jìn)一步提高的重組 酵母。具體而言，希望產(chǎn)生一種重組酵母林，它在有利于乳酸生產(chǎn)的厭 氧和/或^:需氧條件下以良好的收率和生產(chǎn)率產(chǎn)生乳酸。發(fā)明概述一方面，本發(fā)明是將外源乳酸脫氫酶基因整合到酵母細(xì)胞內(nèi)的 一種 方法，其中在整合之前，該細(xì)胞在其基因組的一個基因座處具有一個耙 定的基因，該方法包括下列步驟(a)用一種重組核酸轉(zhuǎn)化該細(xì)胞，該核 酸含有乳酸脫氫酶(LDH)基因、LDH基因上游(即5，)和下游(即3，)的側(cè) 翼序列和至少 一個選擇性標(biāo)記基因，該側(cè)翼序列與耙定的基因上游和下 游的側(cè)翼序列同源，其中LDH基因插入細(xì)胞基因組內(nèi)，與靶定的基因的基因座相鄰，(b)通過在選擇劑存在下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，獲得第一種轉(zhuǎn)化 細(xì)胞，其含有LDH基因和選擇性標(biāo)記基因，(c)在非選擇性培養(yǎng)基中培 養(yǎng)所述第一種轉(zhuǎn)化細(xì)胞，和(d)由所述笫一種轉(zhuǎn)化細(xì)胞獲得第二種轉(zhuǎn)化細(xì) 胞，其含有LDH基因，但是刪除了選擇性標(biāo)記基因和靶定的基因。在 優(yōu)選的酵母細(xì)胞中，耙定的基因有利地是丙酮酸脫羧酶(PDC)、醇脫氬 酶(ADH)、乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶(wm3)和3-異丙基蘋果酸脫氬酶在本發(fā)明的這一方面，選擇性標(biāo)記基因和靶定的基因的刪除在一定 比例的第一種轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)自發(fā)發(fā)生。結(jié)果，插入的LDH與功能啟動子 和終止序列有效連接，后者與靶基因的啟動子和終止序列同源。本發(fā)明的第二方面是用于轉(zhuǎn)化一個酵母種的細(xì)胞的一種重組核酸， 它含有至少一個選擇性標(biāo)記和對于該酵母種外源的LDH基因，其與 LDH基因上游(5，)和下游(3，)的側(cè)翼序列連接，該側(cè)翼序列分別與對于 該酵母種天然的一種基因的上游和下游側(cè)翼序列同源。本發(fā)明的第三方面是一個酵母種的一種重組細(xì)胞，其中該酵母種在 其基因組的一個基因座處含有一個天然的靶定的基因。該重組細(xì)胞含有 外源乳酸脫氳酶(LDH)基因，該基因整合到基因組內(nèi)的靼定的基因位點 處，且該靶定的基因已經(jīng)刪除。整合的LDH基因與功能啟動子和終止 序列有效連接，后者與靶定的基因的啟動子和終止序列同源。這些重組 酵母細(xì)胞在發(fā)酵方法中使用時，顯示出人意料地高的由碳水化合物底物 產(chǎn)生乳酸的收率，以及高生產(chǎn)率。該重組細(xì)胞也能夠產(chǎn)生高滴度的乳酸。 盡管本發(fā)明不局限于任何理論，但是認(rèn)為在天然基因的基因座處插入 LDH基因，以及使用如此處所述的天然啟動子和終止子，能夠使細(xì)胞 利用現(xiàn)有的基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)，并且使插入的LDH基因起作用。眾所周知， 當(dāng)細(xì)胞處于厭氧或微需氧發(fā)酵條件下時，非常有利于產(chǎn)生乳酸的代謝途 徑。因此，本發(fā)明的第四方面是將碳水化合物發(fā)酵為乳酸的一種方法， 包括在發(fā)酵條件下在含有可被該細(xì)胞發(fā)酵的碳水化合物的培養(yǎng)基中培 養(yǎng)產(chǎn)生的細(xì)胞。本發(fā)明的第五方面是馬克斯克魯維酵母種的一種細(xì)胞，其具有整合 到其基因組內(nèi)的多個外源乳酸脫氫酶基因，每個基因都在功能啟動子和 終止序列的控制之下，其中該馬克斯克魯維酵母細(xì)胞的基因組還含有一 個功能丙酮酸脫羧酶基因。令人驚訝的是，使用這種細(xì)胞獲得極高的乳酸生產(chǎn)率和收率，以及出乎意料地低的乙醇收率，甚至在低pH發(fā)酵條 件下仍然如此。本發(fā)明不局限于任何理論，認(rèn)為通過使PDC途徑保持 完整，該細(xì)胞能夠更好地利用現(xiàn)有的代謝途徑使其代謝過程保持平衡， 有利于細(xì)胞的總體健康和生存力。因此，本發(fā)明的第六方面是將碳水化 合物發(fā)酵為乳酸的一種方法，包括在發(fā)酵條件下在含有可被該細(xì)胞發(fā)酵 的碳水化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得的細(xì)胞。根據(jù)以下某些優(yōu)選實施方案和權(quán)利要求書的更詳細(xì)描述，本發(fā)明的 具體的優(yōu)選實施方案將易于理解。附圖簡述

圖1是顯示pNC2質(zhì)粒的圖。 圖2是顯示pNC4質(zhì)粒的圖。 圖3是顯示pVR22質(zhì)粒的圖。 圖4是顯示pVR29質(zhì)粒的圖。圖5是顯示由pPSl質(zhì)粒和pNC14質(zhì)粒構(gòu)建pPS9質(zhì)粒的圖。 圖6是顯示pVR39質(zhì)粒的圖，其含有瑞士乳桿菌L-LDH基因和 G418抗性標(biāo)H圖7是顯示pVRl質(zhì)粒的圖，其含有瑞士乳桿菌L-LDH編碼基因 序列、釀酒酵母pTEFl啟動子和大腸桿菌EM7啟動子。 圖8是顯示pS018質(zhì)粒的圖。 圖9是顯示pS019質(zhì)粒的圖。 圖10是顯示pSO20質(zhì)粒的圖。圖11是顯示pVR41質(zhì)粒的圖，其含有瑞士乳桿菌L-LDH基因和 G418抗性標(biāo)H圖12是顯示pCA3質(zhì)粒的圖，其含有巨大芽孢桿菌L-LDH基因和 G418選擇性標(biāo)記。
圖13是顯示pVR24質(zhì)粒的圖。圖14是顯示pVR38質(zhì)粒的圖，其含有巨大芽孢桿菌L-LDH基因 和潮霉素抗性基因。圖15a是顯示pBH5a質(zhì)粒構(gòu)建的圖。圖15b是顯示由pVR29和pBH5a質(zhì)粒構(gòu)建pBH5b質(zhì)粒的圖。 圖16是顯示pBH8質(zhì)粒的圖。圖17A和17B是根據(jù)本發(fā)明的一個方面，可能與外源LDH基因定 向整合到酵母染色體內(nèi)有關(guān)的遺傳事件的示意圖。發(fā)明詳述在本發(fā)明的前兩個方面， 一種外源LDH基因整合到酵母細(xì)胞的基 因組內(nèi)，位于靶定的天然基因的基因座處，且該靶定的天然基因已經(jīng)刪 除。該外源LDH基因與一個啟動子序列和一個終止序列有效連接，這 兩種序列分別與該靶定的基因的啟動子和終止序列同源。對于本發(fā)明，如果一種基因、啟動子或終止子(l)未在未修飾細(xì)胞的 基因組內(nèi)發(fā)現(xiàn)，并且(2)不與未修飾細(xì)胞的基因組內(nèi)存在的遺傳物質(zhì)同 源，則認(rèn)為它們是"外源的"。在此使用時， 一種基因、終止子或啟動子 如果在該酵母種的未修飾細(xì)胞的基因組內(nèi)發(fā)現(xiàn)(除了不影響其功能的個 體-個體突變之外)，則它們對于該酵母種是"天然的"。一種基因、啟動子、終止子或其它基因組物質(zhì)，如果在核普酸序列 上與其它遺傳物質(zhì)相同，即具有至少75%、 80%、 85%、卯％、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%或約99%的同一性，或者 如果不同，而是與之足夠相似，從而保持其功能，則認(rèn)為該基因、啟動 子、終止子或其它基因組物質(zhì)與其它遺傳物質(zhì)"同源"。因此，甚至如果 遺傳物質(zhì)例如由于點突變、堿基對的缺失或添加而含有不同，只要這些 突變、缺失或添加不影響該遺傳物質(zhì)的功能，則認(rèn)為它們是"同源的"。 對于側(cè)翼序列，如果該序列與天然基因的側(cè)翼序列足夠相似，以致側(cè)翼 序列均能夠參與與天然基因側(cè)翼序列的單交換事件，則同源性是確定 的。
如本領(lǐng)域所知，術(shù)語"同 一性"是指兩種或多種多肽分子或兩種或多 種核酸分子的序列之間的關(guān)系，通過比較它們的序列確定。在本領(lǐng)域中，"同 一性"也指核酸分子或多肽之間的序列相關(guān)性(relatedness)的程度， 視情況不同，根據(jù)兩種或多種核苷酸串或兩種或多種氨基酸序列之間的 匹配確定。"同一性"決定兩種或多種序列中的較小序列與通過具體數(shù)學(xué) 模型或計算機程序(即"算法")進(jìn)行的缺口比對(如果有的話)之間相同匹 配的百分比。術(shù)語"相似性"在本領(lǐng)域中用于一種相關(guān)的概念，但是與"同 一性"不 同，"相似性"是指相關(guān)性的量度，包括相同的匹配和保守置換匹配。如 杲兩種多肽序列例如有10/20個相同的氨基酸，并且其余的都是非保守 置換，則百分同一性和相似性都是50%。如果在同一個實例中，有5 個以上的位點是保守置換，則百分同一性仍為50%，但是百分相似性將 是75% (15/20)。因此，在保守置換的情況下，兩種多肽之間的百分相 似性將高于這兩種多肽之間的百分同一性。相關(guān)核酸和多肽的同一性和相似性能夠用已知的方法容易地計算。 這些方法包括但不限于以下所述《計算分子生物學(xué)》(Lesk，A.M.編著), 1988， Oxford University Press, New York;《生物計算信息學(xué)和基因 組計劃》(Smith, D.W.編著)，1993， Academic Press, New York;《序列 數(shù)據(jù)的計算機分析》，第l部分(Griffin， A.M.和Griffin, H.G.編著)，1994, Humana Press, New Jersey; von Heinje， G.， 《分子生物學(xué)中的序列分 析》，1987， Academic Press;《序歹'〗分4斤引物》(Gribskov， M.和Devereux， J.編著)，1991， M. Stockton Press, New York; Carillo等人，1988， SIAM J. Applied Math" 48:1073; Durbin等人，1998，《生物序列分析》， Cambridge University Press 。確定同 一性的優(yōu)選方法是用來獲得所測序列之間的最大匹配。確定 同 一 性的方法在可以公開獲得的計算機程序中描述。測定兩種序列之間 同一性的優(yōu)選計算機程序方法包括但不限于GCG程序包，包括GAP (Devereux等人，1984， Nud. Acid. Res" 12:387;遺傳學(xué)計算機小組 (Genetics Computer Group), University of Wisconsin, Madison, WI)、BLASTP、 BLASTN和FASTA (Altschul等人，1990， J. Mol. Biol.， 215:403-410)。 BLASTX程序可以從國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)和其 它來源(BLAST手冊，Altschul等人.NCB/NLM/NIH Bethesda， MD20894; Altschul等人，1990,同上)公開獲得。也可以利用眾所周知 的Smith Waterman算法確定同一性。用于比對兩種氨基酸或多核苷酸序列的某些算法可以使兩個序列 只有一個短區(qū)匹配，這個小比對區(qū)可能具有極高的序列同一性，盡管這 兩個全長序列之間沒有明顯的關(guān)系。因此，在某些實施方案中，選擇的 比對方法(GAP程序)將使比對覆蓋靶多肽的至少50個連續(xù)氨基酸。在 某些實施方案中，這種比對能夠包含靶多肽的至少60、 70、 80、 90、 100、 110或120個氨基酸。如果利用GAP比對多核苷酸，則這種比對能夠 覆蓋至少約IOO、 150或200個核苷酸，它們可能是連續(xù)的。例如，利用計算機算法GAP (遺傳學(xué)計算機小組，University of Wisconsin, Madison, WI)，比對將要測定百分序列同 一性的兩種多肽的 各自氨基酸的最佳匹配("匹配范圍，，，取決于算法)。在某些實施方案中， 開放空位罰分(計算為平均對角線的三倍；其中"平均對角線，，是使用的 比較矩陣的對角線的平均值；"對角線"是通過具體比對矩陣歸屬每個完 美氨基酸匹配的得分或數(shù)字)和延伸空位罰分(通常為開放空位罰分的十 分之一)，以及比較矩陣，如PAM250或BLOSUM 62，與該算法一起 使用。在某些實施方案中，該算法也使用一種標(biāo)準(zhǔn)比較矩陣(關(guān)于PAM 250比較矩陣，參見Dayhoff等人，1978， Atlas of Protein Sequence and Structure, 5:345-352;關(guān)于BLOSUM 62比較矩陣，參見Henikoff等人， 1992， Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10915-10919)。在某些實施方案中， 一種多肽序列比較的參數(shù)包括下列參數(shù)算法Needleman等人，1970， J. Mol. Biol" 48:443-453;比較矩陣BLOSUM 62，來自Henikoff等人，1992，同上；空位罰分12空位長度罰分4相似性閾值0 GAP程序可以使用上述參數(shù)。對于核苷酸序列，參數(shù)可能包括50 的空位罰分和3的空位長度罰分，每個空位中每個符號的罰分為3。在 某些實施方案中，為了利用GAP算法進(jìn)行多肽比較(末端空位無罰分)， 上述參數(shù)是缺省參數(shù)。"側(cè)翼序列"是一種基因的上游(即5，)或下游(即3，)的堿基對序列。 側(cè)翼序列可以與該基因直接相鄰，或者與該基因分開 一段適中的堿基對 序列，如1-1000個，優(yōu)選地1-100個堿基對。本發(fā)明的重組核酸中使用 的側(cè)翼序列與靶基因的相應(yīng)側(cè)翼序列同源。側(cè)翼序列的長度足以使其參 與與天然基因的相應(yīng)側(cè)翼序列的單交換事件。有用的側(cè)翼序列的長度為 約50-約4000個堿基對，優(yōu)選地約100-約2000個堿基對，特別是可達(dá) 約1200個堿基對。上游側(cè)翼序列優(yōu)選地含有靶基因的一個啟動子，下 游側(cè)翼序列優(yōu)選地含有 一個終止序列。在優(yōu)選實施方案中，側(cè)翼序列分別與天然酵母的啟動子和終止序列 同源或者包含后者。最優(yōu)選地，重組核酸向酵母基因組染色體DNA中 靶基因的基因座內(nèi)的整合使得它們編碼的外源LDH基因處于包含該側(cè) 翼序列的天然基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列的轉(zhuǎn)錄控制之下。如此處所用的術(shù)語"啟動子"是指未轉(zhuǎn)錄的序列，它位于一種結(jié)構(gòu)基 因的翻譯起始密碼子的上游(即5')(通常在約1-1000 bp以內(nèi)，優(yōu)選地在 1-500 bp以內(nèi)，特別是1-100 bp以內(nèi))，控制一種結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄起始， 或者以其它方式控制該基因的轉(zhuǎn)錄。類似地，術(shù)語"終止子"是指未轉(zhuǎn)錄的序列，它位于一種結(jié)構(gòu)基因的 翻譯終止密碼子的下游(即3')(通常在約1-1000 bp以內(nèi)，更一般地在 1-500個堿基對以內(nèi)，特別是在1-100個堿基對以內(nèi))，控制該結(jié)構(gòu)基因 的轉(zhuǎn)錄終止，或者以其它方式控制該基因的轉(zhuǎn)錄。在本發(fā)明內(nèi)，視情況而定，如果一種啟動子或終止子在整合到酵母 基因組內(nèi)后起作用，控制一種結(jié)構(gòu)基因(例如LDH基因或選擇性標(biāo)記基 因)的轉(zhuǎn)錄，則該結(jié)構(gòu)基因與該啟動子或終止子"有效連接"。如此處所用的術(shù)語"轉(zhuǎn)化"是指細(xì)胞遺傳特征的一種變化，當(dāng)一種細(xì) 胞被修飾而含有新的核酸時，該細(xì)胞被轉(zhuǎn)化。因此，當(dāng)一種細(xì)胞由其天
然狀態(tài)遺傳修飾時，該細(xì)胞被轉(zhuǎn)化。例如，在轉(zhuǎn)染后，轉(zhuǎn)化的DNA優(yōu) 選地通過物理整合到細(xì)胞染色體內(nèi)與細(xì)胞基因組DNA重組。此外，至 少是瞬時地(即在細(xì)胞轉(zhuǎn)化48-96小時內(nèi))，核酸能夠作為一種附加體元 件短暫保持，而不復(fù)制，或者可以作為質(zhì)粒獨立地復(fù)制。當(dāng)DNA整合 到染色體內(nèi)并且隨著細(xì)胞分裂而復(fù)制時，則認(rèn)為該細(xì)胞已經(jīng)被穩(wěn)定地轉(zhuǎn) 化。術(shù)語"轉(zhuǎn)染"用來指細(xì)胞攝取外來或外源DNA，當(dāng)外源DNA被導(dǎo)入 細(xì)胞膜內(nèi)時，該細(xì)胞被"轉(zhuǎn)染"。本領(lǐng)域公知大量轉(zhuǎn)染技術(shù)。參見，例如 Graham等人，1973, Virology 52:456; Sambrook等人，2001，《分子克 隆，實驗室手冊》，Cold Spring Harbor Laboratories; Davis等人，1986, 《分子生物學(xué)基本方法》，Elsevier; Chu等人，1981， Gene 13:197。這 些技術(shù)能夠用來將一種或多種外源DNA種導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，產(chǎn)生一種重組核酸，其含有與側(cè)翼序 列連接的一個外源LDH基因和至少一種選擇性標(biāo)記。術(shù)語"重組核酸" 在此是指用來向宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)編碼信息的任何分子(例如核酸 片段、質(zhì)粒或病毒)。合適的側(cè)翼序列能夠如下獲得確定目標(biāo)整合位 點，如酵母細(xì)胞基因組中的靶基因，獲得位于該位點側(cè)翼的序列(使用 任何一種適當(dāng)?shù)姆椒?，包括但不限于化學(xué)合成、重組遺傳技術(shù)或體外擴(kuò) 增)，將這些序列摻入重組核酸中希望的位點處(例如，通過共價連接分 別位于LDH編碼序列5，和3，的側(cè)翼序列)。然后利用任何適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化 技術(shù)，用該重組核酸轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。這樣獲得細(xì)胞，其中至少一個含有 LDH基因的重組核酸片段整合到酵母細(xì)胞的基因組內(nèi)。該重組核酸包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，它們更優(yōu)選地處于其 自身啟動子和終止序列的轉(zhuǎn)錄控制之下。標(biāo)記基因的啟動子和終止序列 優(yōu)選地不與靶基因的啟動子和終止序列同源。選擇性標(biāo)記基因及其各自 的啟動子和終止子優(yōu)選地不打斷上游側(cè)翼序列-LDH基因-下游側(cè)翼序 列的序列。選擇性標(biāo)記基因及其各自的啟動子和終止子優(yōu)選地位于載體 上LDH啟動子序列(和其它側(cè)翼序列，如果存在的話)的上游(5，)。在生產(chǎn)本發(fā)明的重組核酸和細(xì)胞中以及在實施本發(fā)明的方法中有
用的含有LDH基因的優(yōu)選酵母種包括瑞士乳桿菌(1""<^ "'// 5 Ae/ve《/c附)、乳酸片球菌(iVrf/ococc"s flfc/flto/a"i'ci)、 干酪乳桿菌 (La"o6a"7/ws casei)、耐熱克魯維酵母(jRT,Mj;veiY7附j(luò);ces狄er附oto/mi附)、 戴爾有孢圓酵母(r^"/fl印om rfe你r""/^T)、 粟酒裂殖酵母 (5^/柳acc/r"/Y 附j(luò);ce51 "附6//)、米根霉(及A/zo戸s wjzfle)和巨大芽孑包桿菌 (及/ 化《&〃'"附)。具體而言，能夠分離含有適當(dāng)L-乳酸脫氫酶基因的菌 林，用來生產(chǎn)本發(fā)明的重組核酸。兩種優(yōu)選的L-乳酸脫氫酶基因是瑞士 乳桿菌和巨大芽孢桿菌L-乳酸脫氫酶。典型的選擇性標(biāo)記基因編碼的蛋白質(zhì)(a)為宿主細(xì)胞提供對抗生素 或其它毒素如zeocin (印度斯坦鏈異壁菌(5^r印似"〃We/c/f"s / > /附似《附) 的ble博來霉素抗性基因)、G418(Tn卯3的卡那霉素抗性基因)、潮霉素 (來自大腸桿菌的氨基糖甙類抗生素抗性基因)、氨爺青霉素、四環(huán)素或 卡那霉素的抗性；(b)補充細(xì)胞的營養(yǎng)缺陷，如亮氨酸缺陷(Leu2);或(c) 提供無法從簡單培養(yǎng)基中獲得的重要養(yǎng)分，例如ura3。優(yōu)選的選擇性標(biāo) 記包括Zeocin抗性基因、G418抗性基因和潮霉素抗性基因等非限制性 實例。本發(fā)明的重組核酸也可以含有一個或多個限制性酶切位點，它們可 以使該分子-皮酶切，形成含有LDH基因、啟動子和側(cè)翼序列、標(biāo)記基 因和有關(guān)啟動子和終止子等的線性片段，用于向酵母細(xì)胞的基因組內(nèi)插 入。本發(fā)明的重組核酸還可以含有一個骨架部分。骨架部分有利地含有 復(fù)制起點(在酵母或細(xì)菌中有效，允許產(chǎn)生有用的量的核酸)和其它有用 的特征，方便地由可商品獲得的酵母載體獲得。用本發(fā)明的重組核酸轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域中公 知，可包括如電穿孔、基于氯化鈣或乙酸鋰的方法等非限制性實例。轉(zhuǎn) 化中使用的本發(fā)明的重組核酸能夠在使用前用具體限制性內(nèi)切酶消化， 或者不消化。因為LDH基因的側(cè)翼序列顯示與位于靼基因側(cè)翼的序列 高度同源，上游側(cè)翼序列/LDH基因/下游側(cè)翼序列片段的插入可能在耙 基因的基因座處發(fā)生。
靶基因是希望用LDH基因替換的任何基因。 一種優(yōu)選的靶基因是 丙酮酸脫羧酶基因，因為替換該基因可破壞產(chǎn)生乙醇的 一個竟?fàn)幫緩健?另外，丙酮酸基因在酵母種中傾向于具有活性，因此在PDC啟動子和 終止子控制下向基因組內(nèi)插入LDH基因有助于產(chǎn)生一種良好地表達(dá) LDH的突變體。其它優(yōu)選的靶基因有ADH、 Leu2和Ura3。由于用本發(fā)明的重組核酸轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，通過在針對選擇性標(biāo)記的 選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)選擇的重組細(xì)胞，并且在非選擇性條件下進(jìn)一步培養(yǎng)選擇的轉(zhuǎn)化子，獲得含有外源LDH基因的重組酵母細(xì)胞，該基因中 含有整合到酵母染色體靶基因的基因座內(nèi)的重組核酸。如根據(jù)本發(fā)明的 方法獲得的，這些細(xì)胞已經(jīng)刪除了靶基因，并且整合的外源D-LDH基 因插入耙基因的基因座內(nèi)，使其與靶基因的表達(dá)控制序列(如啟動子和 終止序列)有效連接，并且處于后者的轉(zhuǎn)錄控制下。當(dāng)靶基因是一種PDC 基因時，發(fā)生PDC刪除的細(xì)胞在厭氧條件下不能良好地生長。因此， 通過暴露于厭氧條件下能夠篩選鑒定并選擇的細(xì)胞的菌落。不能生長的 菌落被鑒定為已經(jīng)發(fā)生PDC刪除的菌落。類似地，根據(jù)與每種靶基因 缺失有關(guān)的表型能夠鑒定向其它任何靶基因內(nèi)的定向整合。圖17A和17B顯示可以產(chǎn)生這種結(jié)果的遺傳事件的示意圖。如圖 17B所示，選擇性標(biāo)記基因能夠與靶基因的刪除一起自發(fā)地刪除。篩選 選擇性標(biāo)記基因已經(jīng)刪除的轉(zhuǎn)化子是優(yōu)選的，因為具有某些特性，如耐 藥性提高的遺傳工程酵母細(xì)胞可能產(chǎn)生不希望的環(huán)境危險。產(chǎn)生的酵母細(xì)胞丟失了靶基因，含有整合到酵母細(xì)胞基因組內(nèi)，位 于靶基因的基因座處的一個外源D-LDH基因。LDH基因處于一個啟動 子序列和一個終止序列的轉(zhuǎn)錄控制下，這兩個序列與靶基因的啟動子和 終止序列同源。如圖17B所見，LDH啟動子和終止序列可以是在用來轉(zhuǎn)化細(xì)胞的 重組核酸所含側(cè)翼序列中存在的序列，或者可以是最初存在于細(xì)胞基因 組整合位點處的序列。靶基因的終止子保留而整合載體中存在的終止序 列缺失也是可能的。適于在本發(fā)明的第一和第二方面進(jìn)行轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞包括來自下
列屬的酵母細(xì)胞假絲酵母屬(CVwi力V/fl)、酵母屬0^cchiw^c^)、克魯 維酵母屬(X/wve/wMjY^)、畢赤酵母屬(P/cAiVi)、漢森酵母屬 (好""^""/ )。優(yōu)選不能積累丙酮酸(鹽)，即可將丙酮酸(鹽)自然代 謝為乙醇或其它代謝產(chǎn)物的酵母細(xì)胞。來自假絲酵母屬和克魯維酵母屬 的細(xì)胞是特別優(yōu)選的。特別優(yōu)選的細(xì)胞是C. ^"o/ww/s和馬克斯克魯維 酵母。本發(fā)明第五方面的細(xì)胞是馬克斯克魯維酵母種的重組細(xì)胞。這些細(xì) 胞一般通過略微不同的轉(zhuǎn)化方法制備，但是上述方法是合適的，只要把 基因不是PDC基因。在此情況下，重組核酸并非用于在酵母細(xì)胞的天 然PDC基因的基因座處定向插入。因此，用來轉(zhuǎn)化細(xì)胞的載體一般不 含與酵母細(xì)胞的天然PDC基因的側(cè)翼序列高度同源的側(cè)翼序列。第五方面的細(xì)胞一般通過兩次或多次轉(zhuǎn)化制備，每次引入一個拷貝 的LDH基因。然而，也能夠構(gòu)建含有多個LDH基因的重組核酸，從而 使得多個LDH基因能夠一步插入。因此，用來轉(zhuǎn)化細(xì)胞的一個或多個 載體含有一個或多個LDH基因，每個均與一個啟動子和一個終止子有 效連接。如前所述，該一個或多個重組核酸也可以含有多個標(biāo)記基因， 每一個均處于啟動子和終止序列的控制之下，它們優(yōu)選地不是對于酵母 細(xì)胞天然的PDC啟動子和終止序列。合適的LDH基因包括以上關(guān)于本發(fā)明的前三個方面所述的基因。 優(yōu)選瑞士乳桿菌L-LDH和巨大芽孢桿菌基因L-LDH基因。用多個LDH 基因，即至少兩個這樣的基因，優(yōu)選地約2-10個這樣的基因，更優(yōu)選 地2-5個這樣的基因轉(zhuǎn)化這些細(xì)胞。插入的LDH基因可以全部是相同 的基因，或者可以由兩種或多種不同類型的LDH基因(即來自一個以上 的種的基因)組成。優(yōu)選含有兩個或多個拷貝的瑞士乳桿菌L-LDH基因 的重組酵母細(xì)胞，含有兩個或多個拷貝的巨大芽孢桿菌L-LDH基因的 重組酵母細(xì)胞，以及含有瑞士乳桿菌和巨大芽孢桿菌L-LDH基因各至 少一個拷貝的重組酵母細(xì)胞。在形成第五方面的細(xì)胞中供LDH使用的適當(dāng)啟動子包括用于酵母 基因磷酸甘油酸激酶(PGK)、甘油醛-3-磷酸脫氬酶(TDH)、丙酮酸脫羧 酶(PDC)(來自馬克斯克魯維酵母以外的種)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)、轉(zhuǎn) 錄增強因子-l(TEF)、噤呤-胞嘧啶通透酶(PCPL3)和醇脫氫酶(ADH)的 啟動子。本發(fā)明優(yōu)選的啟動子包括釀酒酵母PGK啟動子和釀酒酵母 PDC1啟動子。合適的終止子包括來自釀酒酵母或其它酵母種的GAL10和CYC-1 終止子。合適的選擇性標(biāo)記如本發(fā)明前三方面所述。當(dāng)以多個步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)化時，細(xì)胞首先用至少含有一個LDH基因的 第一種載體轉(zhuǎn)化。然后通常利用存在選擇性標(biāo)記產(chǎn)生的特性，篩選成功 轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。成功的轉(zhuǎn)化子然后另外轉(zhuǎn)化一次或多次，直到獲得最終的 細(xì)胞，其含有希望的數(shù)量和類型的外源LDH基因。轉(zhuǎn)化的本發(fā)明的酵母細(xì)胞可用于利用一種發(fā)酵方法由碳水化合物 生產(chǎn)乳酸。發(fā)酵能夠用任何適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵方法進(jìn)行。這些細(xì)胞一般使用一 種含有能夠被該細(xì)胞代謝為丙酮酸(鹽)的碳水化合物的發(fā)酵培養(yǎng)基， 并且暴露于可以發(fā)生發(fā)酵的條件下。發(fā)酵培養(yǎng)基也含有提高細(xì)胞生存力 的養(yǎng)分(如氮、磷、硫、痕量無機物等的來源)。能夠使用的具體碳水化合物取決于具體的宿主細(xì)胞，以及該宿主細(xì) 胞是否工程改造為能夠?qū)⑷魏我环N具體碳水化合物代謝為丙酮酸(鹽)。 優(yōu)選己糖，如葡萄糖和果糖，葡萄糖寡聚體，如麥芽糖、異麥芽糖、麥 芽三糖、淀粉和蔗糖，麥芽糊精和木糖(一種戊糖)。次優(yōu)選的碳水化合 物包括半乳糖、甘露糖和阿拉伯糖。發(fā)酵過程中的溫度可以是從大約室溫，更優(yōu)選地從大約30。C,更優(yōu) 選地從大約35°C ，到大約55°C ，更優(yōu)選地大約50°C ，更優(yōu)選地大約45°C 。 最高溫度在一定程度上取決于具體的宿主細(xì)胞。例如，當(dāng)宿主細(xì)胞是馬 克斯克魯維酵母時，(本發(fā)明任一方面的)重組細(xì)胞能夠耐受相對較高的 溫度(如40。C以上，可達(dá)50。C，特別是可達(dá)45。C)。另外一個優(yōu)選的宿 主種是C. M"ore附/s，它能夠耐受可達(dá)約4(TC的溫度。這一溫度范圍提 供了在較高溫度下進(jìn)行發(fā)酵的可能性(從而降低了冷卻成本)，而沒有明 顯的生產(chǎn)率損失。良好的高溫耐受的另一個優(yōu)點是，如果發(fā)酵被一種不 希望的微生物污染，則在許多情況下，能夠通過將發(fā)酵培養(yǎng)基加熱到40。C或以上，特別是45。C或以上，選擇性地殺死這種不希望的^L生物， 而不會明顯損傷本發(fā)明的重組細(xì)胞。在發(fā)酵過程中，發(fā)酵培養(yǎng)基中的細(xì)胞濃度一般是約1-150克干細(xì)胞 /升發(fā)酵培養(yǎng)基，優(yōu)選地約3-10克干細(xì)胞/升發(fā)酵培養(yǎng)基，更優(yōu)選地約3-6 克干細(xì)胞/升發(fā)酵培養(yǎng)基。在發(fā)酵的生產(chǎn)階段，在某些情況下優(yōu)選地可以微需氧操作，而不是 嚴(yán)格厭氧操作。能夠為每種微生物建立最佳通氣條件，方法是測量氧吸 收比速度(OUR),并將該速度與收率、底物消耗率和希望的發(fā)酵產(chǎn)物的 生產(chǎn)率相關(guān)聯(lián)。在許多情況下，在具體OUR范圍內(nèi)優(yōu)化收率和生產(chǎn)率。 對于含有PDC破壞的酵母，最佳OUR值傾向于在約0,8-約3.5 mmol 02/ 干重細(xì)胞/小時的范圍內(nèi)。OUR是指發(fā)酵過程中細(xì)胞消耗氧氣的速度， 表示為每單位時間每細(xì)胞干重的氧氣單位(摩爾或克)，如mmol02/干重 細(xì)胞/小時。通過測量向發(fā)酵中導(dǎo)入的氧氣以及從發(fā)酵中排出的氧氣， 可以方便地測定耗氧量。為了使OUR保持在對于具體生物最佳的范圍 內(nèi)，能夠利用OUR測量作為在發(fā)酵的生產(chǎn)階段控制通氣條件(特別是通 氣速度、攪拌、通氣氣體中氧的比例等)的基礎(chǔ)。同時培養(yǎng)液中溶解氧 的濃度保持在不到飽和量的1%，特別是不到10微摩爾02/L。在一個 特別優(yōu)選的方法中，進(jìn)行發(fā)酵的生長階段，使得培養(yǎng)液中溶解氧的濃度 減少至不到飽和量的1%,特別是不到IO微摩爾02/L,保持一段時間， 如大約15-90分鐘，之后開始生產(chǎn)階段(即從生長階段的需氧條件轉(zhuǎn)換為 生產(chǎn)階段的微需氧條件)。當(dāng)生產(chǎn)乳酸時，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH趨于降低，除非加入一種堿來中 和形成的全部或部分酸。在發(fā)酵方法的一個實施方案中，向培養(yǎng)液中加 入一種中和劑，如碳酸鈣、氫氧化鈣、碳酸鈉、氫氧化鈉、氨、氬氧化 銨等，使pH保持在希望的范圍內(nèi)， 一般是約5.0-約8.0，特別是約5.5-約7.5。當(dāng)加入這種堿時，形成相應(yīng)的乳酸鹽。因此，乳酸的回收包括 再生游離乳酸。實現(xiàn)方法一般包括分離細(xì)胞，并用一種強酸(如硫酸)酸 化發(fā)酵培養(yǎng)液。形成一種鹽副產(chǎn)物(如果一種鈣鹽是中和劑，硫酸是酸
化劑，則為石膏)，它與乳酸分離。然后通過如液液提取、蒸餾、吸附
等技術(shù)回收乳酸，如下所述T.B. Vickroy，《綜合生物技術(shù)》，第3 巻，第38章(M.Moo-Yoimg編著)，Pergamon, Oxford, 1985; R. Datta 等人，F(xiàn)EMS Microbiol. Rev" 1995; 16:221-231;美國專利號4，275，234、 4，771，001、 5,132,456、 5,420,304、 5,510,526、 5，641，406和5，831，122和 國際專利申請?zhí)朩O 93/00440。
此外，細(xì)胞產(chǎn)生乳酸也可以使發(fā)酵pH降低。因此，由于乳酸的產(chǎn) 生，發(fā)酵培養(yǎng)液的pH可以處于約1.5-約5.0，優(yōu)選地約1.5-約4.2，更 優(yōu)選地約1.5-約3.86 (乳酸的pKa)，特別是約2.0-不到3.86的范圍內(nèi)。 如果達(dá)到可以接受的生產(chǎn)率和收率，則這樣進(jìn)行發(fā)酵可能具有幾個好 處。中和劑的成本降低或消除。如果發(fā)酵pH (在發(fā)酵結(jié)束時)低于乳酸 的pKa，則乳酸主要以酸的形式存在。這可以取消酸化步驟，從而可以 省略額外的加工步驟，節(jié)約了酸化成本和鹽副產(chǎn)物的處理成本。因此， 一種特別優(yōu)選的方法包括繼續(xù)發(fā)酵，直到發(fā)酵培養(yǎng)液的pH下降到3.86 以下。能夠利用如WO 99/19290公開的方法，從獲得的發(fā)酵培養(yǎng)液中 分離乳酸。
細(xì)胞耐受低pH環(huán)境的能力提供了另外一種機制，通過這種機制能 夠清除不希望的微生物的污染?？梢詫⒑斜景l(fā)明的細(xì)胞的培養(yǎng)物置于 降低的pH條件下，如約1.5-4.2，優(yōu)選地約2.0-3.86的pH，保持足以 殺死不耐酸的污染ft生物的一段時間。
為了在商業(yè)上有用，本發(fā)明的重組酵母應(yīng)當(dāng)顯示幾個特征。該酵母 應(yīng)當(dāng)能夠?qū)⑾喈?dāng)比例的碳水化合物轉(zhuǎn)化為乳酸(即產(chǎn)生高產(chǎn)量的產(chǎn)物)。 這些酵母細(xì)胞應(yīng)當(dāng)顯示高比生產(chǎn)率，即每單位時間每細(xì)胞重量產(chǎn)生大量 的乳酸。這些酵母細(xì)胞優(yōu)選地能夠耐受低于約5.0、優(yōu)選地約1.5-4.2、 特別是2.0-3.86的發(fā)酵pH，而在這些條件下達(dá)到良好的收率和生產(chǎn)率。 在5.0-8.0的pH值，優(yōu)選地1.5-5.0、優(yōu)選地1.5-4.2、特別是2.0-3.86 的pH值下，這些細(xì)胞優(yōu)選地也能耐受高濃度的乳酸。這最后一個特性 可以使該發(fā)酵方法使用高濃度的起始碳水化合物。
通常希望使用本發(fā)明的重組細(xì)胞的發(fā)酵方法具有下列某些或全部
特征
A. 收率至少為30克乳酸/克碳水化合物，優(yōu)選地至少40克乳酸/ 克碳水化合物，更優(yōu)選地至少60克乳酸/克碳水化合物，更優(yōu)選地至少 75克乳酸/克碳水化合物。希望的理論收率為100%,但是收率的實際上 限約為95%。
B. 比生產(chǎn)率至少為O.l,優(yōu)選地至少0.3,更優(yōu)選地至少約0.4，特 別是至少約0.5克乳酸/克細(xì)胞/小時。比生產(chǎn)率希望盡可能高。
C. 滴度(乳酸的最大濃度)至少為15克/升發(fā)酵培養(yǎng)基，優(yōu)選地至少 20g/L,更優(yōu)選地至少40g/L，更優(yōu)選地至少80g/L，可達(dá)150g/L，優(yōu) 選地可達(dá)約120 g/L。發(fā)酵培養(yǎng)基的溫度在一定程度上影響容易達(dá)到的 滴度的最大范圍，因為高度濃縮的乳酸溶液(即高于約150g/L)在低于約 35。C的溫度下傾向于變得極為粘稠或者成為凝膠。使用較高的發(fā)酵溫 度，如約35-50°C，可以獲得更高的滴度，而不會凝膠化或有不當(dāng)?shù)恼?性發(fā)生(build-up)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)對葡萄糖進(jìn)行中性(pH5.0-8.0)發(fā)酵時，本發(fā)明第三方 面的細(xì)胞可以達(dá)到85-95%的收率，0.5-2 g/g/小時的比生產(chǎn)率，和80-120 g/L的滴度。在使pH降至約2.8-3.0的低pH發(fā)酵時，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明第三 方面的細(xì)胞達(dá)到75-81%或更高的收率，和0.1-0.4 g/g/小時的比生產(chǎn)率 和14-40 g/L的滴度。在所有情況下，不需優(yōu)化發(fā)酵條件即可獲得這些 結(jié)果。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對葡萄糖進(jìn)行中性pH (5.0-8.0)發(fā)酵時，本發(fā)明第五方 面的細(xì)胞(含有多個拷貝的外源LDH基因，并且含有一個完整的天然 PDC基因)達(dá)到40%以上的收率，0.4-0.9 g/g/小時的比生產(chǎn)率，和40-75 g/L的滴度。對葡萄糖進(jìn)行低pH(終pH為2.8-3.0)發(fā)酵時，本發(fā)明第五 方面的細(xì)胞達(dá)到30%以上的收率，0.3-0.5 g/g/小時的比生產(chǎn)率，和20-35 g/L的滴度。因此，第五方面的細(xì)胞保持在低pH條件下良好發(fā)酵的能 力。如前所述，不需優(yōu)化發(fā)酵條件即可獲得這些結(jié)果。
另外，本發(fā)明的發(fā)酵方法優(yōu)選地達(dá)到高容積生產(chǎn)率。"容積生產(chǎn)率，， 表示為每單位時間每單位體積發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)生的產(chǎn)物量， 一般是克產(chǎn)物
/升培養(yǎng)基/小時。至少1.5g/L/小時，優(yōu)選地至少2.0 g/L/小時，更優(yōu)選 地至少2.5 g/L/小時的容積生產(chǎn)率是希望的。在可達(dá)3-6克細(xì)胞/升發(fā)酵 培養(yǎng)基的優(yōu)選細(xì)胞密度時，最大生產(chǎn)率趨于可達(dá)約5.0 g/L/小時，更一 般地可達(dá)約4.0 g/L/小時。非常優(yōu)選的是進(jìn)行發(fā)酵，使得當(dāng)培養(yǎng)基的pH、 溫度或這兩者都處于上段所述范圍內(nèi)時，達(dá)到這些容積生產(chǎn)率。
根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的乳酸可以用來生產(chǎn)丙交酯，即兩個乳酸分子的一 種環(huán)酐。根據(jù)乳酸的立體異構(gòu)體不同，丙交酯可以是D-丙交酯(由兩個 D-乳酸分子組成)、L-丙交酯(由兩個L-乳酸分子組成)或D-L-丙交酯(由 L-乳酸和D-乳酸分子各一個組成)。由乳酸生產(chǎn)丙交酯的一種適當(dāng)?shù)姆?法是通過聚合/解聚方法，如授予Gruber等人的USP 5,142,023所述。
丙交酯又特別可以作為一種單體用來生產(chǎn)聚丙交酯聚合物(PLA)和 共聚物。制備這些聚合物的方法在授予Gruber等人的USP 5，142，023 中也有描述。優(yōu)選的PLA產(chǎn)物是如授予Gruber等人的USP 5，338，822 所述的熔解穩(wěn)定的聚合物。PLA可以是半晶體或非晶體。
下列實施例用來說明本發(fā)明的某些實施方案，并非限制其范圍或精神。
實施例1A:基于釀酒酵母ScPGKl啟動子的表達(dá)載體pNC2和基 于釀酒酵母PDC1啟動子的pNC4的構(gòu)建
表達(dá)載體pNC2 (圖l)通過在pGEM5Z(+) (Promega， Wisconsin)骨 架載體上組合釀酒酵母ScPGKl啟動子和釀酒酵母GAL10終止子產(chǎn)生。 釀酒酵母ScPGKl啟動子和ScGAL10終止子由一個多接頭區(qū)隔開，該 接頭區(qū)含有限制酶切位點Xbal、 EcoRI和BamHI,用于在酵母啟動子 與終止子之間插入將要表達(dá)的具體基因。
使用的釀酒酵母ScPGKl啟動子含有下列序列(SEQ ID No.l)
5，-GCGGCCGCGG ATCGCTCTTC CGCTATCGAT TAATTTTTTT TTCTTTCCTC TTTTTATTAA CCTTAATITT TATTTTAGAT TCCTGACTTC AACTCAAGAC GCACAGATAT TATAACATCT GCACAATAGG CATTTGCAAG AATTACTCGT GAGTAAGGAA AGAGTGAGGA ACTATCGCAT ACCTGCATTT
AAAGATGCCG
ATTTGGGCGC GAATCCTTTA TTTTGGCTTC ACCCTCATAC TATTATCAGG GCCAGAAAAA GGMGTGTTT CCCTCCTTCT TGAATTGATG TTACCCTCAT AAAGCACGTG GCCTCTTATC GAGAAAGAAA TTACCGTCGC TCGTGATTTG TTTGCAAAAA GAACAAAACT GAAAAAACCC AGACACGCTC GACTTCCTGT CTTCCTATTG ATTGCAGCTT CCAATTTCGT CACACAACAA GGTCCTAGCG ACGGCTCACA GGTTTTGTAA CAAGCAATCG AAGGTTCTGG AATGGCGGGA
AAGGGTTTAG TACCACATGC TATGATGCCC ACTGTGATCT CCAGAGCAAA GTTCGTTCGA TCGTACTGTT ACTCTCTCTC TTTCAAACAG AATTGTCCGA ATCGTGTGAC AACAACAGCC TGTTCTCACA CACTCTTTTC TTCTAACCAA GGGGGTGGTT TAGTTTAGTA GAACCTCGTG AAACTTACAT TTACATATAT ATAAACTTGC ATAAATTGGT CAATGCAAGA AATACATATT TGGTCTTTTC TAATTCGTAG TTTTTCAAGT TCTTAGATGC TTTCTTTTTC TCTTTTTTAC AGATCATCAA GGAAGTAATT ATCTACTTTT TACAACAAAT CTAGAATT-3'
該序列作為來自被命名為pBFY004的專利質(zhì)粒的一條限制酶切片
段獲得。此外，也能夠以釀酒酵母染色體DNA為模板，使用根據(jù)SEQ IDNO:l設(shè)計的引物，通過PCR擴(kuò)增獲得。
使用的釀酒酵母GAL10終止子含有下列序列(SEQ ID NO:2):
5，-GTAGATACAT TGATGCTATC AATCCAGAGA ACTGGAAAGA TTGTGTAGCC TTGAAAAACG GTGAAACTTA CGGGTCCAAG ATTGTCTACA GATHTCCTG ATTTGCCAGC TTACTATCCT TCTTGAAAAT ATGCACTCTA TATCTTTTAG TTCTTAATTG CAACACATAG ATTTGCTGTA TAACGAATTT TATGCTATTT TTTAAATTTG GAGTTCAGTG ATAAAAGTGT CACAGCGAAT TTCCTCACAT GTAGGGACCG AATTGTTTAC AAGTTCTCTG TACCACCATG GAGACATCAA AAATTGAAAA TCTATGGAAA GATATGGACG GTAGCAACAA GAATATAGCA CGAGCCGCGG ATTTATTTCG TTACGC畫3，
該序列作為被命名為pBFY004的專利質(zhì)粒的一條限制酶切片段獲 得。此外，也能夠以釀酒酵母染色體DNA為模板，使用根據(jù)SEQ ID NO:2設(shè)計的引物，通過PCR擴(kuò)增獲得。
構(gòu)建載體pNC4，其含有基于釀酒酵母PDC1啟動子和ScGALlO 終止子的表達(dá)盒，用該質(zhì)粒作為一種通用表達(dá)載體。pNC4載體在圖2 中顯示。
pNC4的載體骨架是pGEM5Z(+) (Promega Corporation; Madison， WI)。以來源于釀酒酵母GY5098林的染色體DNA為模板(ATCC 4005098)， 4吏用引物PSPDCSl (5'-CCA TCG ATA ACA AGC TCA TGCAAA GAG-3，； SEQ ID No:3)和PSPDCAS2 (5'-GCT CTA GAT TTG ACT GTGTTA TTT TGCG國3'; SEQ ID No:4)， PCR擴(kuò)增釀酒酵 母PDC1啟動子。使用Pfu Turbo DNA聚合酶(Stratagene)進(jìn)行熱循環(huán)
94。C 1 min，56。C 1 min，72。C 1 min，共30個循環(huán)，最后72。C溫育7min。
釀酒酵母GAL10終止子如上所述獲得。圖2a( SEQ ID No:37)和2b (SEQ ID No:38)顯示了含有ScPGKl啟動子和ScGAL10終止子以及多 克隆位點，和含有ScPDCl啟動子和ScGAL10終止子以及多克隆位點 的片段。
實施例1B: pVR22載體的構(gòu)建，其含有與釀酒酵母PDC1啟動子 和ScGAL10終止子有效連接的G418抗性基因
克隆G418抗性標(biāo)記(一種細(xì)菌neoK基因)，將其置于釀酒酵母PDCl 啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下；這些構(gòu)建體被命名為pVR22 (圖3)。以質(zhì)粒 pPIC9K (Invitrogen， Carlsbad， CA)為模板，使用引物5'-GCT CTA GAT GAG CCA TAT TCA ACG GGA AAC (5，G片段；SEQ ID No:5) 和5'-ATG GAT CCT TAG AAA AAC TCA TCG AGC ATC (3，G片段； SEQ ID No:6)，使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)， PCR擴(kuò)增G418 抗性基因。熱循環(huán)如下進(jìn)行開始時反應(yīng)混合物95。C溫育5min,然后
95。C30sec， 49。C 30 sec, 72°C 2 min,共35個循環(huán)，最后72。C溫育10 min。 PCR產(chǎn)物用BamHI和XbaI消化，分離到一條821 bp的片段， 將其與pNC2的4303 bp的BamHI-XbaI片段連接(實施例1A)。獲得的 質(zhì)粒(pVR22;圖3)含有與G418抗性基因有效連接的ScPGKl啟動子 和ScGAL10終止子。
實施例1C: pVR29質(zhì)粒的構(gòu)建，其含有與釀酒酵母ScPGKl啟動 子和ScGALlO終止子(pVR29)功能連接的G418抗性基因?qū)418抗性標(biāo)記(pVR22;實施例1B)克隆到pNC2 (實施例1A)內(nèi)， 該構(gòu)建體被命名為pVR29(圖4)。用釀酒酵母ScPGKl啟動子和釀酒酵 母GAL10終止子表達(dá)該G418抗性基因。以質(zhì)粒pVR22(實施例1B)為 模板，使用引物5-GCT CTA GAT GAG CCA TAT TCA ACG GGA AAC C5'G片段；SEQ. ID NO:5)和5-ATG GAT CCT TAG AAA AAC TCA TCG AGC ATC (3'G片段；SEQ. ID NO:6)，用Pfu聚合酶 (Stratagene， Madison， WI) PCR擴(kuò)增該G418抗性基因。此外，質(zhì)粒 pPIC9K (Invitrogen， Carlsbad, CA)也能夠作為模板。熱循環(huán)如下進(jìn)行 開始時反應(yīng)混合物95。C溫育5 min,然后95。C 30 see, 49。C 30 sec, 72。C 2 min,共35個循環(huán)，最后72。C溫育10 min。 PCR產(chǎn)物用BamHI和 Xbal消化，分離一條821 bp的片段，將其與pNC2的4303 bp BamHI-Xbal片段連接。產(chǎn)生的質(zhì)粒pVR29 (圖4)含有與G418抗性基 因有效連接的ScPGKl啟動子和ScGALlO終止子。實施例ID:質(zhì)粒pPSl(潮霉素抗性盒)、pNCl4 (Lh-L-LDH表達(dá)盒) 和pPS9 (用于向基因組內(nèi)整合Lh-L-LDH的載體，用于生產(chǎn)L-乳酸， 使用潮霉素抗性作為選擇性標(biāo)記)的構(gòu)建制備一種重組核酸，它使轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞具有潮霉素抗性，從而允 許篩選含有一種重組核酸構(gòu)建體的酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化子，該構(gòu)建體編碼可用 于合成乳酸的蛋白質(zhì)。能夠利用載體pPS9 (圖5)，通過選擇潮霉素抗性， 將瑞士乳桿菌L-LDH基因整合到酵母基因組內(nèi)?？寺〕泵顾乜剐詷?biāo)記(大腸桿菌hph)，使其處于釀酒酵母PDC1 (丙 酮酸脫羧酶)啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下。以質(zhì)粒pRLMex30為模板，使用引 物5，HYGXBA1 (5，-AAG CTC TAG ATG AAA AAG CCT GAA CTC AC國3'; SEQ ID No:7)和3'HYGBAMH1 (5'-CGC GGA TCC CTA TTC CTT TGC CCT CGG AC誦3'; SEQ ID No:8)， PCR擴(kuò)增提供潮霉素B
抗性的大腸桿菌hph基因(Mach等人.1994， Curr. Genet. 25,567-570; Rajgarhia等人，美國專利申請?zhí)?0/154,360， 2002年5月23日提交， 在此全文引用作為參考)。也能夠以大腸桿菌染色體DNA為模板，使用 相同的引物，獲得hph基因。使用Pfu Turbo DNA聚合酶(Stratagene) 進(jìn)行熱循環(huán)94。Clmin, 56。C 1 min， 72。C 3 min，共30個循環(huán)，最 后72。C溫育7min。在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳分離PCR產(chǎn)物，分離到 1026 bp的產(chǎn)物。該1026 bp片段然后用Xbal和BamHI消化，將其連 接到含有釀酒酵母ScPDCl啟動子和ScGALlO終止子的pNC4 (實施例 1A)的XbaI-BamHI片段內(nèi)，產(chǎn)生質(zhì)粒pPSl (圖5)。克隆編碼L-乳酸脫氬酶的瑞士乳桿菌L-LDH基因，使其處于釀酒 酵母ScPDCl啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下。以質(zhì)粒pSO20 (實施例1H;圖10) 為模板，使用引物PS15S (5，-GCT CTA GAA TTA TGG CAA GAG AGG AAAAAC-3'; SEQ. ID NO. 9)和PS16AS (5'-CGG GAT CCT CAT TGA CGA ACC TTAACG-3'; SEQ. ID NO. 10)， PCR擴(kuò)增編碼L-乳酸 脫氫酶的瑞士乳桿菌L-LDH基因。此外，也能夠以瑞士乳桿菌染色體 DNA為模板，使用相同的引物，獲得LDH基因。使用Pfu Turbo DNA 聚合酶(Stratagene)進(jìn)行熱循環(huán)94°C 1 min， 56°C 1 min, 72。C 3 min， 共30個循環(huán)，最后72。C溫育7 min。在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳分離990 bp的產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物用Xbal和BamHI消化，將其連接到Xbal和 BamHI消化的栽體pNC2中(實施例1A)，產(chǎn)生質(zhì)粒pNC14 (圖5)。pNC14 用Sail和BsaHI消化，產(chǎn)生LhLDH表達(dá)盒。分離該LhLDH表達(dá)盒， 將其連接到pPSl的Sall-Clal片段內(nèi)，產(chǎn)生質(zhì)粒pPS9 (圖5)。實施例IE: PVR39質(zhì)粒的構(gòu)建，其含有瑞士乳桿菌L-LDH基因 和G418標(biāo)記pPS9 (實施例1H;圖5)用Sphl消化，用河壞堿性磷酸酶(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)按照廠商所述方案去磷酸化，產(chǎn)生含有瑞 士乳桿菌LDH表達(dá)盒的片段。pVR29(實施例1C;圖4)用Sphl消化， 利用0.8%瓊脂糖凝膠分離含有G418抗性基因盒的2048 bp片段。連接
這些片段，獲得的質(zhì)粒pVR39 (圖6)含有彼此相鄰的瑞士乳桿菌L-LDH 基因和G418抗性基因標(biāo)記(圖6)。實施例1F: pHES和pSEH質(zhì)粒的構(gòu)建按照PCT申請PCT/US/44041所述，用0.5照質(zhì)粒pGAD424 (如 Chien等人，1991， Proc. Natl Acad. Sci. USA 88:9578-9582所述)構(gòu)建 pHES和pSEH質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶HindIII消化。消化的混合物在 TBE緩沖液(Biorad， USA)中通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離。然后如 Sambrook等人(1989,《分子克隆》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY)所述，從凝膠中純化5.9 kbp片段。設(shè)計含 有多個限制性內(nèi)切酶識別位點的92bp合成寡聚物的互補對。第一個被 命名 為 "fwd HES"oligo , 含有下列序歹ij : 5'-CCCAAGCTTGAATTCCCCGG GGGATCCCTG CAGGGTACCACGCGTAGATC TACTAGTGCG GCCGCCTCGA GTCTAGAGGGCCCAAGCTTG GG-3, (SEQ. ID NO:11)。第二個,皮命 名為"comp (S01)(CMA2)hes"oligo , 含有下列序列 5'-CCAAGCTTGGGCCCTCTAGA CTCGAGGCGG CCGCACTAGT AGATCTACGC GTGGTACCCT GCAGGGATCC CCCGGGGAA TTCAAGCTTG GG-3， (SEQ. ID NO:12)。通過將兩種oligos在水浴中 煮沸10分鐘(10(TC),并逐漸冷卻到室溫，使500 nmoles兩種互補寡聚 物彼此退火。雙鏈92 bp DNA用HindIII消化，將其與HindIII消化的 pGAD424 (Clontech， USA)的5.9 kbp片段連接。如Sambrook等人(同 上)所述，通過電穿孔，用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B(electromax cells, Life Technologies, Rockville， MD)。將重組大腸桿菌接種于 Luria-Bertani培養(yǎng)基平板(Difco， USA)上，利用100將/ml氨爺青霉素 (Sigma Chemicals, USA)篩選含有該質(zhì)粒的細(xì)胞。從氨卡青霉素抗性大 腸桿菌克隆中篩選質(zhì)粒DNA,獲得兩種質(zhì)粒pHES和pSEH。這兩種質(zhì) 粒在載體上多克隆位點-合成雙鏈寡聚物相對于醇脫氬酶啟動子(ADHl) 的方向上不同。
實施例1G:含有瑞士乳桿菌L-LDH的pVRl質(zhì)粒的構(gòu)建，用于進(jìn) 一步構(gòu)建pSO20和pPS9瑞士乳桿菌L-LDH如下所述分離。瑞士乳桿菌細(xì)胞從美國模式培 養(yǎng)物保藏中心獲得(ATCC保藏號10797)，并在標(biāo)準(zhǔn)條件下生長。然后 使用下列方案從這些細(xì)胞中純化基因組DNA:用來自細(xì)菌甘油貯存液的單菌落(或5mL)接種兩個250 mL無菌搖 瓶，其中各含有50 mL無菌MRS培養(yǎng)液(Difco， USA)。培養(yǎng)物在37'C 和170rpm充分?jǐn)嚢柘屡囵B(yǎng)48小時。將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到50mL無菌藍(lán)帽 試管中，以3000 rpm離心10分鐘。將沉淀懸浮于50 mL 12.5% w/v蔗 糖溶液中，再次以3000 rpm離心10分鐘。將新形成的沉淀在50 mL 無菌藍(lán)帽試管中重懸浮于5 mL 12.5% w/v蔗糖中。向試管中加入5 mL TES溶液(200 ml TES: 2 ml 1.0 M Tris (pH 8.0)，10 mM Tris (pH 8.0)， 20 ml 500 mM EDTA (pH 8.0)， [50 mM EDTA (pH 8.0)，0.584 g NaCl50mMNaCl，使用前過濾除菌)。向試管中加入12.5% w/v蔗糖溶液， 混合。加入300 mg溶菌酶粉末(Sigma Chemicals, USA),混合物以2000 rpm振蕩1分鐘。向混合物中加入25 變?nèi)芫厝芤?Sigma)(濃度為 2.2 mg/mL),該混合物在37°C下溫育過夜( 10-12小時)。向混合物中加入2.5 mL 20% SDS 、溶液(Biorad， USA)和168 蛋 白酶K溶液(濃度-28 mg/1.4 mL) (Sigma)，獲得的混合物通過顛倒混合， 在5(TC下溫育1小時。細(xì)胞膜物質(zhì)較好地破裂，溶液變?yōu)榘胪该?。在?管中用NaCl稀釋該混合物，達(dá)到0.15M的濃度。將該混合物轉(zhuǎn)移到一個50 mL Oakridge管中，用等體積的酚:氯仿: 異戊醇(25:24:1)溶液處理。振蕩獲得的混合物，以10,000 rpm離心10 分鐘。將水層轉(zhuǎn)移到一個清潔的Oakridge管中，加入等體積的氯仿。 然后充分振蕩該混合物，以5000 rpm離心10分鐘。將水層吸到一個新 試管中，加入25 pLRNAse (100 mg/mL)，顛倒混合。獲得的混合物在 37。C下溫育15分鐘。沿試管壁向混合物中加入2.5倍體積的EtOH，但是不混合。收集
在界面處形成的DNA，在70% EtOH中洗滌，混合物以10000 rpm離 心10分鐘。在底部形成的沉淀是DNA，使其風(fēng)干，在微量離心管中重 懸浮于10 mM Tris-HCl， pH 8.5中。該混合物在試管中50。C溫育，直到 DNA進(jìn)入溶液(~2-3小時)。根據(jù)Genbank中可以獲得的瑞士乳桿菌L-LDH的序列(Genbank 保藏號Z81318)設(shè)計引物。使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene， WI， USA) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。每個反應(yīng)體系含有濃度為500ng的瑞士乳桿菌基因組 DNA，濃度各為0.2 mM的4種dNTP，和濃度各為1 jiM的擴(kuò)增引物 S022 5，醫(yī)CCG GGA TCC ATG GCA AGA GAG GAA AAA CCTC (SEQ. ID NO. 13)和S023 5'-CCA AGA TCT TTA TTG ACG AAC CTT AAC GCC AG (SEQ. ID NO. 14)。熱循環(huán)如下進(jìn)行開始時95。C 溫育10 min，隨后95°C 30 sec, 41°C 30 sec, 72°C 60 sec，共35個循 環(huán)。利用常規(guī)方法凝膠純化該反應(yīng)產(chǎn)生的990 bp片段，用限制性內(nèi)切 酶BamHI和BglH消化，然后將其克隆到BamHI和BglII消化的pHES (實施例1F)中，產(chǎn)生質(zhì)粒pLhLDH-HES。獲得的序列能夠被翻譯為一 種多肽，該多肽顯示與Genbank中已知的瑞士乳桿菌L-LDH編碼基因 序列(保藏號Z81318)有極高的同源性。設(shè)計其它引物，以在瑞士乳桿菌L-LD基因的5，端和3，端分別引入 Ncol和DraIII限制酶切位點。使用Pfu聚合酶(Stratagene， Wisconsin, USA)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。每個反應(yīng)體系含有濃度為5 ng的 pLH-LDH/HES，濃度各為0.2 mM的4種dNTP，和濃度各為1 的 擴(kuò)增引物VRl 5'ATC CAT GGC AAG TAT TAC GGA TAA GGA TCA CCAA (SEQ. ID NO. 15)和VR2 5-ATC ACG AAG TGT CAC GTA CGG GTT TCG ATG TC (SEQ. ID NO. 16)。熱循環(huán)如下進(jìn)行開 始時95。C溫育10 min，隨后95。C 30 sec, 55°C 30 see, 72°C 60 sec,共 35個循環(huán)。利用常規(guī)方法凝膠純化該反應(yīng)產(chǎn)生的982bp片段，用Ncol 和DraIII限制性內(nèi)切酶消化，將其克隆到Ncol和DraIII消化的 pTEFl/Zeo (Invitrogen， Carlsbad, CA)中，產(chǎn)生的質(zhì)粒pVRl (圖7)證實 含有瑞士乳桿菌L-LDH編碼基因序列，處于釀酒酵母pTEFl啟動子控
制下。存在大腸桿菌EM7啟動子，但是它不是本發(fā)明的整合載體的一 個必要成分。實施例1H:質(zhì)粒pSO20的構(gòu)建，其用于在馬克斯克魯維酵母中表 達(dá)瑞士乳桿菌L-LDH質(zhì)粒質(zhì)粒pSO20如下構(gòu)建將BamHI (NEB)消化的、河壞堿性磷酸酶 處理的(Roche Diagnostics, USA) pUC19質(zhì)粒(Life Technologies, USA) 與消化pVRl(實施例1F)獲得的含有瑞士乳桿菌L-LDH基因+相鄰的啟 動子和終止序列的BamHI片段相連接。產(chǎn)生的質(zhì)粒為pS018 (圖8)。 然后用Sphl消化pS018，與pSPHI構(gòu)建體(Chen等人，1986，"來自酵 母果蠅克魯維酵母CK/"yve/^附j(luò)^" ^0^p似/w"附)的環(huán)形質(zhì)粒pKDl的 序列組織"，Nucleic acids Res. 14:4471-4481)的含有pKDl骨架的Sphl 片段相連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pS019(圖9)。pTEFl/Zeo (Invitrogen， Inc)用XhoI/Xbal消化，產(chǎn)生釀酒酵母 TEF1啟動子、Zeocin抗性基因和釀酒酵母GAL10終止子。該1195bp 片段的末端然后用Pfu DNA聚合酶(Stratagene， Madison， WI)補平。構(gòu) 建體pS019用AatII消化，用Pfu DNA聚合酶產(chǎn)生平端，用河壞堿性 磷酸酶處理獲得的片段。然后將該9.3 kbp與含有釀酒酵母TEF1啟動 子、Zeocin抗性基因和釀酒酵母GAL10終止子的1195bp pTEF/Zeo片 段相連接。產(chǎn)生的構(gòu)建體是pSO加(圖10)。實施例II:通過轉(zhuǎn)化的DNA向馬克斯克魯維酵母基因組內(nèi)的隨機 整合，瑞士乳桿菌L-LDH基因的引入通過用Sstl和Apal消化pVR39，從該質(zhì)粒中分離含有瑞士乳桿菌 L-LDH:G418抗性基因盒的4.28 kbp片段。用0.8%瓊脂糖凝膠分離該 片段，利用如下所述的電穿孔方案，用該片段轉(zhuǎn)化馬克斯克魯維酵母 (CD21):用馬克斯克魯維酵母的一個單菌落接種50 mL YPD培養(yǎng)基(在250 mL帶擋板的搖瓶中含有10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，和20 g/L 葡萄糖，至OD600-0.1)。培養(yǎng)物在30。C和250rpm下溫育16小時，直 到終OD600=10。從10 mL培養(yǎng)物中離心收集細(xì)胞，用電穿孔緩沖液(IO mMTris-Cl， 270 mM蔗糖，lmMMgCl2， pH7.5)洗滌一次。然后將 細(xì)胞重懸浮于溫育緩沖液(YPD + 25 mM DTT， 20mM HEPES， pH 8.0) 中，在30。C和250 rpm下溫育30分鐘。離心收集細(xì)胞，用電穿孔緩沖 液洗滌一次，將其重懸浮于lmL電穿孔緩沖液中。然后將400iaL細(xì)胞 轉(zhuǎn)移到一個0.4 cm的電穿孔杯(BioRad; USA)中。用Sstl和Apal消化pVR39，將2嗎獲得的4.3 kbp片段加入杯中。 然后這些細(xì)胞以1.8 kV， 1000 Q， 25 jiF電穿孔。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50 mL螺 帽Falcon管中的1 mL YPD中，在30。C和250 rpm下溫育4小時，之 后選擇性接種于含有300照/mL G418的YPD上。這些轉(zhuǎn)化子在37°C 下生長3天。將G418抗性轉(zhuǎn)化子在含有300 pg/mL G418的新鮮選擇 平板上重新劃線。使用與瑞士乳桿菌L-LDH基因同源的PCR引物和與G418抗性基 因同源的反向引物證實該片段向馬克斯克魯維酵母基因組內(nèi)的整合。VR146 5，-GCT GAG TAC CCA GAT TGT AAGGATG-3' (SEQ.I D NO. 17)和VR143 5'CTG CCA GCG CAT CAA CAA TAT TTT CAC-3， (SEQ. ID NO. 18)用來在含有該盒的菌林中擴(kuò)增位于瑞士乳桿 菌L-LDH與G418抗性基因之間的2.3 kb的產(chǎn)物。在不含該盒的菌林 中，這些引物不能擴(kuò)增任何片段。使用TaqDNA聚合酶(Qiagen，USA)對轉(zhuǎn)化子菌落進(jìn)行熱循環(huán)開 始時反應(yīng)混合物94。C溫育2 min，隨后94。C 30 sec， 53。C 30 sec, 72°C 3 min，共35個循環(huán)，最后72。C溫育7 min。分析的10個轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生預(yù) 期的2.3 kb PCR產(chǎn)物。使用可與作為探針的瑞士乳桿菌L-LDH基因雜 交的10個窗林的基因組DNA進(jìn)行Southern印跡分析，所分析的10個 轉(zhuǎn)化子中有2個顯示適當(dāng)?shù)膸?，與來自pVR39的一個拷貝的瑞士乳 桿菌L-LDH基因的整合相一致。兩個菌抹中的一個被鑒定為CD484。實施例1J:通過轉(zhuǎn)化的DNA向馬克斯克魯維酵母基因組內(nèi)的隨機
整合，另外一個拷貝的瑞士乳桿菌L-LDH基因的導(dǎo)入通過用Sstl和Apal消化pPS9，從該質(zhì)粒中分離含有瑞士乳桿菌 L-LDH:HPH抗性基因盒的4.7 kbp片段。用0.8%瓊脂糖凝膠分離該片 段，通過電穿孔用來轉(zhuǎn)化馬克斯克魯維酵母CD484:用馬克斯克魯維酵母CD484的一個單菌落接種50 mL YPD培養(yǎng)基 (在250mL帶擋板的搖瓶中含有10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，和 20g/L葡萄糖和2%瓊脂，至OD柳-O.l)。培養(yǎng)物在30。C和250rpm下 溫育16小時，至終OD6。。-10。從10mL培養(yǎng)物中離心收集細(xì)胞，用電 穿孔緩沖液(IO mM Tris-Cl， 270 mM蔗糖，1 mM MgCl2， pH 7.5)洗 滌一次。然后將細(xì)胞重懸浮于溫育緩沖液(YPD + 25 mM DTT， 20mM HEPES，pH8.0)中，在30。C和250rpm下溫育30分鐘。離心收集細(xì)胞， 用電穿孔緩沖液洗滌一次，將其重懸浮于1mL電穿孔緩沖液中。然后 將400 nL細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個0.4 cm的電穿孔杯(BioRad; USA)中。用Sstl和Apal消化pPS9，將5照獲得的4.7 kbp片段加入杯中。 然后這些細(xì)胞以1.8kV，1000Q，25nF電穿孔。將電穿孔的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到 50 mL螺帽Falcon管中的1 mL YPD中，在30。C和250 rpm下溫育4 小時，之后選擇性接種于含有200 ng/mL潮霉素(Invitrogen， Carlsbad, CA)的YPD上。潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子在37。C下生長3天。將這些轉(zhuǎn)化子 在含有300 ng/mL G418的新鮮選擇平板上重新劃線，以確保該菌抹含 有兩種抗性基因。使用與瑞士乳桿菌L-LDH基因同源的PCR引物以及與潮霉素抗性 基因同源的反向引物，證實瑞士乳桿菌L-LDH:G418盒的新4.7 kbp片 段的整合。VR146(SEQ ID NO. 17)和VR142 5'-GTG ACA CCC TGT GCA CGG CGG GAG ATG-3' (SEQ. ID NO. 19)用來在含有該盒的菌 抹中擴(kuò)增位于瑞士乳桿菌L-LDH與潮霉素抗性基因之間的2.3 kb產(chǎn)物。 在不含該盒的菌林中，這些引物不能擴(kuò)增任何片段。使用TaqDNA聚合酶(Qiagen，USA)進(jìn)行熱循環(huán)開始時反應(yīng)混合 物94。C溫育2min，隨后94°C 30 sec, 53°C 30 sec， 72。C 3 min，共35 個循環(huán)，最后72。C溫育7 min。使用上述PCR分析的4個轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生
預(yù)期的1.76kbPCR產(chǎn)物。利用與瑞士乳桿菌L-LDH基因同源的PCR引物以及與G418抗性 基因同源的反向引物，證實來自馬克斯克魯維酵母CD484的4288 bp 瑞士乳桿菌L-LDH:G418基因的存在。VR146(SEQ ID NO. 17)和VR143 (SEQ. ID NO. 18)用來在含有該盒的菌抹中擴(kuò)增位于瑞士乳桿菌L-LDH 與G418抗性基因之間的2.3kb產(chǎn)物。在不含該盒的菌抹中，這些引物不能擴(kuò)增任何片段。使用Taq DNA聚合酶(Qiagen， USA)進(jìn)行熱循環(huán)開始時反應(yīng)混合 物94。C溫育2min,隨后94。C 30 sec， 53。C 30 sec， 72。C 3 min，共35 個循環(huán)，最后72。C溫育7min。所有4個菌林都產(chǎn)生預(yù)期的2.3 kb PCR 產(chǎn)物。與瑞士乳桿菌L-LDH探針雜交的菌林基因組DNA的Southern印 跡分析證明，對于G418和潮霉素盒產(chǎn)生陽性PCR結(jié)果的4個轉(zhuǎn)化子 也含有插入基因組內(nèi)的兩個拷貝的瑞士乳桿菌L-LDH基因。該菌林被 鑒定為馬克斯克魯維酵母CD492，進(jìn)一步分析L-乳酸的產(chǎn)生。實施例1K:搖瓶培養(yǎng)物在YPD+葡萄糖培養(yǎng)基中的L-乳酸產(chǎn)生 重組菌林CD492在一個250 mL帶擋板的搖瓶中培養(yǎng)，其中含有補 充了 100 g/L葡萄糖的50 mL YPD。來自于YPD瓊脂平板的細(xì)胞在30。C 和250 rpm下溫育16小時，至OD卿-O.l。然后利用YSI分析檢測搖瓶 的殘余葡萄糖，以確保細(xì)胞處于指數(shù)生長期。離心收集4g/L細(xì)胞干重 ("gcdw")當(dāng)量，將其重懸浮于一個250 mL帶擋板的搖瓶中，其中含有 補充了約100 g/L葡萄糖和55 g/L CaC03的50 mL YPD。該培養(yǎng)物然 后在30。C和70rpm下溫育。在0、 12、 24小時的時間間隔后采樣。通 過過濾從樣品中除去細(xì)胞，通過HPLC分析上清液的葡萄糖、乳酸鹽、 丙酮酸鹽和乙醇。在這些條件下，CD492林產(chǎn)生對映體純度大于99% 的L-乳酸。終滴度為69g/L。容積生產(chǎn)率為3.6g/L/小時。為了比較，CD 484林(實施例l)在相同條件下培養(yǎng)。與CD492所見 相比，L-乳酸產(chǎn)量較低，乙醇產(chǎn)量較高。
實施例1L:搖瓶培養(yǎng)物在YPD+葡萄糖培養(yǎng)基中的L-乳酸產(chǎn)生492林在一個250 mL帶擋板的搖瓶中培養(yǎng)，其中含有補充了 100 g/L葡萄糖的50 mL YPD。細(xì)胞接種到搖瓶中，至OD綱-O.l，搖瓶在 30。C和250 rpm下溫育16小時。終pH<3.1。然后利用YSI分析檢測搖 瓶的殘余葡萄糖，以確保細(xì)胞處于指數(shù)生長期。離心收集4g/L細(xì)胞干 重當(dāng)量，將其重懸浮于一個250 mL帶擋板的搖瓶中，其中含有補充了 約25g/L葡萄糖的50mLYPD。培養(yǎng)物然后在30。C和70 rpm下溫育。 以不同時間間隔采樣，過濾除去細(xì)胞。通過HPLC分析培養(yǎng)上清液的葡 萄糖、乳酸鹽、丙酮酸(鹽)和乙醇。產(chǎn)生的L-乳酸對映體純度大于99%。 L-乳酸滴度為15 g/L,容積 生產(chǎn)率為2g/L/hr。當(dāng)在相同條件下檢測CD484林時，乳酸產(chǎn)量較低， 而乙醇產(chǎn)量較高。在一個不同的實驗中，含有100 mL YPD +100 g/L葡萄糖的一個 500 mL帶擋板的搖瓶接種CD492抹，至OD6(H)=0.1。搖瓶在37。C和250 rpm下培養(yǎng)約16小時。在確保細(xì)胞處于指數(shù)生長期后，收集4g/L細(xì)胞 干重當(dāng)量。將細(xì)胞沉淀重懸浮于50mL YPD+40 g/L葡萄糖中，將其轉(zhuǎn) 移到一個250 mL帶擋板的搖瓶中。該搖瓶置于37。C和70 rpm下。在 生物質(zhì)生長結(jié)束時，以及進(jìn)入生產(chǎn)階段O、 15、 18.5、 23小時，直到所 有葡萄糖消耗光，采樣進(jìn)行HPLC分析。在生產(chǎn)開始和結(jié)束時測量pH。 終pH為3.00+/-0.06。CD 492抹在15-23小時內(nèi)消耗葡萄糖。在生產(chǎn)結(jié)束時(當(dāng)葡萄糖完 全消耗光時)采樣進(jìn)行游離酸分析，并分析總?cè)樗?、乙酸鹽、乙醇和丙 酮酸鹽。CD492林產(chǎn)生32 g/L游離乳酸、32 g/L乙醇和各< 1 g/L的乙 酸鹽和丙酮酸鹽。游離乳酸為32g/L。在所有情況下，在發(fā)酵結(jié)束時， 質(zhì)子化形式的酸的百分比至少為97%。基于葡萄糖的乳酸收率為59%。在類似的條件下評價CD484抹。它產(chǎn)生26-28 g/L游離乳酸，基于 葡萄糖的收率為46-58%。 實施例2A: pVR24質(zhì)粒的構(gòu)建，其含有巨大芽孢桿菌L-LDH，用 于在釀酒酵母ScPGKl啟動子控制下表達(dá)L-LDH編碼L-LDH基因的巨大芽孢桿菌DNA如下分離。巨大芽孢桿菌從 美國模式培養(yǎng)物保藏中心獲得(ATCC保藏號6458)，在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)。 使用Invitrogen的"Easy-DNA"試劑盒，按照廠商方案，從這些細(xì)胞中 純化基因組DNA。以可從Genbank獲得的巨大芽孢桿菌L-LDH的序 列(Genbank保藏號M22305)為基礎(chǔ)設(shè)計引物。使用Perkin Elmer緩沖 液II (1.5 mM MgCl2)和AmpliTaq Gold聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。每 個反應(yīng)體系含有濃度為6 ng/jiL的巨大芽孢桿菌基因組DNA、濃度各為 0.2 mM的4種dNTP和濃度各為1 nM的兩種擴(kuò)增引物BM1270和 BM179:(5， - CCT GAG TCC ACG TCA TTA TTC -3，； SEQ. ID NO. 20) (5, - TGA AGC TAT TTA TTC TTG TTAC -3，； SEQ. ID NO. 21)熱循環(huán)如下進(jìn)行開始時95。C溫育10 min，隨后95。C 30 sec, 50°C 30sec, 72。C60sec,共35個循環(huán)。利用常規(guī)方法凝膠純化該反應(yīng)產(chǎn)生 的1100bp片段，克隆，測序。獲得的序列能夠被翻譯為一種多肽，該 多肽顯示與已知L-LDH編碼基因的同源性，其中兩種序列之間的同源 程度至少為75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%或大約99%的序列同一性。巨大芽孢桿菌LDH的編碼序列與來自質(zhì)粒pNC2(實施例1A)的釀 酒酵母ScPGKl啟動子和ScGAL10轉(zhuǎn)錄終止子有效連接。兩種寡核苦 酸引物，被命名為Bmeg5，和Bmeg3，，用來在該基因的編碼序列的末端 引入限制酶切位點(5'畫GCT CTA GAT GAA AAC ACA ATT TAC ACC-3; SEQ ID No:22)和(5-ATGG ATC CTT ACA CAA AAG CTC TGTCGC-3，； SEQ ID No:23)。使用上述dNTP和引物濃度，使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene), 在廠商提供的緩沖液中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。熱循環(huán)如下進(jìn)行開始時反應(yīng)混 合物95。C溫育3 min，隨后95。C 30 sec, 50°C 30 sec, 72°C 60 sec,共 20個循環(huán)，最后72。C溫育9min。產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Xbal和BamHI
消化，然后將其連接到質(zhì)粒pNC2(實施例1A)的Xbal和BamHI片段內(nèi)。 這種連接產(chǎn)生質(zhì)粒pVR24,其含有與巨大芽孢桿菌LDH編碼序列有效 連接的ScPGKl啟動子和ScGALlO終止子(圖12)。實施例2B:編碼巨大芽孢桿菌L-LDH的G418抗性標(biāo)記質(zhì)粒 (pCA3)修飾從Invitrogen (Carlsbad， CA)獲得的G418抗生素選擇性標(biāo)記， 將其與來自釀酒酵母的丙酮酸脫羧酶基因啟動子和一個轉(zhuǎn)錄終止子有效連接。在構(gòu)建該構(gòu)建體中，制備下列寡核苷酸，用來從含有G418抗 性基因插入片段的質(zhì)粒中擴(kuò)增編碼序列。兩種oligo-寡核苷酸引物G5' 和G3'才艮據(jù)該序列設(shè)計，用來在該基因編碼序列的末端引入限制酶切位 點5,-AAA TCT AGA TGA GCC ATA TTCAAC GGGA-3'; (SEQ. ID No. 24)和5，-CCG GAT CCT TAG AAA AAC TCA TCG AGCAT3'; (SEQ. ID No. 25)。使用G5'和G3，引物和所有4種dNTP和Pfu Turbo聚合酶，PCR 擴(kuò)增來自pPIC9K栽體(Invitrogen, Carlsbad， CA)的G418抗性基因。 使用上述dNTP和引物濃度，使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene),在廠 商提供的緩沖液中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。熱循環(huán)如下進(jìn)行開始時反應(yīng)混合物 95。C溫育3min，隨后95。C 30 sec， 50。C 30 sec， 72。C60sec，共30個 循環(huán)，最后72。C溫育9 min。產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Xbal和BamHI消化， 然后將其連接到質(zhì)粒pNC4(實施例1A)的Xbal和BamHI位點內(nèi)。將與釀酒酵母ScPGKl啟動子和ScGAL10終止子有效連接的巨大 芽孢桿菌LDH基因引入該載體中，位于G418基因ScGAL10終止子的 3，末端的Sphl位點處，產(chǎn)生質(zhì)粒pCA3(圖13)。實施例2C: pVR38質(zhì)粒的構(gòu)建，其含有巨大芽孢桿菌LDH基因 和潮霉素抗性標(biāo)記pVR24 (實施例2A)用Sphl消化，并用河蝦堿性磷酸酶(RocheDiagnostics, Indianapolis USA)按照廠商所述方案去磷酸化，產(chǎn)生含有 巨大芽孢桿菌LDH表達(dá)盒的片段。pPSl (實施例1D)用Sphl消化，利 用0.8%瓊脂糖凝膠分離含有潮霉素抗性基因盒的2259 bp片段，將其 與去磷酸化的pVR24連接。產(chǎn)生的質(zhì)粒pVR38(圖14)含有彼此相鄰的 巨大芽孢桿菌L-LDH基因和潮霉素抗性基因標(biāo)記。實施例2D:通過轉(zhuǎn)化的DNA向馬克斯克魯維酵母基因組內(nèi)的隨機 整合，巨大芽孢桿菌LDH基因的引入通過用Sstl和Apal消化pCA3，從該質(zhì)粒中分離含有巨大芽孢桿 菌L-LDH:G418抗性基因盒的4.2 kbp片段。用0.8%瓊脂糖凝膠分離 該片段，利用如下所述的電穿孔方案，用該片段轉(zhuǎn)化馬克斯克魯維酵母 (CD21)。用馬克斯克魯維酵母的一個單菌落接種50 mL YPD培養(yǎng)基(在250 mL帶擋板的搖瓶中含有10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，20 g/L葡 萄糖，和2%瓊脂，至OD60()=0.1)。培養(yǎng)物在30。C和250 rpm下溫育16 小時，至終OD6(H^10。從10 mL培養(yǎng)物中離心收集細(xì)胞，用電穿孔緩 沖液(10mMTris-Cl， 270mM蔗糖，lmMMgCl2， pH7.5)洗滌一次。 然后將細(xì)胞重懸浮于溫育緩沖液(YPD + 25 mM DTT, 20mM HEPES， pH8.0)中，在30。C和250rpm下溫育30分鐘。然后離心收集細(xì)胞，用 電穿孔緩沖液洗滌一次。然后將細(xì)胞重懸浮于1mL電穿孔緩沖液中， 將400 fiL細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個0.4 cm的電穿孔杯(BioRad; USA)中。將2 ng來自pCA3的4.2 kbp Sstl/Apal片段加入杯中，這些細(xì)胞 以1.8 kV， 1000 Q， 25 nF電穿孔。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50 mL螺帽Falcon 管中的1 mL YPD中，在30。C和250 rpm下溫育4小時，之后選擇性 接種于含有300 ng/mL G418的YPD上。這些轉(zhuǎn)化子在37。C下生長3 天。將G418抗性轉(zhuǎn)化子在含有300 ng/mL G418的新鮮選擇平板上重 新劃線。使用與巨大芽孢桿菌L-LDH基因同源的PCR引物和與G418抗性 基因同源的反向引物證實該片段向馬克斯克魯維酵母基因組內(nèi)的整合。 BmLDH3 5-GTA CGC ATT ACC AAG GCT ATT TTA GAT誦3， (SEQ. ID NO. 26)和VR143 (SEQ. ID NO. 18)用來在含有該盒的菌林中擴(kuò)增位 于巨大芽孢桿菌L-LDH與G418抗性基因之間的1.8 kb產(chǎn)物。在不含 該盒的菌林中，這些引物不能擴(kuò)增任何片段。使用TaqDNA聚合酶(Qiagen，USA)對轉(zhuǎn)化子菌落進(jìn)行熱循環(huán)開 始時反應(yīng)混合物94。C溫育2 min，隨后94。C 30 sec, 53。C 30 sec， 72。C 3 min，共35個循環(huán)，最后72。C溫育7 min。 PCR分析的10個轉(zhuǎn)化子中 有7個產(chǎn)生預(yù)期的1.8kbPCR產(chǎn)物。利用來自7個菌林的基因組DNA 與作為探針的巨大芽孢桿菌L-LDH基因的Southern印跡雜交，所分析 的7個PCR陽性轉(zhuǎn)化子中有2個顯示適當(dāng)?shù)膸?，與來自pCA3的一 個拷貝的巨大芽孢桿菌L-LDH基因的整合相一致。兩個菌林中的一個 3皮鑒定為CD162。實施例2E:通過轉(zhuǎn)化的DNA向馬克斯克魯維酵母基因組內(nèi)的隨機 整合，另外一個拷貝的巨大芽孢桿菌LDH基因的導(dǎo)入通過用Sstl和Apal消化pVR38,從該質(zhì)粒中分離含有巨大芽孢桿 菌L-LDH:HPH抗性基因盒的4.5 kbp片段。用0.8%瓊脂糖凝膠分離該 片段，通過電穿孔用來轉(zhuǎn)化馬克斯克魯維酵母CD162林。用馬克斯克魯維酵母CD162的一個單菌落接種50 mL YPD培養(yǎng)基 (在250 mL帶擋板的搖瓶中含有10 g/L酵母提取物，20 g/L蛋白胨，和 20 g/L葡萄糖和2%瓊脂，至OD6()()=0.1)。培養(yǎng)物在30。C和250 rpm下 溫育16小時，至終OD6Q(p10。從10mL培養(yǎng)物中離心收集細(xì)胞，用電 穿孔緩沖液(10 mM Tris-Cl， 270 mM蔗糖，1 mM MgCl2， pH 7.5)洗 滌一次。然后將細(xì)胞重懸浮于溫育緩沖液(YPD+25 mM DTT， 20mM HEPES，pH8.0)中，在30。C和250rpm下溫育30分鐘。離心收集細(xì)胞， 用電穿孔緩沖液洗滌一次，將其重懸浮于1mL電穿孔緩沖液中。然后 將一等份(400 nL)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個0.4 cm的電穿孔杯(BioRad; USA)中。用Sstl和Apal消化pVR38，將5將獲得的4.5 kbp片段加入電穿 孔杯中。然后這些細(xì)胞以1.8kV，1000Q,25nF電穿孔。將電穿孔的細(xì)
胞轉(zhuǎn)移到50 mL螺帽Falcon管中的1 mL YPD中，在30。C和250 rpm 下溫育4小時，之后選擇性接種于含有200 pg/mL潮霉素(Invitrogen， Carlsbad, CA)的YPD上。這些轉(zhuǎn)化子在37。C下生長3天。將潮霉素抗 性轉(zhuǎn)化子在含有300嗎/mL G418的新鮮選擇平板上重新劃線，以確保 該菌林含有兩種抗性基因。使用與巨大芽孢桿菌L-LDH基因同源的PCR引物和與潮霉素抗性 基因同源的反向引物證實含有巨大芽孢桿菌L-LDH:HPH盒的新4.5 kbp片段的整合。BmLDH3 (SEQ. ID NO. 26)和VR142 (SEQ. ID NO. 19) 用來在含有該盒的菌林中擴(kuò)增位于巨大芽孢桿菌L-LDH與潮霉素抗性 基因之間的1.76 kb產(chǎn)物。在不含該盒的菌抹中，這些引物不能擴(kuò)增任 何片段。^吏用TaqDNA聚合酶(Qiagen，USA)對轉(zhuǎn)化子菌落進(jìn)行熱循環(huán)開 始時反應(yīng)混合物94。C溫育2 min，隨后94。C 30 sec, 53。C 30 sec, 72。C 3 min，共35個循環(huán)，最后72。C溫育7 min。使用上述PCR法分析的9 個轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生預(yù)期的1.76 kb PCR產(chǎn)物。使用與巨大芽孢桿菌L-LDH基因同源的PCR引物以及與G418抗 性基因同源的反向引物證實馬克斯克魯維酵母CD162林中已經(jīng)存在的 4.2 kbp巨大芽孢桿菌L-LDH:G418基因的存在。BmLDH3 (SEQ. ID NO. 26)和VR143 (SEQ. ID NO. 18)用來在含有該盒的菌抹中擴(kuò)增位于巨大 芽孢桿菌L-LDH與G418抗性基因之間的1.8 kb產(chǎn)物。在不含該盒的 菌林中，這些引物不能擴(kuò)增任何片段。使用TaqDNA聚合酶(Qiagen,USA)對轉(zhuǎn)化子菌落進(jìn)行熱循環(huán)開 始時反應(yīng)混合物94。C溫育2 min，隨后94。C 30 sec, 53。C 30 sec， 72。C 3 min，共35個循環(huán)，最后72。C溫育7 min。所有9個菌抹都產(chǎn)生預(yù)期的 1.8 kb PCR產(chǎn)物。來自這些菌林的基因組DNA與作為探針的巨大芽孢 桿菌LDH雜交的Southern印跡分析表明，對于G418和潮霉素盒產(chǎn)生 陽性PCR結(jié)果的9個轉(zhuǎn)化子中有7個也含有插入基因組內(nèi)的兩個拷貝 的巨大芽孢桿菌L-LDH基因。這些菌林中的一個被鑒定為CD355。
實施例2F:搖瓶培養(yǎng)物在YPD+葡萄糖培養(yǎng)基中的L-乳酸產(chǎn)生 重組菌抹CD492以實施例1K所述的通用方法培養(yǎng)。在這些條件下，CD355林產(chǎn)生對映體純度大于99%的L-乳酸。終滴度為52 g/L。容積生產(chǎn)率為1.5g/L/小時。為了比較，CD162林在相同條件下培養(yǎng)。與CD162所見相比，L-乳酸產(chǎn)量較低，乙醇產(chǎn)量較高。實施例2G:搖瓶培養(yǎng)物在YPD+葡萄糖培養(yǎng)基中的L-乳酸產(chǎn)生 355林在一個250 mL帶擋板的搖瓶中培養(yǎng)，其中含有補充了 100 g/L葡萄糖的50 mL YPD。這些細(xì)胞接種到搖瓶中，至OD鋼-O.l，搖 瓶在30。C和250 rpm下溫育16小時。終pH<3.1。然后利用YSI分析 檢測搖瓶的殘余葡萄糖，以確保細(xì)胞處于指數(shù)生長期。然后離心收集4 g/L細(xì)胞干重當(dāng)量，將其重懸浮于一個250 mL帶擋板的搖瓶中，其中 含有補充了約25 g/L葡萄糖的50 mL YPD。培養(yǎng)物然后在30。C和70 rpm下溫育。以不同時間間隔采樣，過濾除去細(xì)月包。通過HPLC分析 培養(yǎng)上清液的葡萄糖、乳酸(鹽)、丙酮酸(鹽)和乙醇。產(chǎn)生的L-乳酸對映體純度大于99%。 L-乳酸滴度為12 g/L，容積 生產(chǎn)率為1.9g/L/小時。當(dāng)在相同條件下檢測CD162抹時，乳酸產(chǎn)量較 低，而乙醇產(chǎn)量較高。實施例3A: pBH5a/b質(zhì)粒的構(gòu)建，其用于將DNA定向整合到馬克 斯克魯維酵母PDC1基因座內(nèi)將位于馬克斯克魯維酵母丙酮酸脫羧酶(KmPDCl)基因側(cè)翼的 DNA克隆到載體pVR29 (實施例1C)內(nèi)，產(chǎn)生一種載體，用于在 KmPDCl基因座處進(jìn)行定向DNA整合。產(chǎn)生的構(gòu)建體被命名為pBH5b (圖15)?？寺〉絧BH5b的Sbfl限制酶切位點內(nèi)的一個基因與馬克斯克 魯維酵母啟動子和終止子有效連接。以質(zhì)粒pS021為模板，使用引物5，-Flank5': 5'誦CAA GAA GGT ACC CCT CTC TAA ACT TGA ACA-3， (SEQ. ID NO. 27)和
5,-Flank3': 5-GTA ATT CCT GCA GGT GCA ATT ATT TGG TTT GG-3' (SEQ. ID NO. 28)， PCR擴(kuò)增位于馬克斯克魯維酵母PDC1直接 上游的DNA的1254 bp片段。熱循環(huán)如下進(jìn)行開始時反應(yīng)混合物94°C 溫育2 min,隨后94°C 30 sec, 55。C 30 sec， 72°C 1.5 min，共35個循 環(huán)，最后72。C溫育7min。用0.8%瓊脂糖凝膠分離1254bpPCR產(chǎn)物。 該PCR產(chǎn)物和pVR29質(zhì)粒(實施例1C)均用Kpnl和Sbfl消化。消化的 PCR產(chǎn)物與5067 bp pVR29片段連接，產(chǎn)生6315 bp pBH5a (圖15)。 pBH5a質(zhì)粒含有與釀酒酵母ScPDCl啟動子和ScGALlO終止子有效連 接的G418抗性基因，和與馬克斯克魯維酵母PDC1基因直接上游的 DNA同源的DNA的1240 bp片段。以質(zhì)粒pS021為模板，使用引物3，-Flank 5': 5，-CCA AGC CCT GCA GGA GAG GGA GAG GAT AAA GA-3， (SEQ. ID NO. 29)和 3，-Flank3': 5 - CTC GTA ACG CGT GTA CAA GTT GTG GAA CAA-3， (SEQ. ID NO. 30)， PCR擴(kuò)增位于馬克斯克魯維酵母PDCl直 接下游的DNA的535 bp片段。熱循環(huán)如下進(jìn)行開始時反應(yīng)混合物94°C 溫育2min，隨后94°C 30 see, 55。C30sec， 72。C45sec，共35個循環(huán)， 最后72。C溫育4min。用0.8%瓊脂糖凝膠分離PCR產(chǎn)物，分離到535 bp 的產(chǎn)物。529 bp PCR產(chǎn)物用Sbfl和Mlul消化，該片段與pBH5a的 Sbfl-Mlul片段連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pBH5b (圖15)。 pBH5b質(zhì)粒含有位于 馬克斯克魯維酵母PDC1基因直接上游的1.2 kb DNA和直接下游的0.5 kbDNA,在側(cè)翼PDC1序列之間有一個唯一的Sbfl位點，以及與釀酒 酵母ScPDCl啟動子和ScGAL10終止子有效連接的選擇性G418抗性 標(biāo)記。實施例3B: pBH8質(zhì)粒的構(gòu)建，其用于將瑞士乳桿菌L-LDH基因 定向整合到馬克斯克魯維酵母的KmPDCl基因座內(nèi)將來自瑞士乳桿菌的L-乳酸脫氫酶基因克隆到pBH5b (實施例3A) 的Sbfl位點內(nèi)，產(chǎn)生一種載體，該載體能夠?qū)⑷鹗咳闂U菌L-LDH整合 到馬克斯克魯維酵母的KmPDCl基因座內(nèi)，并且使用內(nèi)源馬克斯克魯
維酵母KmPDCl啟動子和終止子表達(dá)瑞士乳桿菌L-LDH。以pPS9 (實施例1D)為模板，使用引物L(fēng)-LDH 5， 5'-ACA AAT CCT GCA GGA TGG CAA GAG AGG AAA AA-3' (SEQ. ID NO. 31)和 L國LDH 3': 5'-TAT CTA CCT GCA GGT CAT TGA CGA ACC TTA AC-3' (SEQ. ID NO. 32)， PCR擴(kuò)增瑞士乳桿菌L-LDH基因。使用 Failsafe PCR系統(tǒng)(Epicentre， Madison, WI)進(jìn)行熱循環(huán)94。C 30 see, 55°C 30 sec， 72°C 1.5 min,共30個循環(huán)，最后72。C溫育4 min。用0.8% 瓊脂糖凝膠分離971 bp PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物用Sbfl消化，將其與Sbfl 消化的pBH5b的6844 bp片段連接，產(chǎn)生7824 bp質(zhì)粒pBH8 (圖16)。 pBH8含有與馬克斯克魯維酵母KmPDCl啟動子和終止子有效連接的 瑞士乳桿菌L-LDH基因，以及與釀酒酵母ScPDCl啟動子和ScGALlO 終止子有效連接的G418抗性標(biāo)記。實施例3C:通過pBH8向KmPDCl基因座內(nèi)的整合，馬克斯克魯 維酵母CD606抹的構(gòu)建用pBH8質(zhì)粒(實施例3B)轉(zhuǎn)化野生型馬克斯克魯維酵母。將整個 pBH8質(zhì)粒整合到CD21的KmPDCl基因座內(nèi)，位于pBH8的瑞士乳桿 菌L-LDH基因直接上游的側(cè)翼KmPDClDNA與馬克斯克魯維酵母染 色體上KmPDCl基因直接上游的DNA之間。產(chǎn)生的菌抹被命名為 CD606，含有野生型拷貝的KmPDCl以及在KmPDCl基因座處整合的 一個拷貝的pBH8。在一個250 mL帶擋板的搖瓶中，用CD21接種補充了 100 g/L葡 萄糖的50 mL YPD培養(yǎng)基(含有10 g/L酵母提取物，20 g/L蛋白胨，20 g/L葡萄糖和2%瓊脂)，至OD柳-O.l。培養(yǎng)物在30。C和250 rpm下溫 育16小時，至終OD卿-12。從10mL培養(yǎng)物中離心收集細(xì)胞，用電穿 孔緩沖液(電穿孔緩沖液10 mM Tris-Cl， 270 mM蔗糖，1 mM MgCl2, pH 7.5)洗滌一次。然后將細(xì)胞重懸浮于溫育緩沖液(YPD + 25 mM DTT， 20mM HEPES， pH 8.0)中，在30。C和250 rpm下溫育30分鐘。離心收 集細(xì)胞，用電穿孔緩沖液洗滌一次，將其重懸浮于1mL電穿孔緩沖液 中。然后將一等份(400 nL)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個0Jcm的電穿孔杯中。將總 體積為50 nL的12 pg未酶切的pBH8加入杯中，這些細(xì)胞以1.8 kV， 1000 Q, 25 電穿孔。將電穿孔的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50 mL螺帽Falcon管中 的1 mL YPD中，在30。C和250 rpm下溫育4小時，之后選擇性接種 于含有300將/mL G418的YPD上。這些轉(zhuǎn)化子在37。C下溫育2天， 在新鮮選擇平板上重新劃線。pBH8向位于pBH8的瑞士乳捍菌L-LDH基因直接上游的側(cè)翼 KmPDCl DNA與馬克斯克魯維酵母染色體上KmPDCl基因直接上游 的DNA之間的KmPDCl基因座內(nèi)的適當(dāng)整合，用引物PDC1染色體 5， 5'-AAG CAC CAA GGC CTT CAA CAG畫3' (SEQ. ID NO. 33)和 L-LDH 3': 5'-TCG ATA TCG CTA AGG AAC GCG-3' (SEQ. ID NO. 34)證實。這些引物用來擴(kuò)增2.7kb產(chǎn)物，其位于KmPDCl基因上游且 摻入pBH8中的同源區(qū)之外的染色體DNA與瑞士乳桿菌L-LDH基因 之間。熱循環(huán)如下進(jìn)行開始時反應(yīng)混合物94。C溫育2min，然后94。C 30 sec, 55。C30sec， 72°C 3 min,共35個循環(huán)，最后72。C溫育7 min。 PCR分析的10個轉(zhuǎn)化子中有4個產(chǎn)生預(yù)期的2.7 kb PCR產(chǎn)物。使用用來擴(kuò)增KmPDCl基因座的引物PDC1 5' 5'-CGC AAA GAA AAG CTC CAC ACC-3'( SEQ.ID NO. 35)和PDC1 3' 5'-CCC ATA CGC TTA TAA TCC CCC腸3'( ; SEQ. ID NO. 36)進(jìn)行PCR，產(chǎn)生兩種 產(chǎn)物。 一種產(chǎn)物是對應(yīng)于馬克斯克魯維酵母PDC1的1.7kb片段，笫二 種產(chǎn)物是對應(yīng)于瑞士乳桿菌L-LDH的1.0 kb片段。熱循環(huán)如下進(jìn)行 開始時反應(yīng)混合物94。C溫育2 min,然后94。C 30 sec, 55°C 30 sec, 72°C 2 min，共35個循環(huán)，最后72。C溫育5 min。使用G418抗性基因編碼 區(qū)作為探針，通過Southern印跡分析進(jìn)一步證實單拷貝整合。所分析 的3個轉(zhuǎn)化子中有l(wèi)個顯示與一個pBH8拷貝整合相一致的適當(dāng)帶型。 通過PCR和Southern分析證實，在KmPDCl基因座處含有一個pBH8 拷貝的菌林，被命名為CD606。這些結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化的pBH8DNA向CD21的KmPDCl基因座內(nèi) 的定向整合在KmPDCl啟動子序列之間發(fā)生。
實施例3D:由馬克斯克魯維酵母CD606林構(gòu)建CD607林和CD608抹CD606在非選擇性培養(yǎng)基上繁殖數(shù)輪，以利于靶PDC1基因的刪 除。分離一種菌林，其中KmPDCl基因已經(jīng)被替換為瑞士乳桿菌L-LDH 基因。該菌林也不含G418抗性標(biāo)記基因，顯示G418敏感表型，通過 在G418存在下的生長抑制得到證實；ne()K基因的丟失通過Southern 印跡分析證實。另外，該菌株也不能夠厭氧生長。將CD606接種于YPD瓊脂平板上，在37。C下培養(yǎng)過夜約16小時。 將一個菌落拭子轉(zhuǎn)移到新鮮的YPD瓊脂平板上。該過程重復(fù)4次。在 YPD瓊脂平板上進(jìn)行第5輪非選擇性培養(yǎng)后，由第5輪非選擇性生長 的CD606平板接種6個250 mL帶擋板的搖瓶，至OD60。=0.1，搖瓶中 含有補充了 100 g/L葡萄糖和42 g/L CaC03的50 mL YPD。搖瓶在30。C 和250 rpm下溫育16小時。然后通過將豌豆大小的菌落拭子連續(xù)稀釋 到PBS(磷酸緩沖液)中，稀釋培養(yǎng)物。豌豆大小的菌落^t式子的最初懸液 在1 ml PBS中的10-5、 10-6、 10-7稀釋液在YPD瓊脂平板上使用。將在YPD平板上第5輪非選擇性生長的另外一個菌落拭子懸浮于 1 mL PBS(磷酸緩沖液；137 mN NaCl， 2.7 mM KCl， 10 mM Na2HP04， 2 mM KH2P04 pH 7.4)中，隨后稀釋，用單菌落接種YPD瓊脂平板。將 單菌落接種于YPD瓊脂上，置于一個厭氧培養(yǎng)室[Becton Dickinson, "GasPakSystem",使用三個氣嚢l(fā)中，按照廠商說明使用。在37。C下生 長2天后，打開厭氧培養(yǎng)室，標(biāo)記厭氧生長的菌落。平板在37'C下再溫 育一天。將需氧而不是厭氧生長的菌落轉(zhuǎn)移到三份平板上進(jìn)行篩選。使 用的篩選條件是需氧YPD平板、厭氧YPD平板和補充了 300 ng/mL G418的YPD平板。鑒定了兩個轉(zhuǎn)化子，其具有希望的G418敏感表型， 不能厭氧生長，被命名為CD607和CD608。使用引物PDC1 5， (SEQ. ID NO. 35)和PDC1 3' (SEQ. ID NO. 36) 證實KmPDCl被瑞士乳桿菌L-LDH的替換。以來自CD607和CD608 的DNA為模板，用這些引物擴(kuò)增PDC1基因座。熱循環(huán)如下進(jìn)行開
始時反應(yīng)混合物94。C溫育2 min，隨后94。C 30 sec, 55。C 30 sec, 72。C 2 min，共35個循環(huán)，最后72。C溫育5 min。兩個菌株的染色體DNA產(chǎn) 生對應(yīng)于瑞士乳桿菌L-LDH的1.0 kb PCR產(chǎn)物。使用用來雜交G418 基因的G418基因的完整編碼區(qū)作為探針進(jìn)行Southern印跡分析，表明 PCR產(chǎn)物不含G418基因。使用KmPDCl編碼探針的Southern分析顯 示沒有條帶，表明沒有用來雜交KmPDCl直接上游和下游區(qū)域的 KmPDCl編碼序列探針。使用的探針是與PDC1基因直接上游和下游 的染色體區(qū)域同源的DNA片段。用寡聚體5'探針-CA110和CA111; 3'探針-CA112和CA113經(jīng)PCR擴(kuò)增探針，產(chǎn)生大小與KmPDCl被瑞 士乳桿菌L-LDH置換相一致的條帶。這些結(jié)果表明，CD606的染色體中丟失了 KmPDCl基因以及含有 與釀酒酵母ScPDCl啟動子和ScGALlO終止子連接的G418抗性標(biāo)記 的pBH8質(zhì)粒骨架，產(chǎn)生一種菌林，其中KmPDCl基因被側(cè)翼為Sbfl 位點的瑞士乳桿菌L-LDH基因準(zhǔn)確替換。實施例3E: CD607在復(fù)雜CaC03緩沖培養(yǎng)基中的L-乳酸產(chǎn)生 CD607林在一個250 mL帶擋板的搖瓶中培養(yǎng)，其中含有補充了 100 g/L葡萄糖和50 g/L CaC03的50 mL YPD培養(yǎng)基，由YPD瓊脂平板接 種至OD6()。=0.1，之后在30。C和250 rpm下培養(yǎng)16小時。在確定搖瓶 中含有殘余葡萄糖，因此細(xì)胞處于指數(shù)生長期后，離心收集4g/L細(xì)胞 千重當(dāng)量，將其重懸浮于一個250 mL帶擋板的搖瓶中，其中含有補充 了 100 g/L葡萄糖和50 g/L CaC03的50 mL YPD。培養(yǎng)物在30。C和70 rpm下溫育(站小時)。在不同時間(O、 8、 24、 48小時間隔)采樣，過濾 除去細(xì)胞。通過HPLC分析培養(yǎng)上清液的葡萄糖、乳酸(鹽)、丙酮酸 (鹽)和乙醇。24小時后，CD607林消耗了 59-61 g/L葡萄糖，產(chǎn)生58-60 g/L乳 酸(鹽)和0.3 g/L丙酮酸(鹽)。48小時后，CD607林消耗了 101-104 g/L葡萄糖，產(chǎn)生了 94力9 g/L乳酸(鹽)和0.4 g/L丙酮酸(鹽)。這 些乳酸滴度代表微需氧生產(chǎn)階段基于葡萄糖的90-98%的乳酸收率，和
大于2.1g/L/hr的容積生產(chǎn)率。48小時后，由于培養(yǎng)物中產(chǎn)生高水平的 乳酸鹽，形成一種不可溶的乳酸鈣沉淀("結(jié)塊")，妨礙了進(jìn)一步的分析。 乳酸鹽酶分析顯示，乳酸(鹽)是對映體純度大于99%的L-乳酸(鹽)。 在CD607的培養(yǎng)物中未檢測到乙醇，因此表明只有一個拷貝的PDC1 被一個L-LDH替換。與之相比，CD 606抹(含有PDC基因和瑞士乳桿菌L-LDH基因) 在相同發(fā)酵條件下消耗了 124g/L葡萄糖，產(chǎn)生83g/L乳酸(鹽)、20 g/L乙醇和0.2 g/L丙酮酸(鹽)。實施例3F:在不添加緩沖劑的復(fù)雜培養(yǎng)基中，游離L-乳酸的產(chǎn)生 CD607抹在一個250 mL帶擋板的搖瓶中培養(yǎng)，其中含有補充了 100 g/L葡萄糖的50 mL YPD培養(yǎng)基，由YPD瓊脂平板接種至OD6。。=0.1， 之后在30。C和250 rpm下培養(yǎng)16小時。在確定搖瓶中含有殘余葡萄糖， 因此細(xì)胞處于指數(shù)生長期后，離心收集2g/L細(xì)胞干重當(dāng)量，將其重懸 浮于一個250 mL帶擋板的搖瓶中，其中含有補充了另外40 g/L葡萄糖 的50mLYPD。培養(yǎng)物在30。C和70 rpm下溫育(72小時)。在不同時間 (在開始生產(chǎn)后O、 24、 47、 72小時)采樣。通過HPLC分析培養(yǎng)樣品的 葡萄糖、乳酸(鹽)(總和游離酸)、丙酮酸(鹽)、甘油、乙酸(鹽) 和乙醇。在生產(chǎn)開始和結(jié)束時測定pH。72小時后，CD607林消耗了 10.8 g/L葡萄糖，產(chǎn)生9.1 g/L乳酸(鹽)、 0.5 g/L乙酸(鹽)和1.2 g/L丙酮酸(鹽)。這些乳酸滴度代表^L需氧 生產(chǎn)階段基于葡萄糖的84%的乳酸收率，和大于0.1 g/L/hr的容積生產(chǎn) 率。乳酸(鹽)酶分析顯示，乳酸(鹽)是對映體純度大于99%的L-乳酸(鹽)。在CD607林的培養(yǎng)物中未檢測到乙醇。另外，也未檢測 到甘油。在生產(chǎn)階段，由于有機酸的產(chǎn)生，培養(yǎng)液的pH由6.50降為 3.05。通過HPLC測定游離乳酸(質(zhì)子化乳酸)，發(fā)現(xiàn)9.1g/L游離乳酸， 表明CD607產(chǎn)生的所有乳酸基本上都是質(zhì)子化形式。應(yīng)當(dāng)理解，上述公開內(nèi)容強調(diào)了本發(fā)明的某些具體實施方案，與之
相當(dāng)?shù)乃行揎椇透淖兌荚谌鐧?quán)利要求書所述的本發(fā)明的精神和范圍 之內(nèi)。此處引用的所有參考文獻(xiàn)均全文引用作為參考。<110><120><130><1S0> <1S1><160><170><210> <211> <212> <213><400>序列表Cargill Dow polymers LLC Hause， Ben Rajgarhia， vineet Suomi nen ， Pi rkko在酵母中生產(chǎn)L-乳酸的方法和材料00-1237-PUS 60/384,333 2002-05-3038Patentln version848釀酒酵母gcggccgcgg3tcgctcttccgctatcgattaatttttttttctttcctctttttattt祖60CCttMtttttattttsgeittcctgacttcaactcaagactataacatct120gcacaataggC3tttgc3sigsiattsLCtcgtSLCt3tCgC3t180acctgcatttasagatgccg3tttgggcgcgaatcctttattttggcttcaccctcatac240tattatcagggccagaaaaaggaagtgtttccctccttcttgatattgatgttsLCcctcat300aaagcacgtggcctcttstcgagaaagaaattaccgtcgctcgtgstttgtttgcaaaaa3603g3c3cgctcgacttcctgtcttcctattgattgcaigctt420ccwtttcgtggtcctagcgacggctcacaggttttgtaacaagcaatcg480aaggttctggaatggcggg這aagggtttagtaccacatgct3tgstgcccactgtgatct540ccagagcwagttcgttcgatcgtactgttactctctxtctttcawceigwttgtccga600atcgtgtgactgttctcacacactcttttc哪ggtggtt660gaacctcgtgaaacttacatataaattggt720caatgcaagatggtcttttctwtcgtaigtttttC33gttcttagatgc780tttctttttctcttttttscagatcatcaaggaagtaattaitctsctttttacaacaaat840848<210> 2<211> 376<212> DNA <213>釀酒酵母<400> 2gtagatacat tgatgctatc aatccagaga actggaaaga ttgtgtagcc ttgaaaaacggtgaiaactta cgggtccaag attgtctaca gattttcctg atttgccagc ttactatccttcttgaaaat atgcactcta tatcttttag ttcttaattg 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1.一種用于轉(zhuǎn)化酵母種的細(xì)胞之重組核酸，其包含與LDH基因上游和下游側(cè)翼序列共價連接的對于該酵母種而言外源的LDH基因，該側(cè)翼序列分別與對于該酵母種天然的靶基因的上游和下游側(cè)翼序列同源，并且含有至少一個選擇性標(biāo)記。
2. 權(quán)利要求l的重組核酸，其中所述LDH基因上游的側(cè)翼序列包 括與靶基因啟動子序列同源的啟動子序列，該LDH基因下游的側(cè)翼序 列包括靶基因的終止序列。
3. 權(quán)利要求2的重組核酸，其中所述選擇性標(biāo)記與啟動子和終止 序列有效連接。
4. 權(quán)利要求2的重組核酸，其中所述靶基因是PDC基因。
5. 權(quán)利要求3的重組核酸，其中所述選擇性標(biāo)記不打斷上游側(cè)翼 序列、LDH基因和下游側(cè)翼序列的序列。
6. 權(quán)利要求1的重組核酸，其中所述外源乳酸脫氫酶基因來自于 瑞士乳桿菌(L.helveticus )或巨大芽孢桿菌(B.megaterium )。
7. 酵母種的一種重組細(xì)胞，其中該酵母種在其基因組的基因座內(nèi) 含有靶基因，該細(xì)胞具有整合到其基因組內(nèi)的外源乳酸脫氫酶基因，其 處于靼基因的啟動子和終止序列的功能部分的轉(zhuǎn)錄控制之下，LDH基 因在耙基因的基因座處整合，而該靶基因被從細(xì)胞基因組中刪除。
8. 權(quán)利要求7的細(xì)胞，其中靶基因是丙酮酸脫羧酶基因。
9. 權(quán)利要求7的細(xì)胞，它是酵母屬(Saccharomyces)、克魯維酵 母屬(Kluyveromyces )、假絲酵母屬(Candida)、畢赤酵母屬(Pichia )、 漢森酵母屬(Hansenula )、球擬酵母屬(Torulopsis )或Fawww/fl^附a 之一的一個種。
10. 權(quán)利要求9的細(xì)胞，其中所述酵母種是馬克斯克魯維酵母 (K.marxianus )、耐熱克魯維酵母(幼er附oto/em附)、乳酸克魯維酵母(K.lactics )或C s^m0re附/s。
11. 權(quán)利要求8的細(xì)胞，其中乳酸脫氫酶基因來源于瑞士乳桿菌或巨大芽孢桿菌。
12. —種將外源乳酸脫氫酶基因整合到細(xì)胞內(nèi)的方法，其中在整合 之前，該細(xì)胞在其基因組的基因座處含有一個靶基因，該方法包括下列 步驟(a)用一種重組核酸轉(zhuǎn)化該細(xì)胞，該核酸具有乳酸脫氬酶(LDH) 基因、LDH基因上游和下游的側(cè)翼序列和至少一個選擇性標(biāo)記基因， 該側(cè)翼序列與靶基因上游和下游的側(cè)翼序列同源，使得LDH基因在單 交換事件中插入該細(xì)胞的基因組內(nèi)，與靶基因的基因座相鄰，(b)選擇含 有LDH基因和選擇性標(biāo)記基因的第一種轉(zhuǎn)化子，(c)非選擇性培養(yǎng)所述 第一種轉(zhuǎn)化子，和(d)在所述第一種轉(zhuǎn)化子中選擇含有LDH基因但是刪 除了選擇性標(biāo)記基因和乾基因的第二種轉(zhuǎn)化子。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中所述LDH基因上游的側(cè)翼序列包括 與靶基因的啟動子序列同源的啟動子序列，并且該LDH基因下游的側(cè) 翼序列包括靶基因的終止序列。
14. 權(quán)利要求13的方法，其中所述靶基因是丙酮酸脫氫酶基因。
15. 權(quán)利要求12的方法，其中所述載體還包含與啟動子和終止序 列有效連接的標(biāo)記基因。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中與標(biāo)記基因有效連接的啟動子和終 止序列對于該酵母菌林而言不是天然的。
17. 馬克斯克魯維酵母種的一種細(xì)胞，其具有整合到其基因組內(nèi)的 多個外源乳酸脫氫酶基因，各自處于功能啟動子和終止序列的控制之 下，其中該馬克斯克魯維酵母細(xì)胞的基因組還含有功能丙酮酸脫羧酶基 因。
18. 權(quán)利要求17的細(xì)胞，其中所述功能丙酮酸脫羧酶基因?qū)τ隈R 克斯克魯維酵母而言是天然的。
19. 權(quán)利要求18的細(xì)胞，其中所述功能丙酮酸脫羧酶基因是PDC1 基因。
20. 權(quán)利要求19的細(xì)胞，其中所述外源乳酸脫氫酶基因來源于瑞 士乳桿菌或巨大芽孢桿菌。
21. 權(quán)利要求20的細(xì)胞，其含有多個拷貝的來源于瑞士乳桿菌的乳酸脫氫酶基因。
22. 權(quán)利要求20的細(xì)胞，其含有來源于巨大芽孢桿菌的乳酸脫氬 酶基因的多個拷貝。
23. 權(quán)利要求20的細(xì)胞，其含有來源于瑞士乳桿菌的乳酸脫氬酶 基因的至少一個拷貝和來源于巨大芽孢桿菌的乳酸脫氫酶基因的至少 一個拷貝。
24. 權(quán)利要求21的細(xì)胞，其中乳酸脫氫酶基因的至少一個拷貝處 于TEF1啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下。
25. 權(quán)利要求22的細(xì)胞，其中乳酸脫氬酶基因的至少一個拷貝處 于TEF1啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下。
26. 權(quán)利要求21的細(xì)胞，其中乳酸脫氫酶基因的至少一個拷貝處 于PGK啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下。
27. 權(quán)利要求22的細(xì)胞，其中乳酸脫氫酶基因的至少一個拷貝處 于PGK啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下。
28. 權(quán)利要求21的細(xì)胞，其中乳酸脫氫酶基因的至少一個拷貝處 于GAL10終止子的轉(zhuǎn)錄控制之下。
29. 權(quán)利要求22的細(xì)胞，其中乳酸脫氬酶基因的至少一個拷貝處 于GAL10終止子的轉(zhuǎn)錄控制之下。
30. 權(quán)利要求23的細(xì)胞，其中至少一個乳酸脫氬酶基因處于TEF1 啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下。
31. 權(quán)利要求23的細(xì)胞，其中至少一個乳酸脫氬酶基因處于PGK 啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下。
32. 權(quán)利要求23的細(xì)胞，其中至少一個乳酸脫氬酶基因處于GAL10 終止子的轉(zhuǎn)錄控制之下。
33. —種將糖發(fā)酵為乳酸的方法，其包括在發(fā)酵條件下在含有可被 該細(xì)胞發(fā)酵的糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求7的細(xì)胞。
34. 權(quán)利要求33的方法，其中在整個發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基的pH 保持在約pH 5-約pH8的范圍內(nèi)。
35. 權(quán)利要求33的方法，其中在發(fā)酵過程中由于細(xì)胞產(chǎn)生乳酸， 培養(yǎng)基的pH降到約2.5-約5.0。
36. 權(quán)利要求34的方法，其中在發(fā)酵過程中由于細(xì)胞產(chǎn)生乳酸， 培養(yǎng)基的pH降至約2.5-約3.8。
37. 權(quán)利要求33的方法，它還包括將至少一部分乳酸轉(zhuǎn)化為與丙 交酯的步驟。
38. 權(quán)利要求37的方法，它還包括聚合丙交酯形成聚丙交酯聚合 物或共聚物的步驟。
39. —種生產(chǎn)乳酸的方法，包括在發(fā)酵條件下在含有可被該細(xì)胞發(fā) 酵的糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求7的細(xì)胞。
40. 權(quán)利要求39的方法，其中在整個發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基的pH 保持在約pH 5-約pH 8的范圍內(nèi)。
41. 權(quán)利要求39的方法，其中在發(fā)酵過程中由于細(xì)胞產(chǎn)生乳酸， 培養(yǎng)基的pH降至約2.5-約5.0。
42. 權(quán)利要求41的方法，其中在發(fā)酵過程中由于細(xì)胞產(chǎn)生乳酸， 培養(yǎng)基的pH降至約2.5-約3.8。
43. 權(quán)利要求39的方法，它還包括將至少一部分乳酸轉(zhuǎn)化為丙交 酯的步驟。
44. 權(quán)利要求43的方法，它還包括聚合丙交酯形成聚丙交酯聚合 物或共聚物的步驟。
45. —種將糖發(fā)酵為乳酸的方法，包括在發(fā)酵條件下在含有可被該 細(xì)胞發(fā)酵的糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求17的細(xì)胞。
46. 權(quán)利要求45的方法，其中在整個發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基的pH 保持在約pH 5-約pH 8的范圍內(nèi)。
47. 權(quán)利要求45的方法，其中在發(fā)酵過程中由于細(xì)胞產(chǎn)生乳酸， 培養(yǎng)基的pH降至約2.5-約5.0。
48. 權(quán)利要求47的方法，其中在發(fā)酵過程中由于細(xì)胞產(chǎn)生乳酸， 培養(yǎng)基的pH降至約2.5-約3.8。
49. 一種生產(chǎn)乳酸的方法，包括在發(fā)酵條件下在含有可被該細(xì)胞發(fā) 酵的糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求17的細(xì)胞。
50. 權(quán)利要求45的方法，它還包括將至少一部分乳酸轉(zhuǎn)化為丙交 酯的步驟。
51. 權(quán)利要求50的方法，它還包括聚合丙交酯形成聚丙交酯聚合 物或共聚物的步驟。
52. 權(quán)利要求49的方法，其中在整個發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基的pH 保持在約pH 5-約pH8的范圍內(nèi)。
53. 權(quán)利要求49的方法，其中在發(fā)酵過程中由于細(xì)胞產(chǎn)生乳酸， 培養(yǎng)基的pH降至約2.5-約5.0。
54. 權(quán)利要求53的方法，其中在發(fā)酵過程中由于細(xì)胞產(chǎn)生乳酸， 培養(yǎng)基的pH降至約2.5-約3.8。
55. 權(quán)利要求49的方法，它還包括將至少一部分乳酸轉(zhuǎn)化為丙交 酯的步驟。
56. 權(quán)利要求55的方法，它還包括聚合丙交酯形成聚丙交酯聚合 物或共聚物的步驟。
全文摘要
一方面，提供了重組酵母，其具有整合到基因組內(nèi)的多個外源LDH基因，而天然PDC基因保持完整。第二方面，提供了重組酵母，其具有整合到其基因組內(nèi)天然PDC基因的基因座處的一個外源LDH基因，而該天然PDC基因已經(jīng)刪除。該重組酵母在生產(chǎn)乳酸的發(fā)酵方法中有用。
文檔編號C12N1/21GK101157930SQ200710127898
公開日2008年4月9日 申請日期2003年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月30日
發(fā)明者B·豪斯, P·索米寧, V·賴格里亞 申請人:卡吉爾道有限責(zé)任公司