專利名稱：黃牛I-mfa基因的單核苷酸多態(tài)性位點及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子遺傳學領(lǐng)域，涉及以黃牛的功能基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)作為分子遺傳標記，特別涉及黃牛I-mfa基因的單核苷酸多態(tài)性位點及其檢測方法。
背景技術(shù)：
黃牛是我國的主要的家畜之一，但是現(xiàn)在面臨著優(yōu)秀黃牛品種種源不足和種群遺傳品質(zhì)較差的壓力。傳統(tǒng)的育種方法應(yīng)用測試動物的表現(xiàn)型和其親代、祖代及其它親屬在小動物模型中的遺傳信息，設(shè)想性狀受到許多基因遺傳差異的影響，每個基因?qū)π誀钣邢鄬^小的貢獻，因此對性狀的估計不可避免有些偏差。分子遺傳標記是近年來現(xiàn)代遺傳學發(fā)展最快的領(lǐng)域之一，新的方法正在不斷涌現(xiàn)，已定位的標記基因數(shù)目與日俱增。這將為數(shù) 量遺傳學提供了分子水平信息，家畜育種也將跨入分子育種階段。應(yīng)用分子遺傳標記的現(xiàn)代育種技術(shù)是加快良種選育和提高種群遺傳品質(zhì)，從而増加黃牛的產(chǎn)肉量和改善肉品質(zhì)的先進的有效的方法。分子遺傳標記輔助選擇就是將現(xiàn)代生物技術(shù)與常規(guī)選擇方法相結(jié)合，通過對遺傳標記的選擇來間接選擇控制某性狀的數(shù)量性狀位點(QTL)，使之能夠同時利用標記位點信息和數(shù)量性狀的表型信息，更準確估計動物個體的育種值，提高選擇效率，加快育種進展。標記輔助選擇主要經(jīng)歷了三個階段第一階段是家畜各性狀間的遺傳分析；第二階段是蛋白質(zhì)(酶)標記對數(shù)量性狀的標記階段；第三個階段是分子遺傳標記階段。隨著分子標記技術(shù)日漸成熟與豐富，使覆蓋整個基因組的標記成為可能，通過與QTL間的連鎖分析，實現(xiàn)分子標記輔助選擇的目標。單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotide polymorphism, SNP)就是指基因組 DNA 序列中由于單個核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態(tài)性。因此，通常所說的SNP包括堿基的替換、插入、缺失以及重復序列拷貝數(shù)的變化。ー個SNP表示在基因組某個位點上有ー個核苷酸的變化，主要由單個堿基的轉(zhuǎn)換或者顛換所引起；具有轉(zhuǎn)換型變異的SNP約占2/3，其他幾種SNP在相似的水平上。CpG 二核苷酸的胞嘧啶是基因組中最易發(fā)生突變的位點，其中大多數(shù)是甲基化的，可自發(fā)地脫去氨基而形成胸腺嘧啶。SNP作為新的遺傳標記已廣泛應(yīng)用于基因定位、克隆、遺傳育種及多祥性的研究。SNP是基因組中存在的ー種數(shù)量非常豐富的變異形式，占人類基因組中遺傳多態(tài)性的90%以上。SNP與罕見的變異不同，通常在種群中頻率等于或小于1%的此種變異被稱為突變，而只有頻率大于1%時才被稱為單核苷酸多態(tài)性。目前，主要采用幾種不同的方法來發(fā)現(xiàn)SNPs =DNA序列測定方法、PCR-SSCP與DNA測序結(jié)合法、AS-PCR方法、PCR-RFLP法、TaqMam技術(shù)與分子信標(molecular beacons)等。在這些SNP檢測技術(shù)中，(I)DNA序列測定法是最為準確的SNP檢測方法，但是，其檢測費用極其昂貴，且需要有DNA測序儀等大型儀器，同時，在測序過程中需要非常熟練的技術(shù)人員和經(jīng)驗，所以，DNA序列測定法不是ー種應(yīng)用于生產(chǎn)實際的理想SNP檢測方法；(2) PCR-SSCP與DNA測序結(jié)合法檢測SNP可以適當降低檢測費用，但是，PCR-SSCP的實驗過程比較長，操作比較繁瑣，且實驗過程中存在假陽性問題，所以，也并非理想的SNP檢測手段；(3) AS-PCR方法作為ー種新型的SNP檢測方法，在未來的應(yīng)用領(lǐng)域中具有非常廣闊的前景，但是，該方法需要設(shè)計特別的引物，且只能針對特定的基因位點，同吋，檢測過程中還存在誤檢的概率，因此，目前不具有普遍應(yīng)用的特點；(4)TaqMam技術(shù)與分子信標(Molecular Beacons)都是在突光能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resornance energ transfer,FRET)基礎(chǔ)上建立起來的，利用熒光標記及儀器達到檢測目的。焦磷酸測序(pyrosequencing)則是利用測序過程中可釋放的焦磷酸和酶類產(chǎn)生熒光，是不依賴平板膠或毛細管電泳、不依賴DNA的熒光標記技術(shù)，很可能成為未來的主流技術(shù)。(5) RFLP-PCR方法是ー種檢測SNP的有效技術(shù)，在發(fā)現(xiàn)SNP位點后引入限制性內(nèi)切酶進行切割，然后進行瓊脂糖、聚丙烯凝膠電泳分析，就能準確地鑒別SNP位點。RFLP-PCR方法不僅具有DNA測序法的準確性，又克服了費用昂貴、繁瑣操作、假陽性的缺點，而且所檢測的序列位點無特殊性要求。
I-mf (inhibitor of MyoD family)是一種生肌因子MyoD家族的抑制物，又稱MDFI (MyoD family inhibitor),它能直接與MyoD家族成員相互作用，如MyoD, myf5,myogenin and MRF4。Inf基因最早是1996年由C. _M. Amy Chen等在小鼠胚胎的實驗中發(fā)現(xiàn)并分離的。和MyoD家族成員主要存在于生肌節(jié)不同，I-mfa主要在生骨節(jié)高度表達。I-mf基因位于人6號染色體短臂上，全長15kb，有5個外顯子和4個內(nèi)含子，編碼246個氨基酸。小鼠I-mf基因定位于17號染色體上，全長19kb，有5個外顯子和4個內(nèi)含子。cDNA編碼三種蛋白質(zhì)，I-mfa，I-mfb和I-mfc。牛的I_mf基因位于23號染色體上，全長17kb，具有5個外顯子和4個內(nèi)含子，編碼247個氨基酸。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也有三種亞型I-mfa，I-mfb和I-mfc。它們具有相同的氨基末端,在羧基端卻有很大差異,致使只有I-mfa能與MyoD家族相互作用。I-mfa通過獨特的羧基末端直接和MyoD家族成員共有的bHLH域結(jié)合，從而阻止MyoD家族成員與相關(guān)DNA結(jié)合,并I_mfa通過掩蓋MyoD家族成員的核定位信號進而達到抑制MyoD家族轉(zhuǎn)錄活性的作用。近幾年ー些研究人員發(fā)現(xiàn)，I-mfa不僅可以抑制與肌形成相關(guān)的MyoD家族成員的轉(zhuǎn)錄活性，其對ー些和骨骼形成相關(guān)的蛋白也有影響，如Zic家族蛋白。I-mfa的生理功能主要體現(xiàn)在對骨骼和肌肉形成的抑制作用上，對于它的作用機制，近年來也有進展。I-mfa與TRPCl結(jié)合，作為分子開關(guān)抑制依賴電流的TRPCl通道；此外，通過參與fct信號通路達到抑制肌肉形成分化的目的。2006年，Pan等發(fā)現(xiàn)I-mfa介導的對LEF-I的抑制作用能夠被連環(huán)蛋白解除，這為其作用機制提供有力的證明。2008年Kim等發(fā)現(xiàn)對于調(diào)節(jié)肌肉發(fā)育的Wnt信號通路來說，β -連環(huán)蛋白是必需的，可與MyoD直接結(jié)合并增加它的活性。這些表明I-mfa在參與Wnt信號途徑中和MyoD及β-連環(huán)蛋白起著相互調(diào)控的作用，這為正常進行肌肉分化提供了基礎(chǔ)。我們可以預見，如果I-mfa基因發(fā)生突變，將有可能對I-mfa的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響從而影響其生理活性，解除對MyoD的抑制作用，促進肌肉的生長發(fā)育。關(guān)于動物I-mfa基因的研究國內(nèi)外多見于人、鼠等動物，對黃牛I_mfa基因遺傳變異或SNP研究的報道還未見報道。由于目前黃牛I-mfa基因遺傳變異領(lǐng)域的研究匱乏，使該基因位點的功能研究及該基因遺傳變異與經(jīng)濟性狀(如生長發(fā)育性狀)關(guān)聯(lián)的研究成為空白
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于提供黃牛I-mfa基因單核苷酸多態(tài)性檢測方法及其應(yīng)用，尋找與黃牛經(jīng)濟性狀相關(guān)的SNP作為分子標記，加快黃牛良種繁育速度。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)黃牛I-mfa基因的單核苷酸多態(tài)性位點，其中，該基因單核苷酸多態(tài)性位點包括黃牛I-mfa基因第12284位為A或G的單核苷酸多態(tài)性位點；和黃牛I-mfa基因第12331位為T或C的單核苷酸多態(tài)性位點。黃牛I-mfa基因的單核苷酸多態(tài)性位點的檢測方法，其中，包括以下步驟
(I)、以包含I-mfa基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增黃牛I-mfa基因；所述的引物對P為上游引物Pl TTCTCCTCCATCGCCCTTTTC ；下游引物P2 ATGCTGCTGCCGCTCCCT ；(2)、對步驟(I)的擴增產(chǎn)物進行PCR產(chǎn)物的切膠回收及純化、測序；(3)、對步驟(2)的純化產(chǎn)物進行PCR-SSCP檢測首先對純化的PCR產(chǎn)物用變性劑進行變性處理，再進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果鑒定其多態(tài)性位點。如上述技術(shù)方案所述的黃牛I-mfa基因的單核苷酸多態(tài)性位點的檢測方法，其中，步驟(2)中PCR擴增反應(yīng)程序為94°C預變性 5min ;94°C變性 45s，62. 8°C退火 lmin，72°C延伸 45s，32 個循環(huán)；72°C延伸IOrnin0如上述技術(shù)方案所述的黃牛I-mfa基因的單核苷酸多態(tài)性位點的檢測方法，其中，步驟(3)中聚丙烯酰胺凝膠的濃度為10%。如上述技術(shù)方案所述的黃牛I-mfa基因的單核苷酸多態(tài)性位點的檢測方法，其中，步驟(3)中根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛I-mfa基因的多態(tài)性位點，所述多態(tài)性位點包括黃牛I-mfa基因第12284位為A或G的堿基多態(tài)性位點和第12331位為T或C的堿基多態(tài)性位點，表現(xiàn)為AATT、AGTC, GGCC三種基因型。本發(fā)明中第12284位和第12331位兩個位點為完全連鎖，所以用突變位點堿基來表示，12284位有AA、AG、GG三種基因型，12331位有TT、TC、CC三種基因型，由于完全連鎖，所以表示為AATT、AGTC、GGCC三種基因型。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果(I)、本發(fā)明公開了與黃牛生長發(fā)育相關(guān)的功能基因I-mfa的核苷酸多態(tài)性，該核苷酸多態(tài)性能夠作為ー個分子遺傳標記，利用標記位點信息和數(shù)量性狀的表型信息，更準確估計動物個體的育種值，提高選擇效率，加快育種進展。(2)、本發(fā)明對I-mfa基因的SNP進行了基因分型和基因頻率分析，以及與三種黃牛體尺性狀之間進行了性狀關(guān)聯(lián)分析；結(jié)果顯示I-mfa基因的核苷酸多態(tài)位點能夠為黃牛雜交育種提供幫助。(3)、本發(fā)明提供的檢測方法為I-mfa基因的SNP與體尺性狀關(guān)系的建立奠定了基礎(chǔ)，以便用于中國黃牛標記輔助選擇，快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。(4)、本發(fā)明把PCR產(chǎn)物混合測序篩查SNP與PCR-SSCP結(jié)合起來解決了 SSCP的不穩(wěn)定性，以防突變位點的漏檢，提供了ー種用簡單、快速、低成本、精確度高的，便于推廣應(yīng)用的在DNA水平上篩查和檢測與黃牛生長性狀密切相關(guān)的遺傳標記，可在以后的肉牛養(yǎng)殖中建立相應(yīng)的純合配套系用于雜交育種獲得優(yōu)良性狀的子代。


I、圖I是本發(fā)明的技術(shù) 流程示意圖；2、圖2是本發(fā)明中PCR產(chǎn)物混合測序篩查到的黃牛I-mfa基因序列12284位A-G突變測序結(jié)果圖；3、圖3是本發(fā)明中PCR產(chǎn)物混合測序篩查到的黃牛I-mfa基因序列12331位為T或C突變測序結(jié)果圖；4、圖4是本發(fā)明用來檢測PCR產(chǎn)物片段大小的瓊脂糖凝膠電泳；5、圖5是本發(fā)明用來檢測各樣本突變情況的聚丙烯酰胺凝膠電泳。
具體實施例方式為使本發(fā)明的技術(shù)方案便于理解，以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進ー步的說明。本發(fā)明以I-mfa基因保守序列設(shè)計引物，分別以3種黃牛品種的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，混合PCR產(chǎn)物并對其純化，測序。然后，進行測序圖分析和序列比對篩查出SNP位點；其次，對待測群體進行多態(tài)位點的PCR-SSCP檢測；最后，根據(jù)在群體中檢測到的基因型，進行群體遺傳統(tǒng)計分析和生長性狀的關(guān)聯(lián)分析，篩選出與黃牛生長性狀密切相關(guān)的分子標記。下面對本發(fā)明做詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。一、地方黃牛品種I-mfa基因部分DNA序列的克隆I、血樣的采集及處理取血樣10mL，加入O. 5mol/L的EDTA 500 μ L抗凝，緩慢顛倒3次后放入冰盒，-80°C保存?zhèn)溆谩１狙芯克命S牛血樣總數(shù)541份，具體為(I)、郟縣紅牛368份血樣采自河南省平頂山市郟縣紅牛保種區(qū)；(2)、秦川牛血樣113份采自陜西省秦川牛場；(3)、魯西牛血樣60份，采自山東魯西牛原種場。2、血樣基因組DNA的提取(I)、將冷凍血樣室溫解凍，轉(zhuǎn)移500 μ L至I. 5mL Eppendorf管，加入等體積PBS緩沖液，充分混勻，12000r/min離心IOmin(4°C ),棄去上清液,重復上述步驟至上清液透明、沉淀呈淡黃色。(2)、在離心管中加入DNA抽提緩沖液500 μ L，搖動，使血細胞沉淀脫離離心管管壁，37°C水浴lh。DNA抽提緩沖液的配制0. 6057g的Tris、18. 612g的EDTA和2. 5g的SDS加超純水500mL，滅菌、調(diào)pH至8. 0，4°C保存?zhèn)溆谩?3)、加蛋白酶K 3yL(20mg/mL)并混勻，55°C過夜至澄清，尚未澄清者，可補加
Iμ L蛋白酶K混勻繼續(xù)消化至澄清。(4)、將反應(yīng)液冷卻至室溫，加Tris-飽和酚500 μ L，溫和搖動離心管20min，使其充分混勻，4°C，12000r/min離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)入另一 1. 5mL離心管中，重復一次。(5)、加氯仿500 y L,充分混勻20min,4°C, 12000r/min離心lOmin,將上清液轉(zhuǎn)入 另一 1. 5mL離心管中。(6)、加0. 1倍體積的NaAc緩沖液及2倍體積的冰冷的無水乙醇，混合轉(zhuǎn)動離心管 直至白色的絮狀沉淀析出，_20°C保存30 60min。(7)、4°C，12000r/min離心lOmin，棄上清，用70%的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。(8)、4°C, 12000r/min離心lOmin,棄上清，室溫下使乙醇揮發(fā)干凈。(9)、干燥后的DNA溶于80 100 y L的TE-緩沖液或超純水，4°C保存直至DNA完 全溶解，0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，-80°C保存。3、擴增引物設(shè)計根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫中(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)牛的 GenBank 登錄號 為NC_007324. 4的I_mfa基因的外顯子3DNA序列，以該基因序列保守區(qū)序列為參考利用 Primer 5. 0設(shè)計PCR引物對，其引物對序列如下上游引物PI TTCTCCTCCA TCGCCCTTTTC 21 ；下游引物P2 :ATGCTGCTGC CGCTCCCT 18。該引物擴增了黃牛I-mfa基因第3外顯子區(qū)域及一部分內(nèi)含子區(qū)域。4、PCR擴增I-mfa基因外顯子3分別以3個黃牛品種的DNA為模版，用上述設(shè)計的引物對進行PCR擴增，PCR總反 應(yīng)體系為15 U L，見表1 ;PCR總反應(yīng)程序，見表2。表1本發(fā)明的PCR反應(yīng)體系
體系成分體積(y L)
權(quán)利要求
1.黃牛I-mfa基因的單核苷酸多態(tài)性位點，其特征在于，該基因單核苷酸多態(tài)性位點包括 黃牛I-mfa基因第12284位為A或G的單核苷酸多態(tài)性位點；和 黃牛I-mfa基因第12331位為T或C的單核苷酸多態(tài)性位點。
2.黃牛I-mfa基因的單核苷酸多態(tài)性位點的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)、以包含I-mfa基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增黃牛I-mfa基因； 所述的引物對P為 上游引物 Pl TTCTCCTCCATCGCCCTTTTC ； 下游引物 P2 ATGCTGCTGCCGCTCCCT ； (2)、對步驟(I)的擴增產(chǎn)物進行PCR產(chǎn)物的切膠回收及純化、測序； (3)、對步驟(2)的純化產(chǎn)物進行PCR-SSCP檢測首先對純化的PCR產(chǎn)物用變性劑進行變性處理，再進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果鑒定其多態(tài)性位點。
3.如權(quán)利要求2所述的黃牛I-mfa基因的單核苷酸多態(tài)性位點的檢測方法，其特征在于，步驟(2)中PCR擴增反應(yīng)程序為94°C預變性5min ;94°C變性45s，62. 8°C退火lmin，72°C延伸45s，32個循環(huán)；72°C延伸IOmin0
4.如權(quán)利要求2所述的黃牛I-mfa基因的單核苷酸多態(tài)性位點的檢測方法，其特征在于，步驟(3)中聚丙烯酰胺凝膠的濃度為10%。
5.如權(quán)利要求2所述的黃牛I-mfa基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，步驟(3)中根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛I-mfa基因的多態(tài)性位點，所述多態(tài)性位點包括黃牛I-mfa基因第12284位為A或G的堿基多態(tài)性位點和第12331位為T或C的堿基多態(tài)性位點，表現(xiàn)為AATT、AGTC, GGCC三種基因型。
全文摘要
本發(fā)明公開了黃牛I-mfa基因的單核苷酸多態(tài)性及其檢測方法，其基因單核苷酸多態(tài)性包括以包含I-mfa基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增黃牛I-mfa基因，對擴增片段進行聚丙烯酰胺凝膠電泳；根據(jù)電泳結(jié)果鑒定黃牛I-mfa基因第12284位為A或G的堿基多態(tài)性；在黃牛的I-mfa基因第12331位為T或C的堿基多態(tài)性；這兩個位點完全連鎖。本發(fā)明是一種在DNA水平上篩查和檢測與黃牛生長性狀密切相關(guān)的分子遺傳標記，為利用雜種優(yōu)勢進行黃牛雜交育種提供了分子依據(jù)。
文檔編號C12Q1/68GK102660540SQ201210122458
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月17日
發(fā)明者張春雷, 房興堂, 李景景, 陳宏 申請人:江蘇師范大學