專利名稱：一種非洲菊灰霉病抗性鑒定的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬植物抗病性鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及非洲菊灰霉病離體抗性鑒定的方法。
背景技術(shù)：
非洲菊(fer力era )是世界五大重要切花之一，其盆花的應(yīng)用也越來越流行， 具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值?；颐咕?徹iiriis是一種空氣傳播、適宜溫度范圍大 (4°C -25°C)、侵染200多種寄主的腐生菌，由灰霉菌引起的軟腐病，嚴(yán)重危害非洲菊的生產(chǎn)、貯藏、運(yùn)輸?shù)雀鱾€(gè)環(huán)節(jié)，尤其是在非洲菊切花采后貯藏、運(yùn)輸過程中，由于高濕、溫度波動(dòng)大產(chǎn)生結(jié)露等環(huán)境條件，給灰霉菌的滋生繁殖提供了良好的條件，灰霉菌引起的軟腐病成為非洲菊切花采后質(zhì)量保持的限制因子之一，灰霉菌侵染引起的軟腐病給非洲菊切花導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失，直接的影響是侵染產(chǎn)品被拒絕進(jìn)入采后供應(yīng)鏈，間接的影響是被感染產(chǎn)品的觀賞性狀降低，極大的影響了產(chǎn)品的銷售價(jià)格。大田生產(chǎn)發(fā)現(xiàn)，在非洲菊不同栽培品種中存在對(duì)灰霉菌軟腐病的抗性差異。雖然可以通過控制栽培條件來降低灰霉菌軟腐病的危害，但隨著能源成本的升高，培育抗性品種是非洲菊育種、生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的主要出路。抗性資源的準(zhǔn)確鑒定篩選是抗性品種培育的首要條件，現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)非洲菊灰霉病抗性鑒定常采用大田活體植株接種法，存在供試植株感染病害、鑒定周期長、結(jié)果易受環(huán)境條件影響的缺陷和不足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的大田活體植株接種法對(duì)非洲菊灰霉病抗性鑒定存在供試植株感染病害、鑒定周期長、結(jié)果易受環(huán)境條件影響的缺陷和不足，其目的是提供一種簡單、快速、準(zhǔn)確和能大規(guī)模篩選鑒定非洲菊灰霉病抗性資源的方法，為進(jìn)一步的雜交育種或分子標(biāo)記輔助育種提供支持。解決上述技術(shù)問題和實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的 一種非洲菊灰霉病抗性鑒定方法，按以下步驟進(jìn)行
(1)適宜的接種材料的選擇，以新鮮采集的完整幼葉或花瓣作為接種材料；
(2)灰霉菌SoiiTiisCinerea培養(yǎng)及其分生孢子懸浮液的制備
用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(簡稱PDA培養(yǎng)基)培養(yǎng)灰霉菌(徹iiriis cinerea), 將-70°C _80°C低溫保存的灰霉菌(SoiiTii1S于超菌工作臺(tái)接種于馬鈴薯葡萄
糖瓊脂培養(yǎng)基中，于18°C 25°C溫度，光照強(qiáng)度為1000 20001x條件下16 h連續(xù)光照培養(yǎng)培養(yǎng)3天后，轉(zhuǎn)入黑暗條件培養(yǎng)7 15天，菌絲長滿整個(gè)培養(yǎng)皿后，用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0. 1%吐溫-20的滅菌蒸餾水懸浮培養(yǎng)皿中所培養(yǎng)的分生孢子，用小孔計(jì)數(shù)法制備每毫升孢子數(shù)為IXIO7個(gè)的分生孢子貯備液供接種用；
(3)制備接種液
3于接種前，將步驟(2)獲得的分生孢子貯備液稀釋為含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的馬鈴薯葡萄糖(potato dextrose, PD)和分生孢子數(shù)為1 X IO6個(gè)/ml濃度的接種液供接種用或?qū)⒉襟E (2)獲得的分生孢子貯備液稀釋為含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的馬鈴薯葡萄糖(potato dextrose, PD)和分生孢子數(shù)為3 X IO5個(gè)/ml濃度的接種液供接種用； (4)接種
用微量移液器取2μ 1的接種液以液滴的方式將孢子液接種到步驟(1)所述的幼葉或花瓣，將該幼葉或花瓣材料保持在相對(duì)濕度為90% 95%、光照強(qiáng)度為IOOOIx 20001χ、溫度為18°C 25°C的條件下，接種24h后開始觀察病情發(fā)展，根據(jù)病情發(fā)展的速度及病情指數(shù)判斷供試材料的抗性，花瓣在4 內(nèi)病情指數(shù)達(dá)到3 5級(jí)為感病品種，幼葉在120h 內(nèi)病情指數(shù)達(dá)到3 5級(jí)為感病品種。所述的病情指數(shù)分為花瓣病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)方法和幼葉病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)方法，所述的花瓣病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)方法如下
0級(jí)接種液滴清澈，無任何侵染跡象，
1級(jí)開始侵染，侵染斑限于接種液滴之內(nèi)，液滴呈褐色狀，
2級(jí)侵染擴(kuò)展到液滴之外，侵染斑大小為液滴的2-4倍，
3級(jí)侵染區(qū)域繼續(xù)擴(kuò)大，但小于接種花瓣的1/2面積，
4級(jí)侵染面積超過花瓣的1/2，
5級(jí)整個(gè)花瓣幾乎或完全被侵染，
48h內(nèi)病情指數(shù)達(dá)到3 5級(jí)為感病品種；
所述的幼葉病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)方法如下
0級(jí)接種液滴清澈，無任何侵染跡象，
1級(jí)開始侵染，侵染斑限于接種液滴之內(nèi)，液滴呈褐色狀，
2級(jí)侵染擴(kuò)展到液滴之外，侵染斑大小為液滴的2-5倍，
3級(jí)侵染區(qū)域繼續(xù)擴(kuò)大，侵染斑大小為液滴的6-10倍，
4級(jí)侵染區(qū)域繼續(xù)擴(kuò)大，侵染區(qū)域接近葉片面積的1/2，
5級(jí)侵染區(qū)域達(dá)到或超過葉片面積的2/3，
120h內(nèi)病情指數(shù)達(dá)到3 5級(jí)為感病品種。所述的接種是對(duì)完整幼葉的正面接種或?qū)ò甑恼娼臃N。本發(fā)明所涉及的生物材料灰霉菌徹iiriis Cinerea已在許多非專利文獻(xiàn)公開， 如在“番茄灰霉病病原菌生物學(xué)特性的研究”(徐明等，貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(3) :68-71) 中公開，并且上述生物材料申請人有保存，申請人保證自本專利申請日起20年內(nèi)向公眾發(fā)放。申請人聯(lián)系地址是云南省昆明市北郊黑龍?zhí)对颇限r(nóng)業(yè)大學(xué)，郵政編碼650201，聯(lián)系電話0871-5220399。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是
1、現(xiàn)有的大田非洲菊活體灰霉菌病害抗性鑒定從育苗開始、小苗移栽、接種到發(fā)病是一項(xiàng)歷時(shí)2 3月、費(fèi)時(shí)費(fèi)力的工作，且病害表現(xiàn)易受環(huán)境影響、很難獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。本發(fā)明采用小分生孢子液滴、補(bǔ)充營養(yǎng)、花瓣無創(chuàng)傷接種，于室溫、高濕、自然光條件下48h能清楚地鑒別出非洲菊不同基因型間的灰霉病抗性差異，花瓣鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性被幼葉鑒定結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，且對(duì)非洲菊抗感親本雜交分離后代的檢測結(jié)果符合非洲菊灰霉菌抗病基因?yàn)镼TL基因控制性狀的分離特點(diǎn)，達(dá)到了簡單、快速、準(zhǔn)確鑒定非洲菊灰霉病抗性的目的。2、現(xiàn)有非洲菊灰霉病抗性鑒定采用活體鑒定的方法，因接種病菌使植株感染病害影響植株正常生長發(fā)育、甚至死亡，致使非洲菊雜交育種后代的早期抗性鑒定無法進(jìn)行。本發(fā)明的方法采用離體的幼葉作接種材料，不但不影響植株正常的生長發(fā)育，并且能夠在早期對(duì)雜交后代進(jìn)行灰霉病抗性鑒定，能夠有效的促進(jìn)非洲菊灰霉病抗性育種。3、現(xiàn)有灰霉菌活體抗性鑒定方法，因易受環(huán)境的影響，其鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性低，無法為非洲菊灰霉菌抗性連鎖分子標(biāo)記的建立提供可靠的研究材料，本發(fā)明的離體花瓣鑒定方法是在人工控制的穩(wěn)定條件下進(jìn)行，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性高，可為非洲菊灰霉菌抗性連鎖分子標(biāo)記的建立提供可靠的支持。


圖1是一對(duì)抗病和感病的非洲菊親本及其雜交分離后代的灰霉菌抗性變異，橫坐標(biāo)及其數(shù)字表示雜交親本及其雜交分離后代。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。以下各實(shí)施例中所用的灰霉菌 Botrytis cinerea由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，其余試劑均為是市售產(chǎn)品。所用儀器光學(xué)顯微鏡、 光照培養(yǎng)箱、人工氣候箱均為普通配制。本發(fā)明使用的生物材料灰霉菌召oiiTiis ci/^rea是利用灰霉菌的致灰霉病的致病共性來感染植株，因此具有致病力的各種灰霉菌菌株都能達(dá)到本發(fā)明的效果，該灰霉菌廣泛存在于許多大田或園藝作物中，采用植物病原真菌的常規(guī)稀釋分離方法(方中達(dá)，植病研究法(第三版)，中國農(nóng)業(yè)出版社，1998，124 125)即可得到灰霉菌召oirj^is chwrea。實(shí)施例1以花瓣為接種材料的實(shí)施例
(1)植物材料
供試的灰霉菌不同抗性的非洲菊切花栽培品種為Macy，Kaliki, Risto, Serena, CK100, 3142，5544共7個(gè)基因型，由荷蘭非洲菊育種公司Florist和Shreurs提供，采集新鮮花瓣作為接種材料；
(2)灰霉菌SoiiTiiscinerea培養(yǎng)及其分生孢子懸浮液的制備
用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(簡稱PDA培養(yǎng)基)培養(yǎng)灰霉菌徹trytis cinerea， 將-80°C低溫保存的灰霉菌OtoiiTiis ci/^rm)于超菌工作臺(tái)接種于裝有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的直徑IOcm培養(yǎng)皿中心，于20°C 22°C溫度，光照強(qiáng)度為18001x條件下1 連續(xù)光照培養(yǎng)，培養(yǎng)3天后，轉(zhuǎn)入黑暗條件培養(yǎng)7天，菌絲長滿整個(gè)培養(yǎng)皿后，用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0. 1%吐溫-20的滅菌蒸餾水懸浮培養(yǎng)皿中所培養(yǎng)的分生孢子，用小孔計(jì)數(shù)法制備每毫升孢子數(shù)為IXlO7的分生孢子貯備液供接種用；
(3)制備接種液
于接種前，將步驟(2)獲得的分生孢子貯備液制備為分別含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、3%、6%濃度的馬鈴薯葡萄糖(potato dextrose, PD)及分生孢子數(shù)為3X IO5個(gè)/ml、1 X IO6個(gè)/ml 濃度的接種液供接種用； (4)接種
5取將步驟(3)制備的含不同濃度分生孢子和PD的接種液2μ 1分別接種到步驟(1) 所述的花瓣上，將該花瓣材料分別保持在塑料膜密封，相對(duì)濕度90% 95%，光照強(qiáng)度為 18001χ、溫度為20°C 22°C的條件下，接種24h后開始觀察病情發(fā)展，根據(jù)病害發(fā)展速度及病情指數(shù)判斷供試材料的病害抗性。接種采用對(duì)花瓣的正面和反面接種對(duì)比形式。(5)病情觀察及病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)花瓣病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)方法如下
0級(jí)接種液滴清澈，無任何侵染跡象； 1級(jí)開始侵染，侵染斑限于接種液滴之內(nèi)，液滴呈褐色狀； 2級(jí)侵染擴(kuò)展到液滴之外，侵染斑大小為液滴的2-4倍； 3級(jí)侵染區(qū)域繼續(xù)擴(kuò)大，但小于接種花瓣的1/2面積； 4級(jí)侵染面積超過花瓣的1/2 ； 5級(jí)整個(gè)花瓣幾乎或完全被侵染。48h內(nèi)病情指數(shù)達(dá)到3 5級(jí)為感病品種。(6)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析
接種花瓣正反兩面比較組織正反面對(duì)接種效果的影響。觀察結(jié)果為，花瓣正反面接種均能發(fā)病、且正反面發(fā)病表現(xiàn)結(jié)果一致，但花瓣正面接種病害發(fā)展快于反面，可能是非洲菊花瓣背面膜質(zhì)化程度的增大加大了病菌侵入的難度，以正面接種為理想。統(tǒng)計(jì)灰霉菌分生孢子及營養(yǎng)濃度配比對(duì)非洲菊花瓣正面接種的病情指數(shù)詳見表 1。病情指數(shù)結(jié)果表明，含有1%的PD的兩個(gè)分生孢子濃度3 X IO5個(gè)/ml、1 X IO6個(gè)/ml接種的各品種的花瓣4天內(nèi)均發(fā)病輕、且品種間差異不明顯；含有6%的PD及分生孢子濃度 1 X IO6個(gè)/ml接種的各品種的花瓣在接種4 均已嚴(yán)重發(fā)病、無法鑒定品種間差異；3%PD 與分生孢子3X IO5個(gè)/ml濃度組合接種的花瓣雖然品種間差異明顯，但48h時(shí)品種間差異尚??；以3%PD與分生孢子1 X IO6個(gè)/ml及6%PD與分生孢子3 X IO5個(gè)/ml濃度組合最為理想，4 能清楚鑒別品種間抗性差異，病情指數(shù)大于3的品種均為田間觀察較為感病的品種。表1灰霉菌分生孢子及營養(yǎng)濃度配比對(duì)非洲菊花瓣正面接種的病情指數(shù)
權(quán)利要求
1.一種非洲菊灰霉病抗性鑒定的方法，按以下步驟進(jìn)行(1)適宜的接種材料的選擇，以新鮮采集的完整幼葉或花瓣作為接種材料；(2)灰霉菌SoiiTiisCinerea培養(yǎng)及其分生孢子懸浮液的制備用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)灰霉菌，將-70 -80°C低溫保存的灰霉菌于超菌工作臺(tái)接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，于18°C 25°C溫度，光照強(qiáng)度為1000 20001x 條件下16 h連續(xù)光照培養(yǎng)培養(yǎng)3天后，轉(zhuǎn)入黑暗條件培養(yǎng)7 15天，菌絲長滿整個(gè)培養(yǎng)皿后，用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1%吐溫-20的滅菌蒸餾水懸浮培養(yǎng)皿中所培養(yǎng)的分生孢子，用小孔計(jì)數(shù)法制備每毫升孢子數(shù)為IX IO7個(gè)的分生孢子貯備液供接種用；(3)制備接種液于接種前，將步驟(2)獲得的分生孢子貯備液稀釋為含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的馬鈴薯葡萄糖和分生孢子數(shù)為1 X IO6個(gè)/ml濃度的接種液供接種用或?qū)⒉襟E(2)獲得的分生孢子貯備液稀釋為含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的馬鈴薯葡萄糖和分生孢子數(shù)為3 X IO5個(gè)/ml濃度的接種液供接種用；(4)接種用微量移液器取2μ 1的接種液以液滴的方式將孢子液接種到步驟(1)所述的幼葉或花瓣，將該幼葉或花瓣材料保持在相對(duì)濕度為90% 95%、光照強(qiáng)度為IOOOIx 20001χ、溫度為18°C 25°C的條件下，接種24h后開始觀察病情發(fā)展，根據(jù)病情發(fā)展的速度及病情指數(shù)判斷供試材料的抗性，花瓣在4 內(nèi)病情指數(shù)達(dá)到3 5級(jí)為感病品種，幼葉在120h 內(nèi)病情指數(shù)達(dá)到3 5級(jí)為感病品種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非洲菊灰霉病抗性鑒定的方法，其特征在于所述的病情指數(shù)分為花瓣病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)方法和幼葉病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)方法，所述的花瓣病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)方法如下0級(jí)接種液滴清澈，無任何侵染跡象，1級(jí)開始侵染，侵染斑限于接種液滴之內(nèi)，液滴呈褐色狀，2級(jí)侵染擴(kuò)展到液滴之外，侵染斑大小為液滴的2-4倍，3級(jí)侵染區(qū)域繼續(xù)擴(kuò)大，但小于接種花瓣的1/2面積，4級(jí)侵染面積超過花瓣的1/2，5級(jí)整個(gè)花瓣幾乎或完全被侵染，48h內(nèi)病情指數(shù)達(dá)到3 5級(jí)為感病品種；所述的幼葉病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)方法如下0級(jí)接種液滴清澈，無任何侵染跡象，1級(jí)開始侵染，侵染斑限于接種液滴之內(nèi)，液滴呈褐色狀，2級(jí)侵染擴(kuò)展到液滴之外，侵染斑大小為液滴的2-5倍，3級(jí)侵染區(qū)域繼續(xù)擴(kuò)大，侵染斑大小為液滴的6-10倍，4級(jí)侵染區(qū)域繼續(xù)擴(kuò)大，侵染區(qū)域接近葉片面積的1/2，5級(jí)侵染區(qū)域達(dá)到或超過葉片面積的2/3，120h內(nèi)病情指數(shù)達(dá)到3 5級(jí)為感病品種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非洲菊灰霉病抗性鑒定的方法，其特征在于所述的接種是對(duì)完整幼葉的正面接種或?qū)ò甑恼娼臃N。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種非洲菊灰霉病抗性鑒定的方法，屬植物抗病性鑒定技術(shù)領(lǐng)域。該方法是(1)適宜的接種材料的選擇，以新鮮采集的完整幼葉或花瓣作為接種材料；(2)灰霉菌培養(yǎng)及其分生孢子懸浮液的制備(3)制備接種液，于接種前將分生孢子貯備液稀釋為含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的馬鈴薯葡萄糖和分生孢子數(shù)為1×106個(gè)/ml濃度的接種液或?qū)⒎稚咦淤A備液稀釋為含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的馬鈴薯葡萄糖和分生孢子數(shù)為3×105個(gè)/ml濃度的接種液；(4)接種。本發(fā)明方法在人工控制的穩(wěn)定條件下進(jìn)行，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性高，達(dá)到了簡單、快速、準(zhǔn)確鑒定非洲菊灰霉病抗性的目的。
文檔編號(hào)C12Q1/18GK102220407SQ20111012255
公開日2011年10月19日 申請日期2011年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月12日
發(fā)明者吳興恩, 吳景芝, 吳紅芝, 都婷, 陳溪 申請人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)