專利名稱：：增強抗性并減少重金屬吸收的植物遺傳改良的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生具有促進對重金屬抗性的轉(zhuǎn)化體的方法。更具體地是，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因植物，其在被重金屬污染地環(huán)境中，具有能夠改善生長但卻有降低的重金屬含量，因此該方法可以開發(fā)用于植物補救(phytoremediatim)的植物，也可開發(fā)安全作物。
背景技術(shù)：
：重金屬是主要的對環(huán)境有毒的物質(zhì)，可以導(dǎo)致活性氧種類的產(chǎn)生、DNA損傷和通過與細胞中酶的活性位點結(jié)合而使酶失活。由于工業(yè)化導(dǎo)致了重金屬污染環(huán)境越來越嚴重。在20世紀90年代早期，全球每年釋放22000噸鎘、954000噸銅、796000噸鉛和1372000噸鋅(AllowayBJ&AyresDC(1993)Principlesofenvironmentalpollution.ChapmanandHall，London)。重金屬污染的土壤抑制植物的正常生長和引起食品污染。許多重金屬對人類健康非常有害，低濃度即具有致癌性。因此，從環(huán)境中去除重金屬是十分緊迫的問題。從土壤中去除重金屬的研究在全球也非?；钴S。處理土壤污染傳統(tǒng)的方法包括物理方法和化學(xué)方法，例如去除和埋葬污染的土壤、對污染區(qū)域進行隔離、固定(對土壤進行化學(xué)處理以固定金屬)和用酸或堿溶解濾去(SaltDE，BlaylockM，KumarNPBA，ViatcheslavD，EnsleyBD，etal.(1995).Phytoremediationanovelstrategyfortheremovaloftoxicmetalsfromtheemvironmentusingplants.Bio-Technology13，468-74；Raskin1，SmithRD，SaltDE.(1997)Phytoremediationofmetalsusingplantstoremovepollutantsfromtheenvironment.Curr.Opin.Biotechnol.8，221-6)。然而，這些方法成本非常高并需要消耗大量的能源。植物補救法作為一種從污染土壤中去除重金屬的低成本的、對環(huán)境有益的(environment-friendly)方法最近已被提出來，它是對污染土壤進行清潔的一種相對比較新的技術(shù)，這種技術(shù)使用普通植物，尤其是栽培植物(bredplant)或轉(zhuǎn)基因植物來聚積、去除或解毒環(huán)境污染物。植物補救技術(shù)可分成植物提取法、根瘤過濾法(rhizofiltration)、和植物穩(wěn)定法。植物提取法是一種使用金屬蓄積植物從土壤中吸收金屬到植物的可收集(harvestable)部分的方法；根瘤過濾法是一種利用植物根從污染的水流(aqueousstream)中去除污染物的方法；而植物穩(wěn)定法也是用植物對污染物例如土壤中的有毒金屬進行保持固定，以防止它們進入地下水(Saltetal.，Biotechnology13(5)468-474，1995)。植物補救法的例子是使用Larreatridentate品種植物的方法，其專門用于脫污染包括銅、鎳和鎘的土壤(美國專利5,927,005)的方法，和一種利用十字花科(Brassicaceae)的植物的方法(Bakeretal.，NewPhytol.12761-68，1994)。另外，已經(jīng)利用通過將對重金屬有抗性活性的基因?qū)攵a(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物的植物補救法進行了嘗試。重金屬抗性基因的例子有CAX2(鎘交換器2)，細胞色素P4502E1，NtCBP4(煙草(Nicotianatabacum)鎘結(jié)合蛋白)，GSHII(谷胱甘肽合成酶)，merB(有機汞制劑裂解酶(organomercuriallyase))和MRT多肽(金屬調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運多肽)。CAX2(鎘交換器2)，是從擬南芥(Arabidopsisthaliana)中分離到的，可在植物中積累包括鎘和錳的重金屬(Hirschietal.，PlantPhysiol，124125-134，2000)。細胞色素P4502E1可吸收和分解有機化合物例如三氯乙烯(DotySLetal.Proc，Natl，Acad.Sci.USA，976287-6291，2000)。用NtCBP4轉(zhuǎn)化的煙草(Nicotianatabacum)具有對鎳的抗性(Arazietal.PlantJ.20171-182，1999)，GSHII可聚積鎘(Liangetal.，PlantPhysiol.11973-80，1999)，merB可對有機汞進行解毒(Bizilyetal.，Proc.Natl.Sci.USA966808-6813，1999)，和MRT多肽可從污染土壤中去除包括鎘、鋅和錳的重金屬(美國專利5,846,821)。然而，通過導(dǎo)入上述所提及的基因產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物在受污染的土壤中生長時，由于積累了重金屬其生長受到限制，并且它們產(chǎn)生污染的果實和作物。因此，需要尋找比野生型對重金屬吸收少并能夠甚至在受重金屬污染的環(huán)境中保持健康生長的植物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種基因，當(dāng)它在植物中表達時，可以賦予對重金屬的抗性并且能抑制重金屬的積累。本發(fā)明的另一目的是提供攜帶有重金屬抗性基因的重組載體。本發(fā)明另一目的是提供一種產(chǎn)生具有重金屬抗性轉(zhuǎn)化體并且比野生型植物累積較少重金屬的方法。本發(fā)明另一目的是提供一種具有重金屬抗性并且比野生型植物積累較少重金屬的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明另一目的是提供一種將污染的區(qū)域轉(zhuǎn)化為環(huán)境良好空間的方法。為達到上述目的，本發(fā)明提供了一種重組載體，它包含重金屬轉(zhuǎn)移P型ATPase的編碼序列，其中該編碼序列可操縱地連接植物表達的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列，并受所述調(diào)控序列的調(diào)節(jié)控制。本發(fā)明還提供一種用重組載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物或其部分。本發(fā)明還提供轉(zhuǎn)基因植物細胞。本發(fā)明還提供一種用重組載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明還提供一種重組載體，其包括SEQIDNO1的編碼重金屬轉(zhuǎn)移P型ATPase，ZntA序列；其中該編碼序列操縱地連接于并受可植物表達的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列調(diào)控；和其中ZntA包含約100個氨基酸殘基N端延伸區(qū)域、第一跨膜區(qū)、包含推定的陽離子通道基序CPX區(qū)的第二跨膜區(qū)、第三跨膜區(qū)，第一胞質(zhì)區(qū)、第二胞質(zhì)區(qū)和C末端區(qū)。本發(fā)明還提供一種含有重金屬轉(zhuǎn)移P型ATPase，ZntA的編碼序列的重組載體其中該編碼序列可操縱地連接于植物表達的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列，并受所述調(diào)控序列的調(diào)節(jié)控制；其中的ZntA包含約100個氨基酸殘基的N端延伸區(qū)域、第一跨膜區(qū)、包含推定的陽離子通道基序CPX區(qū)的第二跨膜區(qū)、第三跨膜區(qū)，第一胞質(zhì)區(qū)、第二胞質(zhì)區(qū)和C末端區(qū)；和其中所述編碼序列的每個區(qū)與SEQIDNO1中相同區(qū)至少有50％的同源性。本發(fā)明還提供一種產(chǎn)生對重金屬具有促進抗性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括(a)制備包含重金屬轉(zhuǎn)移P型ATPase編碼序列的表達構(gòu)建體，該編碼序列可操縱地連接于植物表達的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列，并受所述調(diào)控序列的調(diào)節(jié)控制；(b)制備攜帶有所述表達構(gòu)建體的重組載體；和(c)將重組載體的表達構(gòu)建體導(dǎo)入到植物細胞或植物組織以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細胞或轉(zhuǎn)基因植物組織。附圖簡要說明圖1表示重組載體pEZG的圖譜。圖2表示擬南芥中表達ZntA蛋白在細胞質(zhì)膜上的定位。圖3是表示擬南芥原生質(zhì)體中表達ZntA蛋白在膜上的定位的Western印跡圖。圖4表示重組載體pBI121/zntA的圖譜。圖5是Northern印跡圖，表示在擬南芥中zntAmRNA的表達。圖6表示在含有鉛的培養(yǎng)基中生長的zntA轉(zhuǎn)基因植株比野生型植株的生長勢要好(enhancedgrowth)。圖7表示在含有鎘的培養(yǎng)基中生長的zntA轉(zhuǎn)基因植株比野生型植株的生長勢要好。圖8表示在含有重金屬的培養(yǎng)基上培養(yǎng)用zntA轉(zhuǎn)基因的植株的重量。圖9表示zntA轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株在含有重金屬的培養(yǎng)基上生長的葉綠素含量。圖10表示zntA轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株在含有重金屬的培養(yǎng)基上生長后，重金屬含量。優(yōu)選實施方案的詳細描述在本發(fā)明中，術(shù)語“P型ATPase”是指通過利用自ATP水解的能量可運輸特定物質(zhì)并形成磷酸化中間體的轉(zhuǎn)運蛋白。更具體地，P型ATPase是一種重金屬運輸ATPase。重金屬是指比重超過4的金屬元素，包括砷(As)、銻(Sb)、鉛(Pb)、汞(Hg)、鎘(Cd)、鉻、錫(Sn)、鋅、鋇(Ba)、鎳(Ni)、鉍(Bi)、鈷(Co)、錳(Mn)、鐵(Fe)、銅(Cu)和釩(V)。ZntA是大腸桿菌的一種P型ATPase(RensingC，MitraB，RosenBP.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94，14326-31；Sharma，R.，Rensing，C.Rosen，B.P.，Mitra，B.(2000)J.Biol.Chem.275，3873-8)，可泵送Pb(II)/Cd(II)/Zn(II)通過質(zhì)膜。P型ATPase典型地含有2個大的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和6個跨膜結(jié)構(gòu)域。ZntA具有類似的結(jié)構(gòu)域，此外在N末端有2個以上(more)跨膜螺旋和包含CXXC基序的大約100個氨基酸的N末端延伸區(qū)。ZntA的第一個大的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域約145個氨基酸長并參與磷酸中間體的水解，第二個大的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域為280個氨基酸長并含有磷酸化基序。我們將N末端側(cè)的4個跨膜螺旋區(qū)定名為第一跨膜區(qū)(transmembranespanningdomain)。在兩個大的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域之間的2個跨膜螺旋區(qū)命名為第二跨膜區(qū)。該區(qū)包含被推定為陽離子通道基序CPX結(jié)構(gòu)域。在第二個大的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和C末端之間的跨膜螺旋區(qū)命名為第三跨膜區(qū)。第三跨膜區(qū)之后的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域命名為ZntA的C末端區(qū)。術(shù)語“同源性”是指兩個DNA或蛋白分子之間的序列相似性?！熬哂猩飳W(xué)活性ZntA類的重金屬泵送ATPase”是由與ZntA至少有50％同源性的DNA序列所編碼，并具有重金屬泵送活性。具有ZntA類生物學(xué)活性的重金屬汞送ATPase包括鋅轉(zhuǎn)運ATPase(NC_000913)、鋅轉(zhuǎn)運ATPase(NC_002655)、重金屬轉(zhuǎn)運ATPase(NC_003198)、P型ATPase家族(NC_003197)、來源于麻風(fēng)桿菌(Mycobacteriumlepraed)的陽離子轉(zhuǎn)運P型ATPase(GenBank#Z46257)及其它一些成員?！爸亟饘倏剐缘鞍住笔侵改軌蚪閷?dǎo)對至少一種重金屬產(chǎn)生抗性的蛋白質(zhì)，其中重金屬包括但不限于鉛、鎘和鋅。SEQIDNO1所示的ZntA蛋白是重金屬抗性蛋白的一個例子。術(shù)語“可植物表達的”(plant-expressible)意指編碼序列可操縱地連接于植物表達的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列并受所述調(diào)控序列的調(diào)節(jié)控制，其能夠通過植物細胞、組織、植物的部分或整株植物來有效的進行表達?！翱芍参锉磉_的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列”是指可以在植物、植物組織、植物的部分或植物細胞中起作用而影響與之相關(guān)的靶序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯表達。包括欲表達的靶序列的5｀端序列，可以定性控制基因的表達(控制基因?qū)Νh(huán)境信號例如光的反應(yīng)時是否表達或者組織特異性表達的模式)；和可有利于提高下游基因的表達水平的定量調(diào)控序列。核糖體結(jié)合位點序列是翻譯調(diào)控序列基序的一個例子。聚腺苷酸信號是位于下游靶序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的例子，以及其它在植物分子生物學(xué)本領(lǐng)域中非常熟知的一些?！稗D(zhuǎn)基因植物”是指經(jīng)過遺傳修飾而不同于野生型的植物。轉(zhuǎn)基因植物典型的是表達異源DNA序列，而賦予植物不同于野生型植株的一些特征。在本發(fā)明中作為具體的例子，轉(zhuǎn)基因植物是通過遺傳修飾而含有和表達至少一個可操縱地連接于轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列并受其調(diào)控的異源DNA序列，其中所述調(diào)控序列可在植物細胞或組織、或整株植物中具有功能。本發(fā)明提供一種可在植物表達的構(gòu)建體，它包括一個重金屬轉(zhuǎn)運ATPase蛋白的編碼序列。該編碼序列可操縱地連接于植物表達的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列并受其調(diào)控。重金屬包括砷(As)、銻(Sb)、鉛(Pb)、汞(Hg)、鎘(Cd)、鉻、錫(Sn)、鋅、鋇(Ba)、鎳(Ni)、鉍(Bi)、鈷(Co)、錳(Mn)、鐵(Fe)、銅(Cu)和釩(V)。表達構(gòu)建體包括啟動子、重金屬轉(zhuǎn)運ATPase基因和轉(zhuǎn)錄終止子。合適的植物表達啟動子包括花椰菜花葉病毒(CauliflowerMosaicrirus)的35S或19S啟動子；根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)Ti質(zhì)粒的nos(胭脂堿合成酶)、ocs(章魚堿合成酶)、或mas(甘露氨酸合成酶)啟動子以及其它本領(lǐng)域已知的一些例子。本發(fā)明中重金屬轉(zhuǎn)運ATPase基因優(yōu)選地編碼ZntA(SEQIDNO1)或與ZntA至少有50％同源性并編碼了具有重金屬泵送活性的蛋白質(zhì)的具有ZntA類生物活性的重金屬泵ATPase基因。本發(fā)明的重金屬轉(zhuǎn)運ATPase基因也優(yōu)選地包含ZntA的約100個氨基酸殘基的N末端延伸區(qū)、第一跨膜區(qū)、包含有推定的陽離子通道基序CPX區(qū)的第二跨膜區(qū)、第三跨膜區(qū)，第一胞質(zhì)區(qū)、第二胞質(zhì)區(qū)和C末端區(qū)的DNA序列、或者與生物活性的ZntA類重金屬泵ATPase基因上述所提及的結(jié)構(gòu)域至少50％同源性的DNA序列。本發(fā)明的表達構(gòu)建體可以進一步包括標(biāo)記以用于在植物細胞中篩選轉(zhuǎn)化體或顯示靶蛋白的定位。標(biāo)記的例子包括對抗生素如卡那霉素、潮霉素、慶大霉素和博來霉素有抗性的基因；和編碼了GUS(β-葡糖醛酸糖苷酶)、CAT(氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)、熒光素酶和GFP(綠色熒光蛋白)的基因。這些標(biāo)記可以成功的篩選在含有特定抗生素的培養(yǎng)基中生長的轉(zhuǎn)化植物細胞，因為它們攜帶了針對該抗生素的抗性基因的表達構(gòu)建體。此外，本發(fā)明提供包含所述表達構(gòu)建體的重組載體。所述重組載體包括了普通載體的骨架和表達構(gòu)建體。普通載體優(yōu)選自pROKII、pBI76、pET21、pSK(+)、pLSAGPT、pBI121和pGEM。本發(fā)明已制備的重組載體是PBI121/zntA和pEZG。PBI121/zntA包括PBI121的骨架、CMV的35S啟動子、zntA基因、胭脂堿合成酶的終止子；pEZG包括pUC的骨架、CMV的35S啟動子、zntA基因、綠色熒光蛋白和胭脂堿合成酶的終止子。本發(fā)明還提供包含所述表達構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體。所述轉(zhuǎn)化體包括編碼重金屬轉(zhuǎn)運P型ATPase的DNA序列，其中DNA序列可操縱地連接于轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列，并受所述調(diào)控序列的調(diào)節(jié)控制。所述轉(zhuǎn)化體優(yōu)選的是植物，更具體的是植物或其部分和植物細胞。植物部分包括種子。可以是草本植物和樹木，包括開花植物、園藝植物、洋蔥、胡蘿卜、黃瓜、橄欖樹、甘薯、馬鈴薯、甘藍、蘿卜、萵苣、嫩莖花椰菜、煙草(Nicotianatabacum)、矯牽牛(Petuniahybrida)、向日葵、芥菜(Brassicajuncea)、草皮草(turf)、擬南芥、大白菜(Brassicacampestris)、白樺(Betulaplatyphylla)、白楊、雜交白楊和Betulaschmidtii。產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體技術(shù)是熟知的。實例為根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)化。優(yōu)選的，可通過電激法、微粒子注射法或基因槍法聯(lián)合使用生成重組根癌農(nóng)桿菌。此外，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生促進對重金屬抗性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括(a)制備包含編碼重金屬轉(zhuǎn)移P型ATPase的可植物表達序列的表達構(gòu)建體，其可操縱地連接于轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列，并受所述調(diào)控序列的調(diào)節(jié)控制；(b)制備攜帶有所述表達構(gòu)建體的重組載體；和(c)將重組載體的表達構(gòu)建體導(dǎo)入到植物細胞或植物組織中以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細胞或轉(zhuǎn)基因植物組織。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法進一步還包括如下步驟(d)從步驟(c)所述的轉(zhuǎn)基因植物細胞或轉(zhuǎn)基因植物組織再生轉(zhuǎn)基因植物。在本發(fā)明中，ZntA蛋白在細胞質(zhì)膜中表達(圖2和3)。而且，用ZntA轉(zhuǎn)基因的擬南芥植株表現(xiàn)出對鉛和鎘的抗性，鉛和鎘的含量比野生型植株的要低。因此，用zntA轉(zhuǎn)基因的植物或用編碼具有生物活性的ZntA類重金屬泵ATPase的基因轉(zhuǎn)化的植物可以在污染了重金屬的環(huán)境中生長，而且該技術(shù)也可用于產(chǎn)生減少對有害重金屬吸收的作物。由于有害重金屬通過如黃沙現(xiàn)象或自然災(zāi)害而不經(jīng)意地流入農(nóng)田中，重金屬泵送轉(zhuǎn)基因的作物可以作為注重健康的消費者的安全選擇。下面所提供的實施例用以說明的目的而不是對本發(fā)明所要求的保護范圍的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明所提供例舉的組合物和方法的進行任何改變都落于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。實施例1zntA基因的分離大腸桿菌K-12來源于韓國生物科學(xué)和生物技術(shù)研究所韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KoreanCollectionofTypeCulturesoftheKoreaResearchInstituteofBioscienceandBiotechnology)，zntA基因被克隆。zntA是通過用大腸桿菌K-12菌株的基因組DNA作模板經(jīng)PCR分離的。用SEQIDNO2和SEQIDNO3作引物組進行PCR，獲得2.2kb的PCR產(chǎn)物，得到了SEQIDNO1所示的zntA。分析了PCR產(chǎn)物的序列并將PCR產(chǎn)物克隆到pGEM-T簡易載體中以產(chǎn)生pGEM-T/zntA。實施例2ZntA蛋白的表達將zntA基因?qū)氲綌M南芥的原生質(zhì)體中，并研究所表達的ZntA蛋白的部位(localization)。(2-1)擬南芥(Arabidopsis)原生質(zhì)體的制備擬南芥原生質(zhì)體的制備按照所述的方法進行(AbelS，TheologisA(1994)TransienttransformationofArabidopsisleafprotoplastsaversatileexperimentalsystemtostudygeneexpression.PlantJ.5，421-7)。將擬南芥種子置于防腐(antiseptic)溶液(蒸餾水∶chlorox∶0.05％tritonX-100＝3∶2∶2)，搖動20-30秒，于室溫下培養(yǎng)5-10分鐘。種子再用蒸餾水沖洗5次。將擬南芥種子在100ml液體溶液中培養(yǎng)((Murashige&Skoog)培養(yǎng)基；MSMO，pH5.7-5.8)，其包含有維生素，Duchefa4.4g/L，蔗糖20g/L，MES(2-(N-嗎啉基)乙磺酸，2-(N-Morpholino)Ethanesulfonicacid，Sigma)0.5g/L，并于22℃，120rpm攪拌，16/8小時(光照/黑暗)的光照周期下培養(yǎng)2-3周。將2-3周齡的整個植株用刀切成5-10mm2的片狀。將這些葉片轉(zhuǎn)移入含酶溶液中(1％纖維素酶R-10，0.25％marcerozymeR-10，0.5M甘露醇，10mMMES，1mMCaCl2，5mMβ-巰基乙醇和0.1％BSA，pH5.8-5.9)，真空過濾10分鐘，然后于黑暗中22℃培育5小時，同時以50-75rpm輕輕攪拌。釋放出來的原生質(zhì)體用100μm篩目(mesh，SigmaS0770，USA)過濾，再用21％蔗糖密度梯度以730rpm離心10分鐘純化，然后懸浮于20ml的W5溶液中(154mmNaCl，125mMCaCl2，5mMKCl，5mM葡萄糖，和1.5mMMES，pH5.6)，再用530rpm離心6分鐘。沉淀的原生質(zhì)體重懸浮于W5溶液中，并置于冰上保存。(2-2)載體的制備pGEM-T/zntADNA用BamHI限制酶進行切割，提取zntA基因(QIAGENGelextraction試劑盒)。將zntA基因置于花椰菜花葉病毒35S啟動子控制之下，并融合接著插入到含有綠色熒光蛋白(GFP)基因和胭脂堿合成酶基因的終止子(NOS)的載體pUC-GFP中，而由此獲得載體pEZG。(2-3)制備含H+泵送基因載體擬南芥的氫離子泵送基因AHA2cDNA(GenBankP19456)通過PCR進行擴增，PCR所用的引物是SEQIDNO4和SEQIDNO5所示多核苷酸。PCR反應(yīng)的參數(shù)是94℃，30s-＞45℃，30s-＞72℃，1min，反應(yīng)50個循環(huán)。所得到的PCR產(chǎn)物就是AHA2cDNA。用BgIII/NotI限制酶處理DsRed載體(Clontech，Inc.)而得到DsRed。然后插入被BamHI/Ecl136II限制酶處理成開放型(open)的smGFP載體中而得到326RFP。進一步，AHA2cDNA插入到326RFP載體的XmaI而制成326RFP/AHA2。(2-4)將pEZG或326RFP/AHA2導(dǎo)入到原生質(zhì)體將pEZG和326RFP/AHA2導(dǎo)入到由實施例(2-1)的制備得到的原生質(zhì)體，并進一步確定外源基因的表達。原生質(zhì)體在500rpm離心5分鐘，將5×106/ml原生質(zhì)體懸浮到MaMg溶液(400mM甘露醇，15mMMgCl2，5mMMES-KOH，pH5.6)中。300μl懸浮溶液分別與10μg的pEZG和326RFP/AHA2混合，然后加入300μl的PEG(400mM甘露醇，100mMCa(NO3)2，40％PEG6000)，并于室溫下保持30分鐘。該混合物用5mlW5溶液洗滌，于500rpm離心3分鐘，得到沉淀。用2mlW5溶液洗滌沉淀，于黑暗中22-25℃下培養(yǎng)。24小時后，鑒定GFP蛋白的表達，利用ZeissAxioplan熒光顯微鏡的預(yù)冷的charge-coupled裝置照像機拍其圖像。用于GFP的過濾器是XF116(激發(fā)器(exciter)，474AF20；二色分光鏡(dichraic)，500DRLP；發(fā)射器，510AF23)(Omega，Inc.，Brattleboro，VT)。獲得的資料用Adobe(MountainView，CA)Photoshop軟件進行處理。圖2顯示融合了GFP的ZntA蛋白在用pEZG和326RFP/AHA2分別轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體中的部位?！癮”是對照；“b”是在326RFP/AHA2中表達的AHA2蛋白；“c”是pEZG中表達的ZntA蛋白；“d”是圖“b”和“c”的重疊部分。與GFP融合的ZntA由于GFP的原故而呈現(xiàn)出綠色，與DsRED融合的AHA2由于DsRed的原故而呈現(xiàn)出紅色。在圖2中，與GFP融合的ZntA在擬南芥原生質(zhì)體的細胞質(zhì)膜中的定位。此外，細胞膜和細胞溶液成分也從擬南芥原生質(zhì)體中分離出來，利用GFP抗體作為探針進行WesternBlot。圖3顯示了WesternBlot圖，其中“WT-C”是野生型擬南芥原生質(zhì)體的細胞溶膠，“WT-M”是野生型擬南芥原生質(zhì)體的膜，“ZntA-C”是用pEZG轉(zhuǎn)化的擬南芥原生質(zhì)體的細胞溶膠，“ZmA-M”是用pEZG轉(zhuǎn)化的擬南芥原生質(zhì)體的膜。在圖3中，GFP抗體只與從用pEZG轉(zhuǎn)化的擬南芥原生質(zhì)體中提取到的膜蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)，進一步確定了ZntA蛋白在膜中的表達。實施例3表達ZntA蛋白的轉(zhuǎn)基因植物的制備(3-1)擬南芥擬南芥植株于4℃生長2天，然后在16/8hr(光照/黑暗)的光周期、22/18℃的溫度下生長3-4周直到花莖(stalk)分化為止。將第1輪花莖去掉，而第2輪花莖用于轉(zhuǎn)化。(3-2)pBI121/zntA載體zntA基因插入到適合于植物表達的載體中，制備pBI121和pBI121/zntA。通過用SmaI和Ecl136II限制酶消化而去掉pBI121的GUS基因，將從pGEM/zntA中制備得到的zntA基因插入到pBI121中而得到pBI121/zntA載體(圖4)。(3-3)轉(zhuǎn)基因植物的制備用制備試劑盒(Qiagen)分離pBI121/zntA載體DNA，然后通過電穿孔導(dǎo)入到農(nóng)桿菌(agrobacterium)中。農(nóng)桿菌(KCTC10207BP)在YEP培養(yǎng)基(酵母抽提物10g，NaCl5g，蛋白胨10g，pH7.5)中培養(yǎng)，直到OD值達到0.8-1.0。培養(yǎng)液進行離心，收集細胞并重懸浮于含5％蔗糖的MS培養(yǎng)基(Morashige&Skoog培養(yǎng)，4.3g/LDuchefa)中，并在即將轉(zhuǎn)化之前加入SilwetL-77(LehleSeeds，USA)至終濃度為0.01％。為了植物轉(zhuǎn)化，將pBI121/zntA導(dǎo)入到農(nóng)桿菌LBA4404菌株中，以用于浸漬(dipping)法(CloughSJ，andBentAF(1998)，F(xiàn)loraldipasimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.PlantJ.16，735-743)轉(zhuǎn)化擬南芥。實施例4轉(zhuǎn)化體的篩選選擇zntA基因轉(zhuǎn)化的植物，將其在含有卡那霉素(50mg/l)的固體Morashige&Skoog(MS)培養(yǎng)基上生長。檢測T2或T3代種子。此外，用pBI121載體導(dǎo)入擬南芥，并選擇出其轉(zhuǎn)化體(稱為pBI121植株)。分別收獲野生型擬南芥、pBI121植株和pBI121/zntA植株的種子。為了檢測ZntA的表達水平，從卡那霉素篩選出的T2代植株中分離總RNA用于Northern印跡分析。從在1/2MS(Morashige&Skoog，2.15g/L，Duchefa)瓊脂培養(yǎng)基上生長3周的擬南芥植株中提取總RNA。后面的RNA的制備和Northem印跡方法均根據(jù)已確定的《分子克隆實驗手冊》(Sambrooketal.2001，第三版，ColdSpringHarborLaboratoryPres，ColdSpringHarbor，NY)方法進行，稍作改進。植物材料用液氮進行冷凍后，用研缽和研杵磨成粉末勻質(zhì)化。每100mg組織樣品中加入1mlTRIzol試劑(Lifetechnology，USA)，于室溫下溫育5min，再按每1mlTRIzol試劑中加入0.2ml的氯仿。于4℃，10,000g下離心10min，取水相，再按每1mlTRIzol試劑中加入0.5ml異丙醇進行沉淀，用UV光譜學(xué)進行定量。總RNA在含甲醛的瓊脂糖凝膠上進行分離，然后轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。經(jīng)UV交聯(lián)后，雜交在改進的Church緩沖液(7％(W/V)SDS，0.5M磷酸鈉緩沖液(pH7.2)，1mMEDTA(pH7.0))中于68℃過夜雜交，使用32P標(biāo)記的zntA探針。膜用含1×SSC，0.1％SDS于室溫下洗1次，時間為10min，再用含0.5×SSC，0.1％SDS于68℃下洗2次，時間為10min。再將膜暴露于phosphorimangerscreen(Fuji膠卷)或X-射線薄膜(Kodak)。用Mac-BAS圖像處理系統(tǒng)來分析mRNA的表達水平。圖5顯示了擬南芥中zntAmRNA表達的NorthernBlot圖。在野生型擬南芥和pBI121植株中沒有觀察到zntARNA的轉(zhuǎn)錄，而在pBI121/zntA植株中可以觀察到。EF1-a在植株中是組成型表達的并且水平一致，表明不同樣品中使用了相同量的RNA。實施例5zntA基因的轉(zhuǎn)化植株對重金屬的抗性野生型和pBI121/zntA植株在1/2MS瓊脂培養(yǎng)基上生長2周，然后轉(zhuǎn)移到含有70μm鎘或0.7mM鉛的1/2MS液體培養(yǎng)基中。2周后測定植株的生長狀況、重量和重金屬含量。(5-1)植株的生長狀況圖6顯示野生型和pBI121/zntA擬南芥植株在含鉛的培養(yǎng)基上的生長。圖7顯示野生型和pBI121/zntA擬南芥植株在含鎘的培養(yǎng)基上的生長?！癢T”表示野生型擬南芥，“1”到“4”表示pBI121/zntA植株。在圖6和7中，pBI121/zntA植株比野生型植株生長要好；它們的葉片更寬、更綠、葉片的鮮重也比野生型要高。這些結(jié)果表明ZntA的表達使轉(zhuǎn)基因植株對Pb(II)和Cd(II)具有了抗性。(5-2)生物量的測定野生型和pBI121/zntA擬南芥植株在1/2MS瓊脂培養(yǎng)基上生長2周然后轉(zhuǎn)移到用含有或不含有Pb(II)或Cd(II)的小砂礫(gravel)為支撐的1/2MS液體培養(yǎng)基中。再生長2周后，收獲植株。用冰預(yù)冷的1mM酒石酸(tartarate)溶液沖洗，并印干(blot-dried)。檢測野生型和pBI121/zntA擬南芥植株的重量。圖8a圖示野生型和pBI121/zntA擬南芥植株在含有鉛的培養(yǎng)基中生長的重量，圖8b圖示野生型和pBI121/zntA擬南芥植株在含有鎘的培養(yǎng)基中生長后的重量。pBI121/zntA植株比野生型擬南芥的重量要高。這些結(jié)果表明表達ZntA蛋白的植株比野生型植株在重金屬污染的土壤中生長要好。(5-3)葉綠素含量的測定為了確定葉綠素的含量，將收獲的葉片于80℃用95％乙醇抽提20min。在664nm和648nm吸光度下測定其光吸收值，用所述的方法來計算出葉綠素A和B的含量(OhSA，ParkJH，LeeGI，PaekKH，ParkSK，NamHG(1997)IdentificationofthreegeneticlocicontrollingleafsenescenceinArabidopsisthaliana.PlantJ.12，527-535)。圖9a圖示在含有鉛的培養(yǎng)基中生長的野生型和pBI121/zntA擬南芥植株的葉綠素含量，圖9b圖示野生型和pBI121/zntA擬南芥植株在含有鎘的培養(yǎng)基中生長后的葉綠素含量。用zntA-轉(zhuǎn)基因的植株比野生型擬南芥中的葉綠素含量高。(5-4)重金屬含量的測定對照植株和ZntA過量表達的植株在含有重金屬的培養(yǎng)基中生長后，測定其Pb和Cd的含量。收集pBI121/zntA植株、稱重后用65％HNO3于200℃下消化過夜。消化樣品用0.5N的HNO3稀釋，后用原子吸收光譜儀(AAS；SpectrAA-800，Varian)進行分析。圖10圖示野生型和ZntA-轉(zhuǎn)基因植株在含有重金屬的培養(yǎng)基中生長后所顯示重金屬含量。圖10a表示的是鉛含量，10b是鎘含量。PBI121/zntA植株的鉛含量在不同的株系之間有一定的變化，但總是低于野生型植株中的鉛含量。轉(zhuǎn)基因株系1和3中的Cd含量比對照植株要低。因此，用zntA或其它具有生物活性的ZntA類重金屬泵ATPase轉(zhuǎn)化的植株可以在重金屬污染的土壤中生長，且對重金屬的吸收要低于野生型植株。因此種植這種植物可以保持固定污染土壤而減少土壤的腐蝕，而且zntA的轉(zhuǎn)基因植株在重金屬污染的土壤中生長要好于野生型植株，因而可以減少污染區(qū)域中污染物的轉(zhuǎn)移進而減少污染物對地下水的污染。本發(fā)明也可以用于產(chǎn)生低重金屬含量的安全作物。序列表<110>POSCO公司(POSCO&POSTECHFOUNDATION)<120>增強抗性并減少重金屬吸收的植物遺傳改良<130>DPP011615<150>KR10-2001-17837<151>2001-04-04<150>KR10-2002-18369<151>2002-04-04<160>6<170>KopatentIn1.71<210>1<211>2199<212>DNA<213>大腸桿菌的ZntA基因<400>1atgtcgactcctgacaatcacggcaagaaagcccctcaatttgctgcgttcaaaccgcta60accacggtacagaacgccaacgactgttgctgcgacggcgcatgttccagcacgccaact120ctctctgaaaacgtctccggcacccgctatagctggaaagtcagcggcatggactgcgcc180gcctgtgcgcgcaaggtagaaaatgccgtgcgccagcttgcaggcgtgaatcaggtgcag240gtgttgttcgccaccgaaaaactggtggtcgatgccgacaatgacattcgtgcacaagtt300gaatctgcgctgcaaaaagcaggctattccctgcgcgatgaacaggccgccgaagaaccg360caagcatcacgcctgaaagagaatctgccgctgattacgctaatcgtgatgatggcaatc420agctggggtctggagcagttcaatcatccgttcgggcaactggcgtttatcgcgaccacg480ctggttgggctgtacccgattgctcgtcaggcattacggttgatcaaatccggcagctac540ttcgccattgaaaccttaatgagcgtagccgctattggtgcactgtttattggcgcaacg600gctgaagctgcgatggtgttgctgctgtttttgattggtgaacgactggaaggctgggcc660gccagccgcgcgcgtcagggcgttagcgcgttaatggcgctgaaaccagaaaccgccacg720cgcctgcgtaagggtgagcgggaagaggtggcgattaacagcctgcgccctggcgatgtg780attgaagtcgccgcaggtgggcgtttgcctgccgacggtaaactgctctcaccgtttgcc840agttttgatgaaagcgccctgaccggcgaatccattccggtggagcgcgcaacgggcgat900aaagtccctgctggtgccaccagcgtagaccgtctggtgacgttggaagtgctgtcagaa960ccgggagccagcgccattgaccggattctgaaactgatcgaagaagccgaagagcgtcgc1020gctcccattgagcggtttatcgaccgtttcagccgtatctatacgcccgcgattatggcc1080gtcgctctgctggtgacgctggtgccaccgctgctgtttgccgccagctggcaggagtgg1140atttataaagggctgacgctgctgctgattggctgcccgtgtgcgttagttatctcaacg1200cctgcggcgattacctccgggctggcggcggcagcgcgtcgtggggcgttgattaaaggc1260ggagcggcgctggaacagctgggtcgtgttactcaggtggcgtttgataaaaccggtacg1320ctgaccgtcggtaaaccgcgcgttaccgcgattcatccggcaacgggtattagtgaatct1380gaactgctgacactggcggcggcggtcgagcaaggcgcgacgcatccactggcgcaagcc1440atcgtacgcgaagcacaggttgctgaactcgccattcccaccgccgaatcacagcgggcg1500ctggtcgggtctggcattgaagcgcaggttaacggtgagcgcgtattgatttgcgctgcc1560gggaaacatcccgctgatgcatttactggtttaattaacgaactggaaagcgccgggcaa1620acggtagtgctggtagtacgtaacgatgacgtgcttggtgtcattgcgttacaggatacc1680ctgcgcgccgatgctgcaactgccatcagtgaactgaacgcgctgggcgtcaaaggggtg1740atcctcaccggcgataatccacgcgcagcggcggcaattgccggggagctggggctggag1800tttaaagcgggcctgttgccggaagataaagtcaaagcggtgaccgagctgaatcaacat1860gcgccgctggcgatggtcggtgacggtattaacgacgcgccagcgatgaaagctgccgcc1920atcgggattgcaatgggtagcggcacagacgtggcgctggaaaccgccgacgcagcatta1980acccataaccacctgcgcggcctggtgcaaatgattgaactggcacgcgccactcacgcc2040aatatccgccagaacatcactattgcgctggggctgaaagggatcttcctcgtcaccacg2100ctgttagggatgaccgggttgtggctggcagtgctggcagatacgggggcgacggtgctg2160gtgacagcgaatgcgttaagattgttgcgcaggagataa2199<210>2<211>732<212>PRT<213>大腸桿菌的ZntA蛋白<400>2MetSerThrProAspAsnHisGlyLysLysAlaProGlnPheAlaAla151015PheLysProLeuThrThrValGlnAsnAlaAsnAspCysCysCysAsp202530GlyAlaCysSerSerThrProThrLeuSerGluAsnValSerGlyThr354045ArgTyrSerTrpLysValSerGlyMetAspCysAlaAlaCysAlaArg505560LysValGluAsnAlaValArgGlnLeuAlaGlyValAsnGlnValGln65707580ValLeuPheAlaThrGluLysLeuValValAspAlaAspAsnAspIle859095ArgAlaGlnValGluSerAlaLeuGlnLysAlaGlyTyrSerLeuArg100105110AspGluGlnAlaAlaGluGluProGlnAlaSerArgLeuLysGluAsn115120125LeuProLeuIleThrLeuIleValMetMetAlaIleSerTrpGlyLeu130135140GluGlnPheAsnHisProPheGlyGlnLeuAlaPheIleAlaThrThr145150155160LeuValGlyLeuTyrProIleAlaArgGlnAlaLeuArgLeuIleLys165170175SerGlySerTyrPheAlaIleGluThrLeuMetSerValAlaAlaIle180185190GlyAlaLeuPheIleGlyAlaThrAlaGluAlaAlaMetValLeuLeu195200205LeuPheLeuIleGlyGluArgLeuGluGlyTrpAlaAlaSerArgAla210215220ArgGlnGlyValSerAlaLeuMetAlaLeuLysProGluThrAlaThr225230235240ArgLeuArgLysGlyGluArgGluGluValAlaIleAsnSerLeuArg245250255ProGlyAspValIleGluValAlaAlaGlyGlyArgLeuProAlaAsp260265270GlyLysLeuLeuSerProPheAlaSerPheAspGluSerAlaLeuThr275280285GlyGluSerIleProValGluArgAlaThrGlyAspLysValProAla290295300GlyAlaThrSerValAspArgLeuValThrLeuGluValLeuSerGlu305310315320ProGlyAlaSerAlaIleAspArgIleLeuLysLeuIleGluGluAla325330335GluGluArgArgAlaProIleGluArgPheIleAspArgPheSerArg340345350IleTyrThrProAlaIleMetAlaValAlaLeuLeuValThrLeuVal355360365ProProLeuLeuPheAlaAlaSerTrpGlnGluTrpIleTyrLysGly370375380LeuThrLeuLeuLeuIleGlyCysProCysAlaLeuValIleSerThr385390395400ProAlaAlaIleThrSerGlyLeuAlaAlaAlaAlaArgArgGlyAla405410415LeuIleLysGlyGlyAlaAlaLeuGluGlnLeuGlyArgValThrGln420425430ValAlaPheAspLysThrGlyThrLeuThrValGlyLysProArgVal435440445ThrAlaIleHisProAlaThrGlyIleSerGluSerGluLeuLeuThr450455460LeuAlaAlaAlaValGluGlnGlyAlaThrHisProLeuAlaGlnAla465470475480IleValArgGluAlaGlnValAlaGluLeuAlaIleProThrAlaGlu485490495SerGlnArgAlaLeuValGlySerGlyIleGluAlaGlnValAsnGly5005055l0GluArgValLeuIleCysAlaAlaGlyLysHisProAlaAspAlaPhe515520525ThrGlyLeuIleAsnGluLeuGluSerAlaGlyGlnThrValValLeu530535540ValValArgAsnAspAspValLeuGlyValIleAlaLeuGlnAspThr545550555560LeuArgAlaAspAlaAlaThrAlaIleSerGluLeuAsnAlaLeuGly565570575ValLysGlyValIleLeuThrGlyAspAsnProArgAlaAlaAlaAla580585590IleAlaGlyGluLeuGlyLeuGluPheLysAlaGlyLeuLeuProGlu595600605AspLysValLysAlaValThrGluLeuAsnGlnHisAlaProLeuAla610615620MetValGlyAspGlyIleAsnAspAlaProAlaMetLysAlaAlaAla625630635640IleGlyIleAlaMetGlySerGlyThrAspValAlaLeuGluThrAla645650655AspAlaAlaLeuThrHisAsnHisLeuArgGlyLeuValGlnMetIle660665670GluLeuAlaArgAlaThrHisAlaAsnIleArgGlnAsnIleThrIle675680685AlaLeuGlyLeuLysGlyIlePheLeuValThrThrLeuLeuGlyMet690695700ThrGlyLeuTrpLeuAlaValLeuAlaAspThrGlyAlaThrValLeu705710715720ValThrAlaAsnAlaLeuArgLeuLeuArgArgArg725730<210>3<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>3ggatccaaagagtaaagaagaacaatgtcgactcctgacaat42<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>4ggatccctctcctgcgcaacaatct25<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>5gagatgtcgagtctcgaa18<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>6ctcgagcacagtgtagtgactgg23PCT/RO/134表關(guān)于微生物保藏的說明(細則13之二)PCT/RO/134表(1998年7月)權(quán)利要求1.一種重組載體，包括重金屬轉(zhuǎn)移P型ATPase的編碼序列，其中該編碼序列可操縱地連接于可植物表達的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列，并受所述調(diào)控序列的調(diào)節(jié)控制。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組載體，其中所述重金屬至少一種選自砷、銻、鉛、汞、鎘、鉻、錫、鋅、鋇、鎳、鉍、鈷、錳、鐵、銅、釩。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組載體，其中P型ATPase是ZntA。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體，其中ZntA具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組載體，其中編碼序列是類ZntA重金屬泵ATPase基因，其包括與SEQIDNO1所示核苷酸序列的ZntA有至少50％同源性的核苷酸序列。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組載體，其中重組載體是PBI121/zntA或pEZG。7.一種用權(quán)利要求1所述重組載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物或其部分。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)基因植物或其部分，其中所述重金屬至少一種選自砷、銻、鉛、汞、鎘、鉻、錫、鋅、鋇、鎳、鉍、鈷、錳、鐵、銅、釩。9.一種用權(quán)利要求1所述重組載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物細胞。10.根據(jù)權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)基因植物細胞，其中重金屬至少一種選自砷、銻、鉛、汞、鎘、鉻、錫、鋅、鋇、鎳、鉍、鈷、錳、鐵、銅、釩。11.一種由權(quán)利要求1所述的重組載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物。12.根據(jù)權(quán)利要求11的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述重金屬至少一種選自砷、銻、鉛、汞、鎘、鉻、錫、鋅、鋇、鎳、鉍、鈷、錳、鐵、銅、釩。13.一種用權(quán)利要求5所述重組載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物或其部分。14.根據(jù)權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)基因植物或其部分，其中重金屬至少一種選自砷、銻、鉛、汞、鎘、鉻、錫、鋅、鋇、鎳、鉍、鈷、錳、鐵、銅、釩。15.一種由權(quán)利要求5所述的重組載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物細胞。16.根據(jù)權(quán)利要求15的轉(zhuǎn)基因植物細胞，其中所述重金屬至少一種選自砷、銻、鉛、汞、鎘、鉻、錫、鋅、鋇、鎳、鉍、鈷、錳、鐵、銅、釩。17.一種由權(quán)利要求5所述的重組載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物。18.根據(jù)權(quán)利要求17的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述重金屬至少一種選自砷、銻、鉛、汞、鎘、鉻、錫、鋅、鋇、鎳、鉍、鈷、錳、鐵、銅、釩。19.一種包括SEQIDNO1的編碼重金屬轉(zhuǎn)移P型ATPase，ZntA序列的重組載體其中該編碼序列可操縱地連接于可植物表達的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列，并受所述調(diào)控序列的調(diào)節(jié)控制；和其中ZntA包含大約100個氨基酸殘基的N末端延伸區(qū)、第一跨膜區(qū)、包含推定的陽離子通道基序CPX區(qū)的第二跨膜區(qū)、第三跨膜區(qū)，第一胞質(zhì)區(qū)、第二胞質(zhì)區(qū)和C末端區(qū)。20.一種用權(quán)利要求19所述重組載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物或其部分。21.根據(jù)權(quán)利要求20的轉(zhuǎn)基因植物或其部分，其中所述重金屬至少一種選自砷、銻、鉛、汞、鎘、鉻、錫、鋅、鋇、鎳、鉍、鈷、錳、鐵、銅、釩。22.一種用權(quán)利要求19所述重組載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物細胞。23.根據(jù)權(quán)利要求22的轉(zhuǎn)基因植物細胞，其中所述重金屬至少一種選自砷、銻、鉛、汞、鎘、鉻、錫、鋅、鋇、鎳、鉍、鈷、錳、鐵、銅、釩。24.一種由權(quán)利要求19所述的重組載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物。25.根據(jù)權(quán)利要求24的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述重金屬至少一種選自砷、銻、鉛、汞、鎘、鉻、錫、鋅、鋇、鎳、鉍、鈷、錳、鐵、銅、釩。26.一種包括編碼重金屬轉(zhuǎn)移P型ATPase，ZntA序列的重組載體其中該編碼序列可操縱地連接于可植物表達的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列，并受所述調(diào)控序列的調(diào)節(jié)控制；其中ZntA包含大約100個氨基酸殘基的N末端延伸區(qū)、第一跨膜區(qū)、包含推定的陽離子通道基序CPX區(qū)的第二跨膜區(qū)、第三跨膜區(qū)，第一胞質(zhì)區(qū)、第二胞質(zhì)區(qū)和C末端區(qū)；和其中編碼序列每個區(qū)與SEQIDNO1的相同區(qū)至少約有50％的同源性。27.一種用權(quán)利要求26所述重組載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物或其部分。28.根據(jù)權(quán)利要求27的轉(zhuǎn)基因植物或其部分，其中所述重金屬至少一種選自砷、銻、鉛、汞、鎘、鉻、錫、鋅、鋇、鎳、鉍、鈷、錳、鐵、銅、釩。29.一種用權(quán)利要求26所述重組載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物細胞。30.根據(jù)權(quán)利要求29的轉(zhuǎn)基因植物細胞或其部分，其中所述重金屬至少一種選自砷、銻、鉛、汞、鎘、鉻、錫、鋅、鋇、鎳、鉍、鈷、錳、鐵、銅、釩。31.一種由權(quán)利要求30所述的重組載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物。32.根據(jù)權(quán)利要求31的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述重金屬至少一種選自砷、銻、鉛、汞、鎘、鉻、錫、鋅、鋇、鎳、鉍、鈷、錳、鐵、銅、釩。33.一種產(chǎn)生增強對重金屬抗性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括(a)制備包含重金屬轉(zhuǎn)移P型ATPase的編碼序列的表達構(gòu)建體，該編碼序列可操縱地連接于可植物表達轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列，并受所述調(diào)控序列的調(diào)節(jié)控制；(b)制備攜帶有所述表達構(gòu)建體的重組載體；和(c)將重組載體的表達構(gòu)建體導(dǎo)入植物細胞或植物組織以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細胞或轉(zhuǎn)基因植物組織。34.根據(jù)權(quán)利要求33所述產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物方法，其中的重金屬至少一種選自砷、銻、鉛、汞、鎘、鉻、錫、鋅、鋇、鎳、鉍、鈷、錳、鐵、銅、釩。35.根據(jù)權(quán)利要求33所述產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物方法，進一步包括如下步驟從步驟(c)所述的轉(zhuǎn)基因植物細胞或轉(zhuǎn)基因植物組織再生轉(zhuǎn)基因植物。全文摘要本發(fā)明涉及產(chǎn)生促進對重金屬的抗性和減少重金屬吸收的轉(zhuǎn)化體的方法，以及用可將重金屬從細胞中泵出的P型ATPaseZntA基因轉(zhuǎn)化的植物。所述轉(zhuǎn)化體在被重金屬污染的環(huán)境中表現(xiàn)出比野生型植株更好的生長性能，并且重金屬含量比野生型植物低。因此，用ZntA或具有生物活性的ZntA類重金屬泵送ATPase轉(zhuǎn)化植物的方法可以開發(fā)用于植物補救的植物和開發(fā)對重金屬有抗性且重金屬含量低的安全作物。文檔編號C12N9/14GK1551921SQ02810289公開日2004年12月1日申請日期2002年4月4日優(yōu)先權(quán)日2001年4月4日發(fā)明者李永叔,梁泳烈,黃仁煥,裵玹珠,李周泫,恩里克·馬蒂諾亞,馬蒂諾亞申請人:Posco公司,學(xué)校法人浦項工科大學(xué)校