專利名稱：毛頭鬼傘菌絲的棘狀小球結(jié)構(gòu)及其應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種毛頭鬼傘菌絲的棘狀小球結(jié)構(gòu)及其應用，屬真菌學和生物農(nóng)藥植物寄生線蟲是一種世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生的植物病害，僅根結(jié)線蟲已知種類就達70多種，為害3000多種植物，每年造成巨大的損失。我國根結(jié)線蟲主要危害煙草、花卉、蔬菜、棉花、大豆、花生、三七、西洋參等經(jīng)濟作物，成為發(fā)展這些作物的重要限制因子。據(jù)不完全統(tǒng)計，2001年全國煙草根結(jié)線蟲發(fā)病面積已達55萬公頃，直接經(jīng)濟損失5億多元。僅云南省發(fā)病面積就達2.7萬公傾，直接經(jīng)濟損失1億元，間接損失更為嚴重。黑龍江省僅大豆胞囊線蟲每年造成的損失達8億元之多。長期以來，線蟲防治主要依賴于化學農(nóng)藥。隨著科學技術(shù)的進步，研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)化學殺線蟲劑除了具高毒性殺傷天敵，破壞生態(tài)平衡及危害人體健康外，對地下水污染嚴重。美國、歐洲等發(fā)達國家已逐步限制化學殺線蟲劑的使用，線蟲生防引起了各國科學家前所未有的關注。
發(fā)明采用的真菌是毛頭鬼傘Coprinus comatus LHA-7，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址中國.北京.中關村；保藏日期2003年5月26日；保藏登記入冊的編號CGMCC NO.0932。
毛頭鬼傘子實體菌蓋4-6×6-11cm，未成熟時為圓柱狀的，白色，成熟時擴展為鐘形且邊緣翻卷，很快液化如墨汁；菌蓋中心呈褐色，有蓬松的毛發(fā)狀鱗片，成熟菌蓋邊緣有條紋。菌褶與菌柄分離，在成熟過程中顏色由白色變?yōu)樘疑詈笞優(yōu)楹谏?，后期與菌蓋邊緣一同自溶為墨汁狀。菌柄圓柱形，7-24.5×1-1.7cm，沿頂端方向逐漸變細；光滑，白色；易于與菌蓋分離；中空或?qū)嵭摹＞赓|(zhì)地軟，白色。菌環(huán)白色，后期可上下移動，易脫落。菌絲為典型的擔子菌菌絲，有明顯的鎖狀聯(lián)合。孢子小大為10-17×7-9μm，黑色，橢圓形，光滑，孢子印黑色。
本項發(fā)明主要分為兩個部份，一個是發(fā)現(xiàn)確定棘狀小球結(jié)構(gòu)，另一個就是對產(chǎn)生了棘狀小球的菌絲進行研究，確定其殺線蟲功能。一、確定棘狀小球結(jié)構(gòu)采集新鮮的毛頭鬼傘子實體，用PDA瓊脂培養(yǎng)基平板(培養(yǎng)皿直徑為9cm)進行組織分離，24℃下培養(yǎng)，獲得一批菌株，從中篩選出一株性狀好的菌株，編號為LHA-7。
取直徑9cm培養(yǎng)皿滅菌后倒入15ml的PDA培養(yǎng)基，將毛頭鬼傘LHA-7接種到培養(yǎng)基平板上，于24℃下培養(yǎng)。2天后開始每天用光學顯微鏡進行菌絲體形態(tài)研究。2天后發(fā)現(xiàn)菌絲上產(chǎn)生明顯的棘狀小球結(jié)構(gòu)，然后隨時間延長，棘狀小球不斷增多，5天后達到高峰。通過電子顯微鏡對棘狀小球進行形態(tài)學研究，確定棘狀小球是擔子菌上發(fā)現(xiàn)的一種未見報道的結(jié)構(gòu)。但研究同時也表明，將毛頭鬼傘LHA-7菌株用PDA培養(yǎng)基液體發(fā)酵時，不產(chǎn)生棘狀小球。
最后將產(chǎn)生了棘狀小球的菌絲體按常規(guī)食用菌栽培方法進行栽培，獲得了出發(fā)菌的毛頭鬼傘子實體，證明產(chǎn)生棘狀小球的菌株的確來源于毛頭鬼傘。二、棘狀小球菌絲體的殺線蟲功能測定為了確定棘狀小球的殺線蟲功能，分別進行了毛頭鬼傘LHA-7菌株具有棘狀小球菌絲體殺線蟲活性測定；液體發(fā)酵不產(chǎn)生棘狀小球的菌絲體殺線蟲活性測定。
本發(fā)明對線蟲的活性測定1、制備試驗用制劑(1)含棘狀小球的菌絲體制劑用直徑9cm培養(yǎng)皿滅菌后倒入15ml的PDA瓊脂培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基平板上接種毛頭鬼傘LHA-7，24℃下培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)9天，此時毛頭鬼傘LHA-7菌絲輔滿平板，并已大量產(chǎn)生棘狀小球。
(2)不含棘狀小球的菌絲體對照用250ml三角瓶加入PDA液體培養(yǎng)基100ml，滅菌后接入毛頭鬼傘LHA-7，24℃下?lián)u床(200rpm)培養(yǎng)9天，此時已產(chǎn)生大量菌絲，但不產(chǎn)生棘狀小球。將發(fā)酵液過濾后，把濾液和菌絲體分別放入滅菌9cm培養(yǎng)皿中備用。
2、制備試驗用線蟲(1)Panagrellus redivivus線蟲的培養(yǎng)將P.redivivus線蟲接種于燕麥片培養(yǎng)基上，于28℃下培養(yǎng)6天，凍于4℃冰箱備用。將所需線蟲用貝曼漏斗法洗出，置于5ml離心管內(nèi)，加5ml無菌水洗滌，瞬時離心，棄上清，重復5次得到潔凈供試線蟲。
(2)花生根結(jié)線蟲(Meloidogyne arenaria)的培養(yǎng)將溫室培養(yǎng)的帶有花生根結(jié)線蟲的蕃茄根用無菌水洗凈，用解剖針挑取根結(jié)線蟲的卵囊置于0.4M的KCl溶液中，在5ml離心管中依次用4ml無菌水(三次)、1ml無菌青-鏈霉素雙抗溶液(濃度為60μg/ml)、3ml0.1％的NaClO溶液洗滌和消毒，每一步驟均通過短暫離心(8000轉(zhuǎn)30秒)除去上清液。洗滌好的蟲卵置于0.4M的ZnCl2溶液中孵化48小時，二齡幼蟲用移液器收集于1.5ml離心管，通過短暫離心(5000轉(zhuǎn)30秒)富集備用。
3、試驗方法按5000條線蟲/培養(yǎng)皿的比例，將線蟲加入到含棘狀小球的菌絲體和對照菌絲體培養(yǎng)皿中，恒溫24℃培養(yǎng)。定時在解剖鏡下觀察計數(shù)，隨機選擇5個視野，分別記錄不動和活動的線蟲的數(shù)目，計算出殺滅率。并對殺死的線蟲進行電子顯微鏡觀察，分析其毒殺機理。
整個實驗設三個平行并重復兩次。
4、結(jié)果表1 毛頭鬼傘LHA-7菌絲體的殺線蟲活性測定

死亡率＝殺死線蟲數(shù)/線蟲總數(shù)結(jié)果表明，毛頭鬼傘LHA-7菌株培養(yǎng)中凡是產(chǎn)生了本發(fā)明棘狀小球結(jié)構(gòu)的菌絲體，對花生根結(jié)線蟲和P.redivivus線蟲都有很好的殺線蟲活性，8小時線蟲死亡率分別達95.8％和95％，而相同菌株在相同培養(yǎng)基上，經(jīng)液體發(fā)酵后獲得的不產(chǎn)棘狀小球的菌絲體，其發(fā)酵液和菌絲體的殺線蟲活性都極低，8小時線蟲死亡率僅達0.8％和1％，對線蟲基本沒有毒殺作用。結(jié)果充分表明了本發(fā)明對花生根結(jié)線蟲和P.redivivus線蟲具極好的毒殺作用，從電子顯微鏡照片(圖4)觀察也清楚的看到，帶有棘狀小球的菌絲體在短時間內(nèi)殺死線蟲。
本發(fā)明毛頭鬼傘LHA-7菌株是一類很好培養(yǎng)的真菌，其產(chǎn)生棘狀小球結(jié)構(gòu)后對線蟲具極強的毒殺作用，而產(chǎn)生棘狀小球結(jié)構(gòu)只是在菌絲培養(yǎng)期間，這就決定了培養(yǎng)時間短，成本低，具有很好的開發(fā)前景。
圖2顯示布滿了棘狀小刺的小球。
圖3顯示純化的棘狀小球。
圖4顯示被帶棘狀小球的菌絲體殺死的P.redivivus線蟲的掃描電鏡圖。
實施例一毛頭鬼傘LHA-7的棘狀小球結(jié)構(gòu)取直徑9cm培養(yǎng)皿滅菌后倒入15ml的PDA瓊脂培養(yǎng)基，將毛頭鬼傘LHA-7接種到培養(yǎng)基上，于24℃下培養(yǎng)。2天后開始每天用光學顯微鏡進行菌絲體形態(tài)研究。結(jié)果表明，從2天開始發(fā)現(xiàn)菌絲上產(chǎn)生明顯的棘狀小球結(jié)構(gòu)，然后隨時間延長，棘狀小球不斷增多，5天后達到高峰。
用掃描電子顯微鏡(SEM)常規(guī)技術(shù)對棘狀小球進行形態(tài)特征研究。將LHA-7菌株接種于PDA瓊脂平板上，24℃培養(yǎng)5天。取靠近菌落邊緣已產(chǎn)生大量棘狀小球的瓊脂塊(8mm×8mm)，立即放入2.5％戊二醛固定液中4℃固定24小時，接下來用0.2M的磷酸緩沖液(pH7.2)洗三次，再用1％的鋨酸(OsO4)固定1小時。采用丙酮溶液進行梯度脫水，并用醋酸異戊酯進行交換。用HCP-2型日立臨界點干燥儀干燥樣品，然后用IB-3型離子濺射真空鍍膜儀(EIKO)噴金，最后在JSM-5600LV型掃描電子顯微鏡下進行觀察攝影。結(jié)果表明，菌絲體上產(chǎn)生大量的棘狀小球(見

圖1)，小球上布滿了棘狀小刺(圖2)。
實施例二制備含棘狀小球的菌絲體取直徑9cm培養(yǎng)皿滅菌后倒入PDA瓊脂培養(yǎng)基，將毛頭鬼傘LHA-7接種到培養(yǎng)基上，于24℃下培養(yǎng)。2天開始發(fā)現(xiàn)菌絲上產(chǎn)生明顯的棘狀小球結(jié)構(gòu)，然后隨時間延長，棘狀小球不斷增多，5天后達到高峰。此時菌絲體對花生根結(jié)線蟲和P.redivivus線蟲具有很好的毒殺作用，對線蟲的致死率8小時即達95％以上。
實施例三分離純化棘狀小球?qū)?2層擦鏡紙折疊后置于直徑10cm玻璃漏斗內(nèi)作為過濾介質(zhì)，用蒸餾水將其浸濕并使其緊密貼附于漏斗內(nèi)壁，然后用錫薄紙將整個漏斗包裹起來進行常規(guī)滅菌后備用。
先按實施例2培養(yǎng)好大量產(chǎn)生棘狀小球的LHA-7菌絲體。然后在培養(yǎng)皿內(nèi)加入7ml無菌水，用玻璃刮子輕輕刮涂表面2分鐘，用移液槍將平板內(nèi)液體吸出，加入上述無菌漏斗內(nèi)過濾，用滅菌1.5ml離心管收集濾液。將裝有濾液的離心管于12000轉(zhuǎn)離心5分鐘，棄上清，沉淀用無菌水洗滌；再次離心(10000轉(zhuǎn)3min)，棄上清，將沉淀用掃描電子顯微鏡，用前述方法觀察，表明為純化的棘狀小球(圖3)。
權(quán)利要求
1.一種毛頭鬼傘菌絲的棘狀小球結(jié)構(gòu)，其特征在于毛頭鬼傘Coprinuscomatus LHA-7菌株有一種棘狀小球結(jié)構(gòu)，LHA-7菌株已于2003年5月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNO.0932。
2.一種毛頭鬼傘菌絲的棘狀小球結(jié)構(gòu)的應用，其特征在于毛頭鬼傘LHA-7帶有棘狀小球結(jié)構(gòu)菌絲體對花生根結(jié)線蟲Meloidogyne arenaria和Panagrellusredivivus線蟲有毒殺作用，可作為制備殺線蟲生物制劑的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種毛頭鬼傘菌絲的棘狀小球結(jié)構(gòu)及其應用，屬真菌學和生物農(nóng)藥技術(shù)領域。發(fā)明采用的真菌毛頭鬼傘，Coprinus comatus LHA－7菌株已于2003年5月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO.0932。本發(fā)明確定了毛頭鬼傘上的棘狀小球結(jié)構(gòu)，并測定了其對線蟲的殺線蟲活性。結(jié)果表明對花生根結(jié)線蟲和腐生線蟲都有很好的殺線蟲活性，8小時線蟲死亡率分別達95.8％和95％，本發(fā)明具有良好的應用開發(fā)前景。
文檔編號C12N1/14GK1471806SQ0313513
公開日2004年2月4日 申請日期2003年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月3日
發(fā)明者張克勤, 羅宏, 周薇 申請人:云南大學