專利名稱：用于人HNF-1α基因擴(kuò)增的多重PCR引物組的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于擴(kuò)增人HNF-1α基因的引物庫(primer pool)，更具體的，涉及通過多重PCR(multiplex PCR)用于擴(kuò)增人HNF-1α基因中靶DNA序列的引物庫。
背景技術(shù)：
用于雜交核酸檢測(cè)的一類方法包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。PCR方法是本領(lǐng)域共知的(U.S.Pat.Nos.4,683,195，4,683,202和4,800,159)。在PCR中，核酸引物與擴(kuò)增靶序列的相反鏈互補(bǔ)，核酸引物與變性樣品退火。然后，DNA聚合酶(典型的是熱穩(wěn)定性的)從雜交的引物開始延伸DNA雙鏈。這個(gè)過程不停的重復(fù)以擴(kuò)增靶核酸。如果核酸引物不能雜交于樣品，就不能形成相應(yīng)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。在這種情況下，PCR引物就起到雜交探針的作用。
在PCR方法中，擴(kuò)增的核酸產(chǎn)物可以用很多方法檢測(cè)，例如，通過使用標(biāo)記的引物向擴(kuò)增鏈中混合入標(biāo)記的核苷酸。用于PCR反應(yīng)的引物包括但不限于放射性物質(zhì)、熒光性染料、洋地黃毒苷(digoxygenin)、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、吖啶酯、生物素和刀豆脲酶。用未標(biāo)記的引物產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物可以用其它方法檢測(cè)，例如凝膠電泳分離后基于染色觀察。
基于PCR的方法在用于檢測(cè)未知序列的核酸時(shí)受到限制。人類基因組由約3×109個(gè)核苷酸組成；因此，很難分離和分析特定的人類基因。然而，PCR可以通過使用一組引物，包括能和靶序列的兩末端互補(bǔ)的引物，高速，特異性和敏感性地?cái)U(kuò)增靶序列(Saiki et al.Science 239487，1988)。
PCR可以廣泛的用于疾病相關(guān)基因的分析。特別是，通過PCR擴(kuò)增基因可以在藥物領(lǐng)域用于分析疾病相關(guān)基因的各種遺傳變異。一種特定的疾病相關(guān)基因可以使用PCR進(jìn)行擴(kuò)增，使用測(cè)序、雜交或者單鏈構(gòu)象多態(tài)性進(jìn)行分析。在分析基因遺傳變異時(shí)，如果靶基因的大小很小，單PCR就足以擴(kuò)增全長(zhǎng)基因。然而，如果靶基因很大，例如，1Kb或者更大，單PCR就很難擴(kuò)增出全長(zhǎng)基因。因此，PCR可以在全部基因的幾個(gè)部分進(jìn)行幾次反應(yīng)，來擴(kuò)增較大靶基因的全長(zhǎng)基因。在分析疾病相關(guān)基因的遺傳變異時(shí)，復(fù)合的PCR反應(yīng)比單PCR反應(yīng)更經(jīng)常使用，因?yàn)榇蠖鄶?shù)疾病相關(guān)基因的大小可達(dá)1.5Kb或更大。
多重PCR方法要求大量的樣品，例如，病人的DNA或者血液。多重PCR也花費(fèi)更多的成本、物力和時(shí)間。因此，多重PCR要被發(fā)展并解決上述問題。一多重PCR反應(yīng)在一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增較多數(shù)基因的靶序列。因此，單PCR使用擴(kuò)增各種靶序列的引物庫擴(kuò)增了大多數(shù)靶序列。
多重PCR試驗(yàn)在本領(lǐng)域是公知的。例如，U.S.Pat.No.5,582,989公開了同時(shí)檢測(cè)多數(shù)已知DNA序列的缺失。此技術(shù)公開了使用第一組探針來與靶雜交。如果靶存在，探針就會(huì)延伸。延伸的產(chǎn)物用PCR進(jìn)行擴(kuò)增。
多重PCR反應(yīng)的一組引物可以特異的雜交于靶序列且為擴(kuò)增靶序列使用的充分的量之間彼此不被干擾。多重PCR使用這樣的一組引物可以使它比單PCR在擴(kuò)增靶序列時(shí)節(jié)省時(shí)間、物力和成本。在使用DNA芯片分析基因的遺傳變異時(shí)，多重PCR在一個(gè)反應(yīng)中擴(kuò)增多于一種DNA樣品時(shí)是有用的。這樣的DNA芯片可用于基因的遺傳變異分析。
眾所周知的，人HNF-1α(肝細(xì)胞核因子-α)基因的遺傳變異，包括了點(diǎn)突變，導(dǎo)致青春晚期糖尿病(matvrity-onset diabetes in the young)(MODY3)(Matschinsky and Magnuson，in‘Molecular Pathogenesis of MODYs′，Karger，1998；US 5,541,060；WO9321343)。MODY 3，一種MODY疾病(MODY1，2，3，4，5)占II型糖尿病病例的大約10-30％。因此，在分析人HNF-1α基因遺傳變異時(shí)，預(yù)料人的糖尿病傾向是可能的。因此，為了使用例如DNA芯片來快速分析人HNF-1α基因，一系列通過多重PCR擴(kuò)增人HNF-1α基因的引物需要被改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了引物庫，包含了至少一組來擴(kuò)增人HNF-1α基因的至少一個(gè)靶序列的引物，所述的至少一組引物選自a)一組包含具有SEQ ID NO 3所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 4所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；b)一組包含具有SEQ ID NO 5所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 6所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；c)一組包含具有SEQ ID NO 7所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 8所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；d)一組包含具有SEQ ID NO 9所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 10所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；e)一組包含具有SEQ ID NO 11所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 12所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；f)一組包含具有SEQ ID NO 13所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 14所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；g)一組包含具有SEQ ID NO 15所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 16所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；h)一組包含具有SEQ ID NO 17所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 18所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；i)一組包含具有SEQ ID NO 19所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 20所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；以及j)一組包含具有SEQ ID NO 21所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 22所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物，其中所述的變體寡核苷酸是指從3′末端，5′末端或者在3′和5′末端有1到3個(gè)附加核苷酸加入或缺失的寡核苷酸。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了使用引物庫對(duì)人HNF-1α基因進(jìn)行測(cè)序的方法。
本發(fā)明的其它實(shí)施方案中提供了用于對(duì)人HNF-1α基因的靶序列的含有引物庫的試劑盒。
本發(fā)明也提供了用于擴(kuò)增本發(fā)明的人HNF-1α基因中靶序列的方法，包括將人HNF-1α基因的靶序列用于使用本發(fā)明引物庫的PCR。


圖1人HNF-1α基因的外顯子1到10的單PCR產(chǎn)物和多重PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果圖。
圖22A到2E描述了使用一組變體(variant)引物獲得的多重PCR反應(yīng)產(chǎn)物的電泳結(jié)果。
圖3圖示使用用于擴(kuò)增每一外顯子的每一引物組作為探針獲得的單PCR和多重PCR的Southern印跡結(jié)果。
圖4通過一組用于擴(kuò)增啟動(dòng)子的引物獲得的單PCR產(chǎn)物核苷酸序列(SEQ ID.31)和已知的人HNF-1α基因的核苷酸序列的比較。
圖5多重PCR反應(yīng)溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)的結(jié)果。
圖6說明通過使用三種不同擴(kuò)增裝置獲得的多重PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果的照片。
具體實(shí)施例方式
為了使本發(fā)明更容易理解，下面定義一些術(shù)語。本文是“核酸”是指核苷酸共價(jià)連接的序列，其中一個(gè)核苷酸的戊糖的3′位置與下一個(gè)戊糖的5′位置通過磷酸二酯基團(tuán)連接，其中的核苷酸殘基(堿基)被連接在特定的序列，即線形順序的核苷酸。
“多核苷酸”在這里是指包含在長(zhǎng)度上大約大于100個(gè)核苷酸序列的核酸。
“寡核苷酸”在這里是指短的多核苷酸或者多核苷酸的一部分。寡核苷酸典型的包含大約2個(gè)到大約100個(gè)堿基的序列。術(shù)語“寡”有時(shí)替代術(shù)語“寡核苷酸”。
堿基“位置”是指給定的堿基或者核苷酸殘基在核酸中的位置。
“目的核酸”是指在樣品中待進(jìn)行研究的特定核酸。
術(shù)語“分離”是用在與核酸或者蛋白相關(guān)時(shí)，是指核酸序列或者蛋白被從至少一種污染物(分別為核酸或者蛋白)中鑒定并分離，在其自然源中該污染物通常與其相關(guān)聯(lián)。分離的核酸與從自然界中發(fā)現(xiàn)的不同。相反，非分離的核酸或蛋白被發(fā)現(xiàn)以其自然存在的狀態(tài)存在。
術(shù)語“純化的”或者“純化”是指一些從目的化合物去除一些污染物的方法的結(jié)果，例如，蛋白或者核酸。純化組分的百分比因此在樣品中是增加的。
術(shù)語“野生型”是指具有在種群中最常觀察到的基因或者基因產(chǎn)物特征的基因或基因產(chǎn)物，并由此特定命名為該基因的“正常的”和“野生型”形式。相反的，術(shù)語“修飾”或者“突變體”是指與野生型基因或者基因產(chǎn)物相比，表現(xiàn)出了序列上的修飾和/或功能性質(zhì)的變化(即，改變的特性)的基因或者基因產(chǎn)物。
已知核酸可以包括不同類型的突變。在這里，“點(diǎn)”突變是指在核酸序列的單個(gè)堿基位置上發(fā)生改變?！皳p害(lesion)”是指在核酸的位點(diǎn)上有一個(gè)或多個(gè)堿基通過缺失或插入而突變，這樣核酸序列就不同于野生型序列。“插入”或者“缺失”典型的是在1到5個(gè)核酸的范圍?？梢岳弥亟MDNA技術(shù)在核酸分子上進(jìn)行有系統(tǒng)地插入、缺失或取代就可以試驗(yàn)性決定所允許的變異并分析所得變體的活性。
此處的“單核苷酸多態(tài)性”或者SNP是指在特定的核酸位置上最大頻率存在的堿基上發(fā)生的一種變異。
不同物種的同源基因或等位基因在序列上有所變化也是公知的。不同物種的同源基因或等位基因的區(qū)域在序列上可以基本一致。這種區(qū)域被稱為“同一性區(qū)域”。值得注意的是這種“基本同一性區(qū)域”可以包括一些錯(cuò)配(mismatches)，在同一性區(qū)域上相同位置的堿基可以是不同的。這個(gè)堿基位置被稱為“錯(cuò)配位置”。DNA分子之所以有5′末端和3′末端是因?yàn)楹怂崃姿岫ユI產(chǎn)生在取代基單核苷酸的戊糖環(huán)的5′碳和3′碳。在新鍵接5′碳的多核苷酸的末端的是其5′末端核苷酸，在新鍵接3′碳的多核苷酸的末端是其3′末端核苷酸。本文的末端核苷酸是3′-或5′-末端位置的核苷酸。在這里，核酸序列，即使大的寡核苷酸或者多核苷酸，也可以說有3′和5′末端。例如，位于較大染色體序列內(nèi)的基因序列仍可以說有3′和5′末端。
在這里，核酸探針的3′末端區(qū)域是指包括從3′末端位置起大約10個(gè)殘基核苷酸的探針區(qū)域。
無論是線形還是環(huán)狀DNA分子，相對(duì)于連接或者能連接于那一元件5′末端的部分，游離的元件(discrete elements)被稱為“5′”或者“上游”。相似的，相對(duì)于連接或者能連接于那元件3′末端的部分，游離的元件被稱為3′或者下游。DNA上轉(zhuǎn)錄是沿DNA鏈5′-3′方向進(jìn)行的。這意味著，RNA也是通過在伸長(zhǎng)鏈的3′末端依次添加5′-三磷酸核糖核苷酸(隨著焦磷酸的去除)來合成的。
術(shù)語“靶核酸”或者“核酸靶”在這里是指特定的目的核酸序列。因此，“靶”可以存在于其它核酸分子或者大的核酸分子中。
術(shù)語‘核酸探針′是指寡核苷酸或者多核苷酸，它能雜交于另一目的核酸。核酸探針可以在純化的限制性消化中天然的存在或者合成產(chǎn)生、重組產(chǎn)生或者通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)生。術(shù)語“核酸探針”是指本發(fā)明所述方法中使用的寡核苷酸或多核苷酸。相同的寡核苷酸也可以被使用，例如，在PCR方法中作為引物聚合，但在這里，寡核苷酸是指“引物”。而且，寡核苷酸可以包含一些修飾的鍵，例如硫代磷酸鍵(phosphorothioate bond)。
術(shù)語“互補(bǔ)”和其衍生物在這里是指核酸(也就是核苷酸序列)相對(duì)于公知的堿基對(duì)規(guī)則，即A配T，C配G。例如，序列5′-AGT-3′互補(bǔ)于序列3′-TCA-5′?；パa(bǔ)可以是“部分的”，也就是說只有一些核酸堿基符合了堿基配對(duì)規(guī)則。在另一方面，它們可以是完全的或者全部的在核酸鏈之間互補(bǔ)，它們所有的堿基都符合堿基配對(duì)規(guī)則。核酸鏈之間的互補(bǔ)程度非常影響核酸鏈間雜交的效率和強(qiáng)度，這是本領(lǐng)域公知的。這對(duì)依靠于核酸間配對(duì)的檢測(cè)方法是特別重要的，例如，本發(fā)明的方法。術(shù)語“基本上互補(bǔ)”是指一些探針在以下描述的低嚴(yán)謹(jǐn)度條件下能和靶核酸序列的一個(gè)或兩個(gè)鏈雜交，優(yōu)選的，在聚合酶反應(yīng)緩沖液(Promega M195A)中加熱到95℃，冷卻到室溫，這時(shí)，認(rèn)為核酸探針部分的或者完全的互補(bǔ)于靶核酸，這里指的是探針的3′末端區(qū)域(例如核苷酸3′末端的大約10個(gè)核苷酸)。
術(shù)語“同源性”在這里是指互補(bǔ)的程度?？梢允遣糠滞椿蛘咄耆?也就是同一性)。至少部分抑制同一序列與靶核酸雜交的部分互補(bǔ)序列被稱為“基本上同源”。與靶序列完全互補(bǔ)序列的雜交的抑制作用可以在低嚴(yán)謹(jǐn)度下用雜交分析檢測(cè)(Southern或northern印記或液體雜交等)。在低嚴(yán)謹(jǐn)度下，基本上同源序列或者雜交探針將競(jìng)爭(zhēng)或抑制完全同源序列與靶序列的結(jié)合。這并不是說低嚴(yán)謹(jǐn)度的條件可允許非特異性結(jié)合，低嚴(yán)謹(jǐn)度條件要求兩個(gè)序列與其它序列發(fā)生特定的(也就是選擇)相互作用。非特異性結(jié)合不存在時(shí)可以通過沒有部分互補(bǔ)的第二靶序列進(jìn)行檢測(cè)(例如低于約30％的同一性)。非特異性結(jié)合不存在時(shí)，探針不會(huì)與第二無互補(bǔ)性靶序列雜交。本發(fā)明揭示的這種序列雜交可以在嚴(yán)謹(jǐn)條件和降低的嚴(yán)謹(jǐn)度條件下實(shí)施(例如，標(biāo)準(zhǔn)的原位雜交方法中的DNA的嚴(yán)謹(jǐn)洗滌條件為0.3M NaCl，0.03M檸檬酸鈉，0.1％SDS，60℃或甚至70℃，參見J.Sambrook等，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(第2版，1989)(冷泉港實(shí)驗(yàn)室))。一般情況下，這種序列與這里給出的序列至少有65％的相似，75％相似，80％相似，85％相似，90％相似，95％相似。
本發(fā)明的多重方法可以用于確定大多數(shù)預(yù)測(cè)定的(已知的)核酸靶序列在核酸樣品中是否存在。核酸靶是“預(yù)定的”，其序列必須知道以能設(shè)計(jì)探針能與之雜交。然而，應(yīng)該注意到，用于本發(fā)明方法的核酸靶序列，可以能夠作為想確定的核酸中不同核酸存在與否的信號(hào)報(bào)道基因(reporter)。其它目的核酸不是必須有預(yù)定的序列。更進(jìn)一步的，本發(fā)明可以在已知足夠的序列來設(shè)計(jì)在探針3′末端區(qū)域有部分互補(bǔ)的靶與探針雜交時(shí)，確定靶內(nèi)堿基身份。這種方法利用了一種能夠?qū)﹄s交于核酸靶序列的寡核苷酸探針的3′-末端進(jìn)行解聚的酶，釋放一個(gè)或者多個(gè)識(shí)別的核苷酸，其存在與否可以用檢測(cè)輸出確定，從而確定靶序列的存在與否。
當(dāng)提供了與核酸靶序列部分的或者完全互補(bǔ)的核酸探針時(shí)，核酸靶序列可以被預(yù)先確定。如果樣品中存在靶序列，這種核酸靶序列是核酸樣品與探針雜交的部分。
本發(fā)明也包括了將待分析的樣品與多數(shù)核酸探針混合的方法。第一步的混合通常在低嚴(yán)謹(jǐn)度雜交條件下進(jìn)行，以形成雜交組合物。在這種雜交組合物中，核酸探針的3′末端區(qū)域(i)與樣品中可能存在的部分或者完全互補(bǔ)的核酸靶序列雜交；以及(ii)包括了3′末端區(qū)域的識(shí)別核苷酸(identifiernudeotide)。
核酸探針可以被設(shè)計(jì)為不與自身雜交形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，這會(huì)干擾探針的3′-末端區(qū)域與靶核酸的雜交。探針的設(shè)計(jì)參數(shù)(parameters guilding probedesign)是本領(lǐng)域公知的。
雜交組合物可以在雜交條件下維持一段時(shí)間以充分形成包含了大量與其各自探針產(chǎn)生了雜交的預(yù)先確定核酸靶序列處理的樣品。
在被分析的樣品不含有雜交探針的靶序列的情況下，此探針不發(fā)生雜交。當(dāng)本發(fā)明的方法用于確定特定靶序列是否在樣品中存在時(shí)，所得處理的樣品可能不含有本發(fā)明的酶的底物。結(jié)果，3′末端區(qū)域的識(shí)別核苷酸沒有釋放，分析輸出結(jié)果(output)在背景或者接近背景的水平。
為制造用于使用多重PCR方法擴(kuò)增人HNF-1α基因的引物庫，下列因子應(yīng)該被納入考慮為擴(kuò)增大量的靶序列，引物庫的引物應(yīng)該能夠結(jié)合于人HNF-1α基因的靶序列并能互相不影響。引物庫的每一個(gè)引物應(yīng)該有相似的解鏈溫度并優(yōu)選不形成引物對(duì)二聚體(pair-dimer)。此外，引物庫的每一個(gè)引物應(yīng)該不能形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)或者引物自身二聚體。微衛(wèi)星區(qū)域和重復(fù)區(qū)域應(yīng)該排除在引物序列之外。
一個(gè)用來擴(kuò)增人HNF-1α基因的引物庫，包含了至少一組擴(kuò)增人HNF-1α基因靶序列的引物，它選自下列物質(zhì)組成的組a)一組包含具有SEQ ID NO 3所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 4所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；b)一組包含具有SEQ ID NO 5所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 6所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；c)一組包含具有SEQ ID NO 7所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 8所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；d)一組包含具有SEQ ID NO 9所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 10所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；e)一組包含具有SEQ ID NO 11所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 12所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；f)一組包含具有SEQ ID NO 13所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 14所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；g)一組包含具有SEQ ID NO 15所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 16所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；h)一組包含具有SEQ ID NO 17所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 18所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；i)一組包含具有SEQ ID NO 19所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 20所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；以及j)一組包含具有SEQ ID NO 21所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 22所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物，其中，所述的變體寡核苷酸是指從3′或者5′末端或者在3′和5′末端有1到3個(gè)附加核苷酸加入或缺失的寡核苷酸。
因此，變體寡核苷酸具有與相應(yīng)的寡核苷酸同樣的核苷酸序列，除了其至少一個(gè)末端部分不同。
本發(fā)明也包括用于擴(kuò)增HNF-1α基因的靶序列含有引物庫的試劑盒。這個(gè)試劑盒可以包含常規(guī)的PCR試劑，如，dNTP溶液，DNA聚合酶和緩沖液等等。
此外，本發(fā)明還可以用于檢測(cè)人HNF-1α基因的遺傳變異。一種這樣的變異包括MODY3，一種MODY疾病(MODY 1，2，3，4，5)，占大約10-30％的II型糖尿病疾病。因此，在分析人HNF-1α基因遺傳變異時(shí)，來預(yù)測(cè)人的糖尿病傾向是可能的。因此，為了快速的分析人HNF-1α基因，可能開發(fā)使用，例如，DNA芯片，通過多重PCR擴(kuò)增人HNF-1α基因的一系列引物。
本發(fā)明將通過以下實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)描述。下面的實(shí)施例用于解釋本發(fā)明的目的，但不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1用于擴(kuò)增人HNF-1α基因中10個(gè)靶序列的引物的制備引物被設(shè)計(jì)為能夠使最終的每個(gè)PCR產(chǎn)物在大小上至少有5-10bp的差別。在設(shè)計(jì)一組用于多重PCR的引物時(shí)，前述的因子是需要被考慮的。進(jìn)一步的，每個(gè)引物應(yīng)該被設(shè)計(jì)為不包括4個(gè)或者更多個(gè)相同的連續(xù)的核苷酸。
引物分析使用HYBsimulaorTM(Advanced Gene Computing Technologies，Inc)。
為了提高PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增效率，T7啟動(dòng)子序列(SEQ ID NO.1)被加在正向引物5′末端，T3啟動(dòng)子序列(SEQ ID NO.2)被加在反向引物5′末端。
每個(gè)引物的序列編號(hào)和特性在表1中給出。
表1


F正向R反向?qū)嵤├?使用單PCR擴(kuò)增人HNF-1α基因使用實(shí)施例1的每一組引物通過單PCR擴(kuò)增人HNF-1α基因的每一個(gè)靶序列。PCR是下列條件完成的，預(yù)變性(95℃5分鐘)，30個(gè)循環(huán)變性(95℃30秒)，退火(64℃15秒)，聚合作用(72℃30秒)，最后延伸(72℃3分鐘)PCR反應(yīng)組合物如下無菌的不含DNA酶RNA酶的水12.8μldNTP混合液(各核苷酸各2.5mM) 2μl10×Taq聚合酶緩沖液 2μl一組引物(各10pmol) 2μl基因組DNA(200-1.0μg) 1μlTaq聚合酶(5單位/μl)0.2μlPCR產(chǎn)物在1.8％的瓊脂糖凝膠上電泳分析(圖1)。在圖1中，泳道1和13表示分子標(biāo)記，50bpDNA梯(ladder)。泳道2是相應(yīng)于啟動(dòng)子的PCR產(chǎn)物，泳道3-11是相應(yīng)外顯子1，2，3，4，5，6，7，8&9和10的PCR產(chǎn)物。泳道12是使用實(shí)施例3的多重PCR得到的產(chǎn)物。
如圖1，人HNF-1α基因的靶序列使用實(shí)施例1的引物組，使用單PCR方法進(jìn)行了擴(kuò)增。
實(shí)施例3通過多重PCR擴(kuò)增人HNF-1α基因使用實(shí)施例1的一組引物進(jìn)行多重PCR。PCR是下列條件完成的，預(yù)變性(95℃5分鐘)。30個(gè)循環(huán)，變性(30秒95℃)，退火(15秒64℃)，聚合作用(30秒72℃)，最后延伸(3分鐘72℃)，所有的引物加在一個(gè)反應(yīng)管中，反應(yīng)組分如下無菌的不含DNA酶和RNA酶的水18.4μl
dNTP混合液(核苷酸各2.5mM)5μl10×Taq聚合酶緩沖液 5μl引物(各10pmol) 20μl基因組DNA(200-1.0μg)1μlTaq聚合酶(5單位/μl) 0.6μ1PCR產(chǎn)物在1.8％的瓊脂糖凝膠上電泳分析(圖1，泳道12)。在圖1中，使用實(shí)施例1的引物組進(jìn)行多重PCR結(jié)果，人HNF-1α基因的所有的10個(gè)靶序列(579，459，365，308，332，241，286，230，414和171bp)被擴(kuò)增。
實(shí)施例4使用變體引物通過多重PCR擴(kuò)增人HNF-1α基因通過在4組引物(擴(kuò)增啟動(dòng)子，外顯子1，2，8 的引物組)的一個(gè)末端附加能與模板互補(bǔ)的3個(gè)核苷酸并在每一引物另一端缺失3個(gè)核苷酸而合成變體引物(表2)。使用實(shí)施例3的多重PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，只是采用上述4組引物中的一組和表1的另外3對(duì)應(yīng)組引物。(圖2)表2 F正向R反向 表1中相應(yīng)的引物中缺失的核苷酸×××表1中相應(yīng)的引物中附加的核苷酸圖2A到2E是PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果的照片。圖2A、2B、2C和2D是PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，所述產(chǎn)物是利用包含啟動(dòng)子，外顯子1，2，8的變體引物的引物庫得到的。圖2E是使用了包含有表2中所示的啟動(dòng)子，外顯子1，2，8的所有變體引物的引物庫進(jìn)行反應(yīng)得到的多重PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果。在圖2A到2E，泳道1是50bp的DNA梯的分子標(biāo)記。泳道2是使用表1給出的引物組進(jìn)行多重PCR反應(yīng)獲得的結(jié)果，泳道3是使用引物庫得到的PCR產(chǎn)物結(jié)果，所述引物庫包含有表2中所示的啟動(dòng)子，外顯子1，2，8的變體引物組和表1中所列一組引物，沒有對(duì)應(yīng)的變體引物組。泳道4是包括表1所列的引物組的引物庫，但不包含有擴(kuò)增啟動(dòng)子，外顯子1，2，8的引物組(圖2A、2B、2C、2D)或不包含有擴(kuò)增啟動(dòng)子，外顯子1，2，8(圖2E)的引物組的引物庫進(jìn)行多重PCR反應(yīng)得到的PCR產(chǎn)物結(jié)果。
在圖2中，基因相應(yīng)的靶序列使用變體引物的多重PCR擴(kuò)增。
實(shí)施例5通過Southern印跡分析鑒定多重PCR產(chǎn)物通過實(shí)施例2、3擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在1.8％的瓊脂糖凝膠上電泳(圖1)。凝膠被加入變性溶液(0.5N NaOH+1.5M NaCl)并伴隨攪拌15分鐘，以變性雙鏈DNA。在進(jìn)行變性處理兩次后重復(fù)兩次，然后使用蒸餾水清洗，在放入中和溶液中(3M NaCl包含了0.5M Tris-HCl，pH7.5)15分鐘并輕輕晃動(dòng)中和凝膠。在中和過程進(jìn)行兩次后，通過凝膠與尼龍膜在20×SSC溶液中反應(yīng)12.5小時(shí)，將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。通過在120℃反應(yīng)30分鐘，使DNA交聯(lián)于尼龍膜上，尼龍膜清洗1到2分鐘并晾干。
獲得的DNA結(jié)合的尼龍膜放入20ml雜交液中，于62℃保持約2小時(shí)以預(yù)雜交并丟棄雜交液。將DNA結(jié)合的尼龍膜和5pmol/ml的DIG(洋地黃毒苷(digoxigenin))標(biāo)記探針放入10ml新鮮的雜交溶液袋中在62℃反應(yīng)約12小時(shí)。在反應(yīng)時(shí)，DIG標(biāo)記的探針雜交于基因的互補(bǔ)區(qū)。在雜交后，使用2×的清洗液(2×SSC+0.1％SDS)在室溫條件下清洗5分鐘，進(jìn)行兩次，用0.5×清洗液(0.5×SSC+0.1％SDS)在62℃清洗15分鐘，進(jìn)行兩次。
膜被放入20ml封閉液中約30-60分鐘，在包含1μl堿性磷酸酶耦合的山羊抗DIG抗體(Roche)的20ml封閉液(blocking solution)中，膜與抗DIG抗體反應(yīng)約30分鐘。膜再用清洗液(100mM馬來酸，150mM NaCl，室溫條件下Ph7.5，0.3％吐溫-20)清洗兩遍，約15分鐘。為確定膜上的DNA與探針雜交，堿性磷酸酶底物，CDP-Star被以1∶100的比例混合到檢測(cè)緩沖溶液中，并用該溶液對(duì)尼龍膜處理約5分鐘，進(jìn)行X放射自顯影。顯影膠片可以用來確定探針的位置(圖3)。如圖3所示，泳道13是用DIG標(biāo)記的分子標(biāo)記。泳道2至11每一個(gè)代表圖3中單個(gè)，泳道13是用IG標(biāo)記的分子標(biāo)記。圖3中泳道2到11是啟動(dòng)子或者外顯子1，2，3，4，5，6，7，8 & 9，10的單PCR產(chǎn)物各自的信號(hào)。泳道12是顯示多重PCR產(chǎn)物。
如圖3所示，探針在相同的位置與單PCR產(chǎn)物和多重PCR產(chǎn)物雜交，這意味著，擴(kuò)增產(chǎn)物基本上是相同的。
實(shí)施例6通過測(cè)序分析鑒定多重PCR產(chǎn)物通過實(shí)施例3擴(kuò)增的多重PCR產(chǎn)物在1.8％的瓊脂糖凝膠上電泳。單DNA帶被分離，使用凝膠提取試劑盒純化。對(duì)純化的DNA序列使用ABI3700進(jìn)行序列鑒定，對(duì)比于相應(yīng)的已知人HNF-1α基因序列(圖4)。
圖4給出PCR產(chǎn)物相應(yīng)與通過一組引物擴(kuò)增啟動(dòng)子獲得的PCR產(chǎn)物的圖解圖。PCR產(chǎn)物相應(yīng)與使用一組引物SEQ ID NOS.3和4通過多重PCR進(jìn)行反應(yīng)的PCR產(chǎn)物被分離并用自動(dòng)測(cè)序方法測(cè)序后的圖解圖。所得的核酸序列(SEQ ID NO.31)(表示為“Query”)與已知的人HNF-1α基因啟動(dòng)子序列(表示為“啟動(dòng)子”)通過稱為L(zhǎng)agergene(DNAs tar Inc.)的程序進(jìn)行對(duì)比(圖4)。如圖4所示，PCR產(chǎn)物與已知人HNF-1α啟動(dòng)子表現(xiàn)出100％的序列同源性。比對(duì)中使用的缺口頻率為0％。除了啟動(dòng)子以外，其它外顯子的單PCR產(chǎn)物使用上面描述的方法進(jìn)行了測(cè)序和分析，每個(gè)PCR產(chǎn)物都與已知的相應(yīng)的外顯子序列表現(xiàn)出95％的甚至更高的同源性。
實(shí)施例7多重PCR反應(yīng)液的穩(wěn)定性測(cè)試實(shí)施例3中使用的多重PCR反應(yīng)液被大量制備，但不包含基因組DNA，以測(cè)試穩(wěn)定性。一個(gè)PCR反應(yīng)需要49μl反應(yīng)液，被均分入大量的0.2ml的PCR反應(yīng)管中。含反應(yīng)液的一些反應(yīng)管保存在-20℃，另一些保存在-70℃，保存3個(gè)月。在反應(yīng)管保存了1天，3天，4天，1周，2周，3周和12周后，分別進(jìn)行多重PCR反應(yīng)。圖5表示多重PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果。在圖5中，左邊第一泳道為分子標(biāo)記，泳道2是使用在-20℃保存的反應(yīng)液進(jìn)行多重PCR的產(chǎn)物結(jié)果，泳道3是使用在-70℃保存的反應(yīng)液進(jìn)行多重PCR的產(chǎn)物結(jié)果。如圖5所示，用于本發(fā)明的多重PCR反應(yīng)液在-20℃和-70℃下穩(wěn)定，在保存3個(gè)月后仍不影響PCR產(chǎn)物結(jié)果。
實(shí)施例8使用不同PCR裝置進(jìn)行的基因擴(kuò)增使用不同PCR裝置，根據(jù)實(shí)施例3的方法進(jìn)行多重PCR。多重PCR產(chǎn)物在1.8％的瓊脂糖凝膠上電泳，以檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物對(duì)PCR裝置的依賴性(圖6A到C)。
圖6A表現(xiàn)了使用PTC-100(MJ Research Co.)擴(kuò)增的多重PCR產(chǎn)物。圖6B表現(xiàn)了使用GeneAmp 9700(Applied Biosystems Co.)進(jìn)行擴(kuò)增的多重PCR產(chǎn)物。圖6C表現(xiàn)了使用Multi-Block系統(tǒng)(ThermoHybaid Co.)擴(kuò)增多重PCR產(chǎn)物。
在圖6A到6C，泳道1是50bp DNA梯的分子標(biāo)記，泳道2是使用表1所示的引物組進(jìn)行擴(kuò)增的多重PCR結(jié)果。箭頭所指的分別是350和50bp。
如圖6所示，不同PCR裝置獲得相似的PCR產(chǎn)物模式，這表明，通過使用本發(fā)明引物組獲得PCR的產(chǎn)物是穩(wěn)定的，經(jīng)濟(jì)的。
用于擴(kuò)增本發(fā)明的人HNF-1α基因的引物庫對(duì)于通過多重PCR來擴(kuò)增相應(yīng)的基因是有效地。特別是，通過多重PCR擴(kuò)增基因的引物庫在使用DNA芯片分析疾病相關(guān)基因時(shí)是有用的，因?yàn)槎嘀豍CR可以相對(duì)的減少樣品數(shù)量的使用。
本發(fā)明的用于人HNF-1α基因擴(kuò)增的引物庫可以用于試劑盒來擴(kuò)增或測(cè)序人HNF-1α基因。
在說明書中，公開了本發(fā)明的典型的優(yōu)選的實(shí)施方案，盡管說明書使用了特定的術(shù)語，其可以被用于一般描述但并不限制本發(fā)明權(quán)利要求描述的保護(hù)范圍。
序列表<110>李娟受(LEE，Yeon Su)金美卿(KIM，Mi Kyung)李貞男(LEE，Jung Nam)<120>用于人HNF-1α基因擴(kuò)增的多重PCR引物組<160>31<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>20<212>DNA<213>噬菌體T7<400>1taatacgact cactataggg 20<210>2<211>19<212>DNA<213>噬菌體T3<400>2gtaaccctca ctaaaggga19<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增MODY3基因啟動(dòng)子的正向引物<400>3tggccgtgag catcctctgc c 21<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增MODY3基因啟動(dòng)子的反向引物<400>4gcgtgggttg cgtttgcctg c 21<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增MODY3基因外顯子1的正向引物<400>5cgtggccctg tggcagccga 20<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增MODY3基因外顯子1的反向引物<400>6gggctcgtta ggagctgagg g 21<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增MODY3基因外顯子2的正向引物<400>7cccttgctga gcagatcccg tc22<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增MODY3基因外顯子2的反向引物<400>8gggatggtga agcttccagc c 21<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增MODY3基因外顯子3的正向引物<400>9gcaaggtcag gggaatggac 20<210>10<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增MODY3基因外顯子3的反向引物<400>10cgccgttgta cctattgcac tcc 23<210>11<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增MODY3基因外顯子4的正向引物<400>11ggctcatggg tggctatttc tgc 23<210>12<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增MODY3基因外顯子4的反向引物<400>12cgtgtccctt gtccccacat acc 23<210>13<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增MODY3基因外顯子5的正向引物<400>13tgctgaggca ggacactgct tc 22<210>14<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增MODY3基因外顯子5的反向引物<400>14tacaagcaag gacactcacc agc 23<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增MODY3基因外顯子6的正向引物<400>15cccggacaca gcttggcttc c 21<210>16<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增MODY3基因外顯子6的反向引物<400>16atccccacca gcttaccgat gac 23<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增MODY3基因外顯子7的正向引物<400>17caggcctggc ctccacgcag 20<210>18<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增MODY3基因外顯子7的反向引物<400>18ggggctctgc agctgagcca t 21<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增MODY3基因外顯子8和9的正向引物<400>19ggcccagtac acccacacgg g 21<210>20<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增MODY3基因外顯子8和9的反向引物<400>20gggcagggac agtaagggag g 21<210>21<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增MODY3基因外顯子10的正向引物<400>21gccttgtttg cctctgcagt g 21<210>22<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增MODY3基因外顯子10的正向引物<400>22ggccatctgg gtggagatga ag 22<210>23<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增MODY3基因啟動(dòng)子的修飾的正向引物<400>23ccgtgagcat cctctgccct t 21<210>24<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增MODY3基因啟動(dòng)子的修飾的反向引物<400>24accgcgtggg ttgcgtttgc c 21<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增MODY3基因外顯子1的修飾的正向引物<400>25ccgcgtggcc ctgtggcagc 20<210>26<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增MODY3基因外顯子1的修飾的反向引物<400>26ctcgttagga gctgaggggg g 21<210>27<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增MODY3基因外顯子2的修飾的正向引物<400>27ttgctgagca gatcccgtcc tt 22<210>28<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增MODY3基因外顯子2的修飾的反向引物<400>28atggggatgg tgaagcttcc a 21<210>29<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增MODY3基因外顯子8的修飾的正向引物<400>29ggtggcccag tacacccaca c 21<210>30<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增MODY3基因外顯子8的修飾的反向引物<400>30cagggacagt aagggagggg g 21<210>31<211>434<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>31ctcctgtctc agcatgatgc ccctacaagg ttctttcggg ggtgggaccc aacgctgctc 60tcctgatggc ctccctggct cccagcacct tccatcccag ctgctcaggg cccctcacct120gcgcctcccc caccctcccc tctgcccact cccatcgcag gccatagctc cctgtccctc180tccgctgcca tgaggcctgc actttgcagg gctgaagtcc aaagttcagt cccttcgcta240agcacacgga taaatatgaa ccttggagaa tttccccagc tccaatgtaa acagaacagg300caggggccct gattcacggg ccgctggggc cagggttggg ggttgggggt gcccacaggg360cttggctagt ggggttttgg gggggcagtg ggtgcaagga gtttggtttg tgtctgccgg420ccggcaggca aacg 43權(quán)利要求
1.引物庫，其包含了至少一組引物，所述引物用于擴(kuò)增人HNF-1α基因的至少一個(gè)靶序列，所述的至少一組引物選自a)一組包含具有SEQ ID NO.3所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及具有SEQ ID NO.4所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；b)一組包含具有SEQ ID NO.5所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及具有SEQ ID NO.6所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；c)一組包含具有SEQ ID NO.7所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及具有SEQ ID NO.8所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；d)一組包含具有SEQ ID NO.9所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及具有SEQ ID NO.10所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；e)一組包含具有SEQ ID NO.11所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及具有SEQ ID NO.12所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；f)一組包含具有SEQ ID NO.13所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及具有SEQ ID NO 14所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；g)一組包含具有SEQ ID NO.15所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及具有SEQ ID NO.16所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；h)一組包含具有SEQ ID NO.17所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及具有SEQ ID NO.18所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；i)一組包含具有SEQ ID NO.19所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及具有SEQ ID NO.20所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；和j)一組包含具有SEQ ID NO.21所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及具有SEQ ID NO.22所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物，其中所述的變體寡核苷酸是指在相應(yīng)寡核苷酸上從3′末端，從5′末端或者從3′和5′末端有1到3個(gè)附加核苷酸加入或缺失的寡核苷酸。
2.權(quán)利要求1所述的引物庫，其中至少一引物的5′末端包含了T7啟動(dòng)子序列或者T3啟動(dòng)子序列。
3.權(quán)利要求1所述的引物庫，其中至少一由SEQ ID NOS.3，5，7，9，11，13，15，17，19和21鑒定的引物，在其5′末端包含了T7啟動(dòng)子序列，和至少一由SEQ ID NOS.4，6，8，10，12，14，16，18，20和22鑒定的引物，在其5′末端包含了T3啟動(dòng)子序列。
4.一種用來擴(kuò)增人HNF-1α基因中至少一個(gè)靶序列的方法，包含了使用至少一組引物對(duì)人HNF-1α基因至少一個(gè)靶序列進(jìn)行PCR，使用的引物選自a)一組包含具有SEQ ID NO 3所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 4所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；b)一組包含具有SEQ ID NO 5所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 6所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；c)一組包含具有SEQ ID NO 7所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 8所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；d)一組包含具有SEQ ID NO 9所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 10所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；e)一組包含具有SEQ ID NO 11所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 12所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；f)一組包含具有SEQ ID NO 13所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 14所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；g)一組包含具有SEQ ID NO 15所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 16所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；h)一組包含具有SEQ ID NO 17所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 18所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；i)一組包含具有SEQ ID NO 19所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 20所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；以及j)一組包含具有SEQ ID NO 21所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 22所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物，其中所述的變體寡核苷酸是指在相應(yīng)的寡核苷酸上從3′末端，從5′末端或者從3′和5′末端有1到3個(gè)附加核苷酸加入或缺失的寡核苷酸。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中至少一個(gè)引物的5′末端包含了T7啟動(dòng)子序列或者T3啟動(dòng)子序列。
6.權(quán)利要求4所述的方法，其中至少一個(gè)由SEQ ID NOS.3，5，7，9，11，13，15，17，19和21鑒定的引物，在其5′末端包含了T7啟動(dòng)子序列，和至少一個(gè)由SEQ ID NOS.4，6，8，10，12，14，16，18，20和22鑒定的引物，在其5′末端包含了T3啟動(dòng)子序列。
7.權(quán)利要求4所述的方法，進(jìn)一步包括將0.1μM-1μM每一所選引物與100ng-1μg的模板DNA混合。
8.權(quán)利要求4所述的方法，PCR是在以下條件進(jìn)行的90℃-98℃預(yù)變性1-5分鐘，90℃-98℃變性10秒到1分鐘，60℃到65℃退火5秒到3分鐘，70℃到75℃聚合5秒到5分鐘，最后70℃到75℃延伸1分鐘到10分鐘。
9.一種使用至少一組引物對(duì)人HNF-1α基因至少一個(gè)靶核苷酸序列進(jìn)行測(cè)序的方法，使用的引物選自a)一組包含具有SEQ ID NO 3所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 4所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；b)一組包含具有SEQ ID NO 5所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 6所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；c)一組包含具有SEQ ID NO 7所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 8所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；d)一組包含具有SEQ ID NO 9所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 10所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；e)一組包含具有SEQ ID NO 11所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 12所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；f)一組包含具有SEQ ID NO 13所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 14所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；g)一組包含具有SEQ ID NO 15所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 16所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；h)一組包含具有SEQ ID NO 17所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 18所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；i)一組包含具有SEQ ID NO 19所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 20所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；以及j)一組包含具有SEQ ID NO 21所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 22所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物，其中所述的變體寡核苷酸是指在相應(yīng)的寡核苷酸上從3′末端，從5′末端或者從3′和5′末端有1到3個(gè)附加核苷酸加入或缺失的寡核苷酸。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中至少一個(gè)引物的5′末端包含了T7啟動(dòng)子序列或者T3啟動(dòng)子序列。
11.權(quán)利要求9所述的方法，其中至少一個(gè)由SEQ ID NOS.3，5，7，9，11，13，15，17，19和21鑒定的引物，在其5′末端包含了T7啟動(dòng)子序列，和至少一個(gè)由SEQ ID NOS.4，6，8，10，12，14，16，18，20和22鑒定的引物，在其5′末端包含了T3啟動(dòng)子序列。
12.一種包含了權(quán)利要求1所述引物庫的用于擴(kuò)增人HNF-1α基因靶序列的試劑盒。
13.權(quán)利要求12所述的試劑盒，其中至少一個(gè)引物的5′末端包含了T7啟動(dòng)子序列或者T3啟動(dòng)子序列。
14.權(quán)利要求12所述的試劑盒，其中至少一個(gè)由SEQ ID NOS.3，5，7，9，11，13，15，17，19和21鑒定的引物，在其5′末端包含了T7啟動(dòng)子序列，并且至少一由SEQ ID NOS.4，6，8，10，12，14，16，18，20和22鑒定的引物，在其5′末端包含了T3啟動(dòng)子序列。
15.一種測(cè)定樣品來檢測(cè)糖尿病的方法，包括對(duì)人HNF-1α基因至少一個(gè)靶序列進(jìn)行擴(kuò)增，其中至少一組引物選自a)一組包含具有SEQ ID NO 3所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 4所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；b)一組包含具有SEQ ID NO 5所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 6所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；c)一組包含具有SEQ ID NO 7所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 8所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；d)一組包含具有SEQ ID NO 9所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 10所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；e)一組包含具有SEQ ID NO 11所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 12所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；f)一組包含具有SEQ ID NO 13所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 14所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；g)一組包含具有SEQ ID NO 15所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 16所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；h)一組包含具有SEQ ID NO 17所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 18所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；i)一組包含具有SEQ ID NO 19所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 20所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物；以及j)一組包含具有SEQ ID NO 21所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 22所示序列的寡核苷酸或其變體寡核苷酸的引物，其中所述的變體寡核苷酸是指在相應(yīng)的寡核苷酸上從3′末端或者從5′末端或者從3′和5′末端有1到3個(gè)附加核苷酸加入或缺失的寡核苷酸。
16.權(quán)利要求15所述的方法，包括在微芯片上與寡核苷酸雜交前向所述樣品的核酸序列中進(jìn)一步添加標(biāo)記。
17.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的糖尿病是MODY 3。
18.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述試驗(yàn)樣品測(cè)定包括測(cè)定缺失、突變和多態(tài)性。
19.權(quán)利要求15所述的方法，其中至少一個(gè)引物的5′末端包含了T7啟動(dòng)子序列或者T3啟動(dòng)子序列。
20.權(quán)利要求15所述的方法，其中至少一個(gè)由SEQ ID NOS.3，5，7，9，11，13，15，17，19和21鑒定的引物，在其5′末端包含了T7啟動(dòng)子序列，和至少一個(gè)由SEQ ID NOS.4，6，8，10，12，14，16，18，20和22鑒定的引物，在其5′末端包含了T3啟動(dòng)子序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于擴(kuò)增人HNF－1α基因的靶序列的包含了至少一組引物或者其變體引物的引物庫，每一組引物都通過兩個(gè)連續(xù)的SEQ ID NOS進(jìn)行鑒定，SEQ ID NOS開始于本發(fā)明的SEQ ID NO.3，結(jié)束于SEQ ID NO.22。靶序列如人HNF－1α基因，可以通過多重PCR從而高特異性、高速度、高靈敏度，低成本的擴(kuò)增來檢測(cè)青春晚期糖尿病(MODY)3相關(guān)基因。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1473943SQ0216112
公開日2004年2月11日 申請(qǐng)日期2002年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月18日
發(fā)明者李娟受, 金美卿, 李貞男 申請(qǐng)人:三星電子株式會(huì)社