專利名稱：通過控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)對目標(biāo)物進行定性和/或定量分析的方法及裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物材料定性定量的分析方法和裝置，特別是一種通過控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)對目標(biāo)物進行定性和/或定量分析的方法及裝置。
背景技術(shù)：
對樣品中、特別是生物樣品中的目標(biāo)物進行定性和/或定量分析的方法，其范圍很廣，其中基于探針-目標(biāo)物特異性反應(yīng)和特異性標(biāo)記反應(yīng)的一類的基本步驟為將目標(biāo)物或含目標(biāo)物的物質(zhì)與檢測裝置的反應(yīng)器中的探針接觸并反應(yīng)；通過標(biāo)記系統(tǒng)對上述反應(yīng)的結(jié)果進行標(biāo)記；檢出上述標(biāo)記的結(jié)果；根據(jù)上述標(biāo)記結(jié)果分析探針-目標(biāo)物特異性反應(yīng)結(jié)果。由于所用檢測裝置、探針-目標(biāo)物特異性反應(yīng)或/和標(biāo)記系統(tǒng)的不同，衍生出很多定性和/或定量分析，例如生物芯片分析、PCR分析、快速檢測試劑條分析、ELISA分析、免疫熒光分析等等，也衍生出很多定性和/或定量分析的方法，例如生物芯片分析中的熒光標(biāo)記法和化學(xué)發(fā)光標(biāo)記法等等。
本發(fā)明中，“檢測裝置”是指定性和/或定量分析中含有反應(yīng)器的裝置，例如生物芯片或生物芯片試劑盒、快速檢測試劑條、酶聯(lián)反應(yīng)酶標(biāo)板或酶聯(lián)反應(yīng)試劑盒，等等。檢測裝置的必不可少的組成是反應(yīng)器，反應(yīng)器的必不可少的組成是探針和用以固定探針的載體。在本發(fā)明中，“反應(yīng)器”是指探針與目標(biāo)物發(fā)生特異性反應(yīng)的場所及與其連通的其它相關(guān)結(jié)構(gòu)，例如生物芯片中的反應(yīng)器、酶聯(lián)反應(yīng)酶標(biāo)板中的孔、快速檢測試劑盒的試劑條等等。本發(fā)明中的探針，包括所有可以固定在固相載體上的具有活性、特別是生物活性的物質(zhì)，例如抗原、抗體、單鏈和多鏈DNA、RNA、核苷酸、藥物配體、配基、多肽、細胞、組織成分等生物成分。在本發(fā)明中，“片基”是指反應(yīng)器中用作固定探針或/和包含探針的物質(zhì)的固相載體。例如，抗原包被生物芯片中的探針為包被抗原而片基通常為活化玻片、抗原包被酶聯(lián)反應(yīng)酶標(biāo)板中的探針為包被抗原而片基通常為多孔板、等等。
下面以生物芯片分析為例來簡單地說明現(xiàn)有定性和/或定量分析及尚待解決的問題。
在本發(fā)明中，“生物芯片”、也簡稱“芯片”，是指定性和/或定量分析方法中的一種檢測裝置，其反應(yīng)器中探針同樣品中的目標(biāo)分子發(fā)生特異反應(yīng)的結(jié)果可以以可尋址的方式進行識別。在本發(fā)明中，“生物芯片試劑盒”是指包含有生物芯片及標(biāo)記系統(tǒng)等其它檢測反應(yīng)介質(zhì)的檢測裝置。
生物芯片包括基因芯片、多肽芯片、糖芯片、細胞芯片和組織芯片等。目前最常用的生物芯片是多肽芯片和基因芯片。多肽芯片是以多個氨基酸的序列結(jié)構(gòu)(包括蛋白質(zhì))作為探針固定在片基上制備的生物芯片。基因芯片是用待檢標(biāo)本中核酸、核苷酸與互補核酸、互補核苷酸探針雜交，形成雜交體，或與特異性抗體結(jié)合，再用呈色反應(yīng)顯示檢測結(jié)果的芯片。生物芯片有著廣泛的應(yīng)用范圍，包括基因表達檢測、基因篩選、藥物篩選、疾病診斷治療、環(huán)境監(jiān)測和治理、司法鑒定等領(lǐng)域。
目前的生物芯片，其標(biāo)記系統(tǒng)在檢測操作時基本上是瞬時釋放的，或者說在探針-目標(biāo)物反應(yīng)的條件下標(biāo)記物的釋放是沒有可控滯后的。利用這種標(biāo)記系統(tǒng)進行生物芯片分析，為避免虎克現(xiàn)象(HOOK effect)，其標(biāo)記物均是在需要時以溶液狀態(tài)完全由機械系統(tǒng)作用而進入反應(yīng)位置的。例如，利用目前具有外置標(biāo)記系統(tǒng)的平面生物芯片和內(nèi)置標(biāo)記系統(tǒng)的通道式生物芯片進行生物芯片分析，需要專門的加入標(biāo)記物溶液的步驟和相應(yīng)機械系統(tǒng)。換言之，目前的生物芯片分析，其中的標(biāo)記步驟必須機械系統(tǒng)專門輸運標(biāo)記物，這就往往需要專門的標(biāo)記物貯存器、標(biāo)記物輸運管道及輸運物轉(zhuǎn)換器及轉(zhuǎn)換程序，從而使撿測裝置的復(fù)雜程度居高不下。
目前，基于探針-目標(biāo)物特異性反應(yīng)和特異性標(biāo)記反應(yīng)的、對樣品中、特別是生物樣品中的目標(biāo)物進行定性和/或定量分析的裝置，例如酶聯(lián)反應(yīng)酶標(biāo)板，也都有與生物芯片同樣的標(biāo)記物輸送問題。而對快檢試劑條而言，由于固定在其中的標(biāo)記物(通常是固體標(biāo)記物，例如酶標(biāo)記的膠體金)在探針-目標(biāo)物反應(yīng)的條件下標(biāo)記物的釋放是沒有可控滯后的，虎克現(xiàn)象(HOOKeffect)的存在嚴(yán)重影響了其靈敏度?？傊?，控制標(biāo)記物釋放的速度或/和滯后，是在提高或不降低靈敏度的條件下，對現(xiàn)有定性和/或定量分析方法和裝置進行簡化步驟和自動化難度、降低檢測成本的一個重要方面。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種通過控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)對目標(biāo)物進行定性和/或定量分析的方法及裝置，是以在提高或不降低靈敏度的條件下，減少對樣品、特別是生物樣品中的目標(biāo)物進行定性和/或定量分析、更特別是生物芯片檢測的操作步驟，從而提高檢測效率為主要目的。
實際上，我們發(fā)現(xiàn)，標(biāo)記物釋放的速度和滯后，是可以在完全不或不完全依賴于機械輸運系統(tǒng)的條件下加以控制的。
本發(fā)明所述的方法如下本發(fā)明提供一種通過控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)對目標(biāo)物進行定性和/或定量分析的方法，其包括下列基本步驟a、將目標(biāo)物或含目標(biāo)物的物質(zhì)與檢測裝置的反應(yīng)器中的探針接觸并發(fā)生探針-標(biāo)記物反應(yīng)；b、通過控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)，對步驟a所述反應(yīng)的結(jié)果進行標(biāo)記，所述控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)中所含標(biāo)記物的控速釋放或/和可控滯后完全不或不完全由機械輸運系統(tǒng)來控制；
c、檢出步驟b所述標(biāo)記的結(jié)果；d、根據(jù)步驟c所述標(biāo)記結(jié)果分析a所述反應(yīng)結(jié)果。
本發(fā)明所述的控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)是指這樣一種標(biāo)記系統(tǒng)，其所含標(biāo)記物的釋放的速度或/和滯后是可以控制的，且所述控制完全不或不完全由機械輸運系統(tǒng)來進行。本發(fā)明方法與目前所有通過標(biāo)記系統(tǒng)對目標(biāo)物進行定性和/或定量分析方法的區(qū)別是標(biāo)記不是通過常規(guī)的標(biāo)記系統(tǒng)、而是通過控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)來進行的。
又一方面，本發(fā)明的一種通過控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)對目標(biāo)物進行定性和/或定量分析的方法，其中控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)中標(biāo)記物的控速釋放或/和可控滯后，由控制緩釋劑或/和控制緩釋結(jié)構(gòu)控制或參于控制。
本發(fā)明所述的控制緩釋劑是指反應(yīng)器中具有控制或參與控制標(biāo)記物釋放的速度和滯后的性質(zhì)的物質(zhì)，例如通過其可控網(wǎng)絡(luò)密度漲落而釋放標(biāo)記物的擴散控制緩釋劑、通過其可控降解而釋放標(biāo)記物的化學(xué)反應(yīng)控制緩釋劑、通過其被溶劑可控活化(例如溶解)而釋放標(biāo)記物的溶劑活化控制緩釋劑、通過膜內(nèi)吸水膨脹物質(zhì)而而使包膜脹裂崩解而快速釋放出標(biāo)記物的可控釋放劑、等等。
本發(fā)明所述的控制緩釋結(jié)構(gòu)是指反應(yīng)器中具有控制或參與控制標(biāo)記物釋放的速度和滯后的性質(zhì)的結(jié)構(gòu)，例如標(biāo)記物或含標(biāo)記物的物質(zhì)的所在高度，等等?？刂凭忈寴?biāo)記系統(tǒng)的一個例子為程序式釋放體系，其中標(biāo)記物釋放的速率、滯后時間主要由體系自身材料及結(jié)構(gòu)來決定。例如，由標(biāo)記物均勻分散或包埋在水溶性適中的聚合物(控制緩釋劑)中形成的擴散控制標(biāo)記系統(tǒng)，其中標(biāo)記物釋放的速度由聚合物溶漲或溶解速度控制，以滿足檢測過程中不同步驟對標(biāo)記物濃度的不同需要。又例如，由標(biāo)記物均勻分散或包埋在可降解的聚合物中(控制緩釋劑)形成的化學(xué)反應(yīng)控制標(biāo)記系統(tǒng)，其中標(biāo)記物釋放的速度，在加樣時實際上為零，在標(biāo)記時由于加入降解劑(例如酶)而使聚合物降解從而使標(biāo)記物釋放出來。又例如，由標(biāo)記物與包膜(控制緩釋劑)形成的溶劑活化控制標(biāo)記系統(tǒng)，其中標(biāo)記物釋放的速度、滯后由包膜溶漲或溶解速度控制。
另一方面，本發(fā)明的一種通過控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)對目標(biāo)物進行定性和/或定量分析的方法，其中控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)中標(biāo)記物的控速釋放，其標(biāo)記物半釋期大于10秒、優(yōu)選方案大于30秒；其中控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)中標(biāo)記物的可控滯后，其標(biāo)記物最大釋放時刻晚于所述探針-目標(biāo)物反應(yīng)最大時刻。在本發(fā)明中，“標(biāo)記物半釋期”是在標(biāo)記反應(yīng)的條件下標(biāo)記物從控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)向反應(yīng)器中釋放50％所需的時間，“標(biāo)記物最大釋放時刻” 是標(biāo)記物從控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)向反應(yīng)器中釋放速度最大的時刻。
本發(fā)明的一種通過控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)對目標(biāo)物進行定性和/或定量分析的方法，其標(biāo)記物的標(biāo)記方法包括化學(xué)發(fā)光標(biāo)記，激發(fā)發(fā)光標(biāo)記，非選擇性光反射標(biāo)記及選擇性光反射標(biāo)記。
本發(fā)明的一種通過控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)對目標(biāo)物進行定性和/或定量分析的方法，其標(biāo)記物標(biāo)記的反應(yīng)結(jié)果應(yīng)用于下述分析之一種生物芯片分析、快速反應(yīng)試劑條分析、酶聯(lián)免疫分析及熒光免疫分析。生物芯片分析、快速反應(yīng)試劑條分析、酶聯(lián)免疫分析及熒光免疫分析，分別是指以生物芯片、快速反應(yīng)試劑條、酶聯(lián)反應(yīng)酶標(biāo)板與熒標(biāo)板為檢測裝置對目標(biāo)物進行的定性和/或定量分析。
本發(fā)明所述的裝置如下本發(fā)明提供一種通過控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)對目標(biāo)物進行定性和/或定量分析的裝置，其特征在于其含有控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)，所述控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)，其標(biāo)記物半釋期大于10秒、優(yōu)選方案大于30秒，或/和其標(biāo)記物最大釋放時刻晚于所述探針-目標(biāo)物反應(yīng)最大時刻。
本發(fā)明所述的檢測裝置，其反應(yīng)器可為流動式反應(yīng)器或非流動式反應(yīng)器，其可為單反應(yīng)器檢測裝置又可為多反應(yīng)器檢測裝置。
另一方面，本發(fā)明的一種通過控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)對目標(biāo)物進行定性和/或定量分析的裝置，其控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)為不置于反應(yīng)器中的、含有控制緩釋劑的外置式控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)，或置于反應(yīng)器中的、含有反應(yīng)器控制緩釋結(jié)構(gòu)或/和控制緩釋劑的內(nèi)置式控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)。在外置式控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)中，控制緩釋劑控制或參與控制標(biāo)記物釋放的速度和滯后。外置式控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)的一個例子為生物芯片試劑盒中含有的分裝的干燥微膠囊及包埋在其中的熒光標(biāo)記特異性抗原，使用時可加在樣品中一起進入反應(yīng)器，在抗原探針-抗體目標(biāo)物反應(yīng)高峰過后，熒光標(biāo)記特異性抗原包裹微膠囊崩解釋放進行標(biāo)記。在本發(fā)明中，預(yù)設(shè)于反應(yīng)器中的控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)顯然不與探針重合。在內(nèi)置式控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)中，控制緩釋劑控制或/和控制緩釋結(jié)構(gòu)參與控制標(biāo)記物釋放的速度和滯后。內(nèi)置式標(biāo)記系統(tǒng)可置于反應(yīng)器中的不與探針重合的任意位置，例如反應(yīng)器壁上、反應(yīng)器通路上、等等。最簡單的控制緩釋結(jié)構(gòu)的例子，是反應(yīng)器中固定含標(biāo)記物的物質(zhì)的水平面和固定探針的水平面的高度差，當(dāng)加入小量樣品時不溶入標(biāo)記物，而反應(yīng)完成后加入較多量的緩沖液，則溶入標(biāo)記物進行標(biāo)記。
除了可含有控制緩釋結(jié)構(gòu)外，本發(fā)明裝置中一個重要的方面是可含有控制緩釋劑。例如，通過利用擴散控制緩釋系統(tǒng)，標(biāo)記物由于擴散控制緩釋劑(例如溶漲性適中的聚合物)網(wǎng)絡(luò)密度漲落而釋放；通過利用化學(xué)反應(yīng)控制緩釋系統(tǒng)，標(biāo)記物由于化學(xué)反應(yīng)控制緩釋劑(例如可降解的聚合物)降解而釋放；通過利用溶劑活化控制緩釋系統(tǒng)，標(biāo)記物由于溶劑活化控制緩釋劑(例如包膜)被溶劑活化(例如溶解)而釋放。
又一方面，本發(fā)明的一種通過控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)對目標(biāo)物進行定性和/或定量分析的裝置，其含有的控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)中的控制緩釋劑為水可溶性有機物，例如天然水溶性有機物、半合成水溶性有機物及合成水溶性有機化合物、等等。
本發(fā)明的一種通過控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)對目標(biāo)物進行定性和/或定量分析的裝置，其控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)中的水可溶性有機物包括碳水化合物、植物膠、動物膠、改性纖維素、改性淀粉、水可溶性聚合物和縮合物、等等。
本發(fā)明的一種通過控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)對目標(biāo)物進行定性和/或定量分析的裝置，其控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)中的水可溶性有機物包括多糖、聚多糖及它們的衍生物，植物淀粉，瓊膠，阿拉伯膠，骨膠，明膠，帶有羧基或羥基的纖維素、帶有羧基或羥基的纖維素衍生物、等等。
本發(fā)明的一種通過控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)對目標(biāo)物進行定性和/或定量分析的裝置，其控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)中的標(biāo)記物與緩釋劑具有一維或二維或三維的單重或多重夾心結(jié)構(gòu)。所述一維、二維或三維結(jié)構(gòu)，分別是指具有線型、平面型或立體型空間形狀的控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)結(jié)構(gòu)。所述夾心結(jié)構(gòu)，是指標(biāo)記物和控制緩釋劑在空間上不均勻分布。在多重夾心結(jié)構(gòu)中，可以含有一種或多種標(biāo)記物及一種或多種控制緩釋劑，如第一重為標(biāo)記物第二重為增強劑的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的一種通過控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)對目標(biāo)物進行定性和/或定量分析的裝置，其控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)中的標(biāo)記物含有標(biāo)記物質(zhì)及配基，所述標(biāo)記物質(zhì)包括酶、熒光染料，化學(xué)發(fā)光催化劑，有色金屬或有色金屬鹽，染料和顏料；所述配基包括抗原，抗體，生物素，藥物配基，多肽，DNA、RNA及其片斷。
本發(fā)明的一種通過控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)對目標(biāo)物進行定性和/或定量分析的裝置，其為生物芯片或生物芯片試劑盒，或快速檢測試劑條或快速檢測試劑條試劑盒，或酶聯(lián)反應(yīng)酶標(biāo)板或酶聯(lián)反應(yīng)試劑盒。
本發(fā)明的一種通過控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)對目標(biāo)物進行定性和/或定量分析的裝置，其為探針陣列的探針密度大于5個/cm2，優(yōu)選方案大于10個/cm2，更優(yōu)選方案大于20個/cm2的生物芯片。
本發(fā)明方法及裝置的優(yōu)點在于通過引入控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)，對于受虎克現(xiàn)象影響較大的分析(例如快速檢測試劑條分析)，可以減小虎克現(xiàn)象影響從而提高檢測方法和裝置的靈敏度；對于現(xiàn)需專門操作步驟及機械輸運系統(tǒng)來減小虎克現(xiàn)象影響的分析(例如生物芯片分析)，可以減少專門操作步驟及機械輸運系統(tǒng)以提高檢測及檢測裝置的效率，降低了檢測自動化的難度，可以降低檢測儀器的投資及檢測成本。
附圖及圖面說明
圖1本發(fā)明有緩釋系統(tǒng)生物芯片的示意圖其中B是A中的緩釋標(biāo)記物的一個點的示意圖其中1為基片 2為緩釋標(biāo)記物 3為探針點 4為反應(yīng)池 5為標(biāo)記物 6為緩釋層
具體實施例方式實施例1，某些溶劑活化控制緩釋系統(tǒng)中標(biāo)記物的半釋期在本實施例中，控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)由控制緩釋劑及賦形劑形成的膜包裹粉狀標(biāo)記物而形成。標(biāo)記物為酶標(biāo)記的羊抗人二抗(北京天壇生物制品股份有限公司)，控制緩釋劑為水溶性有機物(包括淀粉、羥丙基纖維素、阿拉伯膠、明膠、羥丙基甲基纖維素、乙基纖維素、硬酯酸)，賦形劑為乳糖。溶劑為PBS緩沖液，控制緩釋系統(tǒng)活化方式為溶解。
將定量的乙肝抗原(北京人民醫(yī)院肝病研究所)控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)固定于載玻片做成的小池中。在37℃加入定量的溶劑于控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)，然后在不同時間抽出已溶部分，再測定溶出的標(biāo)記物而計算出來(表1)。
表1幾種溶劑活化控制緩釋系統(tǒng)中標(biāo)記物的半釋期
實施例2，控制緩釋標(biāo)記方法及裝置(1)含控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)的生物芯片的制備本實施例控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)中的標(biāo)記物為羅丹明標(biāo)記的羊抗人二抗，控制緩釋劑為阿拉伯膠和乙基纖維素。
本實施例制備含控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)的生物芯片，所用片基為氨基改性玻片(自制，參考蔣中華等《生物分子固定化技術(shù)及應(yīng)用》，化學(xué)工業(yè)出版社，北京，1998)，其尺寸為75×25×1mm。將片基在選定位置涂上高疏水有機硅涂料(成都晨光化工研究院)形成高疏水層隔離結(jié)構(gòu)(參考我們的另一發(fā)明《一種反應(yīng)器隔離結(jié)構(gòu)高度最小化的生物芯片及制備方法》，申請?zhí)?3117397.7)，從而形成2行8個反應(yīng)池，反應(yīng)池尺寸為4.5mm×4.5mm。
本實施例制備芯片所用探針為HCV抗原(北京人民醫(yī)院肝病研究所)和HIV1+2抗原(北京人民醫(yī)院肝病研究所)。將已優(yōu)化濃度的抗原分別點在同一個反應(yīng)池中，各點2個點，形成2×2探針陣列。點樣后，用牛血清白蛋白溶液封閉。將適當(dāng)濃度阿拉伯膠涂在反應(yīng)池底沿周邊形成寬1mm的帶子，干燥后將含有淀粉賦形的標(biāo)記物涂在阿拉伯膠帶內(nèi)，干燥后將控制緩釋劑涂覆在阿拉伯膠帶上，干燥后備用。試驗測得控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)的半釋期37℃為15分鐘。
-利用控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)檢測本實施例4種樣品分別為HCV抗體陽性血清、HIV1+2抗體陽性人血清、陽性對照物(HCV抗體和HIV1-2抗體陽性血清對照物的混合物)和陰性對照物(HCV抗體和HIV1-2抗體都為陰性的血清對照物)。所有樣品的陰、陽性，均預(yù)先用酶聯(lián)反應(yīng)試劑盒(廈門新創(chuàng))按其說明書經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)ELISA方法檢測確定。
實驗時，4種樣品分別加入上述含控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)的生物芯片，每種樣品加2個反應(yīng)池。加樣時樣品作適當(dāng)稀釋，加樣量為5ul，孵育溫度37℃，孵育時間5分鐘。洗滌液每次加入量為15ul，洗滌3次。然后，加入15ul稀釋液，孵育溫度37℃，孵育時間5分鐘。反應(yīng)后以15ul洗滌液洗滌5次。干燥后進行掃描(Afymetrix公司GMS 418芯片掃描儀)，數(shù)據(jù)處理后得到結(jié)果如表2。
表2檢測結(jié)果
表中，“+”為陽性結(jié)果，“-”為陰結(jié)果。
實施例3，控制緩釋標(biāo)記方法及裝置(2)含控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)的酶聯(lián)反應(yīng)酶標(biāo)板的制備本實施例控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)中的標(biāo)記物為酶標(biāo)記的羊抗人二抗(北京天壇生物制品股份有限公司)，控制緩釋劑為羥丙基甲基纖維素及填充劑乳糖。
本實施例制備含控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)的酶聯(lián)反應(yīng)酶標(biāo)板，所用片基為96孔聚苯乙烯微孔板(中國深圳金燦華實業(yè)有限公司)。
本實施例制備含控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)的酶聯(lián)反應(yīng)酶標(biāo)板所用探針為HCV抗原(北京人民醫(yī)院肝病研究所)。將已優(yōu)化濃度的抗原包被到聚苯乙烯微孔板孔內(nèi)。包被后，用牛血清白蛋白溶液封閉。將含有適當(dāng)濃度控制緩釋劑與標(biāo)記物的混合物涂在反應(yīng)池內(nèi)沿周邊離池底3-4mm處形成寬1mm的帶子，干燥后備用。在加入100ulPBS緩沖液時測得標(biāo)記物37℃的半釋期約5分鐘。
-利用控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)檢測所用樣品為HCV抗體陽性血清和HCV抗體陰性血清。樣品的陰、陽性，均預(yù)先用酶聯(lián)反應(yīng)試劑盒(廈門新創(chuàng))按其說明書經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)ELISA方法檢測確定(表3)。
實驗時2種樣品1比5稀釋后分別加入上述制備的2個酶聯(lián)反應(yīng)酶標(biāo)板中，每種樣品加4個反應(yīng)池，加樣量為50ul，反應(yīng)溫度37℃，孵育時間25分鐘。洗板機洗滌5次，每次加入洗滌液量為60ul。然后加入150ul稀釋液，由于液面升高控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)溶解釋出標(biāo)記物，在37℃孵育25分鐘后，加200ul洗滌液，洗滌5次。加入底物的反應(yīng)條件和與經(jīng)典的ELISA法相同。利用酶標(biāo)儀(Thermo Labsystems上海雷勃分析儀器有限公司)進行比色分析，4孔平均結(jié)果見表3。
表3檢測結(jié)果
表中，“+”為陽性結(jié)果，“-”為陰結(jié)果。
實施例4，控制緩釋標(biāo)記方法及裝置(3)含控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)的快檢試劑條的制備本實施例控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)中的標(biāo)記物為膠體金標(biāo)記羊抗人二抗，控制緩釋劑為明膠，并輔以填充劑微晶纖維素。
本實施例制備含控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)的快檢試劑條，所用基片為硝酸纖維膜條(福建泉州長立生化有限公司)。
本實施例制備含控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)的快檢試劑條所用探針為HCV抗原(北京人民醫(yī)院肝病研究所)。
將已優(yōu)化濃度的HCV抗原分別在試劑條上進行點樣(檢測線)，再按常規(guī)方法分別點上兔抗羊IgG質(zhì)控線，后用牛血清白蛋白溶液封閉，再組裝上加樣區(qū)、控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)區(qū)、吸水區(qū)而成?？刂凭忈寴?biāo)記系統(tǒng)區(qū)的制備，首先將纖維條浸入膠體金標(biāo)記羊抗人標(biāo)記物溶液，干燥后剪成長寬適當(dāng)?shù)木匦涡K，用適當(dāng)濃度緩釋劑涂覆其上，干燥后形成適當(dāng)厚度的緩釋層，再將其固定于試劑條上備用。在加入300ul緩沖液時標(biāo)記物室溫的半釋期約10秒鐘。
-利用控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)檢測所用樣品為HCV抗體陽性血清和HCV抗體陰性血清。樣品的陰、陽性，均預(yù)先用酶聯(lián)反應(yīng)試劑盒(廈門新創(chuàng))按其說明書經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)ELISA方法檢測確定(表4)。
實驗時，2種樣品分別加入2個上述快檢試紙條。加樣時樣品作適當(dāng)稀釋，加樣量為100ul，加樣后接著緩慢加入洗滌液至質(zhì)控線出現(xiàn)。結(jié)果見表4。
表4檢測結(jié)果
表中，“+”為陽性結(jié)果，“-”為陰結(jié)果。
實施例5，控制緩釋標(biāo)記方法及裝置(4)含控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)的流動生物芯片的制備本實施例控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)中的標(biāo)記物為羅丹明標(biāo)記的羊抗人二抗，控制緩釋劑為明膠，并輔以填充劑微晶纖維素等。
本實施例制備含控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)的生物芯片，所用片基為與實施例2同的氨基改性玻片。
制備流動反應(yīng)池片基的方法。
本實施例制備芯片所用探針與實施例2同(HCV抗原、HIV1+2抗原)。將已優(yōu)化濃度的抗原分別點在同一個反應(yīng)池中，各點2個點，形成2×2探針陣列。包被后，用牛血清白蛋白溶液封閉。將適當(dāng)濃度明膠涂在反應(yīng)池入液區(qū)內(nèi)并留出寬度1.0mm通道，干燥后將含有賦形劑淀粉的標(biāo)記物涂在明膠帶內(nèi)，干燥后將控制緩釋劑涂覆在蔗糖帶上，干燥后備用。試驗測得控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)的37℃半釋期為3分鐘。
-利用控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)檢測本實施例4種樣品與實施例2同，所有樣品的陰、陽性，均預(yù)先用酶聯(lián)反應(yīng)試劑盒(廈門新創(chuàng))按其說明書經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)ELISA方法檢測確定(表2)。
實驗時，4種樣品分別加入上述含控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)的生物芯片，每種樣品加2個反應(yīng)池。加樣時樣品作適當(dāng)稀釋，加樣量為25ul，反應(yīng)溫度37℃，加樣速度5ul/分鐘，100ul緩沖液流洗。干燥后進行掃描(Afymetrix公司GMS 418芯片掃描儀)，數(shù)據(jù)處理后得到結(jié)果如表5。
表5檢測結(jié)果
表中，“+”為陽性結(jié)果，“-”為陰結(jié)果。
實施例6，控制緩釋標(biāo)記方法及裝置(5)含控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)的生物芯片的制備本實施例控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)中的標(biāo)記物為羅丹明標(biāo)記的HCV抗原、HIV1+2抗原，控制緩釋劑為明膠，并輔以填充劑微晶纖維素等。
本實施例制備含控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)的生物芯片，所用片基為與實施例2同的氨基改性玻片。
制備反應(yīng)池片基的方法。
本實施例制備芯片所用探針與實施例2同。將已優(yōu)化濃度的HCV抗原、HIV1+2抗原分別點在同一個反應(yīng)池中，各點2個點，形成2×2探針陣列。包被后，用牛血清白蛋白溶液封閉。將適當(dāng)濃度的標(biāo)記物涂在反應(yīng)池底部周邊，干燥后備用。試驗測得控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)的37℃半釋期約為3分鐘。
-利用控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)檢測本實施例4種樣品與實施例2同，所有樣品的陰、陽性，均預(yù)先用酶聯(lián)反應(yīng)試劑盒(廈門新創(chuàng))按其說明書經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)ELISA方法檢測確定(表2)。
實驗時，50倍稀釋的4種樣品分別加入上述含控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)的生物芯片，每種樣品加2個反應(yīng)池。加樣量為25ul，37℃孵育30分鐘，洗滌5次。干燥后進行掃描(Afymetrix公司GMS 418芯片掃描儀)，數(shù)據(jù)處理后得到結(jié)果如表5。
表5檢測結(jié)果
表中，“+”為陽性結(jié)果，“-”為陰結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種通過控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)對目標(biāo)物進行定性和/或定量分析的方法，其包括下列基本步驟a、將目標(biāo)物或含目標(biāo)物的物質(zhì)與檢測裝置的反應(yīng)器中的探針接觸并發(fā)生探針-標(biāo)記物反應(yīng)；b、通過控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)，對步驟a所述反應(yīng)的結(jié)果進行標(biāo)記，所述控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)中所含標(biāo)記物的控速釋放或/和可控滯后完全不或不完全由機械輸運系統(tǒng)來控制；c、檢出步驟b所述標(biāo)記的結(jié)果；d、根據(jù)步驟c所述標(biāo)記結(jié)果分析a所述反應(yīng)結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)對目標(biāo)物進行定性和/或定量分析的方法，其特征在于所述標(biāo)記物的控速釋放或/和可控滯后，由控制緩釋劑或/和控制緩釋結(jié)構(gòu)控制或參于控制。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種通過控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)對目標(biāo)物進行定性和/或定量分析的方法，其特征在于所述標(biāo)記物的控速釋放，其標(biāo)記物半釋期大于10秒、優(yōu)選方案大于30秒；所述標(biāo)記物的可控滯后，其標(biāo)記物最大釋放時刻晚于所述探針-目標(biāo)物反應(yīng)最大時刻。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種通過控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)對目標(biāo)物進行定性和/或定量分析的方法，其特征在于所述標(biāo)記物，其標(biāo)記方法包括化學(xué)發(fā)光標(biāo)記，激發(fā)發(fā)光標(biāo)記，非選擇性光反射標(biāo)記及選擇性光反射標(biāo)記。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種通過控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)對目標(biāo)物進行定性和/或定量分析的方法，其特征在于所述標(biāo)記方法，適用于下述分析之一種生物芯片分析、快速反應(yīng)試劑條分析、酶聯(lián)免疫分析及熒光免疫分析。
6.一種通過控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)對目標(biāo)物進行定性和/或定量分析的裝置，其特征在于其含有控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)，所述控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)，其標(biāo)記物半釋期大于10秒、優(yōu)選方案大于30秒，或/和其標(biāo)記物最大釋放時刻晚于所述探針-目標(biāo)物反應(yīng)最大時刻。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種通過控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)對目標(biāo)物進行定性和/或定量分析的裝置，其特征在于所述控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)為不置于反應(yīng)器中的、含有控制緩釋劑的外置式控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)，或置于反應(yīng)器中的、含有反應(yīng)器控制緩釋結(jié)構(gòu)或/和控制緩釋劑的內(nèi)置式控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的一種通過控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)對目標(biāo)物進行定性和/或定量分析的裝置，其特征在于所述控制緩釋劑為水可溶性或水溶液可致崩解的有機物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種通過控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)對目標(biāo)物進行定性和/或定量分析的裝置，其特征在于所述水可溶性或水溶液可致崩解的有機物包括碳水化合物、植物膠、動物膠、改性纖維素、改性淀粉、聚合物和縮合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種通過控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)對目標(biāo)物進行定性和/或定量分析的裝置，其特征在于所述水可溶性或水溶液可致崩解的有機物包括多糖、聚多糖及它們的衍生物，植物淀粉，瓊膠，阿拉伯膠，骨膠，明膠，帶有羧基或羥基的纖維素、帶有羧基或羥基的纖維素衍生物。
11.根據(jù)權(quán)利要求6-10之一所述的一種通過控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)對目標(biāo)物進行定性和/或定量分析的裝置，其特征在于所述控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)中的標(biāo)記物與控制緩釋劑具有一維或二維或三維的單重或多重夾心結(jié)構(gòu)，所述夾心結(jié)構(gòu)是指標(biāo)記物濃度分布在內(nèi)部高于外部的結(jié)構(gòu)。
12.根據(jù)權(quán)利要求6-11之一所述的一種通過控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)對目標(biāo)物進行定性和/或定量分析的裝置，其特征在于其控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)中的標(biāo)記物含有標(biāo)記物質(zhì)及配基，所述標(biāo)記物質(zhì)包括酶、熒光染料，化學(xué)發(fā)光催化劑，有色金屬或有色金屬鹽，染料和顏料；所述配基包括抗原，抗體，生物素，藥物配基，多肽，DNA、RNA及其片斷。
13.根據(jù)權(quán)利要求6-12之一所述的一種通過控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)對目標(biāo)物進行定性和/或定量分析的裝置，其特征在于其為生物芯片或生物芯片試劑盒，或快速檢測試劑條或快速檢測試劑條試劑盒，或酶聯(lián)反應(yīng)酶標(biāo)板或酶聯(lián)反應(yīng)試劑盒。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的一種通過控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)對目標(biāo)物進行定性和/或定量分析的裝置，其特征在于所述生物芯片的探針陣列的探針密度大于5個/cm2，優(yōu)選方案大于10個/cm2，更優(yōu)選方案大于20個/cm2。
全文摘要
本發(fā)明提供一種通過控制緩釋標(biāo)記系統(tǒng)對目標(biāo)物進行定性和/或定量分析的方法及裝置，在提高或不降低靈敏度的條件下，減少檢測的操作步驟，從而提高檢測效率。
文檔編號C12Q1/68GK1514245SQ0313525
公開日2004年7月21日 申請日期2003年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月19日
發(fā)明者鄒方霖, 陳春生, 陳寧, 王建霞 申請人:成都夸?？萍加邢薰?br>