專利名稱：新的癌標(biāo)記物及其在癌癥診斷中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于在人和非人哺乳動(dòng)物受試者中診斷癌癥的新癌標(biāo)記物，特別是涉及這樣的癌標(biāo)記物，其包含質(zhì)荷比(m/z)約為991的帶負(fù)電荷分子。此處描述的癌標(biāo)記物可用于確定來(lái)自受試者的生物樣本(如體液)中一種或多種癌細(xì)胞或腫瘤的存在，這是通過(guò)測(cè)試來(lái)自該受試者的生物樣本中該癌標(biāo)記物水平的降低而確定的。
背景技術(shù)：
盡管在醫(yī)學(xué)研究中已取得了無(wú)數(shù)的進(jìn)步，癌癥仍是世界范圍內(nèi)主要的死亡原因，且因此需要用于癌癥早期診斷的快速和簡(jiǎn)便的方法，以利于通過(guò)外科切除、放射治療、化學(xué)治療或其他已知的治療方法進(jìn)行適當(dāng)?shù)尼t(yī)療處理。用于癌癥的好的診斷方法的可用性對(duì)于評(píng)價(jià)病人的治療反應(yīng)或?qū)τ谠u(píng)價(jià)由于原位再生或癌轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致的復(fù)發(fā)也是重要的。
癌標(biāo)記物，例如腫瘤基因產(chǎn)物、生長(zhǎng)因子和生長(zhǎng)因子受體、生血管因子、蛋白酶、粘附因子和腫瘤抑制基因產(chǎn)物等的特性可提供有關(guān)在人或非人哺乳動(dòng)物受試者中癌癥的風(fēng)險(xiǎn)、存在、狀態(tài)或未來(lái)行為的重要信息。確定一種或多種癌標(biāo)記物的存在、表達(dá)或活性水平可有助于對(duì)具有不確定性臨床異常的患者進(jìn)行鑒別診斷，例如用以鑒別良性和惡性異常。
此外，對(duì)于已確定為惡性的患者，癌標(biāo)記物可用于預(yù)測(cè)未來(lái)復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，或用于預(yù)測(cè)特定患者對(duì)所選擇的治療方法出現(xiàn)反應(yīng)的可能性。通過(guò)分析高特異性癌標(biāo)記物或標(biāo)記的組合甚至可獲得更為具體的信息，所述信息可預(yù)測(cè)患者對(duì)特定藥物或治療方案的反應(yīng)。
已公知異常糖基化是多數(shù)癌癥類型的共有特征，且絲氨酸/蘇氨酸連接的聚糖(即O-聚糖)水平的顯著變化也可發(fā)生于癌癥患者?！錙-聚糖″為一糖蛋白，其中N-乙酰半乳糖胺加入到新生蛋白質(zhì)的絲氨酸和/或蘇氨酸殘基。癌癥患者共有的O-聚糖核心結(jié)構(gòu)水平例如可降低，或唾液酸化聚糖或神經(jīng)節(jié)苷脂的水平提高，或唾液酸的修飾減少。癌癥患者的0-聚糖特定肽部分的合成也可發(fā)生改變，由此使O-聚糖水平發(fā)生變化，這是由于糖蛋白的肽部分部分地指導(dǎo)O-聚糖的合成。備選地，癌癥患者的唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性也可增強(qiáng)，因此產(chǎn)生過(guò)度唾液酸化的O-聚糖。
通常，腫瘤特異抗原為高分子量分子(＞10,000Da)，與正常細(xì)胞相比其在癌細(xì)胞上特異表達(dá)或表達(dá)的水平提高。但是，也存在低分子量(＜10,000Da)的腫瘤特異抗原，所述抗原通常為糖脂，更具體地為包含聚乳糖胺結(jié)構(gòu)的鞘脂。″糖脂″只是具有一個(gè)或多個(gè)糖部分的脂類或脂肪酸分子。
″鞘脂″為包含脂肪酸殘基、極性首基和鞘氨醇或相關(guān)堿基的脂類，包括神經(jīng)酰胺及其衍生物、鞘磷脂(即在羥基基團(tuán)上包含磷酸膽堿部分的神經(jīng)酰胺)或鞘糖脂(即在羥基基團(tuán)上包含糖部分的神經(jīng)酰胺)，包括神經(jīng)節(jié)苷脂。
″神經(jīng)節(jié)苷脂″為含有唾液酸的鞘糖脂(即其中脂肪酸取代的鞘氨醇與寡糖連接的糖脂，所述寡糖包括D-葡萄糖、D-半乳糖、N-乙酰半乳糖胺和/或N-乙酰神經(jīng)氨酸)，且其在多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上表達(dá)。根據(jù)與唾液酸糖基化的程度，神經(jīng)節(jié)苷脂有單-、二-、三-或多-唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的命名法，使用了術(shù)語(yǔ)″GMn″、″GDn″、″GTn″，其中″G″表示神經(jīng)節(jié)苷脂、″M″表示單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂、″D″表示為二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂，且″T″表示為三唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂；其中″n″為賦值至少為1的數(shù)字標(biāo)示，或賦值至少為1a的字母數(shù)字標(biāo)示(例如1a、1b、1c等)，代表觀測(cè)分子的結(jié)合方式[Lehninger，生物化學(xué)(Biochemistry)，294-296頁(yè)(WorthPublishers，1981)；Wiegandt，糖脂新的綜合生物化學(xué)(GlycolipidsNew Comprehensive Biochemistry)，199-260頁(yè)，(Neuberger等編輯，Elsevier，1985)]。
根據(jù)其聚乳糖胺單位的結(jié)構(gòu)，通常將聚乳糖胺分為兩類，具體地說(shuō)是1型聚乳糖胺，其包含半乳糖基-(ョ1-3，)N-乙酰葡糖胺，或備選地，是2型聚乳糖胺，其包含半乳糖基-(ョ1-4)N-乙酰葡糖胺。
神經(jīng)節(jié)苷脂，例如GM2(Livingston等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)84，2911-2915，1987)、GD2(Schulz等，癌癥研究(Cancer Res.)44，5914-5920，1984)或GD3(Cheresh等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81，5767-5771，1984；Reisfeld等，對(duì)癌癥的免疫(Immunity to Cancer)(M.S.Mitchell，編輯)，69-84頁(yè)，1985)，已被鑒定為多種神經(jīng)外胚層來(lái)源腫瘤的主要細(xì)胞表面組成，其中所述腫瘤如惡性黑素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、軟組織肉瘤和肺的小細(xì)胞癌。這些神經(jīng)節(jié)苷脂在多數(shù)正常組織中不存在，或僅以低水平存在。也討論了神經(jīng)節(jié)苷脂作為腫瘤特異抗原的作用，例如，Ritter和Livingston等，癌生物學(xué)論壇(Sem.Canc.Biol.)2，401-409，1991；Chatterjee等，USSN 5,977,316，1999年11月2日授權(quán)；Hakomori癌癥研究(Hakomori Cancer Res.)45，2405-2414，1985；Miraldi，核醫(yī)學(xué)論壇(Seminars in Nuclear Medicine)XIX，282-294，1989；以及Hamilton等，國(guó)際癌癥雜志(Int.J.Cancer)53，1-8，1993。
存在于主要癌癥中的共有腫瘤相關(guān)抗原為包含2型鏈聚乳糖胺結(jié)構(gòu)的神經(jīng)節(jié)苷脂，或備選地，為巖藻糖化形式的神經(jīng)節(jié)苷脂。例如，神經(jīng)節(jié)苷脂唾液酸-Lewis A和唾液酸-Lewis X參與癌細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，并有助于癌癥的血原性轉(zhuǎn)移。唾液酸-Lewis A通常在結(jié)腸癌、胰腺癌和膽道癌中表達(dá)，而唾液酸-Lewis X通常在乳腺癌、肺癌、肝癌和卵巢癌中表達(dá)。癌細(xì)胞表面唾液酸-Lewis A或唾液酸-Lewis X的糖配基的表達(dá)程度與癌癥患者的血原性轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。
另一方面，包含1型聚乳糖胺結(jié)構(gòu)的神經(jīng)節(jié)苷脂，例如2-3唾液酸Lewis A，在正常細(xì)胞和組織中大量存在，并且也是癌癥相關(guān)的。Levery等(USSN 6.08 3,929，于2000年7月2日授權(quán))認(rèn)為具有或不具有唾液酸和/或巖藻糖殘基的乳糖系列1型鏈的延長(zhǎng)形式存在于癌癥組織中。Levery等(見上)顯示從結(jié)腸腺癌細(xì)胞系Colo205的糖脂級(jí)分分離的同種型包含以下的鞘糖脂單位同源二聚體的LewisA，、異源二聚體的LewisB-LewisA和延伸的唾液酸LewisA-LewisA，后者被認(rèn)為是腫瘤相關(guān)的鞘糖脂和潛在的腫瘤標(biāo)記物。
但是，盡管在鑒定用于檢測(cè)癌癥的唾液酸化抗原方面取得了進(jìn)展，仍急切需要癌標(biāo)記物以助于癌癥的診斷和特定癌癥類型的檢測(cè)。特別是，盡管在癌癥中觀察到的糖基化有些混亂，但幾乎所有的(如果有的話)已知癌標(biāo)記物必然為唾液酸化化合物或O-連接的糖蛋白，和/或均為腫瘤特異抗原。
癌標(biāo)記物的優(yōu)選特征在于可應(yīng)用快速或高通量的分析方法對(duì)其實(shí)施檢測(cè)，所述分析方法例如質(zhì)譜或高壓液相色譜(HPLC)-質(zhì)譜。
此外，適宜的癌標(biāo)記物應(yīng)適于在體液(例如血液、血清、尿液、粘液、唾液、汗液、淚液或其他液體分泌物)中進(jìn)行檢測(cè)，因此可有助于使用非侵入性試驗(yàn)進(jìn)行常規(guī)測(cè)試。
發(fā)明概述在導(dǎo)致產(chǎn)生本發(fā)明的工作中，本發(fā)明人意在鑒定出存在于人和非人哺乳動(dòng)物受試者體液中的高分子量以及低分子量的癌標(biāo)記物，并研發(fā)相關(guān)的高通量診斷方法用以檢測(cè)體液中與該癌標(biāo)記物水平降低相關(guān)的惡性改變，其中此類診斷并不依賴于分離分子探針，所述探針如抗體或核酸探針，和/或避免了應(yīng)用該類分子探針?biāo)璧馁M(fèi)時(shí)的結(jié)合步驟。
因此本發(fā)明的第一方面提供了包含質(zhì)荷比約為991的帶負(fù)電荷分子的癌標(biāo)記物，與健康受試者相比所述標(biāo)記物在患癌癥的受試者中存在的水平降低，或提供了該帶負(fù)電荷分子的衍生物。
本發(fā)明的第二方面提供了在人和非人哺乳動(dòng)物受試者中診斷或檢測(cè)癌癥的方法，其包括(i)測(cè)定來(lái)自疑患癌癥受試者的測(cè)試樣本中的癌標(biāo)記物水平，其中所述癌標(biāo)記物包含質(zhì)荷比約為991的帶負(fù)電荷分子或其衍生物；以及(ii)將(i)中的癌標(biāo)記物或衍生物的水平與來(lái)自健康受試者的對(duì)照樣本中的癌標(biāo)記物或衍生物的水平，或與制定的用于健康受試者的水平進(jìn)行比較，其中與健康受試者或與用于健康受試者的制定水平相比，該癌標(biāo)記物或衍生物水平的降低作為癌癥的征兆。
本發(fā)明的第三方面提供了在人和非人哺乳動(dòng)物受試者中診斷或檢測(cè)癌癥的方法，其包括(i)測(cè)定來(lái)自疑患癌癥受試者的測(cè)試樣本中的癌標(biāo)記物水平，其中所述癌標(biāo)記物包含質(zhì)荷比約為991的帶負(fù)電荷分子或其衍生物；以及(ii)將(i)中的癌標(biāo)記物或衍生物的水平與加到測(cè)試樣本中的內(nèi)標(biāo)水平進(jìn)行比較，其中與內(nèi)標(biāo)水平相比該癌標(biāo)記物或衍生物的水平降低作為癌癥的征兆。
本發(fā)明的第四方面提供了在人和非人哺乳動(dòng)物受試者中診斷或檢測(cè)癌癥的方法，其包括測(cè)定來(lái)自疑患癌癥受試者的測(cè)試樣本中的癌標(biāo)記物水平，其中所述癌標(biāo)記物包含質(zhì)荷比約為991的帶負(fù)電荷分子或其衍生物；與在同一測(cè)試樣本中的另一標(biāo)記物的水平相比，其中癌標(biāo)記物與另一標(biāo)記物比率的變化作為癌癥的征兆。
本發(fā)明的第五方面提供了在人和非人哺乳動(dòng)物受試者中監(jiān)測(cè)癌癥治療的方法，其包括(i)測(cè)定來(lái)自進(jìn)行癌癥治療的受試者的測(cè)試樣本中癌標(biāo)記物的水平，其中所述癌標(biāo)記物包含質(zhì)荷比約為991的帶負(fù)電荷分子或其衍生物；以及(ii)將(i)中的癌標(biāo)記物或衍生物的水平與來(lái)自健康受試者的對(duì)照樣本中癌標(biāo)記物或衍生物的水平，或與用于健康受試者的已制定的水平進(jìn)行比較，其中癌標(biāo)記物或衍生物水平的提高作為成功治療的征兆。
本發(fā)明的第六方面提供了在人和非人哺乳動(dòng)物受試者中診斷成功治療后的癌癥復(fù)發(fā)的方法，其包括(i)測(cè)定來(lái)自癌癥治療的受試者的測(cè)試樣本中癌標(biāo)記物的水平，其中所述癌標(biāo)記物包含質(zhì)荷比約為991的帶負(fù)電荷分子或其衍生物；以及(ii)將(i)中的癌標(biāo)記物或衍生物的水平與來(lái)自健康受試者的對(duì)照樣本中的癌標(biāo)記物或衍生物、與用于健康受試者的已制定的水平或與來(lái)自成功治療癌癥后的受試者樣本中的水平進(jìn)行比較，其中癌標(biāo)記物或衍生物水平的降低作為癌癥復(fù)發(fā)的征兆。
定義在本說(shuō)明書中，除非上下文需要另外指出，單詞″comprise″或其改變形式如″comprises″或″comprising″理解為包括所說(shuō)明的一個(gè)步驟、成分或整數(shù)，或包含一組步驟、成分或整數(shù)，但不排除任何其他的步驟、成分或整數(shù)或一組成分或整數(shù)。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解此處描述的本發(fā)明允許改變和變更為并非僅限于那些具體描述。應(yīng)明曉本發(fā)明包括所有此類改變和變更。本發(fā)明也包括在本發(fā)明書中單獨(dú)或總起來(lái)提及或指出的所有步驟、特征、組成和化合物，并包括任何或全部的組合或任何兩個(gè)或更多的所述步驟、特征、組成和化合物。
本發(fā)明并非限定在此處描述的特定實(shí)施方案的范圍之內(nèi)，所述實(shí)施方案僅意在用于例證的目的。功能等同產(chǎn)物、組成和方法也明確包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，如此處所描述的。
本說(shuō)明書中任何現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的參考僅用于進(jìn)一步描述本發(fā)明的目的，且不應(yīng)作為這樣的指示或認(rèn)可，即該文獻(xiàn)構(gòu)成了在澳大利亞或其他地區(qū)的技術(shù)人員公知常識(shí)的一部分。
此處應(yīng)用的單詞″from″或″of″，和術(shù)語(yǔ)″derived from″應(yīng)理解為可從特定來(lái)源、生物體、組織、器管或細(xì)胞中獲得的特定產(chǎn)物，特別是分子，例如多肽、蛋白質(zhì)、基因或核酸分子、抗體分子、Ig片段或其他分子或包含所述分子的生物樣本，但所述特定產(chǎn)物并非必須是從該來(lái)源、生物體、組織、器管或細(xì)胞中直接獲得。
此處應(yīng)用的″癌癥″意指任何一種或多種廣泛的良性或惡性腫瘤，包括那些能夠在人或非人哺乳動(dòng)物身體或身體一部分中浸潤(rùn)生長(zhǎng)并轉(zhuǎn)移的腫瘤，例如通過(guò)淋巴系統(tǒng)和/或通過(guò)血流進(jìn)行浸潤(rùn)生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。如此處所應(yīng)用，″腫瘤″包括良性和惡性的腫瘤和實(shí)體生長(zhǎng)物，盡管本發(fā)明特別針對(duì)惡性腫瘤和實(shí)體癌癥的診斷和檢測(cè)。典型的癌癥包括但不限于癌、淋巴瘤或肉瘤，例如卵巢癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、尿道癌、子宮癌、急性淋巴性白血病、何杰金病、黑素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和軟組織肉瘤。
如此處所描述和由權(quán)利要求所定義的本發(fā)明上下文中，術(shù)語(yǔ)″癌標(biāo)記物″應(yīng)意指可在來(lái)自人和非人哺乳動(dòng)物受試者的生物樣本中可檢測(cè)到的且其為受試者中癌癥征兆的任一分子，所述生物樣本如體液(血液、尿液、粘液、唾液、汗液、淚液或其他液體分泌物)，所述分子特別是指與健康受試者體液中的水平相比在受試者體液中其水平降低的分子。術(shù)語(yǔ)″癌標(biāo)記物″也應(yīng)包括由正常細(xì)胞或在正常細(xì)胞上表達(dá)但不在癌細(xì)胞上表達(dá)的分子，或與正常細(xì)胞相比由癌細(xì)胞或在癌細(xì)胞上的表達(dá)降低了的分子。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)″帶負(fù)電荷的分子″與術(shù)語(yǔ)″帶負(fù)電荷的含糖分子″或″含糖的分子″互換使用，這些術(shù)語(yǔ)指質(zhì)荷比約為991的本發(fā)明的癌標(biāo)記物，無(wú)論該標(biāo)記物事實(shí)上是否含有糖作為分子的一部分。這些術(shù)語(yǔ)也包括分子衍生物在其范圍內(nèi)，例如包含磷酸酯或硫酸酯的衍生物。
當(dāng)分子包含糖時(shí)，其優(yōu)選地包含單糖、二糖或寡糖(即至少為三個(gè)且不多于約九個(gè)單糖單位)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A為以水為洗脫液從C18固相Seppak cartridge柱洗脫的未被處理的大鼠血清級(jí)分的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜圖的圖示。x軸表示質(zhì)荷比(m/z)，且縱坐標(biāo)指與最高豐度分子的豐度相比每一分子的相對(duì)百分比豐度。每一峰頂端的數(shù)值指該峰的質(zhì)荷比。箭頭標(biāo)示出顯著負(fù)離子(m/z 991)的位置，其在患腺癌的受試大鼠中降低(圖1B)。
圖1B為以水為洗脫液從C18固相Seppak cartridge柱洗脫的荷瘤大鼠的血清級(jí)分的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜圖的圖示。在皮下注射具高度惡性和轉(zhuǎn)移性的大鼠乳腺腺癌13762 MAT(106個(gè)細(xì)胞/大鼠)13天后對(duì)荷瘤大鼠進(jìn)行試驗(yàn)。x軸表示質(zhì)荷比(m/z)，且縱坐標(biāo)指與最高豐度分子的豐度相比每一分子的相對(duì)百分比豐度。每一峰頂端的數(shù)值指該峰的質(zhì)荷比。箭頭標(biāo)示出負(fù)離子(m/z 991)的位置，其在未被處理的大鼠質(zhì)譜圖中是顯著的(圖1A)。
圖2A以甲醇為洗脫液從C18固相Seppak cartridge柱洗脫的正常未被處理小鼠的血清級(jí)分的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜圖的圖示。x軸表示質(zhì)荷比(m/z)，且縱坐標(biāo)指與最高豐度分子的豐度相比每一分子的相對(duì)百分比豐度。每一峰頂端的數(shù)值指該峰的質(zhì)荷比。箭頭標(biāo)示出顯著負(fù)離子(m/z 991)的位置，其在荷瘤小鼠中降低(圖2B)。
圖2B為以甲醇為洗脫液從C18固相Seppak cartridge柱洗脫的荷瘤小鼠的血清級(jí)分的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜圖的圖示。在皮下注射具高度惡性和轉(zhuǎn)移性的B16F1黑素瘤(106個(gè)細(xì)胞/小鼠)15天后對(duì)荷瘤小鼠進(jìn)行試驗(yàn)。x軸表示質(zhì)荷比(m/z)，且縱坐標(biāo)指與最高豐度分子的豐度相比每一分子的相對(duì)百分比豐度。每一峰頂端的數(shù)值指該峰的質(zhì)荷比。箭頭標(biāo)示出負(fù)離子(m/z 991)的位置，其在未被處理的小鼠質(zhì)譜圖中是顯著的(圖2A)。
圖3A以水為洗脫液從C18固相Seppak cartridge柱洗脫的正常未被處理的人的血清級(jí)分的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜圖的圖示。x軸表示質(zhì)荷比(m/z)，且縱坐標(biāo)指與最高豐度分子的豐度相比每一分子種類的相對(duì)百分比豐度。每一峰頂端的數(shù)值指該峰的質(zhì)荷比。箭頭標(biāo)示出顯著負(fù)離子(m/z 991)的位置，其在結(jié)腸癌患者中降低(圖3B)。
圖3B為以水為洗脫液從C18固相Seppak cartridge柱洗脫的結(jié)腸癌患者的血漿級(jí)分的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜圖的圖示。x軸表示質(zhì)荷比(m/z)，且縱坐標(biāo)指與最高豐度分子的豐度相比每一分子種類的相對(duì)百分比豐度。每一峰頂端的數(shù)值指該峰的質(zhì)荷比。箭頭標(biāo)示出負(fù)離子(m/z 991)的位置，其在正常未被處理的人類受試者的質(zhì)譜圖中是顯著的(圖3A)。
圖4A為正常未處理小鼠血清的負(fù)離子(m/z 991)片段(圖1A)的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜圖的圖示，該片段通過(guò)應(yīng)用基于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜的源后衰變(postsource decay)斷裂而獲得。x軸表示質(zhì)荷比(m/z)，且縱坐標(biāo)表示每一片段的豐度。每一峰頂端的數(shù)值指該峰的質(zhì)荷比。主要片段的質(zhì)荷比，圖中從左到右為241、644、705、749和947。完整的m/z 991負(fù)離子的位置也在圖譜的最右端標(biāo)出。m/z 241離子片段與磷酸己糖部分(例如磷酸肌醇)或與硫酸己糖一致。
圖4B為正常未處理大鼠血清的負(fù)離子(m/z 991)片段(圖2A)的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜圖的圖示，該片段通過(guò)應(yīng)用基于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜的源后衰變斷裂而獲得。x軸表示質(zhì)荷比(m/z)，且縱坐標(biāo)表示每一片段的豐度。每一峰頂端的數(shù)值指該峰的質(zhì)荷比。主要片段的質(zhì)荷比，圖中從左到右為241、644、705、749和947。完整的m/z 991負(fù)離子的位置也在圖譜的最右端標(biāo)出。m/z 241離子片段與磷酸己糖部分(例如磷酸肌醇)或與硫酸己糖一致。高本底最可能是樣本中存在少量的完整m/z 991負(fù)離子的結(jié)果。
圖4C為健康人血清的負(fù)離子(m/z 991)片段(圖3A)的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜圖的圖示，該片段通過(guò)基于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜的源后衰變斷裂而獲得。x軸表示質(zhì)荷比(m/z)，且縱坐標(biāo)表示每一片段的豐度。每一峰頂端的數(shù)值指該峰的質(zhì)荷比。主要片段的質(zhì)荷比，圖中從左到右為241、644、705、749和947。完整的m/z 991負(fù)離子的位置也在圖譜的最右端標(biāo)出。m/z 241離子片段與磷酸己糖部分(例如磷酸肌醇)或與硫酸己糖一致。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的一個(gè)方面提供了包含質(zhì)荷比約為991的帶負(fù)電荷分子的一種癌標(biāo)記物，與健康受試者相比該標(biāo)記物在癌癥受試者中的存在水平降低，或提供了該帶負(fù)電荷分子的衍生物。
優(yōu)選地，本發(fā)明的帶負(fù)電荷分子以分離的形式提供。″分離的″是指例如在此處定義的條件下通過(guò)質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定基本不含同種的糖脂、二糖、單糖或寡糖。由于MALDI-TOF MS的高分辨率，技術(shù)人員將會(huì)理解，m/z 991離子的源后電離片段的質(zhì)譜圖對(duì)應(yīng)于該分子的″指紋″。
優(yōu)選地，當(dāng)存在糖時(shí)，其包含磷酸己糖或硫酸己糖。在此方面，源后衰變斷裂數(shù)據(jù)顯示，分離的帶負(fù)電荷分子產(chǎn)生通過(guò)MALDI-TOF MS估計(jì)其質(zhì)荷比約為241的片段，所述片段為磷酸己糖的特征，其中所述磷酸己糖例如磷脂酰肌醇(即肌醇-1，2環(huán)磷酸)。
甚至更優(yōu)選地，糖部分包含糖基磷脂酰肌醇(GPI)。
更優(yōu)選地，含糖的分子包含含有至少一個(gè)磷酸己糖、磷脂酰肌醇或GPI單位的二糖或寡糖部分。
同樣在本上下文中，術(shù)語(yǔ)″含帶負(fù)電荷的糖的分子″或以上提出的其可替換術(shù)語(yǔ)，應(yīng)意指含糖的分子具有足夠的親水性以使其不能與疏水基質(zhì)，特別是C-18基質(zhì)牢固結(jié)合，且優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)磷或硫原子。在此方面，應(yīng)用質(zhì)譜，特別是基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)對(duì)本發(fā)明的癌標(biāo)記物進(jìn)行電離，表明本發(fā)明分離的癌標(biāo)記物為帶負(fù)電荷的離子。因此，術(shù)語(yǔ)″含帶負(fù)電荷的糖的分子″包括磷脂、磷酸甘油酯、含磷酸酯的N-連接糖蛋白、含磷酸酯的O-連接糖蛋白、含磷脂酰肌醇的脂類或蛋白質(zhì)或含糖基磷脂酰肌醇(GPI)的脂類或蛋白質(zhì)。
此處描述的癌標(biāo)記物已根據(jù)其特性的選擇對(duì)其進(jìn)行了分析，且認(rèn)為該癌標(biāo)記物的糖部分可在原位與其他功能基團(tuán)連接。例如單糖、二糖或寡糖部分可原位與蛋白質(zhì)部分(例如氨基酸、肽或多肽)進(jìn)行O連接或N連接以形成糖肽/糖蛋白，備選地或另外地，可原位與脂類部分連接，例如脂肪酸(棕櫚酸和/或油酸和/或肉豆蔻酸和/或花生四烯酸，或其他)；三?；视?；磷脂；磷酸甘油酯(例如磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油或磷脂酰乙醇胺，或其他)；鞘脂類；鞘氨醇或膽固醇激素。所有此類變體可在此處描述的上下文中用作癌標(biāo)記物。相應(yīng)地，本發(fā)明明確地包括糖部分的肽類或脂類變體，此類變體的唯一要求是包含m/z 991離子。
更為優(yōu)選地，癌標(biāo)記物包含糖脂，且甚至更優(yōu)選地，包含磷脂酰肌醇和選自肉豆蔻酸、棕櫚酸和油酸的一種或多種脂肪酸的糖脂。應(yīng)用本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員公知的一種或多種技術(shù)可對(duì)此處描述的癌標(biāo)記物的脂類部分的結(jié)構(gòu)進(jìn)行闡明，而無(wú)需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所述技術(shù)特別是快原子轟擊(FAB)、碰撞活化解離(CAD)、串聯(lián)質(zhì)譜(基本上如Ladisch等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)264，12097-12105，1989中所描述的)或P-NMR技術(shù)，以及其他。
本發(fā)明的該實(shí)施方案明確包括該糖脂的衍生物，例如包含一個(gè)或多個(gè)熒光配基、酶配基、放射配基、肽配基(例如FLAG)或抗體配基的衍生物，其中所述配基共價(jià)連接到m/z 991離子以便于檢測(cè)。
在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，癌標(biāo)記物包含二肉豆蔻酰-磷脂酰肌醇(即二肉豆蔻酰-PI)，任選地用額外的脂肪酸如棕櫚酸或油酸進(jìn)行?；?。本發(fā)明的含糖的癌標(biāo)記物的特征與完整分子進(jìn)行MALDI-TOF MS時(shí)的m/z991離子值一致并與源后斷裂分析中m/z 241峰的出現(xiàn)一致。本發(fā)明的該實(shí)施方案明確包括該糖脂的衍生物，例如包含一個(gè)或多個(gè)熒光配基、酶配基、放射配基、肽配基(例如FLAG)或抗體配基的衍生物，其中所述配基與糖脂其價(jià)連接以便于檢測(cè)。
可通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)公知的任何方法測(cè)定本發(fā)明的含糖分子的分子質(zhì)量和/或質(zhì)荷比或其他物理特性，所述方法包括凝膠過(guò)濾、凝膠電泳、毛細(xì)管電泳、質(zhì)譜、HPLC、FPLC，或由組成或結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)化合物的分子質(zhì)量。優(yōu)選地，通過(guò)質(zhì)譜包括MALDI-TOFMS、串聯(lián)MS、電噴霧MS等測(cè)定質(zhì)荷比。
此處提及的質(zhì)荷比或m/z比″約″為一個(gè)特定的值，本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員應(yīng)理解為包括可接受的差異而無(wú)需進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行定義。優(yōu)選地，此處例舉的由樣本質(zhì)譜測(cè)定所估計(jì)的m/z比包括m/z±5的允許誤差，更優(yōu)選地為m/z±4，，更優(yōu)選地為m/z±3，更優(yōu)選地為m/z±2，且甚至更優(yōu)選地為m/z±1。相應(yīng)地，應(yīng)當(dāng)理解，估計(jì)約991的m/z比所包括的m/z比在986-996的范圍內(nèi)，優(yōu)選地在987-995的范圍內(nèi)，更優(yōu)選地在988-994的范圍內(nèi)，更優(yōu)選地在989-993的范圍內(nèi)，且更優(yōu)選地在990-992的范圍內(nèi)，或甚至為991。
如此處所應(yīng)用，″衍生物″應(yīng)意指由此處描述的m/z比約為991的含糖的親本分子所產(chǎn)生的任何分子。
本發(fā)明的衍生物因此包括本發(fā)明的含糖分子的任何及全部的片段，以及包括其作為癌標(biāo)記物的用途，唯一必需的條件是所述片段保留親本分子有關(guān)癌檢測(cè)試驗(yàn)的特異性。此處提供的公開(特別是在圖4A、4B和4C中)中顯而易見的是，本發(fā)明的含糖的分子在后源電離后產(chǎn)生特異的″指紋″，并產(chǎn)生m/z約241、約644、約705、約749和947的片段。樣本中高本底的單糖或磷酸肌醇可掩蓋一個(gè)或多個(gè)特征片段峰。在此情況下，領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，兩個(gè)片段、優(yōu)選地三個(gè)片段、更優(yōu)選地四個(gè)片段且更優(yōu)選地所有五個(gè)片段的存在可用作具有親本分子特異性的癌標(biāo)記物。
含糖的負(fù)電荷分子的優(yōu)選衍生物包括，例如，通過(guò)在糖生物學(xué)中為技術(shù)人員所公知的標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生的該分子糖部分的片段。由于此類分析通常依賴于化學(xué)修飾以便于對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，本發(fā)明因此也包括本發(fā)明的m/z 991癌標(biāo)記物的任何化學(xué)修飾片段，所述修飾片段通過(guò)泛甲基化法(permethylation)、高碘酸氧化法、NaBH4還原法、還原氨化(例如應(yīng)用2-氨基吡啶)或與全氟芐基氨基苯甲酸酯或烷基-氨基苯甲酸酯孵育或其他方法實(shí)現(xiàn)。衍生物進(jìn)一步包括由前述方法的組合所產(chǎn)生的任何含糖的分子。
本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到用于測(cè)定所述癌標(biāo)記物的糖部分精確結(jié)構(gòu)的幾種公知的方法，其中可產(chǎn)生衍生物(例如酶消化或指紋圖譜技術(shù)、質(zhì)譜、串聯(lián)質(zhì)譜、高壓液相色譜(HPLC)-質(zhì)譜、分子模建、凝集素親和層析(特別是與高效液相親和層析聯(lián)合，以下稱為″凝集素-HPLAC″)、反相法、大小排阻法等)。
為提供單糖殘基的數(shù)目或類型或確定N-乙酰半乳糖胺或O-聚糖的存在，例如通過(guò)酸水解或甲醇分解從而分別作為還原糖或甲基糖苷將單糖釋放來(lái)測(cè)定全部糖組份。然后應(yīng)用氣相色譜(GC)和/或液相色譜在低或高壓下分辨并定量所釋放的單糖。應(yīng)用GC，且任選地用液相色譜時(shí)，單糖通常被衍生化，例如通過(guò)泛甲基化作用。也可應(yīng)用具脈沖電流測(cè)定的高pH陰離子交換層析(HPAEC/PAD)，基本上如由Hardy，酶學(xué)方法(MethodsEnzymol.)179，76-82，1989中所描述的進(jìn)行。
為闡明糖蛋白的糖部分，必須釋放出較小的糖單位(單糖、二糖、寡糖)，例如應(yīng)用化學(xué)和/或酶學(xué)方法。酶消化法包括與有效量的肽N-糖苷酶F(EC 3.2.2.18)或其他內(nèi)切糖苷酶或N-聚糖酶(參見Takahashi，N.和Muramatsu，T編輯(1992)內(nèi)切糖苷酶和N-聚糖酶的CRC手冊(cè)(CRCHandbook of Endoglycosidase and Glycoamidases)，CRC出版社，Inc.，Boca Raton，F(xiàn)L)或內(nèi)切-β-N-乙酰葡糖苷酶(EC 3.2.1.96)或如Endo H或Endo F(參見Maley，F(xiàn).等，Anal.Biochem.180，195-204，1989)的糖苷酶孵育以進(jìn)行釋放。化學(xué)法包括在足以達(dá)到糖釋放的條件和時(shí)間下與無(wú)水聯(lián)氨或強(qiáng)堿及還原劑孵育，所述還原劑任選地為NaBH4。
所釋放糖的結(jié)構(gòu)例如通過(guò)應(yīng)用外切糖苷酶的順序消化、區(qū)域?qū)Ｒ坏幕瘜W(xué)降解、甲基化分析(GC-MS)、FAB-MS和/或強(qiáng)磁場(chǎng)質(zhì)子(high-fieldproton)和多維NMR法實(shí)現(xiàn)。為提高產(chǎn)生的含糖片段的分辨率，用發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)或放射性化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行衍生化。也可應(yīng)用脈沖電流計(jì)(PAD)以提高非衍生化糖的分辨率。
光譜測(cè)定技術(shù)如質(zhì)譜、高壓液相色譜(HPLC)或組合技術(shù)如串聯(lián)質(zhì)譜、高壓液相色譜(HPLC)-質(zhì)譜為優(yōu)選的用于分離含糖分子的復(fù)雜混合物的技術(shù)。可從文獻(xiàn)中獲得極好的綜述(參見，例如Honda，生物化學(xué)年鑒(Anal.Biochem.)140，1-47，1984；Townsend.(1993)生物技術(shù)中的色譜(Chromatography in Biotechnology)ACS論壇系列529(Horva′th，C.和Ettre，L.S.編輯.)美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)，Washington，D.C；Scott(1992)應(yīng)用HPLC進(jìn)行食物分析(Food Analysis by HPLC)(L.M.L.Nollet，編輯)，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.)；以及Lee，生物化學(xué)年鑒(Anal.Biochem.)179，404-412，1990)。
例如，應(yīng)用結(jié)合胺的二氧化硅基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)相HPLC可用于解析非衍生化的糖和放射標(biāo)記的糖醇(Mellis和Baenziger，Anal.Biochem.114，276-280，1981)。應(yīng)用ODS-二氧化硅的反相方法有利于解析衍生化的糖(Tomiya等，生物化學(xué)年鑒(Anal.Biochem.)163，489-499，1987)。如應(yīng)用DEAE(Pharmacia)或Mono-Q(Pharmacia)的陰離子交換法可用于解析唾液酸化、磷酸化或硫酸化的糖(Watson和Bhide，液相色譜/氣相色譜(Liq.Chrom/Gas Chrom.)11，216-220，1993)。應(yīng)用高pH下的強(qiáng)陰離子交換劑(例如Dionex或CarboPac)的高壓陰離子交換色譜法也可用于此方面(Townsend和Hardy，糖生物學(xué)(Glycobiol.)1，139-147，1991)。
應(yīng)用一系列固定的凝集素配基的系列凝集素親和層析法，特別是與HPLAC聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，可用于解析多種糖，例如半乳糖、巖藻糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、甘露糖、葡萄糖或N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)(參見Cummings等，細(xì)胞生物學(xué)方法(Methods Cell Biol.)32，141-183，1989；和Virgilio(1998)凝集素，生物學(xué)，生物化學(xué)，臨床生物化學(xué)(Lectins，Biology，Biochemistry，Clinical Biochemistry)，12卷，其中包括來(lái)自第17屆國(guó)際凝集素會(huì)議的進(jìn)展，Wurzburg，1997(van Driessche，E.，Beeckmans，S.，和Bog-Hansen，T.，編輯)，Textop出版社，Hellerup，丹麥(ISBN87-984583-0-2)。凝集素的示例包括直生刀豆(Canavalia ensiformis)的伴刀豆球蛋白A(ConA)、半乳糖凝集素-1(galectin-1)、美國(guó)商陸(Phytolacca americana)的商陸有絲分裂原(PWM)、美國(guó)商陸(P.americana)Pa-2和來(lái)自以下的任何一種或多種凝集素二孢蘑菇(Agaricus bisporus)(ABA-I)、橙黃網(wǎng)孢盤菌(Aleuria aurantia)(AAA)、獨(dú)角仙(Allomyrina dichotoma)(Allo A-1/11)、落花生(Arachis hypogea)(PNA)、紫羊蹄甲(Bauhinia purpura)(BPA)、曼陀羅(Datura stramonium)(DSA)、雙花豆(Dolichos biflorus)(DBA)、雞冠刺桐(Erythrinacristagalli)(EcIA)、龍芽菜(Erythrina corallodendron)(EcoA)、刺酮(Erythrinia variegata)(EVA)、雪花蓮(Galanthus nivalis)(GNA)、柴胡(Griffonia simplicifolia)(I A4或GSA-A4；I B4或GSA-B4；II或GSA-II)、兵豆(Lens culinaris)(LCA)、翅莢豌豆(Lotustetragonolobus)(LTA)、番茄(Lycopersicon esculentum)(LEA)、朝鮮槐(Maakia amurensis)(MAA)、稻(Oryza sativa)(OSA)、菜豆(Phaseolusvulgaris)(紅細(xì)胞凝集素或E-PHA；白細(xì)胞凝集素或L-PHA)、豌豆(Pisumsativum)(PSA)、蓖麻(Ricinus communis)(RCA-I，RCA-II)、西洋接骨木(Sambucus nigra)(SNA)、槐樹(Sophora japonica)(SJA)、普通小麥(Triticum vulgaris)的小麥胚芽(WGA)、荊豆(Ulex europeaus)(UEA-I)、蠶豆(Vicia faba)(VFA)、Vicia graminea(VGA)、柔毛野豌豆(ViciaVillosa)(VVB4)或多花紫藤(Wisteria floribunda)(WFA)。
備選地，或另外地，高壓陰離子交換色譜法如HPAEC/PAD用于分離含糖的復(fù)雜混合物，特別是用于本發(fā)明的含糖的陰離子分子或其含磷酸酯或含硫酸酯的片段。
備選地，或另外地，大小排阻色譜法(Kobataet等，酶學(xué)方法(MethodsEnzymol.)138，84-94，1987；Oxford GlycoSystem′s GlycoMap 1000)用于片段的分辨，片段的分離基于片段的大小。
本發(fā)明人也顯示了反相HPLC(RP-HPLC)可用于將本發(fā)明的癌標(biāo)記物與其他更疏水的分子區(qū)分開來(lái)，所述更疏水分子如疏水的神經(jīng)節(jié)苷脂和神經(jīng)酰胺。這是由于糖部分是親水的。盡管如此，RP-HPLC用于分辨糖部分的片段，特別是當(dāng)它們例如通過(guò)應(yīng)用2-氨基吡啶進(jìn)行還原性氨化的化學(xué)衍生而導(dǎo)入一疏水的發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)時(shí)。用2-氨基吡啶標(biāo)記的糖易于進(jìn)行作圖，基本上如Tomiya等，生物化學(xué)年鑒(Anal.Biochem.)171，73-90，1988描述的。
電泳方法例如紙電泳、毛細(xì)管電泳以及優(yōu)選地應(yīng)用高比例聚丙烯酰胺膠片的凝膠電泳用于分離含糖片段的熒光衍生物(例如熒光團(tuán)輔助的糖電泳(FACE)，Millipore)。
質(zhì)譜(MS)或串聯(lián)MS(例如MS/MS、MALD-TOF/電噴霧MS、電噴霧MS/MALDI-TOF、MALDI-TOF/源后MALDI-TOF等)的應(yīng)用對(duì)于解析含糖的片段是特別優(yōu)選的，特別是當(dāng)它們與NMR、化學(xué)法、外切糖苷酶降解聯(lián)合應(yīng)用來(lái)測(cè)定包括任何被解析的單糖、二糖或寡糖的含糖片段的特性、連接部位和端基異構(gòu)(anomericity)時(shí)。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到質(zhì)譜是用于精確確定分子量、鑒定化學(xué)結(jié)構(gòu)、確定混合物組成以及定性元素分析的一種分析技術(shù)。在實(shí)施中，質(zhì)譜產(chǎn)生所研究樣本分子的離子，根據(jù)它們的質(zhì)荷比分離這些離子，并測(cè)定每一離子的相對(duì)豐度。優(yōu)選地，質(zhì)譜系統(tǒng)應(yīng)用MALDI-TOF MS或電噴霧MS或源后斷裂法。進(jìn)行質(zhì)譜分析的一般步驟如下(i)從樣本中產(chǎn)生氣相離子；(ii)基于離子的質(zhì)荷比在空間或時(shí)間上分離它們；以及(iii)測(cè)定每一所選擇的質(zhì)荷比的離子的數(shù)量。
飛行時(shí)間(TOF)質(zhì)譜，如在USSN 5,045,694和USSN 5,160,840中所描述的TOF質(zhì)譜，產(chǎn)生所研究樣本材料的離子，并通過(guò)測(cè)定所產(chǎn)生的離子行至檢測(cè)器所需的時(shí)間，根據(jù)質(zhì)荷比分離這些離子。TOF質(zhì)譜由于其相對(duì)簡(jiǎn)單、設(shè)備價(jià)廉且實(shí)際上具有不受限的質(zhì)荷比范圍而存在優(yōu)勢(shì)。TOF質(zhì)譜與掃描儀器相比具有潛在的更高的敏感性，這是由于其能夠記錄每次電離產(chǎn)生的所有離子。TOF質(zhì)譜在測(cè)定大的有機(jī)分子的質(zhì)荷比時(shí)特別有用，而常規(guī)磁場(chǎng)質(zhì)譜對(duì)此缺乏敏感性。由特定電位加速的離子的飛行時(shí)間與其質(zhì)荷比成正比。因此離子的飛行時(shí)間是其質(zhì)荷比的函數(shù)，并大約與質(zhì)荷比的平方根成正比。如果僅存在單一的帶電荷離子，最輕的離子最先到達(dá)檢測(cè)器，隨后質(zhì)量較重的基團(tuán)順序到達(dá)。TOF質(zhì)譜因此提供了對(duì)所研究分子的質(zhì)荷比極為精確的估計(jì)，且誤差一般不大于m/z±5，所述誤差主要是由于相同質(zhì)量和電荷的離子沒有恰好同時(shí)到達(dá)檢測(cè)器。該誤差的發(fā)生主要是由于所產(chǎn)生離子的初始時(shí)間、空間和動(dòng)能分布導(dǎo)致質(zhì)譜峰加寬，因此限制了TOF質(zhì)譜儀的分辨力。初始時(shí)間分布產(chǎn)生于離子形成時(shí)間的不確定性。離子形成時(shí)間的確定性通過(guò)脈沖電離技術(shù)得以加強(qiáng)，所述技術(shù)例如等離子解吸和激光解吸，它們?cè)诜浅６痰臅r(shí)間內(nèi)產(chǎn)生離子并導(dǎo)致最小的初始空間分布，這是由于離子從樣本表面充分定義的區(qū)域產(chǎn)生，因此離子形成的初始空間不確定性可以忽略不計(jì)。脈沖電離如等離子解吸(PD)電離和激光解吸(LD)電離產(chǎn)生具有最小空間和時(shí)間不確定性但相對(duì)寬的初始能量分布的離子。因?yàn)殚L(zhǎng)脈沖長(zhǎng)度可嚴(yán)重限制質(zhì)量分辨率，常規(guī)LD一般使用足夠短的脈沖(經(jīng)常小于10毫微秒)以將時(shí)間不確定性降至最小。通過(guò)在激光波長(zhǎng)處將小的有機(jī)基質(zhì)分子加到高吸附性的樣本材料中可提高LD的性能(即基質(zhì)輔助激光解吸/電離，以下稱為″MALDI″)?；|(zhì)促進(jìn)樣本的解吸和電離。MALDI促進(jìn)分子量超過(guò)100,000Da的生物大分子的解吸和電離而不會(huì)將其分裂，因此特別適用于生物應(yīng)用。用于實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選基質(zhì)包含2-(4-羥基苯偶氮基)苯甲酸(HABA)，也稱作4-羥基苯-2-羧酸。在MALDI中，樣本通常放置在光滑金屬表面上并由于脈沖激光束對(duì)樣本表面的撞擊而使樣本解吸到氣相中。這樣，在與激光脈沖持續(xù)時(shí)間基本對(duì)應(yīng)的短時(shí)間間隔內(nèi)，以及在與吸收足夠的激光能量而蒸發(fā)的固體基質(zhì)和樣本部分對(duì)應(yīng)的很小空間區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生離子。MALDI提供了用于飛行時(shí)間(TOF)質(zhì)譜的近乎理想的離子源，當(dāng)初始離子速度很小時(shí)更是如此。在MALDI離子源中使用脈沖離子引出可獲得質(zhì)量分辨率的顯著改進(jìn)。也已知離子反射器(也稱作離子鏡和反射器(reflectron)，由一個(gè)或多個(gè)均一、減速的靜電場(chǎng)組成)可補(bǔ)償分析物離子初始動(dòng)能分布的影響，特別是當(dāng)其放置在自由飛行區(qū)域末端時(shí)。有關(guān)表面離子產(chǎn)生的對(duì)MALDI的其它改進(jìn)在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的，所述改進(jìn)通過(guò)提高分辨率、改進(jìn)質(zhì)量精確度、提高信號(hào)強(qiáng)度以及減少背景噪音實(shí)現(xiàn)，如在USSN 6,057,543中所描述的改進(jìn)。
應(yīng)用電噴霧MS或電噴霧電離MS用于從液體樣本基質(zhì)中產(chǎn)生氣相離子，以允許將樣本導(dǎo)入質(zhì)譜儀。因此電噴霧MS用于提供液相色譜和質(zhì)譜儀間的接口。在電噴霧MS中，通過(guò)毛細(xì)管(下文中稱為″針″)泵入，且在針尖和對(duì)面墻、毛細(xì)入口或類似結(jié)構(gòu)間建立電位差(例如三到四千伏)。從針尖發(fā)出的液流通過(guò)電場(chǎng)擴(kuò)散成高度帶電的小滴，形成電噴霧。也可通過(guò)周圍的毛細(xì)管導(dǎo)入惰性干燥氣體(例如干燥的氮?dú)?以提高液流的噴霧作用。電噴霧小滴在電場(chǎng)中傳送并注射入維持在高真空狀態(tài)的質(zhì)譜儀。通過(guò)干燥氣體和真空的聯(lián)合作用，小滴中的攜帶液體逐漸蒸發(fā)，導(dǎo)致產(chǎn)生更小的、愈加不穩(wěn)定的小滴，表面離子從小滴中釋放到真空中用于分析。溶解的離子通過(guò)樣本錐和分離器透鏡，并在RT透鏡聚焦后，進(jìn)入質(zhì)譜儀的高真空區(qū)域，在此區(qū)域根據(jù)質(zhì)量將離子分開并用適宜的檢測(cè)器(例如光電倍增管)進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)溶劑組成，使用的優(yōu)選液流速度為20-30微升/分鐘。更高的液流速度可導(dǎo)致溶解的樣本離子化的不穩(wěn)定和低效率，在此情況下可應(yīng)用氣動(dòng)輔助電噴霧針。
用于將其導(dǎo)入MS環(huán)境的樣本制備通常包括脫鹽，基本如在實(shí)施例1中所描述的，優(yōu)選地為在分析前應(yīng)用至少一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的色譜分離或純化步驟而進(jìn)行的額外分級(jí)分離(例如，應(yīng)用反相技術(shù))。例如，通過(guò)順序的高碘酸鹽氧化、NaBD4還原和泛甲基化(Nilsson，1993，生物藥物中的糖蛋白分析(Glycoprotein Analysis in Biomedicine)(E.F.Hounsell，編輯)Humana出版社，Totowa，NJ，35-46頁(yè))或用全氟芐基氨基苯甲酸酯對(duì)含糖的片段進(jìn)行衍生化或用烷基氨基苯甲酸酯對(duì)片段進(jìn)行還原性末端修飾以增強(qiáng)其表面活性，可提高該方法的靈敏性和/或分辨能力。當(dāng)應(yīng)用MALDI-TOF MS時(shí)，樣本與適宜的基質(zhì)混合并干燥，而當(dāng)應(yīng)用電噴霧MS時(shí)，樣本將在適宜的載體溶液中以液體樣本形式進(jìn)行直接注射。
此外，此處描述的癌標(biāo)記物或其片段的衍生物也應(yīng)包括通過(guò)將一種或多種熒光配基、發(fā)色團(tuán)、酶配基、放射性配基、肽配基(例如FLAG)或抗體配基加入到該分子的糖部分而產(chǎn)生的含糖的任何分子。用于將此類配基加入到糖的方法在領(lǐng)域內(nèi)公知。
用于分析糖和糖聚合物的方法以及可由其產(chǎn)生的衍生物的類型的進(jìn)一步綜述參見Hounsell，Adv.Carbohydr.Chem.Biochem.，50，311-350，1994；Hounsell，(1997)糖科學(xué)現(xiàn)狀和展望(GlycoscienceStatus andPerspectives)(H.J.Gabius和S.Gabius，編輯)，Chapman和Hall.15-29頁(yè)；以及Hounsell(1997)編輯，分子生物學(xué)中的糖科學(xué)方法(Glycoscience Protocols Methods in Molecular Biology)，Humana出版社。
不被任何理論或作用方式所限制，本發(fā)明的含糖的分子也可能依賴免疫系統(tǒng)，由此需要激活的或功能性免疫系統(tǒng)的存在以用于分子的表達(dá)，和/或該分子在健康受試者中分泌到循環(huán)和其他體液中。因此腫瘤發(fā)生使其表達(dá)和/或分泌減少和/或使其從細(xì)胞上脫落，其中在腫瘤發(fā)生期間例如在轉(zhuǎn)移之前該分子在細(xì)胞上正常產(chǎn)生。
由本發(fā)明人確定的該m/z 991離子癌標(biāo)記物，特別是對(duì)其在正常和癌細(xì)胞上表達(dá)特征的闡明，以及用于對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)的測(cè)試系統(tǒng)的制定，促進(jìn)了多種用于人和非人哺乳動(dòng)物受試者的癌診斷方法的產(chǎn)生。
因此，本發(fā)明的另一方面提供了在人和非人哺乳動(dòng)物受試者中診斷或檢測(cè)癌癥的一種方法，其包括(i)測(cè)定疑患癌癥的受試者的測(cè)試樣本中癌標(biāo)記物的水平，其中所述癌標(biāo)記物包含質(zhì)荷比約991的帶負(fù)電荷分子或其衍生物；以及(ii)將(i)的癌標(biāo)記物或衍生物水平與健康受試者的對(duì)照樣本的癌標(biāo)記物或衍生物水平進(jìn)行比較，其中與健康受試者中的水平相比該癌標(biāo)記物或衍生物水平的降低作為癌癥的征兆。
但是，如果先前已建立了對(duì)照的健康受試者范圍，可不必應(yīng)用對(duì)照樣本，這樣測(cè)試樣本中進(jìn)行的測(cè)量可與對(duì)照范圍進(jìn)行比較。此外，可應(yīng)用內(nèi)部樣本對(duì)照以評(píng)估癌標(biāo)記物水平降低的程度。例如，可選擇測(cè)試樣本中的另一分子(即另一標(biāo)記物)用以計(jì)算比率，其中所述該另一標(biāo)記物在測(cè)試樣本和對(duì)照樣本中的水平穩(wěn)定，其中癌標(biāo)記物與該另一標(biāo)記物比率的變化作為癌癥的征兆。備選地，測(cè)試樣本可″釘入″適宜的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記物，以提供內(nèi)標(biāo)。已有多種此類標(biāo)記物存在，或可容易地由質(zhì)譜領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員進(jìn)行制備。
任何本領(lǐng)域內(nèi)認(rèn)知的方法，例如免疫檢測(cè)、色譜法(疏水作用色譜法、高壓液相色譜法、反相色譜法或凝集素親和層析等)可用來(lái)測(cè)試受試者中癌標(biāo)記物的水平并與健康受試者的水平進(jìn)行比較。優(yōu)選地，盡管并非必須，質(zhì)譜用于診斷。用于檢測(cè)或測(cè)定本發(fā)明的含糖分子或其片段的那些方法在本說(shuō)明書上文中概括描述。
本發(fā)明特別針對(duì)于神經(jīng)外胚層來(lái)源的癌癥的診斷，所述癌癥優(yōu)選地選自癌、淋巴瘤和肉瘤，例如卵巢癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、尿道癌、子宮癌、急性淋巴性白血病、何杰金病、黑素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和軟組織肉瘤。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，癌癥選自黑素瘤、腺癌和結(jié)腸癌。
顯然，此處描述的診斷方法并非限定于對(duì)癌癥的診斷，也可用于監(jiān)測(cè)特定受試者中疾病的發(fā)展，所述監(jiān)測(cè)通過(guò)隨著時(shí)間比較受試者中癌標(biāo)記物的水平而實(shí)現(xiàn)。當(dāng)病人在緩解期時(shí)，在緩解早期采取的樣本可用于與后期樣本比較的標(biāo)準(zhǔn)。優(yōu)選地用來(lái)自相同體液的樣本作為早期樣本，以測(cè)定受試者的狀態(tài)，這是由于癌標(biāo)記物水平的任何進(jìn)一步的改變可指示出緩解期已經(jīng)結(jié)束。類似地，由于癌標(biāo)記物水平的任何改變可指示出復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，對(duì)于已成功治療并導(dǎo)致恢復(fù)、治愈或沒有出現(xiàn)任何癌轉(zhuǎn)移的患者，治療后或癌轉(zhuǎn)移前立即采取的樣本可用作與后期樣本比較的標(biāo)準(zhǔn)，以確定受試者是否發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。
術(shù)語(yǔ)″疑患癌癥的受試者″將意在理解為已經(jīng)呈現(xiàn)出一種或多種與癌癥相關(guān)的癥狀的受試者，或在先前已獲得的測(cè)試樣本作為測(cè)試樣本時(shí)用本發(fā)明的方法診斷為患有癌癥的受試者，包括其中緩解期疑為接近尾聲或正處于監(jiān)測(cè)之中的癌癥緩解期的受試者。
如此處所應(yīng)用，術(shù)語(yǔ)″健康受試者″應(yīng)意指采取對(duì)照樣本時(shí)未呈現(xiàn)出任何與癌癥相關(guān)的癥狀的受試者，或采取對(duì)照樣本時(shí)與癌癥相關(guān)的癥狀處于緩解期的受試者，或采取血液級(jí)分時(shí)先前在血、尿或其他體液中診斷出的腫瘤未出現(xiàn)任何轉(zhuǎn)移表現(xiàn)的受試者。因此，″健康受試者″不必與疑患癌癥的受試者截然區(qū)分。例如，某特定個(gè)體，例如為處于罹患癌癥風(fēng)險(xiǎn)中的個(gè)體，可在不同的時(shí)間提供體液樣本，在此例子中任何癥狀產(chǎn)生之前采取的較早樣本可用作后期測(cè)試樣本的對(duì)照樣本。備選地，從緩解期或治療后受試者中采取的體液樣本可用作較早或之后采取的同一受試者的樣本的對(duì)照樣本，例如，用以監(jiān)測(cè)疾病的進(jìn)程。
″對(duì)照樣本″意指具有一特定整體的已知組成或含量的樣本，以此與測(cè)試樣本進(jìn)行比較。對(duì)照樣本來(lái)源的唯一要求是其不含有與疾病狀態(tài)一致的待檢測(cè)癌標(biāo)記物的水平。
此處描述的試驗(yàn)中所應(yīng)用的測(cè)試樣本或?qū)φ諛颖究蔀閬?lái)自疑患癌癥的受試者或健康受試者的任何體液樣本，例如血液級(jí)分、血漿級(jí)分、尿液、唾液、粘液、痰液或淚液，以及其他。在一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)照樣本或測(cè)試樣本為血液級(jí)分，優(yōu)選地為血漿級(jí)分。
如此處所應(yīng)用，″血液級(jí)分″意指任何來(lái)自血液的物質(zhì)，且應(yīng)包括血液的上清或沉淀、血清級(jí)分或血漿級(jí)分、血沉棕黃層級(jí)分、富含T細(xì)胞的級(jí)分、富含血小板的級(jí)分、富含血小板紅細(xì)胞的級(jí)分、富含嗜堿性細(xì)胞的級(jí)分、富含嗜酸性細(xì)胞的級(jí)分、富含淋巴細(xì)胞的級(jí)分、富含單核細(xì)胞的級(jí)分、富含嗜中性粒細(xì)胞的級(jí)分、任何部分純化或純化的組份或血液，無(wú)論其是否與血液的任何其他組份混合。血液級(jí)分的獲得，例如可通過(guò)用沉淀劑(例如低溫、酸、堿、硫酸銨、聚乙二醇等)或色譜分級(jí)分離(例如大小排阻、離子交換、疏水相互作用、反相、質(zhì)譜等)處理血液實(shí)現(xiàn)。
在本上下文中，術(shù)語(yǔ)″血清級(jí)分″意指源自血清的樣本。示例性的血清級(jí)分包括血漿蛋白質(zhì)級(jí)分(例如白蛋白級(jí)分、纖維蛋白原(因子I)級(jí)分、血清球蛋白級(jí)分、因子V級(jí)分、因子VIII級(jí)分或包含因子VI1、IX和X的凝血酶原復(fù)合體)、血漿的冷上清或冷沉淀、新鮮冷凍血漿的冷上清或冷沉淀、血漿級(jí)分的冷上清或冷沉淀、或血清的部分純化或純化的任何組份，無(wú)論其是否與其他血清組份混合。血清級(jí)分的獲得，例如可通過(guò)用沉淀劑(例如低溫、酸、堿、硫酸銨、聚乙二醇等)或用色譜分級(jí)分離(例如大小排阻、離子交換、疏水相互作用、反相、質(zhì)譜等)處理血清實(shí)現(xiàn)。
由于本發(fā)明的方法是用體液樣本進(jìn)行的，因此其便于進(jìn)行且不具有侵入性。
根據(jù)所應(yīng)用的分析技術(shù)，通過(guò)領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法或根據(jù)此處描述的方法制備體液樣本，而避免不適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)。本發(fā)明明確包括進(jìn)行此處描述的診斷試驗(yàn)的樣本的制備和處理。
″將(i)中的癌標(biāo)記物或衍生物的水平與健康受試者的對(duì)照樣本中的癌標(biāo)記物或衍生物的水平進(jìn)行比較″意指在對(duì)照樣本和測(cè)試樣本間比較本發(fā)明分子的癌標(biāo)記物或衍生物的量或濃度。該比較易于進(jìn)行，例如當(dāng)用質(zhì)譜分析時(shí)兩樣本中的癌標(biāo)記物表示為與最高豐度峰百分比的相對(duì)量。例如，可調(diào)控用于樣本質(zhì)譜的條件以保證特定分子的峰高度或特定峰的面積與樣本中該分子的豐度成正比。因此，并非嚴(yán)格需要對(duì)收集的峰樣本進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)用以測(cè)定其中分子的豐度，這是由于可重疊這兩樣本的圖譜以確定峰高的差異。備選地，或除了測(cè)定癌標(biāo)記物的相對(duì)水平之外，將峰高度整合或通過(guò)進(jìn)一步的對(duì)與癌標(biāo)記物對(duì)應(yīng)的峰進(jìn)行生化試驗(yàn)或免疫試驗(yàn)來(lái)測(cè)定癌標(biāo)記物的絕對(duì)濃度也是可能的。但是，用于定量時(shí)，優(yōu)選地僅進(jìn)行粗樣本制備。
本發(fā)明明確包括測(cè)定測(cè)試樣本或?qū)φ諛颖局斜景l(fā)明的癌標(biāo)記物豐度的步驟，和/或測(cè)定樣本中癌標(biāo)記物相對(duì)豐度的步驟。其包括測(cè)定來(lái)自血液或血清中的任何血液級(jí)分或血清級(jí)分癌標(biāo)記物的豐度或相對(duì)豐度。標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)可用于此目的，所述試驗(yàn)如峰級(jí)分的免疫化學(xué)分析。
優(yōu)選地，本發(fā)明的此方面進(jìn)一步包括第一步，即獲得體液樣本，或由其獲得的任何中間體級(jí)分(例如聚糖、糖脂和糖粗混合物的沉淀)。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明此方面的方法包括進(jìn)一步說(shuō)明癌標(biāo)記物或衍生物的特性，特別是根據(jù)其質(zhì)荷比和/或分子量和/或結(jié)構(gòu)，以確認(rèn)其特性。前述討論將表明，應(yīng)用領(lǐng)域內(nèi)已知的方法可容易地測(cè)定這些特性。在一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，測(cè)定了本發(fā)明的含糖分子的質(zhì)荷比，或測(cè)定了其一個(gè)或多個(gè)后源電離片段的質(zhì)荷比，或測(cè)定了其后源電離片段的特征，用以證實(shí)癌標(biāo)記物的特性，所述測(cè)試如通過(guò)針對(duì)標(biāo)定的標(biāo)記進(jìn)行質(zhì)譜實(shí)施，該測(cè)試所估算質(zhì)荷比的最大誤差為±5，更優(yōu)選地為±4，甚至更優(yōu)選地為±3，仍更優(yōu)選地為±2，且甚至仍更優(yōu)選地為±1。
對(duì)于本發(fā)明癌標(biāo)記物的免疫學(xué)試驗(yàn)，制備針對(duì)癌標(biāo)記物的單克隆抗體，優(yōu)選地針對(duì)該癌標(biāo)記物的純化分子或其衍生物，例如來(lái)自質(zhì)譜的級(jí)分，且然后在標(biāo)準(zhǔn)免疫試驗(yàn)技術(shù)中應(yīng)用以用于隨后的癌癥診斷。
為制備單克隆抗體，用低劑量環(huán)磷酰胺(15mg/Kg非人哺乳動(dòng)物體重)注射小鼠或其他哺乳動(dòng)物進(jìn)行預(yù)處理以降低其抑制細(xì)胞的活性，然后以短時(shí)間間隔(即3-4天和一周之間)用不同劑量的含糖分子進(jìn)行免疫。依靠糖磷酸肌醇部分，含糖分子可導(dǎo)入到脂質(zhì)體中，隨后用脂質(zhì)體免疫動(dòng)物，基本如在USSN 5,817,513中所描述的。應(yīng)用與標(biāo)準(zhǔn)方法一致的皮下、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)注射進(jìn)行免疫。免疫之前及其間，從動(dòng)物中采取血液的血清樣本，通過(guò)任何已知的用于檢測(cè)抗原抗體反應(yīng)的免疫試驗(yàn)監(jiān)測(cè)以含糖分子為抗原所產(chǎn)生的抗體滴度。通常，以短時(shí)間間隔的約5-9次累積劑量的脂質(zhì)體制備物可提高對(duì)含糖分子的抗體反應(yīng)。產(chǎn)生抗含糖分子的血清抗體滴度的小鼠接受脂質(zhì)體制備物的再次免疫，所述免疫在獲得抗體產(chǎn)生細(xì)胞的約三天前進(jìn)行，然后分離產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，優(yōu)選地為脾細(xì)胞。根據(jù)用于制備單克隆抗體的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，將前述細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞。然后通過(guò)免疫試驗(yàn)方法測(cè)試雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的滴度。
優(yōu)選地，應(yīng)用免疫酶試驗(yàn)，其中雜交瘤細(xì)胞上清與含抗原的測(cè)試樣本結(jié)合，然后用與單克隆抗體結(jié)合的酶標(biāo)記的第二抗體檢測(cè)抗原抗體結(jié)合。一旦通過(guò)例如極限稀釋篩選并亞克隆到所需的雜交瘤細(xì)胞，即可在足量的培養(yǎng)基中體外擴(kuò)增所產(chǎn)生的單克隆抗體，經(jīng)過(guò)適宜的時(shí)間后，從上清中回收所需的抗體。所選擇的培養(yǎng)基及適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)時(shí)間為技術(shù)人員公知，或易于確定。
另一產(chǎn)生方法包括將雜交瘤細(xì)胞注射到同源小鼠體內(nèi)。在此條件下，雜交瘤細(xì)胞引起非實(shí)體腫瘤的形成，所述腫瘤可在小鼠的血流和腹膜滲出液(腹水)中產(chǎn)生高濃度的所需抗體。
然后應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)免疫試驗(yàn)測(cè)試測(cè)試樣本和/或?qū)φ諛颖局泻欠肿拥拇嬖凇?br> 本發(fā)明的第三部分明確包括與本發(fā)明含糖分子或其糖部分、脂類部分或蛋白質(zhì)部分交叉反應(yīng)的單克隆抗體。
本發(fā)明的第四部分包括用于在人或其他哺乳動(dòng)物受試者中檢測(cè)癌癥的診斷試劑盒，該試劑盒包含一定量的本發(fā)明分離的含糖分子，所述分子適于用作校正標(biāo)準(zhǔn)，以及包含一種或多種適用的緩沖液。
″校正標(biāo)準(zhǔn)″意指用于輔助測(cè)定所述分子的量和/或該分子的一種或多種物理特性的參考樣本。通常校正標(biāo)準(zhǔn)為分離形式以使由污染物產(chǎn)生的誤差結(jié)果減至最小。因此，文中描述的診斷試驗(yàn)的對(duì)照樣本可為校正標(biāo)準(zhǔn)。
緩沖液可為適于懸浮校正標(biāo)準(zhǔn)或?qū)φ諛颖竞?或測(cè)試樣本的任何緩沖液，用于接下來(lái)應(yīng)用免疫學(xué)方法、質(zhì)譜或其他檢測(cè)方法進(jìn)行試驗(yàn)。備選地，或另外地，緩沖液可為對(duì)本發(fā)明含糖分子進(jìn)行免疫檢測(cè)試驗(yàn)時(shí)適于進(jìn)行抗體抗原結(jié)合反應(yīng)的任何緩沖液。
在一備選實(shí)施方案中，本發(fā)明包含用于在人或其他哺乳動(dòng)物受試者中檢測(cè)癌癥的診斷試劑盒，該試劑盒包含與分離的含糖分子特異結(jié)合的一定量的抗體，以及包含一種或多種適用的緩沖液。
優(yōu)選地，抗體為單克隆抗體。
在進(jìn)一步備選的實(shí)施方案中，本發(fā)明包含用于在人或其他哺乳動(dòng)物受試者中檢測(cè)癌癥的診斷試劑盒，該試劑盒包含一定量本發(fā)明的分離的含糖分子，所述分子適于用作校正標(biāo)準(zhǔn)，包含與分離的含糖分子特異結(jié)合的抗體，以及包含一種或多種適用的緩沖液。
根據(jù)前述的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的試劑盒優(yōu)選地提供使用說(shuō)明書。根據(jù)文中提供的說(shuō)明書，本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員了解這些試劑盒的應(yīng)用。
以下提供的非限定性實(shí)施例意在進(jìn)一步描述本發(fā)明分離的含糖分子，以及其在人或其他哺乳動(dòng)物中檢測(cè)多種不同癌癥的用途。
實(shí)施例實(shí)施例1荷瘤動(dòng)物和人的血液中含糖的m/z 991離子的缺失材料和方法1.腫瘤模型大鼠大鼠為雌性Fischer 344大鼠，攜帶有高轉(zhuǎn)移性大鼠乳腺癌13762 MAT(Parish等，國(guó)際癌癥雜志(Int.J.Cancer)40，511-518，1987)。以先前描述的方法體外維持腫瘤細(xì)胞(Parish等，國(guó)際癌癥雜志(Int.J.Cancer)40，511-518，1987)。為在大鼠中誘發(fā)腫瘤，動(dòng)物(10-13周齡)s/c注射106個(gè)13762 MAT細(xì)胞且約13天后出現(xiàn)腫瘤(直徑為15-17mm)。
小鼠將高度惡性和轉(zhuǎn)移性的B16F1黑素瘤細(xì)胞系s/c注射(106個(gè)細(xì)胞/小鼠)到雌性C57BL/6小鼠，其約15天后出現(xiàn)腫瘤(直徑為12-14mm)。
人應(yīng)用診斷為結(jié)腸癌的受試者，并從其收集檸檬酸化的血漿。
2.血清和血漿樣本從健康人受試者和患結(jié)腸癌的受試者中，或備選地從健康和荷瘤的C57BL/6小鼠或者從健康或荷瘤的Fischer 344大鼠中收集帶有或不帶有抗凝劑(檸檬酸-磷酸葡萄糖)的血液。收集后，不含抗凝劑的血液在37℃孵育30分鐘，4℃過(guò)夜儲(chǔ)存，然后收集血清。通過(guò)離心(4000xg，12分鐘)加抗凝劑的血液獲得血漿樣本。
3.血清的級(jí)分-硫酸銨/吡啶法用鹽酸(HCl)使血清或血漿(2-3ml)酸化(pH 5.5到pH 5.8)。用1倍體積的過(guò)飽和硫酸銨與血清混合，置4℃3小時(shí)以沉淀部分蛋白質(zhì)。置4℃以10,000xg離心10分鐘并收集上清。加入硫酸銨粉使其飽和度為90-95％，然后置4℃混勻過(guò)夜以進(jìn)一步去除蛋白質(zhì)。4℃于100,000xg離心混合物1小時(shí)并收集上清。然后在4℃持續(xù)攪拌中將乙腈(四倍體積)加入到上清?；旌衔锓胖?分鐘后倒出并收集乙腈層。將余下的混合物于1500xg離心5分鐘并收集殘余的乙腈層。將乙腈級(jí)分合并并揮發(fā)掉溶劑。剩余物重懸在氯仿/甲醇/水(CMW；2/43/55；1ml)中并兩次加到預(yù)平衡的C18Seppak cartridge柱(Waters，Taunton，MA)。收集洗出液(未吸附級(jí)分)。用CMW(1ml)洗滌容器并將洗滌液通過(guò)cartridge柱。該洗出液收集至未吸附級(jí)分。然后分別用2ml的水、甲醇/水、甲醇、氯仿/甲醇和氯仿順序洗脫cartridge柱。分別收集所有的洗脫級(jí)分。真空(SpeedVac)干燥洗脫級(jí)分。將未吸附級(jí)分和水級(jí)分重懸在最小量的水中并用1kDa分子量截止透析膜用水進(jìn)行徹底透析。真空(SpeedVac)干燥透析液。將其再溶解在10μl的相關(guān)溶劑中并用如以下描述的MALDI-TOF MS進(jìn)行分析。
4.MALDI-TOF MS分析為制備質(zhì)譜樣本，真空干燥級(jí)分。將直流級(jí)分及甲醇/水級(jí)分溶解在水(200μl)中，并用1kDa分子量截止透析膜用水進(jìn)行徹底透析，并蒸發(fā)干燥。所有級(jí)分再溶解到10μl的相關(guān)溶劑中，以將其加載到質(zhì)譜儀。
如先前所描述的制備級(jí)分(1μl)并通過(guò)渦旋與基質(zhì)溶液[2-(4-羥基苯偶氮基)苯甲酸(HABA)溶于甲醇中的溶液，為3.5mg/ml，從中取出2μl]混合。將混合物(1μl)加載到具有96個(gè)加載位置的樣本平板上，并室溫干燥。然后將樣本平板裝入MALDI-TOF MS(TofSpec-2e；Micromass，Manchester，UK或Voyager Elite-DE；BioPerceptive)中。用氮激光(337nm)進(jìn)行電離，并以線性或反射器負(fù)離子模式進(jìn)行分析。對(duì)含目的離子的一些樣本進(jìn)行源后衰變(PSD)斷裂。以m/z比給出的數(shù)據(jù)顯示每一峰的質(zhì)荷比，峰高表示為樣本中檢測(cè)到的最大豐度分子的百分比高度。
結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用MALDI-TOF MS分析時(shí)(圖1A、2A和3A)，通過(guò)健康大鼠、小鼠或人的血清的直流級(jí)分(即不吸附到C18Seppak柱的級(jí)分)含有非常顯著的質(zhì)荷比約為991的負(fù)離子。該負(fù)離子在荷瘤大鼠的血清(圖1B)、荷瘤小鼠的血清(圖2B)和結(jié)腸癌患者的血漿中(圖3B)缺失。
所有三種受測(cè)試的m/z 991離子的源后衰變斷裂(圖4A、圖4B和圖4C)基本相同，提示該分子在大鼠、小鼠和人中是相同的。
進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，皮下注射106個(gè)B16黑素瘤細(xì)胞僅兩天后，m/z 991離子即在小鼠血清中缺失。此時(shí)小鼠中并不存在明顯的腫瘤，這進(jìn)一步表明了該癌標(biāo)記物在癌癥早期診斷中的應(yīng)用潛力。
盡管本發(fā)明參照特定的優(yōu)選實(shí)施方案和實(shí)施例進(jìn)行了描述，領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員將會(huì)明曉，本發(fā)明的變更和改變形式，如果其與本發(fā)明的總原則和精神一致，也包括于本發(fā)明中。
權(quán)利要求
1.一種癌標(biāo)記物，其包含與健康受試者相比較在患有癌癥的受試者中以降低水平存在的質(zhì)荷比約為991的帶負(fù)電荷分子或所述帶負(fù)電荷分子的衍生物。
2.權(quán)利要求1的癌標(biāo)記物，其為分離的形式。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的癌標(biāo)記物，其中帶負(fù)電荷的分子包含糖、磷酸酯或硫酸酯。
4.權(quán)利要求3的癌標(biāo)記物，其中帶負(fù)電荷分子包含原位O-連接或N-連接到蛋白質(zhì)部分或原位連接到脂類部分的糖部分。
5.權(quán)利要求1的癌標(biāo)記物，其中衍生物包含帶負(fù)電荷分子的片段。
6.權(quán)利要求5的癌標(biāo)記物，其中片段具有的m/z比選自約241、約644、約705、約749和約947。
7.權(quán)利要求6的癌標(biāo)記物，其包含至少兩個(gè)所述片段。
8.權(quán)利要求6的癌標(biāo)記物，其包含至少三個(gè)所述片段。
9.權(quán)利要求6的癌標(biāo)記物，其包含至少四個(gè)所述片段。
10.權(quán)利要求6的癌標(biāo)記物，其包含所有所述片段的指紋。
11.權(quán)利要求1的癌標(biāo)記物，其中衍生物包含共價(jià)連接熒光配基、酶配基、放射性配基、肽配基或抗體配基的帶負(fù)電荷分子。
12.在人或非人哺乳動(dòng)物受試者中診斷或檢測(cè)癌癥的方法，其包括(i)測(cè)定來(lái)自疑患癌癥的受試者的測(cè)試樣本中癌標(biāo)記物的水平，其中所述癌標(biāo)記物包含m/z比為約991的帶負(fù)電荷分子或其衍生物；以及(ii)將(i)的癌標(biāo)記物或衍生物的水平與來(lái)自健康受試者的對(duì)照樣本的癌標(biāo)記物或衍生物的水平進(jìn)行比較，或與已制定的用于健康受試者的水平進(jìn)行比較，其中與健康受試者的水平或已制定的用于健康受試者的水平相比該癌標(biāo)記物或衍生物降低的水平為癌癥的征兆。
13.在人或非人哺乳動(dòng)物受試者中診斷或檢測(cè)癌癥的方法，其包括(i)測(cè)定來(lái)自疑患癌癥的受試者的測(cè)試樣本中癌標(biāo)記物的水平，其中所述癌標(biāo)記物包含m/z比為約991的帶負(fù)電荷分子或其衍生物；以及(ii)將(i)的癌標(biāo)記物或衍生物的水平與加到測(cè)試樣本中的內(nèi)標(biāo)水平進(jìn)行比較，其中與內(nèi)標(biāo)的水平相比該癌標(biāo)記物或衍生物降低的水平為癌癥的征兆。
14.在人或非人哺乳動(dòng)物受試者中診斷或檢測(cè)癌癥的方法，其包括測(cè)定來(lái)自疑患癌癥的受試者的測(cè)試樣本中癌標(biāo)記物的水平，其中所述癌標(biāo)記物包含m/z比為約991的帶負(fù)電荷分子或其衍生物；與同一測(cè)試樣本中的另一標(biāo)記物的水平相比較，其中癌標(biāo)記物與該另一標(biāo)記物的比率的變化為癌癥的征兆。
15.權(quán)利要求12到14中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述癌標(biāo)記物、內(nèi)標(biāo)或另一標(biāo)記物的水平通過(guò)質(zhì)譜或色譜技術(shù)進(jìn)行測(cè)定。
16.權(quán)利要求15的方法，其中癌癥為神經(jīng)外胚層起源的癌癥。
17.權(quán)利要求15的方法，其中癌癥選自癌、淋巴瘤和肉瘤。
18.權(quán)利要求15的方法，其中癌癥為黑素瘤。
19.權(quán)利要求15的方法，其中癌癥為腺癌。
20.權(quán)利要求15的方法，其中癌癥為結(jié)腸癌。
21.權(quán)利要求15的方法，其中測(cè)試樣本和/或?qū)φ諛颖緸轶w液或其級(jí)分。
22.權(quán)利要求21的方法，其中體液為血液。
23.權(quán)利要求21的方法，其中級(jí)分為血清或來(lái)自血清的級(jí)分。
24.權(quán)利要求12到23中任何一項(xiàng)所述的方法，其還包括測(cè)定測(cè)試樣本或?qū)φ諛颖局邪?biāo)記物的豐度，和/或測(cè)定所述樣本中癌標(biāo)記物的相對(duì)豐度。
25.權(quán)利要求12到23中任何一項(xiàng)所述的方法，其還包括第一個(gè)步驟即獲得樣本。
26.權(quán)利要求12到23中任何一項(xiàng)所述的方法，其還包括通過(guò)確定其片段特性來(lái)證實(shí)癌標(biāo)記物的特征。
27.在人或非人哺乳動(dòng)物受試者中監(jiān)測(cè)癌癥治療的方法，其包括(i)測(cè)定來(lái)自正進(jìn)行癌癥治療的受試者的測(cè)試樣本中癌標(biāo)記物的水平，其中所述癌標(biāo)記物包含m/z比為約991的帶負(fù)電荷分子或其衍生物；以及(ii)將(i)的癌標(biāo)記物或衍生物的水平與來(lái)自健康受試者的對(duì)照樣本的癌標(biāo)記物或衍生物的水平進(jìn)行比較，或與已制定的用于健康受試者的水平進(jìn)行比較，其中水平的提高作為成功治療的征兆。
28.在人或非人哺乳動(dòng)物受試者成功治療癌癥后診斷其復(fù)發(fā)的方法，其包括(i)測(cè)定來(lái)自經(jīng)癌癥治療的受試者的測(cè)試樣本中癌標(biāo)記物的水平，其中所述癌標(biāo)記物包含m/z比為約991的帶負(fù)電荷分子或其衍生物；以及(ii)將(i)的癌標(biāo)記物或衍生物的水平與來(lái)自健康受試者的對(duì)照樣本的癌標(biāo)記物或衍生物的水平進(jìn)行比較，或與制定的用于健康受試者的水平進(jìn)行比較，或與來(lái)自癌癥成功治療后的該受試者樣本中的水平進(jìn)行比較，其中降低的水平為癌癥復(fù)發(fā)的征兆。
全文摘要
提供了用于在人或非人哺乳動(dòng)物受試者中診斷癌癥的新的癌標(biāo)記物，特別提供了包含質(zhì)荷比(m/z)約為991的帶負(fù)電荷分子的癌標(biāo)記物。本發(fā)明的癌標(biāo)記物可用于通過(guò)測(cè)試生物樣本中該癌標(biāo)記物水平的降低，來(lái)確定該樣本中一種或多種癌細(xì)胞或腫瘤的存在。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1554021SQ02817623
公開日2004年12月8日 申請(qǐng)日期2002年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月3日
發(fā)明者C·R·帕里什, V·M·卡巴爾達(dá)－克蘭, C R 帕里什, 卡巴爾達(dá)-克蘭 申請(qǐng)人:生物環(huán)境有限公司