專利名稱：多胚芽玉米的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的涉及植物基因工程。具體說(shuō)，本發(fā)明提供抑制玉米和其他禾本科植物低位小花中程序性細(xì)胞死亡的方法。本發(fā)明還提供具有多胚芽谷粒的轉(zhuǎn)基因玉米植物和多胚芽轉(zhuǎn)基因玉米植物的谷粒。
背景技術(shù)：
在1993年，美國(guó)種植了7270萬(wàn)英畝以上的玉米用于谷物生產(chǎn)。美國(guó)種植的玉米主要是黃色凹齒型，該農(nóng)產(chǎn)品作物，或是作為谷物或是作為青貯飼料，被大量用于飼養(yǎng)家畜。余下的玉米出口或經(jīng)濕磨或干磨加工來(lái)生產(chǎn)例如高果糖玉米糖漿和淀粉或油、玉米砂和面粉等產(chǎn)品。這些加工產(chǎn)品在食品業(yè)中廣泛使用，例如，玉米淀粉是許多加工食品的原料，和工業(yè)制造加工中的原料。其他玉米產(chǎn)品包括玉米油、玉米糖漿、葡萄糖、麥芽糊精和乙醇。這些加工的副產(chǎn)品常用于動(dòng)物飼料和各種食品添加劑和消費(fèi)產(chǎn)品。到2100年，24％的作物種植土地收獲的谷物玉米總價(jià)值可為184.4億美元，而1999年為179.3億美元。這在經(jīng)濟(jì)價(jià)值上超過(guò)美國(guó)種植的其他作物。例如，2000年種植的大豆價(jià)值136億美元，小麥為58.9億美元。玉米在許多國(guó)家中的種植超過(guò)其他作物，是全球人類和動(dòng)物食品和蛋白質(zhì)的主要來(lái)源。由于玉米在美國(guó)的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，進(jìn)行了持續(xù)和大量的努力來(lái)增加它的淀粉、蛋白質(zhì)和油含量；由于從玉米中能提取許多產(chǎn)品，已開發(fā)了或含高油、高淀粉，或含高蛋白的玉米品種。玉米谷粒中大多數(shù)油和蛋白質(zhì)存在于胚芽中。
玉米開單性花或小花，這些花在植株中是分開的。植株頂部的雄性花序上有產(chǎn)生花粉的雄花，而發(fā)育成谷粒的雌花存在于雌性花序中。穗部的小花產(chǎn)生雌性花器官而不是雄性花器官。該花穗早期分化后，成對(duì)的小穗狀花序沿著穗部總長(zhǎng)發(fā)育。在每個(gè)小穗狀花序中，發(fā)育出兩個(gè)小花原基。每個(gè)小花原基進(jìn)一步發(fā)育成最初的一層膜，a plaea，兩個(gè)漿片，三個(gè)雄蕊和中心雌蕊。在玉米穗的每個(gè)小穗狀花序產(chǎn)生的兩個(gè)小花中，低位小花死亡，高位小花發(fā)育成谷粒。在剩余的小花中，三個(gè)雄蕊也停止發(fā)育，只留下中心雌蕊發(fā)育成為成熟子房，授粉后，其發(fā)育產(chǎn)生谷粒。
每個(gè)小穗狀花序中低位小花的死亡是玉米植物發(fā)育中程序性細(xì)胞死亡的一個(gè)例子。其他例子包括在谷粒的發(fā)育晚期，胚乳的死亡，從而谷粒組織中大量淀粉合成和沉積。程序性細(xì)胞死亡是通過(guò)幾種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子的平衡來(lái)啟動(dòng)和控制的。例如，玉米胚乳的細(xì)胞死亡受激素乙烯促進(jìn)，但受到激素脫落酸的阻遲。Young et al.，Plant Mol.Biol.42397-414(2000)，Young et al，Plant Physiol.115737-751(1997)。細(xì)胞死亡的激素控制還可應(yīng)用于植物器官細(xì)胞死亡。穗部小花(雄蕊)中的雄性花器官的停止發(fā)育涉及需要激素赤霉酸的程序性細(xì)胞死亡。Calderon-Urreaea al.，Development 126，435-441(1999)。
已確定抑制植物衰老可作為延長(zhǎng)植物光合作用活性生命的一種途徑。已知細(xì)胞分裂素(cytokinin)是抑制葉子衰老的酶。衰老模式改變的植物在種子和花的發(fā)育中含有保留高水平葉綠素的葉子。葉子衰老模式改變的煙草植物增加了生物量的產(chǎn)量和花及種子的產(chǎn)量，盡管每個(gè)花的種子產(chǎn)量保持相同。(見美國(guó)專利5,689,042)。
存在著對(duì)增加食物產(chǎn)量的新方法的需要。本發(fā)明通過(guò)提供抑制玉米和其他禾本科植物中程序性細(xì)胞死亡的方法來(lái)解決這些需要和其他需要。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及抑制玉米植物和其他禾本科植物的低位小花中程序性細(xì)胞死亡的方法。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抑制玉米植物中程序性細(xì)胞死亡的方法。該方法包括將含有操作性連接于能抑制程序性細(xì)胞死亡的核苷酸序列的程序性細(xì)胞死亡可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的構(gòu)建物導(dǎo)入玉米植株中。特別是抑制玉米植物低位小花中的程序性細(xì)胞死亡。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，該核苷酸酸序列編碼植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑合成酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，該植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑合成酶能催化細(xì)胞分裂素的合成。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，該植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑合成酶是異戊烯轉(zhuǎn)移酶。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，該程序性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)啟動(dòng)子是SAG12。在一個(gè)實(shí)施方案中，SAG12啟動(dòng)子來(lái)自擬南芥(Arabidopsis thaliana)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，SAG12啟動(dòng)子與SEQ ID NO1有70％相同。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，抑制玉米植物中程序性細(xì)胞死亡的方法包括檢測(cè)植物中增高的蛋白質(zhì)水平。
在一些實(shí)施方案中，抑制玉米植物中程序性細(xì)胞死亡的方法包括檢測(cè)植物中增高的油的水平。在其他實(shí)施方案中，抑制玉米植物中程序性細(xì)胞死亡的方法包括檢測(cè)所述植物中增高的油和蛋白質(zhì)水平。在其他實(shí)施方案中，抑制玉米植物中程序性細(xì)胞死亡的方法包括檢測(cè)具有多胚芽谷粒的存在。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述構(gòu)建物通過(guò)性雜交導(dǎo)入。在另一發(fā)明，通過(guò)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入該構(gòu)建物。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)基因玉米植物，該玉米植物包括含有與編碼程序性細(xì)胞死亡抑制劑的核苷酸序列操作性相連的程序性細(xì)胞死亡可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的表達(dá)盒，該玉米植物具有多胚芽的谷粒。
在一些實(shí)施方案中，所述核苷酸序列編碼植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑合成酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，該酶催化細(xì)胞分裂素的合成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該酶是異戊烯轉(zhuǎn)移酶。
在一些實(shí)施方案中，所述程序性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)啟動(dòng)子是SAG12。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供來(lái)自含有多胚芽的轉(zhuǎn)基因玉米植物的谷粒，其中該谷粒具有增多的油和蛋白質(zhì)含量。
在一些實(shí)施方案中，抑制玉米植物中程序性細(xì)胞死亡的方法包括，將與能抑制程序性細(xì)胞死亡的核苷酸序列操作性相連的小花特異性基因的啟動(dòng)子，導(dǎo)入所述的植物，由此抑制所述植物低位小花的程序性細(xì)胞死亡。在一個(gè)方面，該小花特異性基因與程序性細(xì)胞死亡有關(guān)。在另一方面，該小花特異性基因與程序性細(xì)胞死亡無(wú)關(guān)。
在一些實(shí)施方案中，所述核苷酸序列編碼植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑合成酶。在一方面，該酶催化細(xì)胞分裂素的合成。在另一方面，該酶是異戊烯轉(zhuǎn)移酶。在還有一方面，抑制程序性細(xì)胞死亡的方法包括檢測(cè)玉米植物中增高的油和蛋白質(zhì)水平。而在另一方面，抑制程序性細(xì)胞死亡的方法包括檢測(cè)具有多胚芽谷粒的存在。
發(fā)明詳述I.序言本發(fā)明第一次表明了一種能抑制玉米和其他禾本科植物低位小花中的程序性細(xì)胞死亡的方法。禾本科植物可包括但不限于禾本科植物如小麥、黑麥、稻、高粱或燕麥。本發(fā)明還第一次提供了具有多胚芽谷粒的玉米植物。由于玉米谷粒中大部分油和蛋白質(zhì)存在于胚芽中，故多胚芽谷粒的玉米植物比單胚芽谷粒的玉米植物含有更多的蛋白質(zhì)和油。因此多胚芽谷粒的玉米植物作為食物來(lái)源和農(nóng)產(chǎn)品是有價(jià)值的。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將包含與能抑制程序性細(xì)胞死亡的核苷酸序列相連的程序性細(xì)胞死亡可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的構(gòu)建物導(dǎo)入玉米或其他禾本科植物。在含有該構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因玉米植物中，該程序性細(xì)胞死亡可誘導(dǎo)啟動(dòng)子在玉米植物穗狀花序的低位小花的程序性細(xì)胞死亡中被活化。低位小花的程序性細(xì)胞死亡受該核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)所抑制，存活的低位小花在授粉后可產(chǎn)生一個(gè)胚芽。高位小花的發(fā)育的谷粒和低位小花的胚芽融合在一起，從而產(chǎn)生由結(jié)合于正常大小胚乳的兩個(gè)或多個(gè)胚芽組成的谷粒。雙胚芽谷粒的萌芽導(dǎo)致產(chǎn)生兩個(gè)或多個(gè)的獨(dú)特、健康和可繁殖的玉米植物。所以，本發(fā)明第一次表明了玉米植物中油和蛋白質(zhì)含量增多的多胚芽谷粒玉米植物。
II.定義術(shù)語(yǔ)“程序性細(xì)胞死亡”指細(xì)胞死亡的模式。一般有兩種細(xì)胞死亡模式，程序性細(xì)胞死亡和壞死。在壞死中，細(xì)胞是導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性喪失的各種形式創(chuàng)傷的被動(dòng)犧牲品。相反，程序性細(xì)胞死亡需要從頭基因表達(dá)，以核形態(tài)變化、核酸酶和蛋白酶的活化和核DNA的核內(nèi)小體退化為特征。在程序性細(xì)胞死亡中，細(xì)胞在死亡以前經(jīng)歷了獨(dú)特的代謝和結(jié)構(gòu)變化，按照這些情況的控制模式使細(xì)胞停止生存。程序性細(xì)胞死亡對(duì)于多細(xì)胞生物體如哺乳動(dòng)物、昆蟲和植物的正常發(fā)育和機(jī)體平衡是一種必要的過(guò)程。程序性細(xì)胞死亡的發(fā)生可以伴有或不伴有衰老過(guò)程。例如，玉米植物的低位小花經(jīng)歷了程序性細(xì)胞死亡但仍然相當(dāng)年青，而從不經(jīng)歷衰老過(guò)程。
術(shù)語(yǔ)“衰老”通常指發(fā)生在細(xì)胞死亡前的老化過(guò)程。
術(shù)語(yǔ)“程序性細(xì)胞死亡相關(guān)基因”指參與程序性細(xì)胞死亡通路的基因。程序性細(xì)胞死亡相關(guān)基因是在程序性細(xì)胞死亡通路中不同時(shí)間可被誘導(dǎo)表達(dá)的基因。程序性細(xì)胞死亡相關(guān)基因可以在程序性細(xì)胞死亡的未成熟期間被誘導(dǎo)或在程序性細(xì)胞死亡規(guī)律性發(fā)生期間被誘導(dǎo)。它們可以在程序性細(xì)胞死亡的初期、中期或末期被誘導(dǎo)。程序性細(xì)胞死亡相關(guān)基因也可以包括可在衰老中誘導(dǎo)表達(dá)的基因，例如，衰老相關(guān)基因。衰老相關(guān)基因在衰老期間表達(dá)。
術(shù)語(yǔ)“程序性細(xì)胞死亡可誘導(dǎo)啟動(dòng)子”指在程序性細(xì)胞死亡中該誘導(dǎo)表達(dá)的基因的啟動(dòng)子。術(shù)語(yǔ)“程序性細(xì)胞死亡可誘導(dǎo)啟動(dòng)子”可指在程序性細(xì)胞死亡初期被誘導(dǎo)表達(dá)的基因的啟動(dòng)子。程序性細(xì)胞死亡可誘導(dǎo)啟動(dòng)子以發(fā)育調(diào)節(jié)方式能夠優(yōu)先啟動(dòng)植物組織中的基因表達(dá)，所以只有當(dāng)植物組織經(jīng)歷程序性細(xì)胞死亡時(shí)3’蛋白編碼區(qū)才發(fā)生實(shí)質(zhì)性表達(dá)。術(shù)語(yǔ)“程序性細(xì)胞死亡可誘導(dǎo)啟動(dòng)子”可包括衰老可誘導(dǎo)啟動(dòng)子(例如，在對(duì)衰老反應(yīng)中被誘導(dǎo)的基因的啟動(dòng)子，不包括上述啟動(dòng)子，如SAG啟動(dòng)子)。
詞語(yǔ)“核酸”指從5’讀到3’末端的脫氧核糖核酸或核糖核酸堿基的單或雙鏈聚合體。核酸還可包括允許聚合酶正確讀通的并且不改變?cè)摵怂峋幋a多肽表達(dá)的修飾的核苷酸。
詞語(yǔ)“多核苷酸序列”或“核酸序列”包括單鏈或雙鏈的有義核酸鏈和反義核酸鏈。它包括但不限于，自身復(fù)制性質(zhì)粒、染色體序列和DNA或RNA的傳染性聚合物。
詞語(yǔ)“核酸序列編碼”指能指導(dǎo)特定蛋白質(zhì)或肽表達(dá)的核酸。核酸序列包括可轉(zhuǎn)錄到RNA中而被RNA序列能翻譯成蛋白質(zhì)的DNA鏈序列。該核酸序列包括全長(zhǎng)的核酸序列和源自該全長(zhǎng)序列的非全長(zhǎng)序列?？梢赃M(jìn)一步理解該序列包括可以被導(dǎo)入特定宿主細(xì)胞以提供密碼子偏愛的天然序列的簡(jiǎn)并密碼子。
本文中使用的術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”包括能在植物細(xì)胞推動(dòng)編碼序列轉(zhuǎn)錄的所有序列。因此，本發(fā)明構(gòu)建物中使用的啟動(dòng)子包括順式作用轉(zhuǎn)錄控制元件和參與控制或調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的時(shí)間和/或速度的調(diào)節(jié)序列。例如，啟動(dòng)子可以是參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的順式作用轉(zhuǎn)錄控制元件，包括增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、復(fù)制起點(diǎn)、染色體整合序列、5’和3’非翻譯區(qū)域，或內(nèi)含子序列。這些順式作用序列通常與蛋白質(zhì)或其他生物分子相互作用以進(jìn)行(開/關(guān)，控制、調(diào)節(jié)等)轉(zhuǎn)錄。
術(shù)語(yǔ)“植物”包括全植株、新芽植物器官/結(jié)構(gòu)(如葉莖和塊莖)，根，花和器官/結(jié)構(gòu)(例如在苞、花萼、花瓣、雄蕊、心皮、花粉囊和胚珠)，種子(包括胚芽、胚乳和種皮)和果實(shí)(成熟子房)，植物組織(例如脈管組織、基底組織等等)和細(xì)胞(如防衛(wèi)細(xì)胞、卵細(xì)胞、毛狀體等等)，和它們的后代。可用于本發(fā)明方法的植物種類通常廣泛，如適合于轉(zhuǎn)化技術(shù)的高等和等植物，包括被子植物(單子葉植物和雙子葉植物)、裸子植物、蕨類植物和多細(xì)胞藻類。它包括各種倍數(shù)葉植物，包括非整倍體、多倍體、雙倍體、單倍體和半合子。
多聚核苷酸序列對(duì)于源自異種種類，或如果源自同一種類，但是與其原來(lái)形式經(jīng)過(guò)修飾的生物體或第二多聚核苷酸而言是“異源性的”。例如，與異源編碼序列操作性相連接的啟動(dòng)子指與該啟動(dòng)子衍生的不同種的編碼序列，或如果衍生自同一種類，則是與任何天然產(chǎn)生的等位基因變體不同的編碼序列。
個(gè)體植物的“外源性”多聚核苷酸，是以性雜交以外任何方式被導(dǎo)入到該植物中的多聚核苷酸。用于實(shí)現(xiàn)該目的的方法的例子在下文描述，包括植物技術(shù)中土壤桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，生物轟擊方法、電穿孔等等。本文所指的包含外源性核酸的植物指R1代轉(zhuǎn)基因植物。性雜交或通過(guò)自花授粉的轉(zhuǎn)基因植物是該植物的后代。
本文中使用的，某具體胚芽特異性基因的同聚物是在相同基因類型和不同基因類型中的第二基因，其多聚核苷酸序列有至少50個(gè)毗連的核苷酸與該第一基因序列中的基本上相同(下文中的描述確定)。通常認(rèn)為同系物有共同的進(jìn)化歷程。
某基因的多聚核苷酸序列是該基因的序列或全長(zhǎng)的多聚核苷酸序列，當(dāng)其存在于在轉(zhuǎn)基因植物中時(shí)具有所需的效果，例如，抑制內(nèi)內(nèi)源性基因的表達(dá)從而驅(qū)動(dòng)異源性多聚核苷酸表達(dá)。本文公開的特定基因的全長(zhǎng)序列可包含下文序列表中所示的整個(gè)序列的約95％，通常至少約98％。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“生殖組織”包括果實(shí)、胚珠、種子、花粉、pistols、花，或任何胚芽組織。
在轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和內(nèi)源性基因的抑制(如反義或有義抑制)的情況，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道插入的多聚核苷酸序列不需要衍生該多聚核苷酸的基因的序列相同和可以“基本上相同”。如下文所述，本術(shù)語(yǔ)特別包含了這些變體。
在插入的多聚核苷酸被轉(zhuǎn)錄和翻譯而產(chǎn)生功能性多肽的情況中，本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得由于密碼子的簡(jiǎn)并性，許多多聚核苷酸可編碼相同的多肽。
在多聚核苷酸被用于抑制內(nèi)源性基因表達(dá)的情況中，導(dǎo)入的序列不需要與目標(biāo)內(nèi)源性基因的序列完全相同。導(dǎo)入的多聚核苷酸序列通常至少與目標(biāo)內(nèi)源性基因基本上相同即可(下文中確定)。
如果兩個(gè)序列的核苷酸或氨基酸殘基的序列在下文所述的最大一致性排列對(duì)比時(shí)分別相同，就說(shuō)這兩個(gè)核酸序列或多肽是“相同的”。本文使用的術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”指該序列與參比的多聚核苷酸序列的全部或部分互補(bǔ)。
進(jìn)行序列的最佳排列對(duì)比可通過(guò)Simth and Waterman Add.APL.Math.2482(1981)的局部同源性算法、Needle man and Wunsch J.Mol.Biol.48443(1970)的同源性排列算法、Pearson and Lipman Proc.Natl.Acad.Sci(U.S.A.)852444(1988)的類似方法檢索進(jìn)行、這些算法通過(guò)計(jì)算機(jī)執(zhí)行(GAP，BESTFTT，BLAST，F(xiàn)ASTA andTFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group(GCG)，575 Science Dr.，Madison，WI)或通過(guò)檢查。
“序列相同性百分比”可通過(guò)在比較窗口中比較兩個(gè)最佳排列的序列而確定，其中在比較窗口中的多聚核苷酸序列部分與參比序列(不含有增加或刪除)相比，可包含增加或刪除(即缺口)以進(jìn)行兩個(gè)序列的最佳排列對(duì)比。通過(guò)確定兩個(gè)序列中相同的核酸堿基或氨基酸殘基的位置數(shù)目以產(chǎn)生相匹配位置的數(shù)目，將相匹位置的數(shù)目除以比較窗中的位置總數(shù)，結(jié)果乘100產(chǎn)生序列相同性的百分比。
術(shù)語(yǔ)多聚核苷酸序列“基本上相同”，指用本文所述比較程序優(yōu)選采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的BLAST算法，某多聚核苷酸包含的序列與參比序列，相比至少有70％序列相同，優(yōu)選至少80％序列相同，優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％最優(yōu)選，至少95％相同。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道這些值可通過(guò)考慮密碼子簡(jiǎn)并性、氨基酸相似性、讀碼框位置等等而適當(dāng)?shù)卣{(diào)整以確定兩個(gè)核苷酸序列的編碼蛋白質(zhì)的相應(yīng)相同性。用于這些目的的氨基酸序列基本上相同通常指至少40％的序列相同，優(yōu)選至少60％，70％，80％的序列相同或更優(yōu)選至少90％相同，和最優(yōu)選至少95％相同。除了不相同的殘基位置由于保守氨基酸的變化而不同，“基本上相似”的多肽享有上述的序列。保守氨基酸的取代指具有相似側(cè)鏈的殘基的可互換性。例如，一組具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸是甘氨酸、丙胺酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸，一組具有脂肪族羥基側(cè)鏈的氨基酸為絲氨酸和蘇氨酸，一組具有含氨基側(cè)鏈的氨基酸為天冬酰胺和谷氨酰胺，一組具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸為苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，一組具有堿性側(cè)鏈的氨基酸為賴氨酸、精氨酸和組氨酸，一組具有含硫側(cè)鏈的氨基酸為半胱氨酸和甲硫氨酸。較佳的氨基酸取代分組是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，賴氨酸-精氨酸，丙氨酸-纈氨酸，天冬氨酸-谷氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
核苷酸序列基本上相同的另一個(gè)指標(biāo)是兩個(gè)分子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下是否能相互雜交，或與第三個(gè)核酸雜交。嚴(yán)謹(jǐn)條件是序列依賴的和在不同環(huán)境中是不同的。通常，嚴(yán)謹(jǐn)條件選擇正確定的離子強(qiáng)度和pH下比該特定序列的熱熔點(diǎn)(Tm)低約5℃。該Tm是50％的靶序列能與完全相配的探針雜交的溫度(在確定的離子強(qiáng)度和pH下)。代表性的嚴(yán)謹(jǐn)條件是鹽濃度在pH時(shí)7約0.02摩爾和溫度是至少約60℃的條件。
為了公開的目的，雜交的嚴(yán)謹(jǐn)條件是包括在0.2X SSC中63℃，或相當(dāng)?shù)臈l件下至少洗滌一次20分鐘。中等嚴(yán)謹(jǐn)條件包括在0.2X SSC中溫度至少約50℃，通常約55℃下或相當(dāng)?shù)臈l件，至少洗滌一次(常常2次)20分鐘。
術(shù)語(yǔ)“表達(dá)盒”指為了在體外或體內(nèi)組成性或誘導(dǎo)性表達(dá)本發(fā)明的核酸序列的任何重組表達(dá)系統(tǒng)，可在任何細(xì)胞，除了植物細(xì)胞，包括原核細(xì)胞、酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞、昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。該術(shù)語(yǔ)包括線性或環(huán)狀表達(dá)系統(tǒng)。該術(shù)語(yǔ)包括所有的載體。該盒可保持游離或整合入宿主細(xì)胞基因組。表達(dá)盒可以具有自身復(fù)制的能力或沒有，即在細(xì)胞中只驅(qū)動(dòng)短暫表達(dá)。該術(shù)語(yǔ)包括只包含該重組核酸轉(zhuǎn)錄所需的最少元件的重組表達(dá)盒。
本文中使用的術(shù)語(yǔ)“操作性相連接”指兩個(gè)或多個(gè)核酸(如DNA)區(qū)段之間的一種功能性關(guān)系。代表性的關(guān)系指轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列和所轉(zhuǎn)錄序列的功能性關(guān)系。例如，如果-啟動(dòng)子能在合適的宿主細(xì)胞或其他表達(dá)系統(tǒng)中刺激或調(diào)節(jié)某編碼基因的轉(zhuǎn)錄，該啟動(dòng)子(下述)則與此編碼序列，如本發(fā)明的核酸操作性相連接。通常，與所轉(zhuǎn)錄序列操作性相連接的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列在物理上毗鄰于該轉(zhuǎn)錄序列，即它們是順式作用。但是，某些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，如增強(qiáng)子，不需要與它們所增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的編碼序列毗鄰或在位置上密切靠近。
本文所用的“重組”指在體外合成的或受到操縱的聚核苷酸(如“重組多聚核苷酸”)、指采用重組聚核苷酸在細(xì)胞或其他生物系統(tǒng)中產(chǎn)生基因產(chǎn)物的方法、或指重組聚核苷酸編碼的多肽(“重組蛋白”)。“重組方法”也包括將含有不同來(lái)源的編碼序列或啟動(dòng)子序列的核酸連結(jié)到表達(dá)盒或載體中以表達(dá)融合蛋白，或可誘導(dǎo)或組成性表達(dá)蛋白質(zhì)(如與本發(fā)明的核酸操作性相連接的啟動(dòng)子)。
本文所用的基因“序列”(除非另有說(shuō)明)或核酸指聚核苷酸中核苷酸的順序，包括雙鏈DNA分子的單鏈或雙鏈(有義和反義)，如，編碼鏈和它的互補(bǔ)鏈的序列，或單鏈核酸分子(有義和反義)的序列。例如，在選擇性實(shí)施方案中，啟動(dòng)子可驅(qū)動(dòng)本發(fā)明的有義和/或反義聚核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。
III.程序性細(xì)胞死亡可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的制備本發(fā)明的程序性細(xì)胞死亡可誘導(dǎo)啟動(dòng)子可用于驅(qū)動(dòng)能抑制玉米和其他禾本科植物中程序性細(xì)胞死亡的基因的表達(dá)。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員通過(guò)鑒定在程序性細(xì)胞死亡中被誘導(dǎo)表達(dá)的基因，和確定這些基因的啟動(dòng)子區(qū)域可不難鑒定程序性細(xì)胞死亡可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。
為了鑒定參與程序性細(xì)胞死亡通路的基因，可采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)鑒定經(jīng)歷程序性細(xì)胞死亡的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，被鑒定的基因在程序性細(xì)胞死亡起始階段表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，被鑒定的基因在成熟前發(fā)生的程序性細(xì)胞死亡階段表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)包括組織學(xué)和活性染色及DNA片段分析，來(lái)確定經(jīng)歷程序性細(xì)胞死亡的細(xì)胞。例如，植物細(xì)胞可以用伊文思藍(lán)染色，伊文思藍(lán)是可被具有完整細(xì)胞膜的活細(xì)胞排除，但可被攝入無(wú)活性細(xì)胞的胞質(zhì)中的一種染料。Young et al.，Plant Physiol.115737-751；Young et al.PlantMol.Biol 42397-414；Young et al Plant.Biol 39915-926.也可評(píng)估植物葉子中的葉綠素和蛋白質(zhì)水平以確定植物是否經(jīng)歷程序性細(xì)胞死亡(見Lowy et al.，J.Biol Chem.193265-275，1951；Peterson，Anal.Biochem.83346-356，1977；Larson et al.Anal Biochem.155243-248，1986；和美國(guó)專利5,689,042)。衰老起始階段的葉子顯示在葉尖有葉綠素?fù)p失。葉綠素和蛋白質(zhì)進(jìn)一步的損失發(fā)生在葉子經(jīng)歷衰老和程序性細(xì)胞死亡的過(guò)程中。
鑒定經(jīng)歷程序性細(xì)胞死亡后，可用現(xiàn)有技術(shù)描述的方法提取細(xì)胞的RNA，如Puissant et al.，BioTechniques 8148-149，1990。隨后從提取的RNA中分離出Poly(A+)RNA用于構(gòu)建cDNA庫(kù)。分離Poly(A+)RNA的方法描述見Crowell，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 878815-8819，1990。
為了鑒定在對(duì)程序性細(xì)胞死亡反應(yīng)中增加的基因(mRNAs)，從經(jīng)歷程序性細(xì)胞死亡獲得的mRNA構(gòu)建了區(qū)分性篩選的cDNA庫(kù)，用于在程序性細(xì)胞死亡中大量增加的mRNAs。所用的cDNA探針可以通過(guò)反向轉(zhuǎn)錄從健康植物部分中分離的Poly(A+)RNA，和從經(jīng)歷程序性細(xì)胞死亡的同一植物部分分離的Poly(a+)RNA而制備。例如，使用上述技術(shù)美國(guó)專利5,689,042從煙草葉子中分離了SAG12和SAG13衰老相關(guān)基因。
在分離程序性細(xì)胞死亡相關(guān)mRNAs和cDNAs后，分離啟動(dòng)子片段。通常，啟動(dòng)子序列來(lái)自程序性細(xì)胞死亡開始階段表達(dá)的基因的啟動(dòng)子。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員知曉許多用于鑒定和特征分析植物基因組DNA中啟動(dòng)子區(qū)域的方法(見，如，Jordano，etal.，Plant cell，1855-866(1989)；Bustos，et al.，Plant Cell，1839-854(1989)；Green，et al.，EMBO J.7，4035-4044(1988)；Meier，et al.，Plant Cell，3，309-316(1991)；和Zhang(1996)Plant Physiology 1101069-1079)。例如，程序性細(xì)胞死亡相關(guān)啟動(dòng)子可以通過(guò)與程序性細(xì)胞死亡相關(guān)cDNA相對(duì)應(yīng)的基因組克隆的5’序列來(lái)確定。啟動(dòng)子序列的序列特征可用于鑒定啟動(dòng)子。序列控制的真核基因表達(dá)已經(jīng)被廣泛研究。一種啟動(dòng)子序列元件可能是TATA盒共有序列(TATAAT)，該序列常常在轉(zhuǎn)錄起始部位上游20到30堿基對(duì)。在大多數(shù)情況下，精確的轉(zhuǎn)錄起動(dòng)需要TATA盒。在植物中，在TATA盒更上游，位置-80到-100，通常含有圍繞三核苷酸G(或T)NG的一系列腺嘌呤的啟動(dòng)子元件。J.Messing et al.，Genetic Engineeringin Plants，p.221-227(Kosage，Meredith and Hollaender，編.(1983))?；蛘?，本發(fā)明的啟動(dòng)子和啟動(dòng)子控制元件可以通過(guò)從基因組DNA庫(kù)中cDNA序列的5’-最遠(yuǎn)部分向上游“行走”(walking)來(lái)確定。其他方法，包括引物延伸試驗(yàn)，(King et al.，Gene 242125(2000))可以用于鑒定啟動(dòng)子區(qū)域。
一旦鑒定到一個(gè)程序性細(xì)胞死亡相關(guān)基因的候選啟動(dòng)子，可用標(biāo)準(zhǔn)方法，如原位RNA雜交或報(bào)告子試驗(yàn)來(lái)確定該推定的啟動(dòng)子是否是程序性細(xì)胞死亡相關(guān)基因啟動(dòng)子。例如，在一個(gè)典型的報(bào)告子試驗(yàn)中，將啟動(dòng)子基因與報(bào)告子基因如β-葡萄糖苷酸酶(GUS)報(bào)告子基因融合，并導(dǎo)入感興趣的植物中，如玉米或其他禾本科植物。隨后固定產(chǎn)生的植物和檢測(cè)該報(bào)告子基因的表達(dá)。如果該報(bào)告子基因在經(jīng)歷程序性細(xì)胞死亡的植物部分中表達(dá)，而在程序性細(xì)胞死亡前在該相同部分不表達(dá)，則該候選啟動(dòng)子可用于本發(fā)明。
一旦從一種植物中，如擬南芥(Arabidopsis)(SEQ ID NO1)的SAG 12中鑒定到程序性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)啟動(dòng)子，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可用標(biāo)準(zhǔn)方法鑒定其他合適啟動(dòng)子。例如，技術(shù)人員可以測(cè)試其他擬南芥(Arabidopsis)SAG基因的啟動(dòng)子，Weaver etal.，Plant Mol.Biol.37455-469(1998)，Noh et al.，Plant Mol.Biol.41181-194(1999)?；蛘撸琒AG 12或其他擬南芥(Arabidopsis)SAG基因的定向進(jìn)化同源基因可通過(guò)檢索EST數(shù)據(jù)庫(kù)從其他種植物中鑒定。例如，檢索玉米EST數(shù)據(jù)庫(kù)后，鑒定到與SAG12基因有明顯相似性的兩個(gè)EST。一個(gè)玉米EST獲自發(fā)育中的穗(登錄號(hào)A1770559)，而另一個(gè)獲自發(fā)育中的花粉囊/花粉(登錄號(hào)AWO56019)。用ESTs作為探針，可以分離基因組克隆和啟動(dòng)子區(qū)域。
本發(fā)明所用的啟動(dòng)子也包括在玉米植物低位小花中誘導(dǎo)表達(dá)的基因的啟動(dòng)子，無(wú)論其是否與程序性細(xì)胞死亡相關(guān)。例如，Tasselseed2啟動(dòng)子(登錄號(hào)L20621)可用作本發(fā)明的程序性細(xì)胞死亡可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。在花穗的低位小花中誘導(dǎo)Tasselseed2基因的表達(dá)是低位小花細(xì)胞死亡所需要的。DeLong et al.，Cell，74757-768(1993)，Calderon et al.，Development 126435-441(1999)。其他顯示小花特異性表達(dá)的基因和可用于本發(fā)明的基因啟動(dòng)子包括玉米ZMM2(登錄號(hào)X81200)，ZMM6(登錄號(hào)AF292703)，ZMM8(登錄號(hào)YO9303)和ZMM14(登錄號(hào)AJ005338)基因。Cacharronet al.，Dev Genes Evol.，209411-420。ZMM2和ZMM6在玉米植物的高位和低位小花中都表達(dá)。ZMM8和ZMM14在玉米植物的高位小花中表達(dá)。其他其啟動(dòng)子可被用于本發(fā)明的小花特異性基因包括ZAG1(登錄號(hào)L18924)和ZAG2(登錄號(hào)X80206)基因。Mena et al.，Science 2741537-1540。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員知曉如何鑒定其他植物種類的小花特異性基因的定向進(jìn)化同源基因并分離它們的啟動(dòng)子用于本發(fā)明。
IV.表達(dá)盒的構(gòu)建本發(fā)明的表達(dá)盒可用于抑制玉米和其他禾本科植物中的程序性細(xì)胞死亡。例如，此表達(dá)盒用于抑制玉米小穗狀花序中低位小花的程序性細(xì)胞死亡?？捎脴?biāo)準(zhǔn)方法通過(guò)將負(fù)責(zé)抑制程序性細(xì)胞死亡的基因與程序性細(xì)胞死亡可誘導(dǎo)啟動(dòng)子操作性相連接來(lái)制備抑制程序性細(xì)胞死亡的表達(dá)盒?？蓪⒃摫磉_(dá)盒通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(包括轉(zhuǎn)化)導(dǎo)入到植物細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化多種高待植物種類的技術(shù)是熟知，和在技術(shù)和科研文獻(xiàn)中有所描述。例如，見Gordonkamm et al，Plant Cell，V2(N7)603-618(1990)，Ishidaet al.，Nature Biotechnology，V14(N6)745-750(1996)。
1.促進(jìn)程序性細(xì)胞死亡的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑熟練技術(shù)人員知曉通過(guò)使用能抑制啟動(dòng)程序性細(xì)胞死亡的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(如乙烯和赤霉酸)活性的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，來(lái)抑制植物中的程序性細(xì)胞死亡。方法包括破壞和敲除編碼合成負(fù)責(zé)啟動(dòng)程序性細(xì)胞死亡化合物的酶的基因，如采用可轉(zhuǎn)座元件來(lái)破壞基因。其他方法包括滅活能結(jié)合負(fù)責(zé)啟動(dòng)程序性細(xì)胞死亡化合物的受體。其他方法還包括降解負(fù)責(zé)啟動(dòng)程序性細(xì)胞死亡的化合物或該化合物前體，或使它們偶聯(lián)。
一種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，基因沉默，可以通過(guò)導(dǎo)入以下轉(zhuǎn)基因來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述轉(zhuǎn)基因以相對(duì)于其啟動(dòng)子的反義方向相應(yīng)于感興趣的基因。(見，如Sheehy et al.，Proc.NatlAcad.Sci.USA 858805-8808(1988)Smith et al.，Nature 334724-726(1988))，或相對(duì)于其啟動(dòng)子的有義方向相應(yīng)于感興趣的基因(Napoli et al，Plant Cell2279-289(1990)；van der Krol et al.，Plant Cell 2291-299(1990)；美國(guó)專利5,034,323；美國(guó)專利5,231,020和美國(guó)專利5,283,184)，這二者都導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源性基因的表達(dá)下降。
已有報(bào)道通過(guò)積累小(20-25核苷酸)片段的反義RNA來(lái)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后的基因沉默，據(jù)報(bào)道該反義RNA可從RNA模板合成并代表該過(guò)程的特異性和流動(dòng)性決定因素。(Hamilton & Baulcome，Science 286950-952(1999))。現(xiàn)已清楚在生物體范圍內(nèi)dsRNA(雙鏈RNA)的導(dǎo)入是導(dǎo)致基因沉默的重要因素(Fire et al.，Nature391806-811(1998))；Timmons & Fire，Nature 395854(1998)；WO99/32619；Kennerdell & Carthew，Cell 951017-1026(1998)；Ngo et al.，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 9514687-14692(1998)；Waterhouse et al.，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA9513959-13964(1998)WO99/53050；Cogoni & Macino，Nature 399166-169(1999)；Lohmann et al.，Dev.Biol.214211-214(1999)；Sanchez-Alvarado & Newmark，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 965049-5054(1999))。在植物中，受抑制的基因不必須是內(nèi)源性植物基因，因?yàn)榭赏ㄟ^(guò)導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因使報(bào)告子轉(zhuǎn)基因和病毒基因二者發(fā)生轉(zhuǎn)錄后基因沉默(English et al.，Plant Cell 8179-188(1996)；Waterhouse etal.，同上)。但是，在上述所有情況中，在導(dǎo)入的轉(zhuǎn)基因和受抑制基因之間需要某些序列相似性。
已發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)導(dǎo)入含有病毒基因或報(bào)告子基因編碼區(qū)的顛倒重復(fù)序列的構(gòu)建物，或通過(guò)雜交能表達(dá)靶基因編碼區(qū)域的有義和反義轉(zhuǎn)錄物的植物，產(chǎn)生高頻率和高水平的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。(Waterhouse et al.，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA9513959-13964(1998))。通過(guò)對(duì)相同植物中不同啟動(dòng)子的控制表達(dá)有義和反義轉(zhuǎn)基因，可獲得類似結(jié)果(Chuang & Meyerowitz，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA974985-4990(2000))。
在一個(gè)實(shí)施例中，克隆了合成負(fù)責(zé)啟動(dòng)程序性細(xì)胞死亡化合物的基因的核酸片段，并將其與程序性細(xì)胞死亡相關(guān)啟動(dòng)子操作性相連接，從而使RNA反義鏈被轉(zhuǎn)錄。然后將該表達(dá)盒轉(zhuǎn)化入玉米和其他禾本科植物中并產(chǎn)生此反義RNA鏈。該反義RNA通過(guò)防止編碼感興趣的酶的mRNA的積累，抑制了細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)，見，如Sheehyet al.，Proc.Nat.Acda.Sci USA，858805-8809(1988)，和Hiatt等的美國(guó)專利4,801,340。
待導(dǎo)入的核酸片段應(yīng)至少與待抑制的內(nèi)源性基因的一部分基本上相同。但是，該序列不必完全相同來(lái)抑制表達(dá)?？梢栽O(shè)計(jì)本發(fā)明的表達(dá)盒使得此抑制作用可施加于顯示與靶基因同源或基本同源的基因家族中的其他蛋白質(zhì)上。
相對(duì)于原代轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或完全加工的mRNA，導(dǎo)入的序列也不必是全長(zhǎng)的。通常，可利用較高的同源性來(lái)補(bǔ)償較短序列的用途。而且，導(dǎo)入的序列不必有相同的內(nèi)含子或外顯子模式，非編碼區(qū)斷的同源性可以是同樣有效的。通常，應(yīng)采用約30或40核苷酸之間的序列，雖然至少約100，200或500核苷酸的序列較佳。
在另一個(gè)實(shí)施例中克隆了，合成負(fù)責(zé)啟動(dòng)程序性細(xì)胞死亡的化合物或植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的基因的核酸區(qū)段，并將其與程序性細(xì)胞死亡相關(guān)啟動(dòng)子操作性相連接，從而使RNA反義鏈被轉(zhuǎn)錄。
通常，當(dāng)需要抑制表達(dá)時(shí)，發(fā)生該導(dǎo)入基因的某些轉(zhuǎn)錄。當(dāng)該導(dǎo)入序列本身不包含編碼序列時(shí)可發(fā)生此種效應(yīng)，但只有當(dāng)內(nèi)含子或非翻譯序列與該內(nèi)源性序列原代轉(zhuǎn)錄物中的序列同源時(shí)才發(fā)生。該導(dǎo)入序列通常與要抑制的內(nèi)源性序列基本相同。這種最小的相同性常超過(guò)約65％，但較高的相同性可以對(duì)內(nèi)源性序列的表達(dá)發(fā)揮更有效的抑制作用。優(yōu)選約80％或約95％以上的相同性。與反義調(diào)節(jié)一樣，應(yīng)將此種作用施加于顯示同源或基本上同源的類似基因家族中的其他蛋白質(zhì)上。
對(duì)于有義抑制，導(dǎo)入的表達(dá)盒中的序列不必絕對(duì)相同，相對(duì)于原代轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或完全加工的mRNA，也不必是全長(zhǎng)的。這對(duì)避免同時(shí)產(chǎn)生過(guò)度表達(dá)的某些植物可能是適宜的。全長(zhǎng)序列為短的序列中的較高相同性，補(bǔ)償了較長(zhǎng)而相同性較差的序列。而且，導(dǎo)入的序列不必有相同的內(nèi)含子或外顯子模式，非編碼區(qū)斷的相同性可以是同樣有效的。通常，用于反義調(diào)節(jié)可采用上述大小范圍的序列。
催化性RNA分子或核酶也可用于抑制基因的表達(dá)。有可能設(shè)計(jì)出能與實(shí)際上任何靶RNA特異性配對(duì)并能在特定部位剪切磷酸二酯主鏈，從而在功能上滅活該靶RNA的核酶。在進(jìn)行此種剪切中，所述核酶本身不改變，并能再循環(huán)剪切其他分子，成為真正的酶。在反義RNAs中包含核酶序列可賦予它們具有RNA剪切活性，因而提高了該構(gòu)建物的活性。
已經(jīng)鑒定到許多類型的核酶。一種類型的核酶衍生自許多能在植物中自我剪切和復(fù)制的小環(huán)形RNAs。此RNAs或可單獨(dú)復(fù)制(類病毒RNAs)或與輔助病毒(衛(wèi)星RNAs)一起復(fù)制。實(shí)施例包括鱷梨sunblotch類病毒的RNAs和煙草環(huán)斑病毒、三葉苜蓿短暫條紋病毒、絲絨煙草斑點(diǎn)病毒、茄屬植物nodiflorum斑點(diǎn)病毒和地下苜蓿斑點(diǎn)病毒的衛(wèi)星RNAs。靶RNA特異性核酶的設(shè)計(jì)和用途在Haseloff et al.，Nature，334585-591(1988)中有描述。
2.抑制程序性細(xì)胞死亡的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)于啟動(dòng)程序性細(xì)胞死亡的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，本發(fā)明還提供通過(guò)調(diào)節(jié)化合物，如能抑制程序性細(xì)胞死亡的細(xì)胞分裂素和脫落酸的活性，抑制植物中程序性細(xì)胞死亡的方法。
可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)影響負(fù)責(zé)抑制程序性細(xì)胞死亡化合物的活性。這些技術(shù)包括提高能合成負(fù)責(zé)抑制程序性細(xì)胞死亡的化合物的酶的表達(dá)，如，可將編碼異戊烯轉(zhuǎn)移酶的基因連接于程序性細(xì)胞死亡可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，并導(dǎo)入到玉米植物中。異戊烯轉(zhuǎn)移酶能催化細(xì)胞分裂素的合成，細(xì)胞分裂素是一種能抑制玉米穗狀花序低位小花程序性細(xì)胞死亡的激素。IPT序列的例子見Crespi et al.，EMBO J.11795-804(1992)；Goldberg et al.，Nucleic Acids.Res.124665-4677(1984)；Heide Kamp et al.，Nucleic Acids Res.，116211-6223(1983)；Strabala et al.，Mol.Gen.Genet.216388-394(1989)。登錄號(hào)NC_003308。影響負(fù)責(zé)抑制程序性細(xì)胞死亡化合物的其他方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括抑制以下酶的表達(dá)，該酶可代謝滅活抑制程序性細(xì)胞死亡的化合物。
V.多胚芽谷粒的檢測(cè)在制備本發(fā)明的表達(dá)盒和把該盒導(dǎo)入玉米中后，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員知曉如何檢測(cè)多胚芽谷粒的存在和蛋白質(zhì)與油含量的增加。例如，在表達(dá)盒導(dǎo)入玉米后，篩選有轉(zhuǎn)基因出現(xiàn)的植物并與玉米近親繁殖系或雜交系雜交。篩選具有轉(zhuǎn)基因的后代植物和自身授粉。培育有自身授粉植物的后代。檢查后代谷粒發(fā)現(xiàn)含該轉(zhuǎn)基因的多胚芽谷粒。
本文中引用的所有文獻(xiàn)和專利申請(qǐng)作為參考，如同每個(gè)單獨(dú)文獻(xiàn)或?qū)＠暾?qǐng)具體和單獨(dú)作為參考所表明的那樣。
雖然為了清楚理解，上述本發(fā)明通過(guò)闡述和實(shí)施例在某種程度上進(jìn)行了詳細(xì)描述，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不難明白在不脫離所附權(quán)利要求的思路和范圍下可作某些變化和改進(jìn)。
實(shí)施例1為了把異戊烯轉(zhuǎn)移酶(IPT)基因?qū)胗衩字惺怪诔绦蛐约?xì)胞死亡發(fā)生前或發(fā)生時(shí)能能在低位小花中被特異性誘導(dǎo)而表達(dá)，采用了pSG516(Gan et al.，Science，270(5244)p.1986-8)，該構(gòu)建物中IPT基因處在擬南芥(Arabidopsis)衰老相關(guān)基因(SAG12)啟動(dòng)子的控制下。
將SAG12-IPT構(gòu)建物(pSG516)用微粒轟擊(技術(shù))導(dǎo)入獲自玉米系Hill發(fā)育胚芽的芽產(chǎn)生胼胝體中。將含有該質(zhì)粒構(gòu)建物的hydroscopicus bar鏈霉菌與pSG516一起轟擊?；騜ar的表達(dá)產(chǎn)生可滅活除草劑膦絲菌素(phosphinothricin，PPT)的膦絲菌素乙?；D(zhuǎn)移酶(PAT)。于是表達(dá)bar的細(xì)胞或植物可抵抗glufosinate(PPT的銨鹽)或雙丙氨膦(bialaphos含有PPT)。培養(yǎng)雙丙氨膦抗性的愈傷組織，并按照標(biāo)準(zhǔn)方式再生這種植物(Gordon-Kamm et al，1990)。
使再生的植物開花并與近親繁殖的B73雜交。雜交后代是該SAG12-IPT構(gòu)建物的半合子，一旦長(zhǎng)成，可自身授粉。受粉后產(chǎn)生的谷粒顯示含有融合胚乳的兩個(gè)胚芽并用分離種群分離。培養(yǎng)含有SAG12-IPT轉(zhuǎn)基因授粉的后代，并自身授粉。發(fā)現(xiàn)發(fā)育穗中高達(dá)40％的低位小花被救活。
上述實(shí)施例提供了對(duì)本發(fā)明的闡述而不是限制其范圍。本發(fā)明的其他變化對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是知道的和包含在所附權(quán)利要求中。
序列表SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)勾長(zhǎng)度3183個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝″SAG12-1啟動(dòng)子DNA″。
(xi)序列描述SEQ ID NO1GATATCTCTTTTTATATTCAAACAATAAGTTGAGATATGTTTGAGAAGAGGACAACTATTCTCGTGGAGCACCGAGTCTGTTTTATATTAGAAACCCGATTGTTATTTTTAGACTGAGACAAAAAAGTAAAATCGTTGATTGTTAAAATTTAAAATTAGTTTCATCACGTTTCGATAAAAAAATGATTAGTTATCATAGCTAATATAGCATGATTCTAAATTTGTTTTTTGACACCCTTTTTTTCTCTCTTTGGTGTTTTCTTAACATTAGAAGAACCCATAACAATGTACGTTCAAATTAATTAAAAACAATATTTCCAAGTTTTATATACGAAACTTGTTTTTTTAATGAAAACAGTTGAATAGTTGATTATGAATTAGTTAGATCAATACTCAATATATGATCAATGATGTATATATATGAACTCAGTTGTTATACAAGAAATGAAAATGCTATTTAAATACCGATCATGAAGTGTTAAAAAGTGTCAGAATATGACATGAAGCGTTTTGTCCTACCGGGTATCGAGTTATAGGTTTGGATCTCTCAAGAATATTTTGGGCCATATTAGTTATATTTGGGCTTAAGCGTTTTGCAAAGAGACGAGGAAGAAAGATTGGGTCAAGTTAACAAAACAGAGACACTCGTATTAGTTGGTACTTTGGTAGCAAGTCGATTTATTTGCCAGTAAAAACTTGGTACACAACTGACAACTCGTATCGTTATTAGTTTGTACTTGGTACCTTTGGTTAAGAAAAAGTTGATATAGTTAAATCAGTTGTGTTCATGAGGTGATTGTGATTTAATTTGTTGACTAGGGCGATTCCTTCACATCACAATAACAAAGTTTTATAGATTTTTTTTTATAACATTTTTGCCACGCTTCGTAAAGTTTGGTATTTACACCGCATTTTTCCCTGTACAAGAATTCATATATTATTTATTTATATACTCCAGTTGACAATTATAAGTTTATAACGTTTTTACAATTATTTAAATACCATGTGAAGATCCAAGAATATGTCTTACTTCTTCTTTGTGTAAGAAAACTAACTATATCACTATAATAAAATAATTCTAATCATTATATTTGTAAATATGCAGTTATTTGTCAATTTTGAATTTAGTATTTTAGACGGTTATCACTTCAGCCAAATATGATTTGGATTTAAGTCCAAAATGCAATTTCGTACGTATCCCTCTTGTCGTCTAATGATTATTTCAATATTTCTTATATTATCCCTAACTACAGAGCTACATTTATATTGTATTCT
AATGACAGGGAAACTTTCATAGAGATTCAGATAGATGAAATTGGTGGGAAACATCATTGAACAGGAAACTTTTAGCAAATCATATCGATTTATCTACAAAAGAATACTTAGCGTAATGAAGTTCACTTGTTGTGAATGACTATGATTTGATCAAATTAGTTAATTTTGTCGAATCATTTTTCTTTTTGATTTGATTAAGCTTTTAACTTGCACGAATGGTTCTCTTGTGAATAAACAGAATCTTTGAATTCAAACTATTTGATTAGTGAAAAGACAAAAGAAGATTCCTTGTTTTTATGTGATTAGTGATTTTGATGCATGAAAGGTACCTACGTACTACAAGAAAAATAAACATGTACGTAACTACGTATCAGCATGTAAAAGTATTTTTTTCCAAATAATTTATACTCATGATAGATTTTTTTTTTTTGAAATGTCAATTAAAAATGCTTTCTTAAATATTAATTTTAATTAATTAAATAAGGAAATATATTTATGCAAAACATCATCAACACATATCCAACTTCGAAAATCTCTATAGTACACAAGTAGAGAAAATAAATTTTACTAGATACAAACTTCCTAATCATCAATTATAAATGTTTACAAAACTAATTAAACCCACCACTAAAATTAACTAAAAATCCGAGCAAAGTGAGTGAACAAGACTTGATTTCAGGTTGATGTAGGACTAAAATGGCTACGTATCAAACATCAACGATCATTTAGTTATGTATGAATGAATGTAGTCATTACTTGTAAAACAAAAATGCTTTGATTTGGATCAATCACTTCATGTGAACATTAGCAATTACATCAACCTTATTTTCACTATAAAACCCCATCTCAGTACCCTTCTGAAGTAATCAAATTAAGAGCAAAAGTCATTTAACTTTCCTAAAACCATGGACCCTGCATCTAATTTTCGGTCCAACTTGCACAGGAAAGACGACGACCGCGATAGCTCTTGCCCAGCAGACAGGGCTTCCAGTCCTTTCGCTTGATCGGGTCCAATCGTGTCCTCAACTATCAACCGGAAGCGGACGACCAACAGTGGAAGAACTGAAAGGAACGACGCGTCTCTACCTTGATGATCGGCCTCTGGTGGAGGGTATCATCGCAGCCAAGCAAGCTCATCATAGGCTGATCGAGGAGGTGTATAATCATGAGGCCAACGGCGGGCTTATTCTTGAGGGAGGATCCACCTCGTTGCTCAACTGCATGGCGCGAAACAGCTATTGGAGTGCAGATTTTCGTTGGCATATTATTCGCCACAAGTTACCCGACCAAGAGACCTTCATGAAAGCGGCCAAGGCCAGAGTTAAGCAGATGTTGCACCCCGCTGCAGGCCATTCTATTATTCAAGAGTTGGTTTATCTTTGGAATGAACCTCGGCTGAGGCCCATTCTGAAAGAGATCGATGGATATCGATATGCCATGTTGTTTGCTAGCCAGAACCAGATCACGGCAGATATGCTATTGCAGCTTGACGCAAATATGGAAGGTAAGTTGATTAATGGGATCGCTCAGGAGTATTTCATCCATGCGCGCCAACAGGAACAGAAATTCCCCCAAGTTAACGCAGCCGCTTTCGACGGATTCGAAGGTCATCCGTTCGGAATGTATTAGGTTACGCCAGCCCTGAGCTCGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAA
TTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATGGCGCGCAAACTGGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGAATTC
權(quán)利要求
1.一種抑制玉米植物中程序性細(xì)胞死亡的方法，其特征在于，所述方法包括將含有操作性連接于能抑制程序性細(xì)胞死亡的核苷酸序列的程序性細(xì)胞死亡可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的構(gòu)建物導(dǎo)入到所述植物中，從而抑制所述植物低位小花中的程序性細(xì)胞死亡。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述核苷酸序列編碼植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑合成酶。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述酶催化細(xì)胞分裂素的合成。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述酶是異戊烯轉(zhuǎn)移酶。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，程序性細(xì)胞死亡可誘導(dǎo)啟動(dòng)子是SAG12。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，SAG12啟動(dòng)子來(lái)自擬南芥(Arabidopsisthaliana)。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，SAG12啟動(dòng)子與SEQ ID NO1有70％相同。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括檢測(cè)所述植物中增高的蛋白質(zhì)水平。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括檢測(cè)所述植物中增高的油水平。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括檢測(cè)所述植物中增高的油和蛋白質(zhì)水平。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括檢測(cè)多胚芽谷粒的存在。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過(guò)一種有性雜交導(dǎo)入所述構(gòu)建物。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于通過(guò)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入所述構(gòu)建物。
14.一種包含表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因玉米植物，其特征在于，該表達(dá)盒含有操作性連接于編碼程序性細(xì)胞死亡抑制劑的核苷酸序列的程序性細(xì)胞死亡可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。
15.如權(quán)利要求14所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，所述核苷酸序列編碼植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑合成酶。
16.如權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，所述酶催化細(xì)胞分裂素的合成。
17.如權(quán)利要求16所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，所述酶是異戊烯轉(zhuǎn)移酶。
18.如權(quán)利要求14所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，程序性細(xì)胞死亡可誘導(dǎo)啟動(dòng)子是SAG12。
19.一種含多胚芽轉(zhuǎn)基因玉米植物的谷粒，其特征在于，所述谷粒的油和蛋白質(zhì)含量升高。
20.一種抑制玉米植物中程序性細(xì)胞死亡的方法，其特征在于此方法包括將操作性連接于能抑制程序性細(xì)胞死亡的核苷酸序列的小花特異性基因的啟動(dòng)子導(dǎo)入所述植物中，從而抑制所述植物低位小花中的程序性細(xì)胞死亡。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，該小花特異性基因與程序性細(xì)胞死亡有關(guān)。
22.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，該小花特異性基因與程序性細(xì)胞死亡無(wú)關(guān)。
23.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述核苷酸序列編碼植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑合成酶。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述酶催化細(xì)胞分裂素的合成。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述酶是異戊烯轉(zhuǎn)移酶。
26.如權(quán)利要求20所述的方法，還包括檢測(cè)所述植物中增高的油和蛋白質(zhì)水平。
27.如權(quán)利要求20所述的方法，還包括檢測(cè)多胚芽谷粒的存在。
全文摘要
本發(fā)明總的涉及植物基因工程。具體說(shuō)，本發(fā)明提供了抑制玉米和其他禾本科植物中程序性細(xì)胞死亡的方法。本發(fā)明還提供具有多胚芽谷粒的轉(zhuǎn)基因玉米植物和多胚芽轉(zhuǎn)基因玉米植物的谷粒。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1643146SQ03805748
公開日2005年7月20日 申請(qǐng)日期2003年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月7日
發(fā)明者D·R·加里, T·E·揚(yáng) 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)