專利名稱：茶樹種性抗性與表現(xiàn)抗性生理鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及到一種茶樹種性抗性與表現(xiàn)抗性生理鑒定方法。
背景技術(shù)：
超氧化物歧化酶(S0D酶)活性和膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量通常被作為植物抗逆性的生理鑒定指標(biāo)而在逆境生理研究中得到廣泛應(yīng)用。SOD酶作為植物體內(nèi)超氧自由基的清除劑，活性高低與膜穩(wěn)定性呈正相關(guān)，反映的是茶樹抵御外界不利因素的能力；MDA植物在逆境條件下會發(fā)生膜脂過氧化作用，MDA是膜脂過氧化的最終產(chǎn)物之一，其含量變化常用來反映植物所受脅迫的傷害程度。茶樹在種植過程中，其抗性除了受種性抗性影響外，還受環(huán)境、氣候、生產(chǎn)管理水平等因素的制約，而表現(xiàn)出抗性差異。即同一品種在不同的環(huán)境、氣候、管理水平下其表現(xiàn)抗性有所不同。本方法以反映茶樹抗性能力的SOD酶和茶樹受脅迫程度的丙二醛為指標(biāo)，從茶樹種性抗性和表現(xiàn)抗性兩個角度加以評價，所得結(jié)果與茶樹抗性田間呈現(xiàn)結(jié)果一致，能較準(zhǔn)確地從生理角度對茶樹抗性進(jìn)行評價。目前，有關(guān)茶樹生理生化分析還沒有統(tǒng)一的取樣部位。羅軍武、唐和平、黃意歡等在研究茶樹不同抗寒性品種間保護(hù)酶類活性的差異時，選用的是成齡茶樹的成熟春葉(自上至下第二葉)；王玉、洪永聰、丁兆堂等在利用茶樹葉片解剖結(jié)構(gòu)指數(shù)預(yù)測茶樹種質(zhì)材料的抗寒性研究中采用的是枝條頂端以下第二張成熟葉片；而魏鵬在研究茶樹抗旱性部分生理生化指標(biāo)時候采用的則是生長高度相近的新梢芽下第2葉和第3葉。本人通過對茶樹無性系后代間抗性生理因子的差異進(jìn)行研究，結(jié)果表明茶樹抗性生理指標(biāo)在茶樹葉片中的分布以第3、第11位最為穩(wěn)定，自第7位葉以后酶活性基本維持在一定水平，這表明茶樹無性系后代不但能繼承母本的形態(tài)特征，保持整齊化一的特點(diǎn)，在生理生化特性方面，本質(zhì)上也具有一致性。然而茶樹是多年生作物，各種生理指標(biāo)與外界環(huán)境因素及栽培條件和管理水平密切相關(guān)，修剪、采摘、病蟲害、光線、溫度等都會對茶樹生理生化因子造成一定的影響。此外，由于茶樹本身具有的品種差異性，因而取樣部位是否具有良好的代表性，在很大程度上決定了茶樹生理檢測的準(zhǔn)確性。本方法采用未修剪、具有明顯葉位變化的茶樹枝條，自上而下采集木質(zhì)化部位第一片、同一著生方向、無病蟲害且完整的葉片能較好代表茶樹的整體生理性狀。
此外，在10°C 13°C休眠臨界狀態(tài)時，各品種茶樹SOD酶活性和MDA含量基本維持同一水平，而后隨溫度的下降，因其抗性大小而有所分化。因而，根據(jù)其生理指標(biāo)的變化趨勢，可以對茶樹種性抗性和表現(xiàn)抗性作一鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有茶樹抗性生理鑒定的方法還不是很成熟的情況下，本發(fā)明提供了一種茶樹種性抗性與表現(xiàn)抗性生理鑒定方法，即以10°C 13°C茶樹臨界休眠狀態(tài)時，選取未修 剪、具有明顯葉位變化的茶樹枝條，采集葉片，帶回實驗室后，進(jìn)行種性抗性指標(biāo)(S0D酶)和表現(xiàn)抗性指標(biāo)(MDA)基礎(chǔ)值檢測；而后當(dāng)氣溫降至0°C以下時，按上述方法對茶樹種性抗性和表現(xiàn)抗性指標(biāo)重新測定后，依指標(biāo)變化趨勢對茶樹抗性進(jìn)行評價。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)
茶樹種性抗性與表現(xiàn)抗性生理鑒定方法，包括選穗、葉片采集、洗凈、擦干、打孔取樣、研磨、離心、抗性指標(biāo)檢測和抗性評價步驟；具體是在10°c 13°C茶樹休眠臨界狀態(tài)時，選取未修剪的枝條，采集葉片，進(jìn)行種性抗性指標(biāo)SOD酶和表現(xiàn)抗性指標(biāo)MDA基礎(chǔ)值的檢測；而后當(dāng)氣溫降至(TC以下時，按上述方法對茶樹種性抗性指標(biāo)SOD酶和表現(xiàn)抗性指標(biāo)MDA重新測定后，依指標(biāo)數(shù)值的變化趨勢對茶樹抗性進(jìn)行評價。茶樹種性抗性與表現(xiàn)抗性生理鑒定方法，所述的選穗、葉片采集為在10°C 13°C茶樹休眠臨界狀態(tài)時，選取未修剪的茶樹枝條，自上而下采集木質(zhì)化部位第一片葉，裝入塑料袋內(nèi)封口，貯于底部置有冰塊的保溫箱內(nèi)，帶回實驗室備用。茶樹種性抗性與表現(xiàn)抗性生理鑒定方法，所述的打孔取樣、研磨、離心為選取的 葉片用蒸餾水沖洗兩次，并用潔凈濾紙吸干，用打孔器，避開葉片主脈打取Φ=0. 5cm圓形葉片作為SOD酶、丙二醛測試材料；按SOD酶和丙二醛檢測方法分別稱取O. 5g和O. 2g，分別添加2ml緩沖液和少許石英砂及適量不溶性吡咯烷酮，所述的SOD酶為O. lmol/1預(yù)冷的pH7. 8磷酸緩沖液，丙二醛為10%三氯乙酸，冰浴中迅速研磨成漿，SOD酶檢測用3mlO. lmol/1的磷酸緩沖液，丙二醛檢測用10%三氯乙酸8ml分次沖洗研缽，轉(zhuǎn)入IOml離心管中，在4°C條件下以4500r/min離心IOmin,上清液在相同條件下二次離心后分別用于SOD酶、MDA檢測。茶樹種性抗性與表現(xiàn)抗性生理鑒定方法，所述的抗性指標(biāo)檢測采用下列方法進(jìn)行檢測超氧化物歧化酶活性測定參考氮藍(lán)四唑法測定；茶樹葉片丙二醛含量的測定采用硫代巴比妥酸法。茶樹種性抗性與表現(xiàn)抗性生理鑒定方法，所述的抗逆性評價為采用上述兩次檢測數(shù)值為縱坐標(biāo)，以溫度為橫坐標(biāo)繪制平面直線，依該直線的斜率大小判斷抗性強(qiáng)弱，超氧化物歧化酶的斜率越小說明茶樹種性抗性越強(qiáng)，反之則弱；丙二醛的斜率越大說明茶樹表現(xiàn)抗性越強(qiáng)，反之則弱。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的創(chuàng)新之處及其優(yōu)勢
I、茶樹種性抗性與表現(xiàn)抗性生理鑒定方法，減少了自然生長茶樹室外低溫情況下，人為觀測誤差，克服了氣候、地理環(huán)境條件、管理水平等因素造成的抗性表現(xiàn)差異，從種性抗性和表現(xiàn)抗性兩個方面對茶樹抗寒性加以評價。2、木質(zhì)化部位第一片茶樹葉片具有相似的生理年齡，考慮到地理環(huán)境、光照、人為等因素的影響，本方法選用未修剪、具有明顯葉位變化的茶樹枝條，自上而下采集木質(zhì)化部位第一片、同一著生方向、無病蟲害且完整的葉片，SOD酶活性和丙二醛等生理指標(biāo)比較穩(wěn)定，能較好代表茶樹整體水平。3、茶樹種性抗性與表現(xiàn)抗性生理鑒定方法，每年都可進(jìn)行，不需要極端最低氣溫出現(xiàn)，就能進(jìn)行，極大地縮短了鑒定周期。


圖I為茶樹抗寒性早期生理鑒定方法流程圖。
具體實施例方式實施例茶樹種性抗性與表現(xiàn)抗性生理鑒定方法
茶樹種性抗性與表現(xiàn)抗性生理鑒定方法，在10°c 13°C茶樹臨界休眠狀態(tài)時，選取未修剪、具有明顯葉位變化的舒茶早、平陽特早、翠峰、鳧早2號茶樹枝條，采集葉片，帶回實驗室后，進(jìn)行種性抗性指標(biāo)(S0D酶)和表現(xiàn)抗性指標(biāo)(丙二醛)基礎(chǔ)值檢測；而后當(dāng)氣溫降至0°C時，按上述方法對茶樹種性抗性和表現(xiàn)抗性指標(biāo)重新測定后，依指標(biāo)變化趨勢對茶樹抗性進(jìn)行評價。主要包括選穗、葉片采集、洗凈、擦干、打孔取樣、研磨、離心、抗性指標(biāo)檢測、抗逆性評價9個步驟。I、舒茶早、平陽特早、翠峰、鳧早2號四個茶樹種，在10°C 13°C茶樹臨界休眠狀態(tài)時，分別選取未修剪且具有明顯葉位變化的茶樹枝條，自上而下采集四種茶樹的木質(zhì)化部位第一片、同一著生方向、無病蟲害且完整的葉片5g，裝入塑料袋內(nèi)封口，貯于底部置有冰塊的保溫箱內(nèi)，帶回實驗室備用。
2、各種茶樹的葉片用蒸餾水沖洗兩次，并用潔凈濾紙吸干。對其中一種茶樹而言(其它茶樹依次進(jìn)行)，SOD酶、丙二醛測試材料用打孔器避開葉片主脈打取Φ=0. 5cm圓形葉片。按SOD酶和丙二醛檢測方法分別稱取O. 5g和O. 2g，添加2ml相應(yīng)緩沖液(SOD酶為O. lmol/1預(yù)冷的pH7. 8磷酸緩沖液，丙二醛為10%三氯乙酸)和少許石英砂及適量不溶性吡咯烷酮，冰浴中迅速研磨成漿，SOD酶用3ml0. lmol/1的磷酸緩沖液，丙二醛用10%三氯乙酸8ml分次沖洗研缽,轉(zhuǎn)入IOml離心管中，在4°C條件下以4500r/min離心IOmin,上清液在相同條件下二次離心后分別用于SOD酶、丙二醛檢測。3、相關(guān)抗性指標(biāo)檢測采用下列方法進(jìn)行測試超氧化物歧化酶(SOD)活性測定參考氮藍(lán)四唑(NBT)法測定；茶樹葉片丙二醛含量的測定采用硫代巴比妥酸法。上述測定結(jié)果作為基礎(chǔ)值。4、當(dāng)氣溫繼續(xù)下降至0°C以下時，重新按上述方法取樣、洗凈、研磨、測試，并以上述兩次檢測數(shù)值為縱坐標(biāo)，以溫度為橫坐標(biāo)繪制平面直線，依該直線的斜率大小判斷4種茶樹抗寒性強(qiáng)弱。結(jié)果如下種性抗性(指標(biāo)為SOD酶)由強(qiáng)到弱為舒茶早 > 平陽特早 > 鳧早2號〉翠峰，表現(xiàn)抗性(指標(biāo)為丙二醛)由強(qiáng)到弱為鳧早2號〉翠峰〉平陽特早 > 舒茶早。
權(quán)利要求
1.茶樹種性抗性與表現(xiàn)抗性生理鑒定方法，其特征在于包括選穗、葉片采集、洗凈、擦干、打孔取樣、研磨、離心、抗性指標(biāo)檢測和抗性評價步驟；具體是在10°c 13°C茶樹休眠臨界狀態(tài)時，選取未修剪的枝條，采集葉片，進(jìn)行種性抗性指標(biāo)SOD酶和表現(xiàn)抗性指標(biāo)MDA基礎(chǔ)值的檢測；而后當(dāng)氣溫降至0°C以下時，按上述方法對茶樹種性抗性指標(biāo)SOD酶和表現(xiàn)抗性指標(biāo)MDA重新測定后，依指標(biāo)數(shù)值的變化趨勢對茶樹抗性進(jìn)行評價。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的茶樹種性抗性與表現(xiàn)抗性生理鑒定方法，其特征在于所述的選穗、葉片采集為在10°C 13°C茶樹休眠臨界狀態(tài)時，選取未修剪的茶樹枝條，自上而下采集木質(zhì)化部位第一片葉，裝入塑料袋內(nèi)封口，貯于底部置有冰塊的保溫箱內(nèi)，帶回實驗室備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的茶樹種性抗性與表現(xiàn)抗性生理鑒定方法，其特征在于所述的打孔取樣、研磨、離心為選取的葉片用蒸餾水沖洗兩次，并用潔凈濾紙吸干，用打孔器，避開葉片主脈打取Φ=0. 5cm圓形葉片作為SOD酶、丙二醛測試材料；按SOD酶和丙二醛檢測方法分別稱取O. 5g和O. 2g，分別添加2ml緩沖液和少許石英砂及適量不溶性吡咯烷酮，所述的SOD酶為O. lmol/1預(yù)冷的pH7. 8磷酸緩沖液，丙二醛為10%三氯乙酸，冰浴中迅速研磨成衆(zhòng)，SOD酶檢測用3ml O. lmol/1的磷酸緩沖液,丙二醒檢測用10%三氯乙酸8ml分次沖洗研缽，轉(zhuǎn)入IOml離心管中，在4°C條件下以4500r/min離心IOmin,上清液在相同條件下二次離心后分別用于SOD酶、MDA檢測。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的茶樹種性抗性與表現(xiàn)抗性生理鑒定方法，其特征在于所述的抗性指標(biāo)檢測采用下列方法進(jìn)行檢測超氧化物歧化酶活性測定參考氮藍(lán)四唑法測定；茶樹葉片丙二醛含量的測定采用硫代巴比妥酸法。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種茶樹種性抗性與表現(xiàn)抗性生理鑒定方法，在10℃～13℃茶樹臨界休眠狀態(tài)時，選取未修剪、葉片著生數(shù)較多的茶樹枝條，自上而下采集木質(zhì)化部位無病蟲害的第一片葉，帶回實驗室后，進(jìn)行種性抗性指標(biāo)和表現(xiàn)抗性指標(biāo)基礎(chǔ)值檢測；而后當(dāng)氣溫降至0℃以下時，再對茶樹種性抗性和表現(xiàn)抗性指標(biāo)重新測定，采用上述兩次檢測數(shù)值為縱坐標(biāo)，以溫度為橫坐標(biāo)繪制平面直線，依該直線的斜率大小判斷抗性強(qiáng)弱。本發(fā)明減少了自然生長茶樹室外低溫情況下，人為觀測誤差，克服了氣候、地理環(huán)境條件、管理水平等因素造成的抗性表現(xiàn)差異，能從種性抗性和表現(xiàn)抗性兩個方面對茶樹抗寒性加以評價，而且不需等待極端最低氣溫出現(xiàn)，極大地縮短了鑒定周期。
文檔編號G01N21/31GK102703573SQ201210164428
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月24日
發(fā)明者夏先江, 張必樺, 張永利, 徐奕鼎, 方吳云, 王燁軍, 蘇有健, 黃建琴 申請人:安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所