專利名稱：基片、制備和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及活性基片的改善，所述活性基片可用來形成結(jié)合了探針、用于多反應(yīng)體系的官能化基片，它們例如與靶分子相互作用。本發(fā)明的各個方面涉及化學(xué)修飾基片表面而在其上共價結(jié)合分子(例如，分子探針)的方法；從所述方法獲得的和/或可獲得的基片；應(yīng)用所述基片制備多反應(yīng)體系的進一步方法；通過所述方法獲得的或可獲得的多反應(yīng)體系；所述多反應(yīng)體系在分析和/或合成中的應(yīng)用；應(yīng)用所述多反應(yīng)體系直接和/或間接合成的產(chǎn)品；和/或得自所述多反應(yīng)體系的信息的應(yīng)用。
在本文的實施方案中，所述多反應(yīng)體系可能是顯微陣列(例如，DNA顯微陣列-也稱為生物芯片)；所述探針可能是DNA序列和/或寡核苷酸，而這樣獲得的信息可能是(生物)化學(xué)的和/或生物的信息。本發(fā)明的多反應(yīng)體系的其它用途包括高處理量篩選。
一種顯微陣列是多反應(yīng)體系的一個實例，它是一種強有效的工具，能利用微量的樣品和試劑平行操作數(shù)千個檢測和分析試驗。當(dāng)例如為了篩選和/或分析和/或了解復(fù)雜的過程而需要操作很多試驗時，這樣的大規(guī)模平行技術(shù)吸引了科學(xué)家。
一個這樣的用途是，DNA序列鑒定和基因表達的領(lǐng)域。在可獲得DNA芯片以前，基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的經(jīng)典技術(shù)只能一次檢測或研究一個基因的表達。下列文獻中描述了這樣的技術(shù)“L’Avenir de laPCRDiversification de Technologies et des Applications”，Le Technoscope du Biofutur，171，pp.3～9(1997)，將它的公開內(nèi)容并入本文作參考。相比之下，DNA芯片能一次性分析高達幾十萬個基因。
應(yīng)懂得，本文使用術(shù)語例如“多反應(yīng)體系”、“顯微陣列”、“芯片”和/或“生物芯片”來表示具有相同或相似的結(jié)構(gòu)和/或基本原理的系統(tǒng)和/或裝置，它們在本文可互換使用。生物芯片表示為了與生物活性分子一起使用的芯片。DNA顯微陣列、DNA生物芯片和DNA芯片都表示這樣的芯片，即，其上的探針都基于DNA序列或寡核苷酸。本文的大多數(shù)實例涉及DNA芯片，所以可省去詞頭DNA。
使多反應(yīng)體系(例如，顯微陣列)成為可能的基本原理是，任選以其上一定的方式選擇性地和持久地將各種化學(xué)物質(zhì)(例如，探針分子)結(jié)合在一個或一系列基片表面的能力。這類基片可用于這樣的用途，即，結(jié)合的物質(zhì)可進一步與它們的環(huán)境相互作用而牢固地連接在基片上。這些基片還可用于檢測和/或分析(用合適的設(shè)備)對于結(jié)合到所述基片(和/或基片系列)上的整個系列物質(zhì)有意義的給定性能。
通過DNA-生物芯片應(yīng)用的雜交方法更詳細地闡明了這一點。在該方法中，當(dāng)兩個彼此存在下，單鏈DNA片段優(yōu)選結(jié)合在它的互補序列上。實際DNA生物芯片包括一個被有序排列的達數(shù)十萬單鏈DNA序列(也稱為捕獲探針)覆蓋的表面，它可以是寡核苷酸、cDNA或DNA片段。然后該芯片暴露于未知的懸浮液中，但標(biāo)記的DNA序列也稱為靶。標(biāo)記的靶將結(jié)合到捕獲探針中它們的互補序列(如果它存在于芯片上)。所以，小心清洗后，將只在來自靶樣品的片段已發(fā)現(xiàn)它的互補捕獲探針的位置上發(fā)現(xiàn)標(biāo)記。由于可從它的位置檢測每個捕獲探針的序列(因而檢測它的互補靶的序列)，所以有可能收集關(guān)于靶樣品的基因含量的信息。
基于前述原理的DNA芯片可被設(shè)計成服務(wù)于很多不同的用途。例如，有可能測定當(dāng)個體暴露于給定的物質(zhì)中時，基因表達是如何變化的。這樣的試驗在藥物工業(yè)中對于測定新藥物的潛在副作用有意義。DNA芯片還可作為診斷裝置，例如，測定引起感染的確切細菌株，于是給予患者最合適的抗生素。為這種用途設(shè)計的DNA芯片應(yīng)證明比現(xiàn)在通用的任何測試迅速得多和更具專一性。DNA顯微陣列還可在遺傳病領(lǐng)域(其中，復(fù)雜的基因模式有時只被一個單一堿基對分化)中提供幫助。在更基本的研究用途中，對于基因測序的工作和在其它生物領(lǐng)域中進一步理解控制細胞壽命的復(fù)雜過程來說，顯微陣列將繼續(xù)是很好的工具。
雜交只是一種可在分子之間發(fā)生的相互作用，所以，操作千萬個平行試驗的構(gòu)思可適用于其它領(lǐng)域。例如，雖然DNA芯片可了解接觸某些物質(zhì)的細胞中發(fā)生了什么，但從研究基因表達不能獲得某些信息。例如，在mRNA或者甚至蛋白質(zhì)水平出現(xiàn)的因子使間題復(fù)雜化。因而，用來鑒定的蛋白質(zhì)芯片和在蛋白質(zhì)水平直接的劑量變化也應(yīng)當(dāng)是有意義的。
其它類的探針(它們應(yīng)用非生物分子)也有意義。例如，要用于高處理量篩選，顯微陣列可被選定的活性化學(xué)物質(zhì)覆蓋，就可以研究這些物質(zhì)的各種性能和/或與一個樣品的各種化學(xué)和物理相互作用。
目前有兩類不同的方法來生產(chǎn)特別適用作DNA芯片的顯微陣列芯片，兩類方法都有缺點。
制造DNA芯片的第一類方法之一是Affymetrix開發(fā)的，它基于將構(gòu)成該陣列的全部分子的就地逐步合成(例如，逐個堿基地合成寡核苷酸)。應(yīng)用的技術(shù)借助于半導(dǎo)體生產(chǎn)工業(yè)，應(yīng)用光刻法選擇性地活化每一個位置(取決于接觸顯微陣列的下一個堿基是否適合該位置)。這類技術(shù)只允許有限尺寸的探針用于寡核苷酸和/或長于約20個堿基對的DNA，在制備的每一步引起的組合誤差會使得難以達到可靠的產(chǎn)品。此外，該技術(shù)麻煩，費時，難于在正規(guī)實驗室裝置中重復(fù)，極昂貴和/或固定不變的。
此外，對于顯微陣列的非DNA用途來說，光刻法特別不合適，因為通常需要光保護基來保護常用的化學(xué)試劑和/或探針上不耐光的基(它們可能包括單體)。在有機化學(xué)工藝中，制備多組光保護的結(jié)構(gòu)單元會是不切實際的。
制備顯微陣列的第二種方法是近期得到普及的所謂的送遞法。在送遞法中，將探針或DNA片段直接接枝到基片上。首先將它們懸浮于合適的載體介質(zhì)中，通過任意合適的技術(shù)將它以微小的液滴淀積在基片上所要求的位置。典型的液滴體積是毫微升(1×10-9l)或者甚至皮升(1×10-12l)的體積。淀積這些液滴的適當(dāng)方法包括，直接接觸(例如，顯微點樣)和/或噴墨印刷。但是，雖然淀積微小的液滴可能是有利的，而實現(xiàn)功能顯微陣列重要的是，制備的基片應(yīng)保證DNA探針將在微小的液滴蒸發(fā)所需的時間內(nèi)在那里反應(yīng)(優(yōu)選通過形成共價鍵)。在Marc Schena通過Eaton Publishing(Natick，MA，USA)出版的“顯微陣列生物芯片技術(shù)”(Micro-array Biochip Technology)，2000中詳細描述了該送遞方法；所以將該文獻的內(nèi)容并入作參考。
不論用于制備顯微陣列的方法如何，要適當(dāng)?shù)仄鹱饔?，重要的是顯微陣列上的探針足夠牢固地連接在顯微陣列基片上。固定化探針不允許在不同的處理步驟(例如，與DNA生物芯片一起應(yīng)用的雜交、洗滌和/或分析步驟)期間解吸。為了滿足這些要求，基片與探針之間的共價鍵是優(yōu)選的連接方式。牢固地連接了探針的顯微陣列是有利的，因為此時探針更容易接受進一步的處理步驟(例如，DNA雜交)，從而改善顯微陣列的靈敏度。
為此，人們進行了很多嘗試，試圖將探針共價結(jié)合到顯微陣列的基片上。例如，N.Zammateo等(分析生物化學(xué)(AnalyticalBiochemistry)，280，pp.143～15，2000)比較了用于具體的玻璃基片情況的現(xiàn)有技術(shù)。研究的體系包括，連接在胺化玻璃上的磷酸化DNA；連接在羧化玻璃上的胺化DNA；以及連接在醛官能玻璃上的胺化DNA。作者們總結(jié)出，通過偶聯(lián)產(chǎn)率和不存在偶聯(lián)劑時的反應(yīng)速率測得，將胺化DNA固定在醛改性的表面是構(gòu)筑DNA顯微陣列最好的偶聯(lián)方法。
然而，醛官能基片與胺化探針的反應(yīng)雖然有效，但具有這一缺點，即，需要額外的還原步驟來穩(wěn)定形成的碳-氮鍵。雖然醛基和氨基之間的初始反應(yīng)生成亞氨基(包含C＝N雙鍵)，它使探針牢固地連接到表面，但該反應(yīng)在顯微陣列應(yīng)用時經(jīng)歷的很多條件下是可逆的。因此，在進一步的步驟中必須將亞氨基還原成氨基(包括更有耐性的C-N單鍵)從而將探針以共價鍵更不可逆地連接在基片上。又一個問題是，典型的醛官能團在長期貯存和應(yīng)用的基片上不夠穩(wěn)定。所以，醛官能化基片需要多個處理步驟，而且在穩(wěn)定性與接枝探針和提供抗性基片所需的反應(yīng)性之間不具有最恰當(dāng)?shù)钠胶狻Ｈ孕枰牧嫉慕Y(jié)合體系。
現(xiàn)有顯微陣列還存在很多其它問題。難于獲得具有提高的功能和/或活性位點密度和/或接枝密度的顯微陣列。還希望顯微陣列應(yīng)當(dāng)每單位面積具有盡可能多的探針而改善顯微陣列的靈敏度。還重要的是，基片上的活性位點和/或官能度以可重現(xiàn)的和適應(yīng)性強的方式獲得。
不想受任何機理的限制，我們認為，解決上述一些或全部問題的的方法可能是，提供一種官能化基片，它能與同它接觸的探針足夠迅速地發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，于是，在其中應(yīng)用探針的載體介質(zhì)有時間干燥以前足夠迅速地在探針與基片之間形成一種鍵(優(yōu)選是共價鍵)。在載體介質(zhì)的微小液滴中將探針應(yīng)用于表面時，該問題是一個特殊的問題，因為這些液滴很迅速地干燥。在基片應(yīng)用期間經(jīng)歷的條件下，合適的基片應(yīng)當(dāng)與探針以基本上不可逆的方式反應(yīng)。
可任選通過本發(fā)明解決的又一個問題是提供在探針(例如，現(xiàn)今應(yīng)用的典型DNA探針)的化學(xué)和基片的化學(xué)之間的正確結(jié)合，于是有可能將它們二者官能化。本發(fā)明解決的另一個任選的問題是提供官能化和/或活性基片，它在正常貯存條件下，在初步處理步驟中和/或在探針結(jié)合前的環(huán)境中都保持穩(wěn)定。所以，不容易發(fā)現(xiàn)這種基片，它在對探針的高活性與貯存和應(yīng)用期間的穩(wěn)定性之間具有合適的平衡。因此，本發(fā)明另一個任選的目的是，提供具有基片的顯微陣列，所述基片的一個表面可通過共價鍵牢固地結(jié)合探針，而且它在連接探針之前和以后兩種情況下、在貯存和應(yīng)用的條件下是穩(wěn)定的。如果通過已知方法生產(chǎn)這樣的基片，對于可應(yīng)用的基片材料有嚴(yán)格限制，因為不是所有的方法都與所有的基片匹配。目前應(yīng)用的大多數(shù)顯微陣列是由玻璃基片制造的。雖然玻璃具有很多有利的性能，但它也具有缺點，例如，玻璃不容易以任何要求的形狀生產(chǎn)。需要比玻璃具有更寬性能范圍的基片來開發(fā)例如集成化芯片基實驗(lab-on-a-chip)和/或用于顯微流體技術(shù)。聚合物是這類用途的優(yōu)選基片，因為它們?nèi)菀妆患庸こ扇魏嗡璧男螤?例如，通過模制)。因此，任選還希望提供一種適用非玻璃基片的方法，因為這將獲得改善的顯微陣列。所以，本發(fā)明另一個任選的目的是，提供具有本文所述的關(guān)于聚合物基片的一些或全部優(yōu)點的顯微陣列。
本發(fā)明又一個任選的目的是提供這樣的顯微陣列，其中，連接的(任選DNA)探針的密度(即，接枝密度)很高。本發(fā)明還有一個任選的目的是提供這類基片，即，具有提高的接枝密度(它是以可再現(xiàn)的方式獲得的)，而且可輕易按用戶需要來修飾。官能化和/或活性基片還可用于顯微流體系統(tǒng)，于是，本發(fā)明又一個任選的目的是，提供適合這樣的系統(tǒng)的基片。
因此，本發(fā)明最寬范圍的一個目的是，解決與現(xiàn)有技術(shù)顯微陣列有關(guān)的前述的一些或全部問題。
所以，按本發(fā)明，提供了一種制備在其上具有對分子探針活性基呈活性的位點的基片的方法，該方法包括如下步驟，對所述基片表面施用一種物質(zhì)，該物質(zhì)包含一個或多個式I的具有活化乙烯基不飽和雙鍵的活性位點 式I其中，如果n＝0，m＝1，X3是碳且X1是氮，它們之間的鍵就是三鍵，而且R4不存在；如果n＝1，m＝1，X3是碳且X1是氧或硫，它們之間的鍵就是雙鍵，而且X2是被一個有機取代基取代的氧或硫或氮；如果n＝1，m＝1或2，X3是硫且X1是氧，它們之間的鍵就是雙鍵，而且X2是被一個有機取代基取代的氮；R1，R2，各自獨立表示氫，羥基或有機基，R3和R4各自獨立表示氫或有機基，最后含一個硅原子，R1和R2不與R4連接。
隨后，在進一步中，將分子探針的活性基與具有式I的活性位點的活化乙烯基不飽和雙鍵共價結(jié)合。
按本發(fā)明，位于基片上的活性位點和分子探針之間的連接反應(yīng)具有下列特征的至少一個(i)連接反應(yīng)足夠快，于是反應(yīng)在應(yīng)用的操作條件下基本上完全；(ii)該反應(yīng)在一個步驟中在物質(zhì)和基片之間形成牢固的結(jié)合鍵；和/或(iii)物質(zhì)和基片之間的連接在基片的應(yīng)用條件下基本上不可逆。
用于本文的“活性基片”表示一種基片，它具有位于它表面的、有效濃度的式I游離活性位點。
任選地，所述基片適用于多反應(yīng)體系，例如，顯微陣列。
本文應(yīng)用的分子探針表示例如生物分子這樣的探針，例如，DNA、RNA、蛋白質(zhì)、生物素、毒素、除草劑、殺蟲劑、碳水化合物、藥物靶、抗生素、細胞毒物、類固醇、肽、核苷酸、肽核酸、結(jié)合配偶體、半抗原等。在本發(fā)明一個實施方案中，在多反應(yīng)體系中應(yīng)用的最終探針可能包含一種或多種不同的其它物質(zhì)，它們以順序方式(例如，在鏈中)與結(jié)合到基片活性位點上的第一種探針連接。這樣，具有任何所需性能的探針即使不適合(和/或不能被修飾而適合)直接連接到基片上的活性位點上，也可以使用。
任選地，所述載體介質(zhì)是一種流體，例如，一種可在其中分散分子探針的液體。
優(yōu)選地，所述流體和/或物質(zhì)呈液滴形式應(yīng)用，更優(yōu)選通過直接方法，例如，顯微點樣和/或噴墨印刷(例如，感熱式和/或壓電式(piezo)噴墨印刷，例如，壓電)，例如采用的平均液滴體積為一毫微升或更小。
任選地，所述連接反應(yīng)以足夠迅速的方式發(fā)生，所以，在載體流體從其中蒸發(fā)以前(例如，當(dāng)該載體流體作為液滴應(yīng)用時)，反應(yīng)基本上完全。
本文應(yīng)用的術(shù)語“牢固地連接的”表示，在顯微陣列和/或基片將被應(yīng)用的條件下(以及與其它試劑一起)基本上抗脫除。優(yōu)選地，這說明通過一個共價鍵將分子探針連接到活性位點上；更優(yōu)選每個活性位點借助于平均至少一個共價鍵與探針連接。更優(yōu)選的是，這樣形成的鍵在顯微陣列的應(yīng)用條件下基本上是不可逆的和/或是通過基本上不可逆的反應(yīng)形成的。優(yōu)選的共價鍵是碳-碳鍵和/或碳-氮鍵，而且更優(yōu)選是飽和鍵，例如，C-N單鍵。
所述活性位點對于基片表面自身來說可能是固有的，此時，在本發(fā)明的方法中應(yīng)用基片時可能不需預(yù)處理。備選地，或者以及，活性位點可呈另一種物質(zhì)的形式添加，該物質(zhì)包含這樣的活性位點，而且它例如作為涂層被加到基片上。利用具有活性位點的物質(zhì)的優(yōu)點在于，這允許更寬范圍地選擇基礎(chǔ)支持基片。
因此優(yōu)選地，所述方法進一步包括將一種物質(zhì)施用和固定到基片上的步驟，所述物質(zhì)包含活性位點。更優(yōu)選地，該物質(zhì)是涂料組合物和/或一種凝膠。優(yōu)選地，所述物質(zhì)是可聚合的，所以，有一個在基片上就地聚合該物質(zhì)而在其上形成涂層的步驟。更優(yōu)選地，所述涂層包含經(jīng)受了聚合過程的活性位點，最優(yōu)選的是，以足夠的濃度將分子探針牢固地連接到它上面而足夠用于多反應(yīng)體系(例如，顯微陣列)。
本發(fā)明還包括那些適合在本發(fā)明方法中處理的基片，這樣的基片包括在其上具有內(nèi)在的活性位點的那些基片和/或其上包含一種包含活性位點的物質(zhì)的那些基片。
還應(yīng)懂得，本文應(yīng)用的基片表示任何合適的載體并且可能包含能負載與之結(jié)合的物質(zhì)(如本文所述)的任何合適的物質(zhì)，而且可能是任意合適的形狀，例如，平的、粗糙的和/或彎曲的。這樣的載體可以是例如，膜、微孔(microwels)、多孔板、離心管、膠片、顯微鏡載片。
本發(fā)明的基片可以是二維的，例如，大致平面自身支持片的表面。然而，也可應(yīng)用其它合適的非平面基片，例如，包括2-D外表面的那些基片和/或處于任意適當(dāng)材料的物品上的它們的部分。
所述基片還可以是三維的，此時，應(yīng)認為表面是任何暴露的表面，不論處于物品和/或其部分的空腔的外部和/或內(nèi)部，例如，多孔性物質(zhì)的物品和/或其上具有多孔表層的物品(例如，燒結(jié)的玻璃)。多孔性應(yīng)當(dāng)是這樣的，物品容易被合適的載體組合物(如本文所述)浸漬而使其暴露的表面(包括空腔和/或間隙內(nèi)的那些表面)官能化?？蓱?yīng)用的其它3-D基片包括呈這種物理形式的物質(zhì)(作為基片本身和/或作為其上的表層)，即，它是高度疏松的和/或高表面積的，例如，具有作為分散相的氣體的分散液，例如，水凝膠和/或氣凝膠。就3-D基片來說，優(yōu)選的是，應(yīng)當(dāng)測定每單位體積或每單位表面積的接枝密度(通過任何合適的技術(shù)測定的，例如解吸)而不是外表面積的單位。
如本文所述希望的平行操作可按很多方式實現(xiàn)。本文應(yīng)用的術(shù)語“多反應(yīng)體系”廣義上表示這樣的任何體系，它提供一系列很多活性位點，它們可被平行處理而且例如可用于同時進行大量通?；瘜W(xué)上相似的反應(yīng)(例如，大量平行的體系)。所以，廣義上一個多反應(yīng)體系包括至少兩個不同類的下述體系。應(yīng)懂得，在本發(fā)明最寬廣的方面，如本文應(yīng)用的術(shù)語“顯微陣列”在適當(dāng)時可由術(shù)語“多反應(yīng)體系”代替。廣義說來，相同的制備技術(shù)和化學(xué)(例如，本文參照本發(fā)明的顯微陣列描述的那些)可用于本發(fā)明的任何多反應(yīng)體系，本領(lǐng)域技術(shù)人員將懂得進行任何必要的修飾。
第一類本發(fā)明的多反應(yīng)體系包括，作為單個裝置(例如，顯微陣列)的一部分的官能化基片，它例如包括其上大量獨立的但共同參與的(co-joined)和/或鄰近的位點(它們可能是多官能的，和/或不同官能化的和/或花樣的)。可從它的呈一定形式(例如，呈陣列形式)的位置獲得關(guān)于位點性能的信息。這類體系的一個具體實例是一塊平的平面薄片(例如，玻璃的或聚合物載片)，它的表面上包括網(wǎng)格狀不同的位點，其上以預(yù)先排列的形式固定了探針。靶物質(zhì)就可暴露于整個網(wǎng)格。
本發(fā)明的多反應(yīng)體系還可包括第二種類型，其中，該體系包含和/或由一系列很多(優(yōu)選是小的或微小尺寸的)官能化基片(任選非平面表面官能化物質(zhì))構(gòu)成，它們各自(和/或它們的組)可能由于活性位點和/或探針和/或特定的組合和/或其混合物的性質(zhì)不同而有差異地與環(huán)境起反應(yīng)。例如，雖然每種(或每組)基片各不相同，但每種基片可能只包括一類位點和其上固定的探針(均勻活性的)。信息可來自統(tǒng)計分析和/或離析具有選定的特性的物質(zhì)(例如，具有某些特性的物質(zhì)的數(shù)量和/或分布是可以測定的和/或可以收集到的)。這樣的基片混合物可通過就地制備而一起生成和/或可能包括很多分別制備的基片(隨后在應(yīng)用前按要求的比率將它們一起混合)。
因此，多反應(yīng)體系的用途在于，它們包含很多組分，這些組分與它們的環(huán)境有差異地相互作用，從而允許基本同時地(平行地)進行許多試驗。如上所述，這可通過兩類體系實現(xiàn)，例如通過在其上一定的位置具有不同特性的顯微陣列和/或通過一組官能化物質(zhì)，各個物質(zhì)一致地在其上官能化但各個物質(zhì)具有不同的特性。
顯微陣列可從包括和/或應(yīng)用于基片表面的物質(zhì)(例如，涂料或凝膠)制備，所述物質(zhì)包含活性位點。隨后可通過合適的反應(yīng)將包含可與所述活性位點反應(yīng)的化學(xué)基的有機探針同所述物質(zhì)牢固地連接(優(yōu)選以共價鍵連接)。優(yōu)選的是，將所述物質(zhì)在它連接的基片上(或者它形成的基片上)就地聚合，這樣，聚合后足夠多的活性位點保持牢固地連接有機探針。還可能，所述物質(zhì)包括包含所述活性位點的分子。該物質(zhì)還可被接枝到基片上和/或可形成部分基片表面(即，基片本來包含活性位點而不需進一步涂布)。
還可能在基片上具有活性位點，它們能與多官能的(優(yōu)選二官能的)連接物質(zhì)反應(yīng)而在相同的位置生成另一種與第一種相同或不同的活性位點。例如，基片上的羥基官能位點可與異氰酸根合(甲基)丙烯酸酯的異氰酸基反應(yīng)而給出新的活性位點，其上具有游離的(甲基)丙烯酸酯部分，通過連接基氨基甲酸酯(甲基)丙烯酸酯連接到基片表面。以這種方式官能化的基片也構(gòu)成本發(fā)明而且也可如本文所述應(yīng)用。
有利地，首先用含活化不飽和部分的可聚合組合物涂布基片。第二步，按讓活化不飽和部分保持在涂層上的方式使涂層聚合。第三步，通過加成反應(yīng)使涂布的基片與包含對活化乙烯基不飽和雙鍵呈活性的基的有機探針反應(yīng)。
本發(fā)明又一方面提供了一個多反應(yīng)體系，它包含一種或多種如本文所述的官能化基片，基片上放置有分子探針。
本發(fā)明的進一步方面提供了一種應(yīng)用多反應(yīng)體系的方法，該方法包括這一步驟，即，對一種或多種如本文所述的本發(fā)明官能化基片施用任選分散于一種或多種載體介質(zhì)中的靶分子。
所述靶可用來提供關(guān)于該靶和/或分散它的介質(zhì)和/或所述多反應(yīng)體系所接觸的和/或已經(jīng)接觸的環(huán)境的信息。
優(yōu)選地，如果所述多反應(yīng)體系包含單一基片(例如，顯微陣列)，活化不飽和部分和/或它(們)的補體以預(yù)定的形式(例如，2-D格柵)淀積在其上。
如本文所述獲得的和/或可獲得的多反應(yīng)體系(例如，顯微陣列)可用來測定關(guān)于同牢固地連接到如本文所述基片的那些互補的有機分子的信息(例如，結(jié)構(gòu)，濃度和/或任何其它有用的化學(xué)的、生化的和/或生物的信息)。顯微陣列還可用來優(yōu)選與顯微陣列所接觸的液體中一種或多種選定的物質(zhì)結(jié)合。這將會適用于例如需要鈍化或靶向生物活性物質(zhì)時(例如，如果探針包含生物活性抗體)。
本發(fā)明其它非限制性的實施方案(除本文其它地方描述的以外)包括，本發(fā)明的基片和/或多反應(yīng)體系在下列任何和/或全部應(yīng)用領(lǐng)域(包括其任意可能的組合)中的應(yīng)用本發(fā)明的基片被用于這樣的用途，例如，cDNA和寡核苷酸芯片，生物化學(xué)免疫測定，蛋白質(zhì)組(proteonomics)，基因表達，藥物靶鑒定，藥物基因組(pharmacogenomics)，藥物/毒素活性預(yù)測(predection)，治療靶的發(fā)現(xiàn)和改良的醫(yī)學(xué)處置，生物樣品分析，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，蛋白質(zhì)藥物靶的化學(xué)實體的篩選。
其它用途是下列物質(zhì)的檢測和/或分析(分析它們的存在和/或濃度)雜質(zhì)、污染物、反應(yīng)副產(chǎn)物、微生物區(qū)系、小型動物區(qū)系、病原體和/或不需要的成分。例如在食品中，可能需要檢測例如牛奶或肉中的下列物質(zhì)，例如，基因修飾的物質(zhì)、抗生素和/或激素。所以，本發(fā)明可用來提供對產(chǎn)品改良的質(zhì)量控制和/或成分標(biāo)記。
其它用途還有，適用于動物和/或人體中生物的，藥物的和/或獸醫(yī)的狀況(例如，疾病和/或障礙)的檢測和/或試驗；和/或提供診斷工具，治療，療法和/或其預(yù)防；和/或適用于任何其它藥物的和/或獸醫(yī)的應(yīng)用，例如，DNA-RNA和/或RNA-肽作用研究。
本發(fā)明另一方面可能提供一種制備基片的方法，其中，可用包含一個或多個活化不飽和部分的可聚合組合物涂布一種基片；然后可按讓活化不飽和部分保持在涂層上的方式使涂料聚合；以及在又一個步驟中，涂布的基片就可通過加成反應(yīng)而與包含對所述活化不飽和部分呈活性的基的有機探針反應(yīng)。
本發(fā)明又一方面可能提供一種制備顯微陣列的方法，其中，可將涂布組合物淀積在一種基片表面；然后可就地聚合而在其上形成一涂層，它在聚合后包含活化不飽和部分；隨后可通過加成反應(yīng)將包含對所述活化不飽和部分呈活性的化學(xué)基的有機探針共價結(jié)合到基片上。
本發(fā)明又一方面可能提供一種基片，它包含通過活化不飽和加成反應(yīng)牢固地連接到它表面的有機探針，該有機探針以一定的形式和/或顯微陣列形式排列在和/或置于它上面。在本說明書中，術(shù)語“活化不飽和部分”被用來表示一種物質(zhì)，它包含與至少一個活化部分化學(xué)鄰近的至少一個不飽和碳碳雙鍵。該物質(zhì)由式I表示。優(yōu)選地，所述活化部分包括任意基，該基通過合適的親電基活化其上的乙烯基不飽和雙鍵而加成。適宜的活化部分包括氧，硫，(任選有機取代的)氨基，硫代羰基和/或羰基(后兩種基任選被硫、氧或(任選有機取代的)氨基取代)。它們還包括磺酰胺、砜和亞砜基。更適宜的活化部分是(硫代)醚、(硫代)酯和/或(硫代)酰胺部分。最適宜的“活化不飽和部分”包括一個“不飽和酯部分”，它表示一種有機活性種，該活性種包含一個或多個“烯化烴基(硫代)羰基(硫代)氧基”和/或一個或多個“烯化烴基(硫代)-羰基(有機)氨基”和/或類似的和/或衍生的部分，例如，包括(甲基)丙烯酸酯官能團和/或其衍生物的部分?！安伙柡王ゲ糠帧笨扇芜x包括任選取代的普通α，β-不飽和酸、酯和/或它們的其它衍生物，包括硫代衍生物及其類似物。
所述活化不飽和部分是式1表示的那些
式1其中，如果n＝0，m＝1，X3是碳且X1是氮，它們之間的鍵就是三鍵，而且R不存在；如果n＝1，m＝1，X3是碳且X1是氧或硫，它們之間的鍵就是雙鍵，而且X2是被一個有機取代基取代的氧或硫或氮；如果n＝1，m＝1，X3是碳且X1是氧或硫，它們之間的鍵就是雙鍵，而且X2是被一個有機取代基取代的氧或硫或氮；如果n＝1，m＝1或2，X1是硫且X1是氧，它們之間的鍵就是雙鍵，而且X2是被一個有機取代基取代的氮；R1，R2，各自獨立表示氫，羥基或有機基，R3和R4各自獨立表示氫或有機基，最后含一個硅原子，R1和R2不與R4連接。
應(yīng)懂得，本文的式1可表示獨立的化學(xué)物質(zhì)(例如，一種化合物、離子、自由基、低聚物和/或聚合物)和/或其任意部分。所以，式1還可表示多價(優(yōu)選二價)自由基。于是，本文關(guān)于R1，R2，R3，R4和R5給定的選擇在適當(dāng)時還包括相應(yīng)的二價或多價自由基。
更優(yōu)選的式1部分(包括它們的異構(gòu)體和混合物)是那些，其中，n是1；X1是O；X2是O，S或NR5；X3是碳。
R1，R2，R3和R4獨立地選自H，任選的取代基和任選取代的C1-10氫碳基(hydrocarbo)，其中，R5選自H和任選取代的C1-10氫碳基。
最優(yōu)選的是，n是1；X1是O；X2是O或S；X3是碳，而且R1，R2，R3和R4獨立是H，羥基和/或任選取代的C1-6烴基。R4還可表示C1-6烴基烷氧基硅烷。
例如，n是1；X1和X2都是O；而且R1，R2，R3和R4獨立是H、OH和/或C1-4烷基或R4是C1-4烷基硅烷。
至于式1部分，其中，n是1而且X1和X2都是O并且X3是碳，那么當(dāng)(R1和R2)之一是H且R3也是H時，式1表示一個丙烯酸酯部分，它包括丙烯酸酯(當(dāng)R1和R2都是H時)及其衍生物(當(dāng)R1或R2不是H時)。同樣，當(dāng)(R1和R2)之一是H而且R3是CH3時，式1表示一個甲基丙烯酸酯部分，它包括甲基丙烯酸酯(當(dāng)R1和R2都是H時)及其衍生物(當(dāng)R1或R2不是H時)。式1的丙烯酸酯和/或甲基丙烯酸酯部分是特別優(yōu)選的。
式1適宜的部分是那些，其中，n＝1；X1& X2＝O，X3是碳；R1和R2獨立是H，甲基或OH，而且R3是H或CH3。
式1最適宜的部分是那些，其中，n＝1；X1& X2＝O，X3是碳；R1是OH，R2是CH3，而且R3是H，和/或其互變異構(gòu)體(例如，乙酰乙酸基官能團)。
最適宜的不飽和酯部分選自-OCO-CH＝CH2；-OCO-C(CH3)＝CH2；乙酰乙酸基，-OCOCH＝C(CH3)(OH)及其全部合適的互變異構(gòu)體。應(yīng)懂得，式1表示的任何合適的部分在本發(fā)明含義中都可以用，例如，其它活性部分。
本文應(yīng)用的術(shù)語“任選的取代基”和/或“任選取代的”(除非后面是其它取代基的清單)表示下列基的一種或多種(或者被這些基取代)羧基、磺基、甲酰、羥基、氨基、亞氨基、次氮基、巰基、氰基、硝基、甲基、甲氧基和/或它們的組合。這些任選的基包括，很多(優(yōu)選兩個)前述基的相同部分的所有化學(xué)上可能的組合(例如，氨基和磺?；绻舜酥苯舆B接，就表示氨磺酰基)。優(yōu)選的任選的取代基包括羧基、磺基、羥基、氨基、巰基、氰基、甲基和/或甲氧基。
如本文應(yīng)用的術(shù)語“有機取代基”或“有機基”(本文還縮寫為“有機的”)表示任何一價的或多價的部分(任選與一個或多個其它部分連接)，它包含一個或多個碳原子和任選一個或多個其它雜原子。有機基可包括有機雜原子基(organoheteryl groups)(也稱為有機元素基)，它們包括一價含碳基，所以它們是有機的，但它們在非碳原子上具有游離價鍵(例如，有機硫基)。有機基可備選地或另外地包括有機基(organyl groups)，它們包含任意有機取代基，不管官能型如何，在碳原子上具有一個游離價鍵。有機基還可包括雜環(huán)基，它們包括通過從雜環(huán)化合物(一種環(huán)狀化合物，它具有作為環(huán)節(jié)的至少兩種不同元素的原子，此時一種原子是碳)的任意環(huán)原子上除去一個氫原子而形成的一價基。優(yōu)選地，本文的有機基中的非碳原子可選自氫、磷、氮、氧、硅和/或硫，更優(yōu)選選自氫、氮、氧、磷和/或硅。
最優(yōu)選的有機基包括一個或多個下列含碳部分烷基，烷氧基，烷?；?，羧基，羰基，甲酰和/或其組合；任選與一個或多個下列含雜原子部分組合氧，硫，亞磺酰，磺酰，氨基，亞氨基，次氮基和/或其組合。有機基包括，很多(優(yōu)選兩個)前述含碳和/或含雜原子部分的相同部分中的所有化學(xué)上可能的組合(例如，烷氧基和羰基如果彼此直接連接，就表示烷氧羰基)。如本文應(yīng)用的術(shù)語“氫碳基(hydrocarbogroup)”是有機基的一個亞組并且表示任何一價或多價部分(任選與一個或多個其它部分連接)，它由一個或多個氫原子和一個或多個碳原子構(gòu)成而且可包括飽和的、不飽和的和/或芳族的部分。氫碳基可包括下列基中的一個或多個。烴基，包括通過除去烴中的一個氫原子而形成的一價基。亞烴基，包括通過除去烴中的兩個氫原子而形成的二價基，它的游離價鍵不參與雙鍵。烯化烴基(hydrocarbylidene groups)，包括通過除去烴中相同碳原子上的兩個氫原子而形成的二價基(由“R2C＝”表示)，它的游離價鍵參與雙鍵。次烴基，包括三價基(由“RC≡”表示)，是通過除去烴中相同碳原子上的三個氫原子而形成的，它的游離價鍵參與叁鍵。氫碳基還可能包括飽和碳碳單鍵；不飽和碳碳雙鍵和/或三鍵(例如，分別是烯基和/或炔基)和/或芳族基(例如，芳基)而且當(dāng)有指明之時可被其它官能團取代的基。
適當(dāng)時和除非文中另外清楚地指出，如本文應(yīng)用的術(shù)語“烷基”或其等同術(shù)語(例如“烷”)可輕易被包括下列基的術(shù)語替代，即，任何其它氫碳基，例如本文描述的那些(例如，包括雙鍵，三鍵，芳族部分(例如，分別是烯基，炔基和/或芳基)和/或其組合(例如，芳烷基)以及連接兩個或多個部分的任何多價氫碳基(例如，二價亞烴基，例如，亞烷基)。
除非另外說明或文中另外清楚地指出，本文所述任何自由基或部分(例如，作為取代基)可能是多價的或一價的自由基(例如，連接兩個其它部分的二價亞烴基部分)。然而，本文指出的這類一價基或多價基還可包括任選的取代基。一個包含三個或更多個原子的鏈的基表示一個這樣的基，其中，整條鏈或部分鏈可能是線形的、支化的和/或形成一個環(huán)(包括螺環(huán)和/或稠合環(huán))。對某些取代基規(guī)定了某些原子的總數(shù)，例如，C1-N有機基，表示有機部分含1～N個碳原子。在本文的任何式中，如果沒有指出一個或多個取代基連接到某部分的任意特定原子上(例如，在沿鏈和/或環(huán)的特定位置上)，該取代基就可替代任何H和/或可位于化學(xué)上適合的或有效的部分上的任意可提供的位置。
優(yōu)選的是，本文列出的任何有機基包含1～36個碳原子，更優(yōu)選1～18個。特別優(yōu)選的是，有機基中的碳原子數(shù)是1～10個，尤其1～4個(含端值)。
如本文應(yīng)用的化學(xué)術(shù)語(除了關(guān)于特別標(biāo)記的化合物的IUPAC名稱)，它們包括括號中給出的特征-例如，(烷基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸酯和/或(共聚)聚合物-表示括號內(nèi)的部分是隨含義指示任選的，所以，例如，術(shù)語(甲基)丙烯酸酯表示甲基丙烯酸酯和丙烯酸酯這兩者。
除非文中另外清楚地指出，如本文應(yīng)用的很多術(shù)語形式都應(yīng)認為包括單數(shù)形式，反之亦然。
如本文應(yīng)用的術(shù)語“包括”應(yīng)理解為，表示隨后列出的不是窮舉的而且可能包括或者可能不包括任何其它另外合適的項目，例如，一個或多個另外的特征、組分、成分和/或合適的替代物。
術(shù)語“有效的”(例如，參照方法、用途、產(chǎn)品、原料、化合物、單體、低聚物、本發(fā)明的聚合物母體和/或聚合物)應(yīng)理解為表示在下列應(yīng)用和/或用途的任一項或多項中的適用性顯微陣列裝置和/或其部件例如，官能化基片(優(yōu)選為了化學(xué)分析和/或合成)的制備和/或應(yīng)用，和/或從它直接和/或間接獲得的產(chǎn)物和/或結(jié)果的應(yīng)用；和/或本文描述的任何其它應(yīng)用。
這樣的適用性可能是直接的(此時某物質(zhì)具有前述應(yīng)用的所需性能)和/或是間接的(此時某物質(zhì)具有作為合成中間體的應(yīng)用)和/或是制備直接有用的物質(zhì)中的檢定工具。如本文應(yīng)用的術(shù)語“合適的”表示一個官能團適合于生產(chǎn)一種有效的產(chǎn)品。可以選定重復(fù)單元中的取代基以改善某些物質(zhì)與聚合物和/或樹脂(其中，可能為了前述應(yīng)用而配制和/或摻和它們)的相容性。于是，可選定取代基的尺寸和長度而優(yōu)化與樹脂的物理纏結(jié)或內(nèi)在位置或者它們可能包括或可能不包括其它能與這樣的其它樹脂進行化學(xué)反應(yīng)和/或交聯(lián)的活性體。
某些部分、物質(zhì)、基、重復(fù)單元、化合物、低聚物、聚合物、原料、混合物、組合物和/或配方，它們包括和/或被用于某些或全部本文描述的本發(fā)明，可能以一種或多種不同的形式存在，例如，下列非窮舉的那些的任意形式立體異構(gòu)體(例如，對映體(例如，E和/或Z型)，非對映異構(gòu)體和/或幾何異構(gòu)體)；互變異構(gòu)體(例如，酮和/或烯醇形式)，構(gòu)象異構(gòu)體，鹽，兩性離子，絡(luò)合物(例如，螯合物，籠形化合物，填隙化合物，配體絡(luò)合物，有機金屬絡(luò)合物，非化學(xué)計量絡(luò)合物，溶劑合物和/或水合物)；同位素替代的形式，聚合構(gòu)型[例如，均聚物或共聚物，無規(guī)、接枝或嵌段聚合物，線形或支化的聚合物(例如，星型和/或側(cè)鏈支化的)，交聯(lián)的和/或網(wǎng)狀的聚合物，可從二價和/或三價重復(fù)單元獲得的聚合物，樹枝狀聚合物，不同立構(gòu)規(guī)整性的聚合物(例如，全同立構(gòu)的、間同立構(gòu)的或無規(guī)立構(gòu)的聚合物)]；多形物(例如，填隙形，晶型和/或無定形)，不同的相，固溶體；它們的組合和/或其混合物。本發(fā)明包括和/或應(yīng)用有效的所有這些形式。
本發(fā)明的一個特征是一層涂層，它里面攜帶活化不飽和部分而將DNA和/或其它生物分子結(jié)合到基片上。從實際前景來看，存在很多方法來增大涂層中活化不飽和部分的量。按本發(fā)明，在涂層表面能達到這樣的作用的所有工藝和方法都是合適的。
現(xiàn)在描述兩種方法，它們優(yōu)選用作、用于本發(fā)明和/或與本發(fā)明一起使用以獲得含游離活化不飽和部分的涂料。
在這些方法之一中，用作、用于本發(fā)明和/或與本發(fā)明一起應(yīng)用的涂料是從含一種或多種聚合物母體(它(們)包含作為唯一可聚合基的活化不飽和部分)的組合物獲得的和/或可獲得的。所述聚合物母體可能含任意單體、低聚物和/或預(yù)聚物(單獨的和/或呈摻和物)?？砂慈魏魏线m的方法固化這些組合物，它給出包含足夠數(shù)量游離的(即，活性的)活化不飽和部分而適用作官能化涂料的聚合物。
可用來制備用作、用于本發(fā)明和/或與本發(fā)明一起作用的涂料的一種備選方法包括聚合物母體，它(們)包含的官能團能與含活化不飽和部分(例如，(甲基)丙烯酸酯部分)的化合物的另一種官能團反應(yīng)。例如，一種含羥基的聚合物母體可與丙烯酰氯反應(yīng)，或者一種含羧酸基的聚合物母體可與(甲基)丙烯酸縮水甘油酯反應(yīng)。合作為唯一化學(xué)上可聚合部分的(甲基)丙烯酸酯部分的聚合物母體還可按一定的方式固化而在聚合后給出含游離(甲基)丙烯酸酯部分的聚合物。
很多不同的聚合物適合作為用作、用于本發(fā)明和/或本發(fā)明一起作用的聚合物母體和/或聚合物涂料，例如，任何下列聚合物和/或它們的任意混合物，它們的共聚物和/或相同物質(zhì)中它們的組合體聚氨酯(甲基)丙烯酸酯，(甲基)丙烯酸(甲基)丙烯酸酯，聚酯(甲基)丙烯酸酯，環(huán)氧(甲基)丙烯酸酯，樹枝狀和/或超支化聚酯(甲基)丙烯酸酯和/或聚氨酯丙烯酸酯，聚硅氧烷(甲基)丙烯酸酯和/或(甲基)丙烯酸酯的胺。
能生產(chǎn)合適的聚合物(例如，本文描述的那些)的組合物是本領(lǐng)域熟知的那些任意組合物，它們優(yōu)選屬于技術(shù)領(lǐng)域中稱為輻射可固化的(輻射固化)組合物。有效的組合物可呈任何合適的物理狀態(tài)和/或形式存在，例如，分散液，溶液和/或乳液，例如，以水和/或有機溶劑為連續(xù)相；和/或沒有任何水或有機溶劑的組合物(例如，聚合物母體的混合物和/或固溶體)。乳液可包含任意合適的連續(xù)相(例如，油包水(W/O)，水包油(O/W)乳液)，而分散相還可任選包含乳液(例如，水包油包水(W/O/W)和/或油包水包油(O/W/O)乳液)。
其它合適的聚合物和/或組合物包括如下文獻中列出的那些“表面涂料技術(shù)”，Vol.II-預(yù)聚物和活性稀釋劑-Chemistry &Technology of UV and EB Formulations for Coatings，Inks andPaints，G.Webster編輯，由Wiley出版(1997)。
可通過任意合適的可被用來獲得用作、用于本發(fā)明和/或本發(fā)明一起使用的聚合物涂料的方法引發(fā)聚合，例如，含游離活化不飽和部分的那些涂料。有兩種優(yōu)選的聚合引發(fā)方法，即，熱引發(fā)和/或通過輻射(例如，UV或電子束輻射)。適合熱聚合的組合物可能包含熱引發(fā)劑。聚合還可在紫外線輻射下發(fā)生，于是通常在組合物中存在一種光敏引發(fā)劑而有助于聚合。還可應(yīng)用電子束輻射。
殘余未反應(yīng)的游離活化不飽和部分(例如，游離(甲基)丙烯酸酯)的量可通過聚合條件來調(diào)節(jié)，例如，溫度，輻射劑量，引發(fā)劑的類別和量等，例如下列文獻中所述超速光聚合反應(yīng)的動力學(xué)研究，C.Decker，B.Elzaouk，D.Decker，J.M.S.-Pure Appl.Chem.，A(33)，pp.173～1790(1996)。
可用來制備本發(fā)明的基片的另一條途徑應(yīng)用的涂料組合物包含單獨的或呈摻和物的任意聚合物母體(例如，單體、低聚物和/或預(yù)聚物)，它的至少一種包含至少一種能加聚的化學(xué)活性基。活化不飽和部分還可存在于這些聚合物母體的至少一種中。備選地，包含能加聚的化學(xué)活性基的聚合物母體可反應(yīng)而生成這樣的聚合物母體，即，大致不含(甲基)丙烯酸酯部分，但是仍包含可隨后與其它活化不飽和部分反應(yīng)的活性基。
例如，聚氨酯聚合物(例如，溶于溶劑中和/或呈水分散液的那些)可通過多元醇與多異氰酸酯反應(yīng)而制備。所以，游離(甲基)丙烯酸酯部分可作為(甲基)丙烯酸酯的醇和/或(甲基)丙烯酸酯的多元醇摻入聚合物，例如，通過異氰酸酯末端的聚合物母體的封端(它任選可能是全部或部分地鏈增長的)和/或作為聚合物母體自身的組分(它也任選可能是全部或部分地鏈增長的)。
本文描述的相同和/或相似的方法可用來制備含很多(甲基)丙烯酸酯部分的樹枝狀和/或超支化的羥基化合物(例如，醇和/或多元醇)。這樣的羥基化合物摻入聚氨酯可生產(chǎn)具有高濃度游離(甲基)丙烯酸酯部分的涂料。
在本發(fā)明一個實施方案中，如果R4表示含取代基的烷氧基或鹵代硅，式I的不飽和活化部分可直接結(jié)合到載體上。
為此，必須選定具有羥基的載體，例如，玻璃或硅片。羥基或鹵硅烷基與載體表面存在的羥基反應(yīng)，將活化不飽和部分直接結(jié)合到載體上。
本文所述本發(fā)明的任意合適的基片可用來制備本發(fā)明的顯微陣列。優(yōu)選的基片包括玻璃和/或塑料，例如，聚碳酸酯(PC)，聚酯(PE)，聚烯烴(例如，聚丙烯(PP))，聚對苯二甲酸乙二酯(PET)，尼龍，聚苯乙烯，環(huán)烯烴共聚物(COC)和/或活化纖維素或其混合物。任選地，這樣的基片可被預(yù)處理(例如，通過用高壓電暈放電處理)以便促進粘合，然后就可如本文所述處理。
優(yōu)選的分子探針包含一個或多個不同的羥基和/或氨基，更優(yōu)選是氨基。
不想受任何機理的束縛，我們認為，所述探針包含化學(xué)基，它們?nèi)菀滓怨矁r鍵與活化不飽和部分結(jié)合(優(yōu)選通過加成反應(yīng))。如果活化不飽和部分包括不飽和酯，合適的加成反應(yīng)可包括人們熟知的邁克爾加成反應(yīng)。優(yōu)選地，這類反應(yīng)在顯微陣列的生產(chǎn)過程中在室溫下進行。更優(yōu)選地，該反應(yīng)在例如淀積在基片上的含氨基的物質(zhì)與官能化基片表面可利用的不飽和酯部分(例如，含(甲基)丙烯酸酯部分的那些)的不飽和(烯化烴基)之間進行。
優(yōu)選的有機探針是生物分子，更優(yōu)選是DNA，最優(yōu)選是含氨基的那些。氨基是常見于生物分子中的普遍的活性基。在本發(fā)明方法的一個實例中，可通過任意合適的方法(例如，顯微點樣和/或噴墨印刷)將胺終端的DNA序列淀積在基片上而與基片上以預(yù)定的形式排列的(例如，顯微陣列)不飽和(甲基)丙烯酸酯部分反應(yīng)。
本發(fā)明的主要優(yōu)點包括下列的任意和/或全部任何基片都可利用適當(dāng)?shù)嘏渲频倪m用于DNA生物芯片和/或相似用途的涂料來處理。
可實現(xiàn)高丙烯酸酯密度從而產(chǎn)生相應(yīng)的每單位面積探針的高密度。
丙烯酸酯部分的反應(yīng)性在基片上探針的迅速固定化的競爭要求與官能化基片的良好貯存性能之間提供了良好的平衡。
與醛官能化基片(被認為是目前可利用的最佳官能化基片)相比，應(yīng)用普及的送遞技術(shù)生產(chǎn)合適的官能化基片需要的操作步驟減少了，本發(fā)明的丙烯酸酯官能化基片取消了還原步驟但具有可比的(如果不是更好的)反應(yīng)性。
本文應(yīng)用的方法適合很多材料，所以減少了以前關(guān)于顯微陣列的設(shè)計限制并且促進集成化芯片基實驗系統(tǒng)的生產(chǎn)。
本發(fā)明的官能化基片具有良好的化學(xué)和/或機械抗性-特別是當(dāng)應(yīng)用輻射可固化原料時。更具體地說，當(dāng)輻射可固化原料用于金屬表面(例如，見于CD-ROM的銀表面)時，有可能配制涂料而將它良好的粘合特性與基礎(chǔ)金屬層很好的耐腐蝕性結(jié)合。
本文還沒有描述的本發(fā)明其它方面和/或優(yōu)選的特征給出于權(quán)利要求書中。
可通過后面的附圖闡述本發(fā)明，其中

圖1是關(guān)于本發(fā)明基片的DNA接枝效率對游離丙烯酸酯官能度的曲線圖；以及圖2是在本文描述的各種固定化和雜交試驗中測試的本發(fā)明顯微陣列的圖。
現(xiàn)在將通過如下非限制性的實施例和試驗(它們只是闡述性的)闡述本發(fā)明。這些實施例包括兩類配方(熱固化的或通過輻射固化的)，它們闡明和評價了某些用于顯微陣列(例如生物芯片)的丙烯酸化基片。在這些實施例中，分別描述了制備基片的操作方法，利用結(jié)果來評價基片。在本文的實施例中NCO值或濃度(本文還以INCO表示)可利用任意合適的標(biāo)準(zhǔn)方法(例如，ASTM D2572-87中描述的方法)測定；羥基值或濃度(本文還以IOH表示)可利用任意合適的標(biāo)準(zhǔn)方法(例如，E222-73中描述的方法)測定；酸值或濃度(本文還以IH+表示)可利用任意合適的標(biāo)準(zhǔn)方法(例如，ASTM D 974-64中描述的方法)測定；和/或游離丙烯酸值或濃度(本文還以IACR表示)可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適的標(biāo)準(zhǔn)方法來測定。
基片制備涂料聚合物母體的合成實施例1羥基官能的氨基甲酸酯丙烯酸酯的合成將444g量的預(yù)熱的5-異氰酸根合-1-異氰酸根合甲基-1，3，3-三甲基環(huán)己烷(也稱為IPDI，可從Degussa-Huels，Germany商購)導(dǎo)入一個裝有攪拌器、溫度計、水冷卻的冷凝器和滴液漏斗的2升四頸圓底燒瓶。在45℃下加熱混合物，然后添加0.37g作為催化劑的二月桂酸二丁基錫(也稱為DBTL，可從Akcros商購)。從滴液漏斗緩慢地添加232g丙烯酸羥乙酯和0.925g氫醌一甲基醚，同時將反應(yīng)混合物的溫度保持在65℃的極大值。在該溫度下將混合物保持一小時直到INCO達到2.96meq/g。然后添加250g二-三羥甲基丙烷(IOH為898mgKOH/g)，同時在65℃下進一步加熱反應(yīng)物直到INCO降到低于0.05meq/g。在40℃下冷卻低聚物，用927g乙酸丁酯稀釋而獲得產(chǎn)物氨基甲酸酯丙烯酸酯的50％有機溶液，具有在25℃下135mPas的粘度，IOH為60mg KOH/g和1.078meq/g游離丙烯酸酯(固體產(chǎn)物的IOH是121mg KOH/g)。該氨基甲酸酯丙烯酸酯的分散液被直接用于下述配方。
實施例2多元醇的合成在一個裝有攪拌器、填充柱、冷凝器、溫度計和惰性氣體入口的三升反應(yīng)器中混合1，6-己二醇(1,144.2g)和己二酸(1,135.6g)(兩者可從BASF商購)與DBTL催化劑(O.02g)。用惰性氣體沖洗反應(yīng)器并將反應(yīng)物加熱到195℃～200℃的溫度，同時除去酯化產(chǎn)生的水。反應(yīng)繼續(xù)進行5小時直到IH+是5mg KOH/g和IOH是117mg KOH/g，從而獲得多元醇產(chǎn)物，它具有1000的Mn和112mg KOH/g的最終IOH。該多元醇被直接用于下述配方。
基片的配方和涂布基片從商品化光盤(可從ISP，Belgium商購的未涂布的無裝飾聚碳酸酯CDs)制備了本發(fā)明的官能化基片，用繞線棒刮涂器將它們涂布一層本文描述的配制品表層，它在基片上淀積10μm厚的未固化配制品膜。還可應(yīng)用的其它合適的基片有商品化涂布的聚碳酸酯CDs(可從ISP，Belgium商購)和/或A4尺寸的1mm厚聚碳酸酯片(可從GeneralElectric，USA商購)。然后，按公知的標(biāo)準(zhǔn)方法和闡述本發(fā)明的顯微陣列特性的方案(例如，丙烯酸酯濃度對接枝能力的影響-見圖1)測試本發(fā)明的官能化基片。
涂料配方試驗了三種配方。兩種基于聚合物骨架(輻射固化和熱固化)，而一種基于硅烷化學(xué)。
輻射固化的配方在下表1中描述了本發(fā)明的UV固化配方(實施例3&4)。固化的涂料的游離丙烯酸酯含量來自UV輻射后存在的未反應(yīng)的不飽和基。下表1中的配方是通過以20m/min的速率穿過80W/cm中壓汞燈四次而UV固化的。表1中除光敏引發(fā)劑以外的所有組分都以商品名(如果括號中指出)得自UCB Chemicals。
表1
熱固化的配方可按本文所述配制寬范圍本發(fā)明的熱固化配方，因為最終基片中所需的游離丙烯酸酯濃度可通過增大或減小配方中的羥基官能氨基甲酸酯丙烯酸酯(例如，實施例1)的濃度來調(diào)節(jié)。例如，實施例1的氨基甲酸酯丙烯酸酯上兩個丙烯酸酯基不參與熱引發(fā)的聚合反應(yīng)(交聯(lián))而在交聯(lián)后仍存在。下表2中的配方(實施例5～8)都是在60℃烘箱中熱固化3小時。表2中的配方包含9wt％可從Bayer以商品名Desmodur N3300商購的聚脂族異氰酸酯；(91-X)％實施例2的多元醇以及X％實施例1的氨基甲酸酯丙烯酸酯；其中，X的值給出于表2中。
表2
基于硅烷的體系具有活化不飽和部分的表面的活化可通過硅烷化進行。首先在室溫下將玻璃載片放入1∶1甲醇∶鹽酸溶液中30min清潔載片。然后，用去離子水漂洗載片直到觀察不到流層線。清潔后，將載片活化。這是通過將載片浸入(3-丙烯酰氧基丙基)硅烷的10-3摩爾無水甲苯溶液達1小時而完成的。隨后將樣品浸入新鮮甲苯中在劇烈攪拌下清洗以除去過量的物理吸附的分子，接著在120℃的烘箱中干燥10min。
生物芯片的制備DNA捕獲探針的制備用來制備用作本文所述試驗中捕獲探針的核苷酸的模板DNA序列是巨細胞病毒的那些序列，它們是按Zammateo等在分析生物化學(xué)(Analytic Biochem)253，pp180～189(1997)中描述的方法和方案合成的。這樣應(yīng)用的MIE4引物在它的5′端包含一個氨基，擴增子長度為257個堿基對。應(yīng)用PCR按常規(guī)方法擴增DNA序列，然后通過色譜法用高純PCR產(chǎn)品純化盒(可從Mannheim，Germany商購)將它們與未結(jié)合的核苷酸和引物分離。DNA濃度通過它在260nm處的吸光度測定。將這樣獲得的胺化DNA捕獲探針加到緩沖液中而將探針上的大部分氨基保持在它們的未質(zhì)子化狀態(tài)(即，作為NH2)。如下所述將包含DNA探針的緩沖液(本文也稱為印刷緩沖液)淀積在顯微陣列上。本文應(yīng)用的不同印刷緩沖液中每一種中的DNA探針濃度都是100nM。
標(biāo)記的靶DNA的制備還將巨細胞病毒DNA序列(按前述文獻中所述制備的)用作靶DNA生產(chǎn)的模板。該靶DNA長度為437個堿基對，在PCR擴增中以1∶1的DNA對標(biāo)記的摩爾比用生物素-16-dUTP標(biāo)記該靶DNA。DNA濃度通過它在260nm處的吸光度測定。
制備生物芯片利用顯微陣列(可從WOW，Belgium商購)將印刷緩沖液中的DNA捕獲探針分散到本發(fā)明的官能化樹脂基片上。通過合適的方法(例如，噴墨印刷)將該印刷緩沖液的液滴淀積在芯片上而得直徑約400μm的點，它們彼此間隔約800μm。在23℃下將生物芯片(即，載有DNA捕獲探針的基片)保溫一小時，隨后用0.2wt％十二烷基硫酸鈉(本文也稱為SDS，可從Merck商購)水溶液洗滌一次，然后用水洗滌兩次。將所述生物芯片在沸水中又保溫3分鐘以保證單鏈核苷酸序列牢固地連接到表面。
雜交配制了雜交溶液，它包含溶于0.35M含4％SDS的pH7磷酸鹽緩沖液(例如，可從AAT，Belgium商購的緩沖液)濃度為10nM的標(biāo)記靶DNA(按上述那樣制備的)。將該雜交溶液(70μl)加到雜交室(可從MJResearch，MA，USA商購)中。將該室框在顯微陣列上，利用蓋片密封而使溶液與生物芯片接觸，然后加熱到50℃達2小時。隨后用洗滌液(10mM含0.1％Tween的pH7.5馬來酸鹽緩沖液)洗滌所述生物芯片四次，接著與鏈霉抗生物素-金綴合物(可從Sigma，MO，USA商購)一起保溫45分鐘。然后用相同的洗滌液將生物芯片再洗滌五次，最后在另一保溫溶液(可從AAT，Belgium以商品名Silver Blue Solution商購)中保溫10分鐘。
結(jié)果按下述公知的標(biāo)準(zhǔn)方法和方案進行了如本文所述制備的本發(fā)明顯微陣列的評估，示于圖1&2。
圖1測試了從本文實施例5～8制備的本發(fā)明的官能化基片以闡述丙烯酸酯濃度對接枝能力的影響。將這些結(jié)果給出于本文圖1中并闡述游離丙烯酸酯含量如何影響DNA接枝效率。
圖1的橫坐標(biāo)以meq/g為單位表示分別用實施例5～8中制備的樹脂試驗的涂料配方中游離丙烯酸酯官能度的濃度。
圖1的縱坐標(biāo)表示以相對DNA表面濃度量度的相對接枝效率。這是通過將各情況下測定的信號強度與關(guān)于具有最高游離丙烯酸酯含量(0.98meq/g)的最濃縮的DNA分散液(200nM，實施例8)測定的值進行比較而計算的。所以，縱坐標(biāo)值被歸一化了而無單位。
圖1中的三條線相應(yīng)于關(guān)于不同濃度的NH2-DNA探針進行的試驗25nM(底線，數(shù)據(jù)以▲表示)，50nM(中線，數(shù)據(jù)以◇表示)，以及200nM(上線，數(shù)據(jù)以■表示)。
這些結(jié)果清楚地說明，對于本發(fā)明的基片來說，增大游離丙烯酸酯濃度的效果是引起基片接枝效率的相應(yīng)增大。
圖2對A4尺寸的1mm厚聚碳酸酯片(例如，可從General Electric，USA商購的那些)進行了一系列試驗，用本文實施例4的配制品涂布聚碳酸酯片(在各不同印刷緩沖液中淀積)。圖2示出了從比色顯微陣列讀出器(可從WOW Belgium商購)獲得的顯微陣列的圖，其中，探針組合物的印刷緩沖液成分和pH如本文所述那樣變化。各試驗是按標(biāo)準(zhǔn)方法和如本文描述的那樣進行的。根據(jù)各試驗的作用不同地解釋了圖2中的結(jié)果。
在圖2中，數(shù)字指示的行表示不同的印刷緩沖液，其中“1”表示pH為8的0.1M硼酸鹽緩沖液；“2”表示pH為8的0.1M硼酸鹽緩沖液，含1M NaCl和1％SDS；“3”表示pH為9的0.1M碳酸鹽緩沖液，含0.1％SDS；“4”表示pH為8的0.1M硼酸鹽緩沖液，含0.1％SDS；以及“5”表示pH為7的0.1M碳酸鹽緩沖液，含0.1％SDS。
在圖2中，字母指示的列表示試驗的作用，其中“A”(x2)表示固定化對照；“B”(x2)表示負雜交對照；而“C”(x2)表示正雜交控制。下文更詳細地描述了這些試驗。
得自HIV的DNA序列被用于這些試驗。用來制備HIV衍生的捕獲探針的引物相應(yīng)于序列NH2-GAGGAAGCTGCAGAATGGG；以及GGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGCTG。這些擴增子都是通過利用常規(guī)方式的PCR擴增來自HIV的“GAG”基因的247個堿基的DNA而獲得的。然后，用“High Pure PCR”純化盒純化擴增子并在瓊脂糖凝膠上定量分析。隨后以在不同印刷緩沖液中300nM的濃度(如本文所述)在本發(fā)明的基片上以點的形式淀積捕獲探針。
固定化控制(A)設(shè)計了該試驗而孤立固定化步驟并確定捕獲探針已固定在基片上。應(yīng)用具有生物素標(biāo)記的捕獲探針制備了不同的印刷緩沖液(如本文所述)。正響應(yīng)在顯微陣列上顯示為黑點，并且說明標(biāo)記的捕獲探針的存在。
正雜交控制(B)按標(biāo)準(zhǔn)顯微陣列操作方法進行了該試驗以驗證整個系統(tǒng)有效。正響應(yīng)顯示為顯微陣列上的黑點，并且說明未標(biāo)記的捕獲探針已連接到基片上，隨后通過它們的互補標(biāo)記的靶序列雜交了。
負雜交控制(C)進行了該試驗以檢測試驗A或B中是否有假的正結(jié)果。將與雜交溶液中存在的靶序列都不相應(yīng)的捕獲探針配制入印刷緩沖液，然后通過合適的工具(例如，噴墨印刷機)以點的形式將緩沖液印刷到基片上。該試驗完成后，在所述點上不會發(fā)生雜交，所以，黑點應(yīng)當(dāng)說明有問題，例如，標(biāo)記的靶序列非特異性結(jié)合到設(shè)計得差的基片上。
結(jié)果的解釋從表2中可見，不論印刷緩沖液組成如何(表2中“1”～“5”行)，固定化控制(A)和正雜交控制(B)試驗都給出正結(jié)果(即，相關(guān)欄中的黑點)。所以，涂布了實施例4的基片確實結(jié)合了胺化DNA捕獲探針而適當(dāng)?shù)亟o出起作用的顯微陣列(生物芯片)。負雜交控制試驗(C)在所有情況下都給出負結(jié)果(即，在C欄中沒有黑點)，說明涂布了實施例4的官能化基片在該試驗中沒有給出任何假的正結(jié)果。
從圖2可見，由于應(yīng)用的印刷緩沖液不同而引起一些差異，因為出現(xiàn)正結(jié)果的黑點形狀和尺寸有些變化。這是重要的，因為圖像分析軟件通常用于讀出結(jié)果，而點幾何結(jié)構(gòu)的變化會改變讀出結(jié)果。不想受任何機理的限制，我們認為這種變化可能是由于因涂布而導(dǎo)致的表面能的差異。我們認為這可以這樣補償以大致不影響試驗的方式改變印刷緩沖液從而避免本發(fā)明的顯微陣列產(chǎn)生不同形狀的點。
本文圖1&2給出的結(jié)果表明，本文制備的配制品(實施例4～8)可涂在任意合適的基片上而適當(dāng)?shù)厣a(chǎn)起作用顯微陣列。
權(quán)利要求
1.制備一種在其上具有對分子探針活性基呈活性的位點的基片的方法，該方法包括如下步驟，對所述基片表面施用一種物質(zhì)，該物質(zhì)包含一個或多個式I的具有活化乙烯基不飽和雙鍵的活性位點 式I其中，如果n＝0，m＝1，X3是碳且X1是氮，它們之間的鍵就是三鍵，而且R4不存在；如果n＝1，m＝1，X3是碳且X1是氧或硫，它們之間的鍵就是雙鍵，而且X1是被一個有機取代基取代的氧或硫或氮；如果n＝1，m＝1或2，X3是硫且X1是氧，它們之間的鍵就是雙鍵，而且X1是被一個有機取代基取代的氮；R1，R2各自獨立表示氫、羥基或有機基，R3和R4各自獨立表示氫或有機基，最終含一個硅原子，R1和R2不與R4連接。隨后，在又一步中，將分子探針的活性基共價結(jié)合到具有式I的活性位點的活化乙烯基不飽和雙鍵。
2.權(quán)利要求1的方法，其中，式I的物質(zhì)選自下組物質(zhì)丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、丙烯腈、乙烯基磺酰胺、乙烯基砜、乙烯基亞砜和C1-4烷基硅烷的丙烯酸酯。
3.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中，所述基片選自下組材料尼龍、聚苯乙烯、玻璃、硅片、膠乳、聚丙烯、聚碳酸酯和聚酯。
4.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中，所述分子探針選自下組物質(zhì)DNA、RNA、生物素、毒素、除草劑、殺蟲劑、碳水化合物、藥物靶、抗生素、細胞毒物、類固醇、肽、核苷酸、肽核酸、結(jié)合配偶體、蛋白質(zhì)和半抗原。
5.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中，所述與活性位點的雙鍵反應(yīng)的分子探針的活性基是氨基。
6.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中，通過加熱或者通過輻射基片使式I的活性位點聚合，以便留下未反應(yīng)的活化不飽和雙鍵，它們將通過分子探針的活性基進一步反應(yīng)。
7.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中，使一種聚合物母體在基片上聚合留下未反應(yīng)的官能團，使這些官能團與具有可與其反應(yīng)的基團的式I的活性位點反應(yīng)而不是與活化不飽和雙鍵反應(yīng)，所述活化不飽和雙鍵與分子探針的活性基進一步反應(yīng)。
8.權(quán)利要求7的方法，其中，在與分子探針反應(yīng)以前，所述聚合物選自下列物質(zhì)聚氨酯(甲基)丙烯酸酯，(甲基)丙烯酸(甲基)丙烯酸酯，聚酯(甲基)丙烯酸酯，環(huán)氧(甲基)丙烯酸酯，樹枝狀和/或超支化聚酯(甲基)丙烯酸酯和/或聚氨酯丙烯酸酯，聚硅氧烷(甲基)丙烯酸酯和/或(甲基)丙烯酸酯化的胺。
9.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中，式I的活性基通過它們與式I的烴基鹵代硅烷丙烯酸酯的鹵代硅烷基反應(yīng)而直接連接到攜帶羥基的基片上，所述活化不飽和雙鍵進一步與分子探針的活性基反應(yīng)。
10.前述權(quán)利要求任一項的制備顯微陣列的方法，其中，該顯微陣列負載在選自下組的材料上膜、微孔、離心管、膠片和載片。
全文摘要
公開了制備基片I的方法。制備在其上具有對分子探針活性基呈活性的位點的基片的方法，該方法包括如下步驟，對所述基片表面施用一種物質(zhì)，該物質(zhì)包含一個或多個式I的具有活化乙烯基不飽和雙鍵的活性位點其中，如果n＝0，m＝1，X
文檔編號C12N15/09GK1505544SQ02809106
公開日2004年6月16日 申請日期2002年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月30日
發(fā)明者L·林德肯斯, L 林德肯斯, M·泰勒曼斯, 章, S·凱普勒, 綻, J·利麥科勒, 罌評, B·德貝克爾, 純碩 申請人:Ucb公司