專(zhuān)利名稱(chēng)：用于多重?cái)U(kuò)增短串聯(lián)重復(fù)基因座的方法和試劑盒的制作方法
用于多重?cái)U(kuò)增短串聯(lián)重復(fù)基因座的方法和試劑盒與相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求根據(jù)35U. S. C. § 119(e)的來(lái)自2008年10月30日提交的美國(guó)專(zhuān)利申 請(qǐng)?zhí)?0/983，737的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，所述申請(qǐng)?jiān)诖送ㄟ^(guò)引用并入本文。介紹本發(fā)明的教導(dǎo)一般地涉及基因組系統(tǒng)中遺傳標(biāo)記的檢測(cè)。在各實(shí)施方案中，在多 重反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)不同的多態(tài)性遺傳基因座，以確定每個(gè)基因座的等位基因。所分析 的多態(tài)性遺傳基因座可以是短串聯(lián)重復(fù)(STR)基因座，其還可包括產(chǎn)生約200個(gè)堿基對(duì)或 更少的擴(kuò)增子的微-STR。附圖簡(jiǎn)述本領(lǐng)域 技術(shù)人員將理解以下描述的附圖僅用于解釋的目的。該附圖不意圖以任何 方式限制本發(fā)明教導(dǎo)的范圍。圖ι是顯示了通過(guò)多重?cái)U(kuò)增15個(gè)STR基因座(10個(gè)SGMplus 基因座加上5個(gè) 新基因座)和Amelogenin性別決定基因座(Amel)所產(chǎn)生的擴(kuò)增子的相對(duì)大小范圍(以堿 基對(duì)為單位)的圖，如實(shí)施例中所述。圖2是從5-色熒光檢測(cè)同時(shí)擴(kuò)增SGMplus STR基因座VWA(vWA)， D16S539(D16)，D2S1338, D8S1179(D8), D21S11(D21), D18S51(D18), D19S433(D19)，THO1, FGA, D3S1358(D3)、性別決定基因座Amelogenin (Amel)以及5個(gè)新STR基因座(圈出了) D10S1248 (DlO)，D22S1045 (D22)，D2S441, D1S1656(D1)和 D12S391 (D12)的產(chǎn)物所產(chǎn)生的 圖。從人類(lèi)基因組DNA樣品擴(kuò)增基因座，并且用ABI PRISM 3130x1遺傳分析儀進(jìn)行檢 測(cè)，如實(shí)施例中所述。從上至下的四個(gè)圖相應(yīng)于6-FAM 、vic 、NED 和PET 染料標(biāo)記的 峰(第5種染料LIZ 用于標(biāo)記大小標(biāo)準(zhǔn)品，并且未顯示)。每一圖的χ軸測(cè)量了擴(kuò)增產(chǎn)物 的以堿基對(duì)為單位的大小。圖3是如在實(shí)施例中所使用的5種熒光染料(6-FAMtm、VIC 、NED 、PET 和 LIZ )加上能用于6染料多重反應(yīng)中的額外的第六種染料(SID)的發(fā)射譜圖(波長(zhǎng)的單位 為 nm) ο各實(shí)施方案描述在本說(shuō)明書(shū)中所使用的多數(shù)詞語(yǔ)具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的這些詞的含義。在 本說(shuō)明書(shū)中明確定義的詞語(yǔ)具有在本教導(dǎo)上下文中作為整體所提供的、并且如本領(lǐng)域技術(shù) 人員所一般理解的含義。在詞語(yǔ)或短語(yǔ)的本領(lǐng)域所理解的定義與該詞語(yǔ)或短語(yǔ)的在本說(shuō)明 書(shū)中明確教導(dǎo)的定義有矛盾時(shí)，以說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。本文所使用的標(biāo)題僅僅為了方便，并且不理 解為以任何方式限制。如本文所使用的“DNA”指如本領(lǐng)域所理解的以其各種形式的脫氧核糖核酸，諸如 基因組DNA、cDNA、分離的核酸分子、載體DNA以及染色體DNA?！昂怂帷笔侵溉魏涡问降腄NA 或RNA (核糖核酸)。如本文所使用的術(shù)語(yǔ)“分離的核酸分子”是指已從其自然環(huán)境中移去 的核酸分子(DNA或RNA)。分離的核酸分子的一些實(shí)例是在載體中含有的重組DNA分子、維持在異源宿主細(xì)胞中的重組DNA分子、部分或基本上純化的核酸分子以及合成的DNA分 子?！胺蛛x的”核酸可以沒(méi)有這樣的序列，即所述序列在該核酸衍生自其中的生物體的基因 組DNA中天然地位于該核酸的側(cè)翼(即，位于該核酸5’和3’端的序列)。此外，當(dāng)通過(guò)重 組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)，“分離的”核酸分子(諸如cDNA分子)可以基本上沒(méi)有其它細(xì)胞材料或培養(yǎng) 基，或當(dāng)化學(xué)合成時(shí)其基本上沒(méi)有化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)?！岸檀?lián)重復(fù)”或“STR”基因座指含有短、重復(fù)序列元件的基因組DNA區(qū)域。所述 重復(fù)的序列元件不限于但一般地為3至7個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度。每一序列元件在STR中至少重復(fù) 一次，并且在本文中稱(chēng)為“重復(fù)單位”。術(shù)語(yǔ)STR還包括這樣的基因組DNA區(qū)域，即其中超過(guò) 一個(gè)重復(fù)單位串聯(lián)地或具有中間堿基地重復(fù)，條件是至少一個(gè)序列串聯(lián)地重復(fù)至少兩次。“多態(tài)性短串聯(lián)重復(fù)基因座”指這樣的STR基因座，其中在基因組DNA特定區(qū)域的 重復(fù)序列元件數(shù)目(以及序列凈長(zhǎng)度)在等位基因間、以及在個(gè)體與個(gè)體之間不同。如本文所使用的“等位基因梯”是指由擴(kuò)增的來(lái)自基因座的等位基因組成的標(biāo)準(zhǔn) 大小標(biāo)記物。“等位基因”是指與DNA區(qū)段相關(guān)的遺傳變異，即占據(jù)相同基因座的DNA序列 的兩個(gè)或多個(gè)備選形式之一?！吧锘瘜W(xué)命名法”是指如在本文所使用的標(biāo)準(zhǔn)生物化學(xué)命名法，其中核苷酸堿基 命名為腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鳥(niǎo)嘌呤(G)和胞嘧啶(C)。相應(yīng)的核苷酸例如為脫氧鳥(niǎo) 苷-5，-三磷酸(dGTP)。"DNA多態(tài)性”是指其中DNA序列中的兩種或更多種不同核苷酸序列共存于同一雜 種繁殖的群體中的情況?！盎蜃被颉斑z傳基因座”是指染色體上的特定物理位置?；蜃牡任换蛭?于同源染色體上的相同位置?！盎蜃禺愋砸铩笔侵概c所指明的基因座的部分或其互補(bǔ)鏈特異性雜交的引 物，其至少用于該基因座的一個(gè)等位基因，并且在用于該擴(kuò)增方法的條件下不與其它DNA 序列有效地雜交?！熬酆厦告?zhǔn)椒磻?yīng)”或“PCR”是指其中使用變性、與引物退火、以及用DNA聚合酶延 伸的重復(fù)循環(huán)來(lái)約IO6倍或更多地?cái)U(kuò)增靶DNA序列拷貝數(shù)的技術(shù)。用于擴(kuò)增核酸的PCR方 法由美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，683，195和4，683，202所覆蓋，其在此通過(guò)引用將其全文地并入本文，用 于描述該方法。用于任意PCR的反應(yīng)條件包括反應(yīng)的化學(xué)成分以及它們的濃度、在反應(yīng)循 環(huán)中使用的溫度、反應(yīng)的循環(huán)數(shù)以及反應(yīng)循環(huán)階段的持續(xù)時(shí)間。本文所使用的“擴(kuò)增”是指用酶增加特定核苷酸序列量的方法。這一擴(kuò)增不限于 但一般通過(guò)PCR完成。如本文所使用的，“變性”是指將兩條互補(bǔ)核苷酸鏈從退火狀態(tài)分開(kāi)。 可通過(guò)許多因素，諸如例如破壞堿基配對(duì)相互作用的緩沖液的離子強(qiáng)度、溫度或化學(xué)物質(zhì) 來(lái)誘導(dǎo)變性。如本文所使用的，“退火”是指核苷酸鏈之間的特定相互作用，其中所述鏈基本 上基于如通過(guò)Watson-Crick堿基配對(duì)所確定的鏈之間的互補(bǔ)性彼此結(jié)合。對(duì)于發(fā)生退火， 不需要100%的互補(bǔ)性。如本文所使用的，“延伸”是指在引物寡核苷酸與靶核酸退火之后 的擴(kuò)增循環(huán)，其中聚合酶應(yīng)用靶核酸作為復(fù)制模板實(shí)現(xiàn)引物延伸為適當(dāng)大小的片段?！耙铩笔侵竼捂湽押塑账峄駾NA片段，其與基因座的DNA鏈以此種方式雜交從而 使得該引物的3’端可作為應(yīng)用DNA聚合酶聚合并延伸的位點(diǎn)?！耙飳?duì)”是指兩條引物，其 包含在待擴(kuò)增的DNA序列的一端與單鏈雜交的引物1，以及與該待擴(kuò)增的DNA序列的互補(bǔ)鏈的另一端雜交的引物2。“引物位點(diǎn)”是指引物與之雜交的靶DNA的區(qū)域。“遺傳標(biāo)記”一般是具有用于分析(諸如DNA分型)的目的性狀的基因組DNA等位 基因，其中個(gè)體基于它們DNA中的變異而區(qū)別。多數(shù)DNA分型方法被設(shè)計(jì)以檢測(cè)和分析群 體中已知以至少兩種不同形式或等位基因出現(xiàn)的一個(gè)或更多個(gè)DNA標(biāo)記區(qū)域的長(zhǎng)度和/或 序列差異。此類(lèi)變異稱(chēng)為“多態(tài)性”，并且其中發(fā)生了此類(lèi)變異的DNA的任何區(qū)域稱(chēng)為“多態(tài) 性基因座”。進(jìn)行DNA分型的一種可能方法包括結(jié)合PCR擴(kuò)增技術(shù)(KB Mullis，美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 4，683，202)和長(zhǎng)度變異多態(tài)性的分析。傳統(tǒng)上PCR僅能可靠地用于擴(kuò)增相對(duì)小的DNA片 段，即僅能擴(kuò)增3000個(gè)堿基長(zhǎng)度以下的DNA片段(M. Ponce和L. Micol (1992)，NAR20 (3) 623 ；R. Decorte 等(1990)，DNA CELL BIOL. 9(6) :461469)。短串聯(lián)重復(fù)(STR)、微衛(wèi)星和可 變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)(VNTR)是長(zhǎng)度變異多態(tài)性的一些實(shí)例。含有微衛(wèi)星或VNTR的DNA片段通 常太長(zhǎng)而不能通過(guò)PCR可靠地?cái)U(kuò)增。相反，含有約3至7個(gè)核苷酸的重復(fù)單位的STR足夠 短以在PCR應(yīng)用中用作遺傳標(biāo)記，因?yàn)榭梢栽O(shè)計(jì)擴(kuò)增方案以產(chǎn)生比可能來(lái)自DNA的其它可 變長(zhǎng)度區(qū)域更小的產(chǎn)物。通常期望在單個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)和分離的過(guò)程中同時(shí)擴(kuò)增并檢測(cè)多個(gè)基因座。此類(lèi)同 時(shí)靶向若干個(gè)用于分析的基因座的系統(tǒng)稱(chēng)為“多重”系統(tǒng)。已描述了含有多個(gè)STR基因 座的若干種此類(lèi)系統(tǒng)。例如參見(jiàn)AMPFLSTR SGMPLUS PCR擴(kuò)增試劑盒用戶(hù)手冊(cè)， AppliedBiosystems,第 i-χ 和 1-1 至 1-16 頁(yè)(2001) ； AMPFLSTR IDENTIFIER PCR擴(kuò)增試劑盒用戶(hù)手冊(cè)，Applied Biosystems，第 i-χ和 1-1 至 1-10 頁(yè)(2001) Jff Schumm 等，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7，008，771。若干個(gè)國(guó)家的政府保持了 DNA分型信息數(shù)據(jù)庫(kù)。聯(lián)合王國(guó)的國(guó)家DNA數(shù)據(jù)庫(kù) (NDNAD)是最大的此類(lèi)數(shù)據(jù)庫(kù)，具有約270萬(wàn)人的DNA概況。H. Wallace (2006)，EMBO REPORTS 7 :S26-S30(引自?xún)?nèi)政部，2006)。從1999年開(kāi)始，NDNAD中的DNA概況已基于
AppliedBiosystems開(kāi)發(fā)的SGMpluS 系統(tǒng)，同上。在DNA概況分析系統(tǒng)中重復(fù)發(fā)生的問(wèn)
題是當(dāng)他們的DNA樣品降解時(shí)如何鑒定個(gè)體。在歐洲和美國(guó)的實(shí)驗(yàn)室中已進(jìn)行了許多研 究，以比較常規(guī)STR(擴(kuò)增子大小為約100至約450個(gè)堿基對(duì)的范圍)和微_STR(約200 個(gè)堿基對(duì)或更少的擴(kuò)增子)作為分析降解的DNA樣品的遺傳標(biāo)記。例如參見(jiàn)LA Dixon等 (2006), FORENSIC Sci. INT. 164(1) :33_44。結(jié)果表明用更小尺寸的擴(kuò)增子改善了從分 析降解的DNA樣品獲得成功結(jié)果的機(jī)會(huì)，諸如從微-STR基因座獲得。同上，MD Coble和 JM Butler (2005), J. FORENSICSci. 50(1) 43-530 歐洲法庭科學(xué)研究所網(wǎng)(The European Network ofForensic Science Institutes (ENFSI))和歐洲 DNA 概況分析(EDNAP)組贊 同應(yīng)當(dāng)重新設(shè)計(jì)用于DNA分型的多重PCR系統(tǒng)以能夠進(jìn)行小擴(kuò)增子檢測(cè)，并且歐洲內(nèi)部的 概況分析系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)當(dāng)考慮微-STR。P.Gill等(2006)，F(xiàn)ORENSIC SCI. INT. 156(2-3) 242-244。本發(fā)明的教導(dǎo)涉及在單個(gè)反應(yīng)中同時(shí)分析多個(gè)長(zhǎng)度變異多態(tài)性。本發(fā)明教導(dǎo)的 各個(gè)實(shí)施方案將微-STR基因座并入了多重?cái)U(kuò)增系統(tǒng)中。這些系統(tǒng)可用于各種應(yīng)用，包括它 們?cè)贒NA分型中的應(yīng)用。本發(fā)明教導(dǎo)的方法考慮了選擇合適的基因座集、引物和擴(kuò)增方案，以從多個(gè) 共_擴(kuò)增基因座產(chǎn)生擴(kuò)增的等位基因(擴(kuò)增子)，所述擴(kuò)增子可被設(shè)計(jì)以便在大小上不重 疊，和/或可被用此種方式標(biāo)記以使得可區(qū)別來(lái)自不同基因座的在大小上重疊的等位基 因。此外，這些方法還考慮了選擇多個(gè)STR基因座，其與使用單擴(kuò)增方案的應(yīng)用是兼容的。本文描述的基因座的特定組合在這一應(yīng)用中是獨(dú)特的。在本發(fā)明教導(dǎo)的各個(gè)實(shí)施方案中， 教導(dǎo)了共擴(kuò)增15個(gè)STR基因座，其包含至少8個(gè)具有少于約200個(gè)堿基對(duì)的最大擴(kuò)增子大 小的微-STR基因座。除了本文描述的那些之外的成功組合例如可通過(guò)基因座組合的試驗(yàn)和誤差、通過(guò) 選擇引物對(duì)序列、以及通過(guò)調(diào)整引物濃度以鑒定其中所有用于分析的基因座均可被擴(kuò)增的 平衡來(lái)產(chǎn)生。一旦公開(kāi)了這些教導(dǎo)的方法和材料，則選擇用于這些教導(dǎo)的方法和試劑盒中 的基因座、引物對(duì)和擴(kuò)增技術(shù)的各種方法也類(lèi)似地暗示給了本領(lǐng)域技術(shù)人員。預(yù)期所有的 此類(lèi)方法均在所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。本發(fā)明教導(dǎo)的方法的實(shí)施可從選擇包含D16S539，D18S51，D19S433，D21S11， D2S1338, D3S1358, D8S1179, FGA, THO1, VffA,以及 D10S1248, D12S391, D1S1656, D22S1045, 和D2S441中至少之一的至少11個(gè)STR基因座的集開(kāi)始，所有的基因座均可在單個(gè)多重?cái)U(kuò) 增反應(yīng)中共擴(kuò)增。除了這些15個(gè)列出的基因座之外的或附加的其它基因座也可以包含在 該多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)當(dāng)中。選擇基因座和用于在本發(fā)明教導(dǎo)的多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增該基因座的 寡核苷酸引物的可能方法描述于本文并在以下實(shí)施例中闡述。可使用許多不同技術(shù)的任一個(gè)來(lái)選擇用于本發(fā)明教導(dǎo)的基因座集。開(kāi)發(fā)用于這 一分析方法的有用基因座集的一個(gè)技術(shù)描述于以下實(shí)例中。一旦開(kāi)發(fā)了含有該至少11個(gè) STR基因座的多重技術(shù)，則其可用作核心以產(chǎn)生含有超過(guò)這些11個(gè)基因座、以及含有除STR 基因座之外基因座(例如，性別決定基因座)的多重技術(shù)。因此可產(chǎn)生包含該最先的11個(gè) STR基因座的超過(guò)11個(gè)基因座的新組合。不管應(yīng)用何種方法選擇通過(guò)本發(fā)明教導(dǎo)的方法進(jìn)行分析的基因座，所選擇的用于 各實(shí)施方案中多重分析的基因座共有以下特征的一個(gè)或更多個(gè)(1)它們產(chǎn)生足夠的擴(kuò)增 產(chǎn)物以允許進(jìn)行DNA的等位基因評(píng)估；(2)在多重?cái)U(kuò)增步驟期間，它們產(chǎn)生很少的(如果 有的話)由于在有效靶基因座的延伸期間摻入其它的堿基或產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增子而產(chǎn)生 的假象；以及(3)它們產(chǎn)生很少的(如果有的話)由于通過(guò)聚合酶的擴(kuò)增反應(yīng)的過(guò)早終止 而產(chǎn)生的假象。例如，參見(jiàn) JW Schumm 等(1993)，F(xiàn)OURTH INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON HUMANIDENTIFICATION，第 177-187 頁(yè)，Promega Corp。如本文所使用的用于特定STR基因座的術(shù)語(yǔ)是指本領(lǐng)域公知的對(duì)這些基因座的 命名。例如，在以下列表中的各種參考文獻(xiàn)中以及通過(guò)不同的登錄號(hào)識(shí)別基因座，其在此 通過(guò)引用全文并入本文。以下的參考文獻(xiàn)列表僅僅意圖是例示基因座信息的來(lái)源。關(guān)于 包含這些基因座并預(yù)期用于靶擴(kuò)增的DNA區(qū)域的信息是公眾可獲得的，并且通過(guò)查詢(xún)以下 或其它參考文獻(xiàn)和/或登錄號(hào)而很容易地獲得。在合適的情況下，呈現(xiàn)了提交時(shí)的當(dāng)前登 錄號(hào)，如通過(guò)GenBank (National Center forBiotechnology Information, Bethesda, MD)所提供的那樣。例如，對(duì)于基因座D3S1358，參見(jiàn)H. Li等(1993)，HUM. M0L. GENET. 2 1327 ；對(duì)于 D12S391，參見(jiàn) MV Lareu 等(1996)，GENE 182 :151_153 ；對(duì)于 D18S51，參見(jiàn) RE Staub 等(1993)，GENOMICS 15 :48_56 ；對(duì)于 D21S 11，參見(jiàn) V. Sharma 和 M. Litt (1992)， Hum. M0L. GENET. 1 67 ；對(duì)于 FGA(FIBRA)，參見(jiàn) KA Mills 等(1992) ,HUM. M0L. GENET. 1 779 ； 對(duì)于 THOl，參見(jiàn) A. Edwards (1991)，AM. J. HUM. GENET. 49 :746_756 和 MH Polymeropoulos 等(1991)，NUCLEIC ACIDS RES. 19 3753 ；對(duì)于 VWA(vWF)，參見(jiàn) CP Kimpton 等(1992)， HUM. M0L. GENET. 1 287 ；對(duì)于 D10S1248,參見(jiàn) MD Coble 和 JM Butler (2005)，J. FORENSICSCI. 50(1) 43-53 ；對(duì)于 Dl6S539,參見(jiàn) J. Murray 等(1"5)，未出版的，Cooperative Human Linkage Center,登錄號(hào) G07925 ；對(duì)于 D2S1338，參見(jiàn) J. Murray 等(1995)，未出版的， Cooperative HumanLinkage Center，登錄號(hào) G08202 和 Watson 等 PROGRESS INF0RENSIC GENETICS 7 PROCEEDINGS OF THE 17 INT，L ISFHCONGRESS，OSLO，1997 年 9 月 2-6， B. Olaisen 等，編輯，第 192-194 頁(yè)(Elsevier, Amsterdam)；對(duì)于 D8S1179,參見(jiàn) J. Murray 等(1995)，未出版的，Cooperative Human Linkage Center，登錄號(hào)G08710，以及NJOldroyd 等(1995)，ELECTROPHORESIS 16 :334_337 ；對(duì)于 D22S1045，參見(jiàn) J. Murray 等(1995)，未出 版的，Cooperative Human LinkageCenter，登錄號(hào) G08085 ；對(duì)于 D19S433，參見(jiàn) J. Murray 等(1995)，未出版的，Cooperative Human Linkage Center，登錄號(hào) G08036，以及 MVLareu 等(1997)，PROGRESS IN FORENSIC GENETICS 7 PROCEEDINGS OF THE 17 INT，L ISFH CONGRESS, OSLO, 1997 年 9 月 2-6，B. Olaisen 等編輯，第 192-200 頁(yè)，Elsevier，Amsterdam ； 對(duì)于 D2S441，參見(jiàn) J.Murray 等(1995)，未出版的，Cooperative HumanLinkage Center, 登錄號(hào) G08184 ；對(duì)于 D1S1656，參見(jiàn) J. Murray 等(1995)，未出版的，Cooperative Human Linkage Center，登錄號(hào) G07820。微-STR(少于約200堿基對(duì)的基因座)擴(kuò)增允許對(duì)高度降解的DNA進(jìn)行概況分 析，如在MD Coble (2005)，J. FORENSIC SCI. 50(1) :43_53中所證實(shí)的那樣，其在此通過(guò)引用 并入本文。

圖1顯示了對(duì)于所有15個(gè)上述基因座加上用于確定大小的Amelogenin基因座 的基因座大小范圍。如可在圖1中看到的那樣，在前述列表中鑒定的8個(gè)基因座包括此類(lèi) 微-STR 基因座D10S1248，VWA，D8S1179, D22S1045, D19S433, D2S441, D3S1358 和 D1S1656。選擇用于根據(jù)這些教導(dǎo)的共擴(kuò)增和分析的基因座集可以除了該至少11個(gè)STR基 因座外還包含至少一個(gè)基因座。附加的基因座可以包含STR或其它序列多態(tài)性，或任意其 它特征，例如，其鑒定了將一個(gè)個(gè)體的DNA與該群體中其它個(gè)體的DNA分開(kāi)的特性。附加 基因座還可以是鑒別所分析的DNA樣品來(lái)源性別的基因座。當(dāng)DNA樣品是人類(lèi)基因組DNA 時(shí)，可以選擇諸如Amelogenin基因座的性別鑒定基因座用于根據(jù)本發(fā)明方法的共擴(kuò)增和 分析。Amelogenin基因座被GenBank鑒定為HUMAMELY(當(dāng)用于鑒定男性DNA中存在的Y染 色體中的基因座時(shí))，或鑒定為HUMAMELX (當(dāng)用于鑒定男性或女性DNA中存在的X染色體中 的基因座時(shí))。一旦鑒定了用于在單個(gè)多重反應(yīng)中共擴(kuò)增的基因座集，則可確定適于共擴(kuò)增該集 中每一基因座的引物?？蓪⒐押塑账嵋锾砑拥椒磻?yīng)混合物中并用來(lái)界定擴(kuò)增的DNA片段 5’和3’端。一個(gè)寡核苷酸引物退火至變性模板DNA的有義(+)鏈，并且另一寡核苷酸引物 退火至該變性模板DNA的反義(-)鏈。寡核苷酸引物一般可為約12-25個(gè)核苷酸長(zhǎng)，但是 它們的大小可取決于諸如以下的參數(shù)而很大不同，例如待擴(kuò)增模板序列的堿基組成、擴(kuò)增 反應(yīng)條件等。引物的具體長(zhǎng)度對(duì)于這些教導(dǎo)的操作不是關(guān)鍵的?？梢栽O(shè)計(jì)寡核苷酸引物以 退火至目的基因座側(cè)翼的DNA的特定部分，以便特異性地?cái)U(kuò)增引物互補(bǔ)位點(diǎn)之間的DNA部 分。寡核苷酸引物可包含腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶，以及尿嘧啶、核苷類(lèi) 似物(例如，但不限于次黃嘌呤核苷、鎖定核酸(LNA)、非核苷酸連接子、肽核酸(PNA)和 phosporamidites)以及含有或與化學(xué)部分綴合的核苷，其中所述化學(xué)部分諸如放射性核素 (例如，32P和35S)、熒光分子、小溝結(jié)合物(MGB)、或本領(lǐng)域公知的任何其它核苷綴合物。
一般地，可化學(xué)合成寡核苷酸引物。在PCR優(yōu)化中引物設(shè)計(jì)和選擇是常規(guī)步驟。本 領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易地設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增目的靶基因座的特異引物，或從本文列出的參考 文獻(xiàn)中獲得引物集。所有的這些引物都在本發(fā)明教導(dǎo)的范圍之內(nèi)。在選擇用于多重反應(yīng)的引物序列時(shí)應(yīng)當(dāng)小心。引物的不恰當(dāng)選擇可能產(chǎn)生不期 望的結(jié)果，諸如缺乏擴(kuò)增、在預(yù)期的靶基因座之外的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增、引物-二聚體形 成、不同基因座的引物間的非期望相互作用、從與來(lái)自另一基因座的等位基因重疊(在大 小上)的一個(gè)基因座的等位基因產(chǎn)生擴(kuò)增子、或需要特別地適于每一不同基因座的擴(kuò)增條 件或方案，其中所述條件/方案在單個(gè)多重系統(tǒng)是不兼容的。例如可通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù) 人員很熟悉的多重優(yōu)化的反復(fù)過(guò)程開(kāi)發(fā)和選擇用于這一教導(dǎo)的多重系統(tǒng)的引物選擇引物 序列、混合用于共擴(kuò)增所選擇的基因座的引物、共擴(kuò)增該基因座、然后分離并檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物 以確定擴(kuò)增中的引物有效性。作為引物選擇的實(shí)例，可以選擇在本文所引用的參考文獻(xiàn)中鑒定的或在其它參考 文獻(xiàn)中描述的能用于擴(kuò)增上述基因座中任一個(gè)的單個(gè)引物和引物對(duì)來(lái)擴(kuò)增和分析根據(jù)本 發(fā)明教導(dǎo)的STR基因座。作為另一實(shí)例，可通過(guò)應(yīng)用可獲得的并且本領(lǐng)域公知用于開(kāi)發(fā)擴(kuò) 增和/或多重系統(tǒng)的各種軟件程序的任一個(gè)來(lái)選擇引物。例如參見(jiàn)Primer Express 軟件 (Applied Biosystems, Foster City，Calif)。在應(yīng)用軟件程序的實(shí)例中，可將來(lái)自目的基 因座區(qū)域的序列信息輸入該軟件。該軟件然后應(yīng)用各種算法來(lái)選擇最符合用戶(hù)技術(shù)要求的 引物。開(kāi)始，這一引物選擇過(guò)程可能產(chǎn)生任意的上述擴(kuò)增中的非期望效果，或者擴(kuò)增產(chǎn) 物的不平衡，即從一些基因座產(chǎn)生比其它基因座更多的產(chǎn)物，這是因?yàn)橐恍┮锖退鼈兏?自的靶之間比其它引物更強(qiáng)的結(jié)合強(qiáng)度，例如導(dǎo)致對(duì)于一些基因座的優(yōu)選的退火和擴(kuò)增。 或者，引物可能產(chǎn)生不代表靶基因座等位基因本身的擴(kuò)增產(chǎn)物，即可能產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增 產(chǎn)物。這些由不好的引物設(shè)計(jì)所產(chǎn)生的無(wú)關(guān)產(chǎn)物可能是由于例如引物與樣品DNA中非靶區(qū) 域退火，或甚至與其它引物退火，隨后在退火之后擴(kuò)增。當(dāng)在引物選擇期間在多重系統(tǒng)中存在非平衡或非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可從總多重 集中取出單個(gè)引物，并且與來(lái)自相同或其它基因座的引物用于擴(kuò)增，以鑒定哪些引物促成 了擴(kuò)增不平衡或假象。一旦鑒定了產(chǎn)生一種或更多種假象或不平衡的兩個(gè)引物，則可修飾 一個(gè)或兩個(gè)貢獻(xiàn)者，并且單獨(dú)成對(duì)地或在多重系統(tǒng)(或多重系統(tǒng)的子集)中再測(cè)試?？芍?復(fù)這一過(guò)程，直到在多重系統(tǒng)中產(chǎn)物評(píng)估產(chǎn)生沒(méi)有擴(kuò)增假象或有可接受水平的擴(kuò)增假象的 擴(kuò)增的等位基因。引物濃度的優(yōu)化可在確定最終引物序列之前或之后進(jìn)行，但是最經(jīng)常在引物選擇 之后進(jìn)行。一般地，增加任何特定基因座的引物的濃度會(huì)增加為該基因座產(chǎn)生的產(chǎn)物量。然 而，引物濃度優(yōu)化也是反復(fù)的過(guò)程，因?yàn)槔缭黾觼?lái)自一個(gè)基因座的產(chǎn)物產(chǎn)量可能會(huì)減少 來(lái)自另一基因座或其它復(fù)數(shù)的基因座的產(chǎn)量。此外，引物可能會(huì)相互作用，其可能直接影響 來(lái)自各基因座的擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量?？傊囟ㄒ锛瘽舛鹊木€性增加并不必然地等于相應(yīng)基 因座擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量的線性增加。有關(guān)基因座特異性引物更詳細(xì)的描述，參見(jiàn)MJ Simons美 國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，192，659，其教導(dǎo)通過(guò)引用而全文并入本文。在多重反應(yīng)中基因座_基因座間擴(kuò)增產(chǎn)物平衡還可能受到擴(kuò)增方案的許多參數(shù) 的影響，例如，諸如模板(樣品DNA)輸入量、所使用的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)、熱循環(huán)方案的退火溫度以及在循環(huán)步驟的的末尾包括或不包括額外的延伸步驟。在所有等位基因和基因座中擴(kuò)增 產(chǎn)物產(chǎn)量的絕對(duì)均勻平衡盡管在理論上是期望的，但一般無(wú)法在實(shí)踐中實(shí)現(xiàn)。確定包含多重系統(tǒng)的基因座和開(kāi)發(fā)這一系統(tǒng)反應(yīng)條件的步驟也可以是反復(fù)的步 驟。也就是，可首先開(kāi)發(fā)用于小量基因座的多重系統(tǒng)，這一系統(tǒng)沒(méi)有或幾乎沒(méi)有擴(kuò)增假象和 產(chǎn)物不平衡。然后可將這一系統(tǒng)的引物與期望用于分析的另一基因座或若干個(gè)其它基因座 的引物聯(lián)合。這一擴(kuò)增的引物組合可能或可能不產(chǎn)生擴(kuò)增假象或不平衡產(chǎn)物產(chǎn)量。反過(guò)來(lái)， 可從該系統(tǒng)移除一些基因座，和/或可引入并評(píng)估新基因座。可重復(fù)上述一個(gè)或更多個(gè)反復(fù)選擇步驟，直到鑒定出完整的引物集，其可用于共 擴(kuò)增上述至少11個(gè)選擇用于共擴(kuò)增的基因座，包括STR基因座VWA，D16S539，D2S1338， D8S1179, D21S11，D18S51，D19S433，THO1, FGA, D3S1358,以及 D10S1248，D22S1045, D2S441, D1S1656，和D12S391中的一個(gè)或更多個(gè)。應(yīng)當(dāng)理解可以開(kāi)發(fā)許多不同的引物集，以擴(kuò)增特 定的基因座集。用于本發(fā)明教導(dǎo)的引物的合成可應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的用于寡核苷酸 合成的任意標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行，和/或可商購(gòu)獲得。在本發(fā)明的各實(shí)施方案中，可在一個(gè)多重?cái)U(kuò) 增系統(tǒng)中擴(kuò)增所有 15 個(gè)這些 STR基因座VWA，D16S539，D2S1338，D8S1179，D21S11，D18S51， D19S433, THO1, FGA, D3S1358, D10S1248, D22S1045, D2S441, D1S1656，和 D12S391。在本發(fā) 明教導(dǎo)的其它實(shí)施方案中，可在一個(gè)多重?cái)U(kuò)增系統(tǒng)中共擴(kuò)增所有15個(gè)這些STR基因座，以 及且包括用于確定DNA樣品來(lái)源性別的Amelogenin基因座?？墒褂门c隨后的DNA擴(kuò)增相容的任何樣品制備方法制備用于本發(fā)明教導(dǎo)的方法 的基因組DNA樣品。許多此類(lèi)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。一些實(shí)例是通過(guò)苯酚抽提 的 DNA 純化(J. Sambrook 等(1989)，MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL，第二版， Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , pp.9. 14-9. 19)、 以及通過(guò)鹽沉淀(S. Miller 等(1988)，NUCL. ACIDS RES. 16 1215)或 chelex(PS Walsh 等(1991)，BIOTECHNIQUES 10:506_513 ；CT Comey 等(1994)，J. FORENSIC Sci. 39 1254) 的部分純化，以及應(yīng)用未處理的血釋放未純化的材料(J. Burckhardt (1994)，PCRMETH0DS AND APPLICATIONS 3 239-243 ；RBE McCabe(1991)，PCR METHODS AND APPLICATIONS 1 99-106 ；BY Nordvag(1992)，BIOTECHNIQUES 12 :4ρρ· 490-492)。當(dāng)待應(yīng)用這一教導(dǎo)的方法進(jìn)行分析的至少一個(gè)DNA樣品是人類(lèi)基因組DNA時(shí)，可 從組織樣品制備DNA，所述組織樣品例如，諸如是血液、精液、陰道細(xì)胞、毛發(fā)、唾液、尿、骨、 口腔樣品、含有胎盤(pán)細(xì)胞或胎兒細(xì)胞的羊膜水、絨膜絨毛、和/或任意這些的混合物或其它 組織的一種或更多種。任選地，可在用于本發(fā)明教導(dǎo)的方法之前使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的DNA定 量的任何標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)量DNA濃度。此類(lèi)定量方法例如包括如由J. Sambrook等(1989)， 同上，Appendix Ε. 5中描述的分光光度測(cè)量；或應(yīng)用諸如由CF Brunk等(1979)，ANAL. BI0CHEM. 92 :497_500描述的測(cè)量技術(shù)的熒光測(cè)定方法?？赏ㄟ^(guò)比較DNA標(biāo)準(zhǔn)品與諸如由 JS Waye 等(1991)，J. FORENSIC SCI. 36 =1198-1203 (1991)中描述的人特異性探針的雜交 量測(cè)量DNA濃度。在擴(kuò)增反應(yīng)中使用太多的模板DNA可能產(chǎn)生可能不代表真實(shí)等位基因的 擴(kuò)增假象。一旦制備了基因組DNA樣品，可在本發(fā)明教導(dǎo)的多重?cái)U(kuò)增步驟中共擴(kuò)增靶基 因座?？梢允褂迷S多不同擴(kuò)增方法中的任一種擴(kuò)增該基因座，例如，諸如PCR(RK Saiki等(1985)，SCIENCE 230 :1350_1354)、基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增(DY Kwoh 禾口 TJ Kwoh (1990), AMERICANB10TECHN0L0GY LABORATORY, 1990 年 10 月)以及鏈置換擴(kuò)增(SDA) (GT Walker 等 (1992), PROC. NATL. ACAD. SCI.，U. S. Α. 89 :392_396)。在本發(fā)明教導(dǎo)的一些實(shí)施方案中，可 通過(guò)PCR實(shí)現(xiàn)多重?cái)U(kuò)增，其中使用特異于該多重中每一基因座的引物對(duì)進(jìn)行DNA樣品的擴(kuò)
+飽
+曰ο標(biāo)準(zhǔn)PCR的化學(xué)成分一般包括溶劑、DNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸(“dNTPs”)、 寡核苷酸引物、二價(jià)金屬離子、以及預(yù)期含有PCR擴(kuò)增靶的DNA樣品。一般可使用水作為PCR 的溶劑，其一般包含緩沖劑和非緩沖鹽諸如KC1。緩沖劑可以是本領(lǐng)域公知的任意緩沖劑， 諸如，但不限于Tri s-HCl，并且可通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行變化以最優(yōu)化PCR結(jié)果。本領(lǐng)域普通技 術(shù)人員能很容易地確定最佳的緩沖條件。可依賴(lài)于用于擴(kuò)增的特定酶優(yōu)化PCR緩沖液。二價(jià)金屬離子通常對(duì)于允許聚合酶有效工作是有利的。例如，鎂離子是允許一些 DNA聚合酶有效工作的一種離子。一般地，可將MgCl2或MgSO4加入到反應(yīng)緩沖液中以提供 最佳的鎂離子濃度。最佳PCR擴(kuò)增所需的鎂離子濃度可能取決于所使用的特定引物集以及 模板。通常經(jīng)驗(yàn)地確定為達(dá)到最佳擴(kuò)增所添加的鎂鹽量，并且是本領(lǐng)域的常規(guī)實(shí)踐。一般 地，對(duì)于最佳PCR的鎂離子濃度可以在約1至約IOmM之間變化。在PCR中鎂離子濃度的一 般范圍可以是約1. 0至約4. OmM，在約2. 5mM的中點(diǎn)周?chē)兓?。備選地，可使用二價(jià)離子錳， 例如以二氧化錳(MnO2)的形式，滴定至適于最佳聚合酶活性的濃度，這可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù) 人員使用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室方法而很容易地確定。在擴(kuò)增核酸分子中使用的構(gòu)件模塊dNTP —般可以以例如約40-200 μ M的脫氧腺 苷三磷酸(“dATP”)、脫氧鳥(niǎo)苷三磷酸(“dGTP”)、脫氧胞苷三磷酸(“dCTP”)和脫氧胸苷 三磷酸(“dTTP”)的每一種的濃度在標(biāo)準(zhǔn)PCR中提供。還可以使用其它dNTP，諸如脫氧尿 苷三磷酸(“dUTP” )、dNTP類(lèi)似物(例如，次黃嘌呤核苷)、以及綴合的dNTP，并且它們也 由本文所使用的術(shù)語(yǔ)“dNTP”所包括。盡管使用約40-200 μ M濃度的每一種dNTP適于這一 教導(dǎo)的方法，但是超過(guò)約200 μ M每一 dNTP的濃度將是有利的。因此，在這些教導(dǎo)的方法的 一些實(shí)施方案中，每一 dNTP的濃度一般至少約500 μ M并且可高達(dá)約2mM。在一些其它的實(shí) 施方案中，每一 dNTP的濃度為約0. 5mM至約ImM。用于任意多重?cái)U(kuò)增的特定dNTP濃度可依 據(jù)多重的條件而變化，并且可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室方法經(jīng)驗(yàn)地確定。在PCR中使核苷酸三磷酸聚合為擴(kuò)增產(chǎn)物的酶可以是任意DNA聚合酶。DNA聚 合酶可以是例如本領(lǐng)域公知的任何耐熱聚合酶?？捎糜谶@一教導(dǎo)的一些聚合酶的實(shí)例 是來(lái)自諸如水生棲熱菌(Thermusaquaticus)、嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)、 Thermococcuslitoralis、嗜熱月旨肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)、海棲熱袍 胃(Thermotoga maritima)、求胃禾中(Pyrococcus sp.)白勺L白勺 DNA 胃☆_。 "SJ 通過(guò)幾種可能方法的任一種獲得該酶；例如從來(lái)源細(xì)菌分離、通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生或購(gòu) 自商業(yè)途徑。此類(lèi)可商購(gòu)的DNA聚合酶的一些實(shí)例包括AmpliTaq Gold DNA聚合酶； AmpliTaq DNA 聚合酶；AmpliTaq DNA 聚合酶 Stoffel 片段；rTth DNA 聚合酶；以 及 rTth DNA 聚合酶，XL (所有均通過(guò) Applied Biosystems, FosterCity, Calif.生產(chǎn))。 合適的聚合酶的其它實(shí)例包括來(lái)自嗜熱脂肪芽孢桿菌的Tne，Bst DNA聚合酶大片段、來(lái)自 Thermococcus Iitoralis的Vent禾口 Vent Exo-、來(lái)自海棲熱袍菌的Tma、來(lái)自火球菌屬物種 的De印Vent和De印Vent Exo-以及Pfu，以及前述那些的突變體、變體和衍生物。
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PCR的其它已知成分可在本教導(dǎo)的范圍內(nèi)使用。此類(lèi)組分的一些實(shí)例包括山梨醇、 去垢劑(例如Triton X-100、Nonidet P-40 (NP-40)、Tween-20)和破壞核苷酸對(duì)錯(cuò)配的試 劑，例如，諸如二甲亞砜(DMSO)、和氯化四甲銨(TMAC)以及尿嘧啶N-轉(zhuǎn)葡糖基酶，或預(yù)防 PCR的擴(kuò)增子污染和/或在PCR步驟開(kāi)始之前的PCR溫育或預(yù)備期間產(chǎn)生不想要的產(chǎn)物的 其它試劑。PCR循環(huán)溫度、循環(huán)數(shù)和它們的持續(xù)時(shí)間可以改變以?xún)?yōu)化特定的反應(yīng)，這是常規(guī)實(shí) 驗(yàn)內(nèi)容。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到以下是作為確定PCR各種參數(shù)的指引，并且也將認(rèn) 識(shí)到一個(gè)或更多個(gè)條件的變化在本教導(dǎo)的范圍內(nèi)。為PCR的三個(gè)階段確定了溫度和循環(huán)時(shí) 間變性、退火和延伸。一輪變性、退火和延伸稱(chēng)為一個(gè)“循環(huán)”。通常在足夠高以允許DNA 鏈分離、而又沒(méi)高到破壞聚合酶活性的溫度下進(jìn)行變性。一般地，可在反應(yīng)中使用耐熱性聚 合酶，其在升高的溫度下不會(huì)變性而是保留了一定水平的活性。然而，如果在PCR的每一變 性步驟之后補(bǔ)充它們的話，也可以使用熱不穩(wěn)定聚合酶。一般地，可在高于約90°C并低于約 100°C進(jìn)行變性。在一些實(shí)施方案中，可在約94-95°C進(jìn)行變性。DNA變性一般地可進(jìn)行至 少約1至約30秒。在一些實(shí)施方案中，變性可進(jìn)行約1至約15秒。在其它實(shí)施方案中，變 性可進(jìn)行達(dá)約1分鐘或更久。除了 DNA變性，對(duì)于某些聚合酶，諸如AmpliTaqGold ，在變 性溫度下溫育還可以活化該酶。因此，當(dāng)使用這些聚合酶時(shí)，允許PCR的第一個(gè)變性步驟比 隨后的變性步驟更長(zhǎng)是有利的。在退火期間，寡核苷酸引物與靶DNA在它們的互補(bǔ)區(qū)域退火，并且一旦DNA聚合酶 與引物-模板雙鏈體結(jié)合，則通過(guò)DNA聚合酶大大地延伸。在常規(guī)PCR中，退火溫度一般地 可在或低于最不穩(wěn)定的引物-模板雙鏈體的解鏈點(diǎn)(Tm)，其中Tm可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公 知的幾種理論方法的任一種估計(jì)。例如，可通過(guò)以下公式確定Tm Tm = (40C XG 和 C 堿基數(shù))+ (2°C XA 和 T 堿基數(shù))。—般地，在標(biāo)準(zhǔn)PCR中，退火溫度可以是比最不穩(wěn)定的引物_模板雙鏈體的估計(jì)Tm 低約5-10°C。退火時(shí)間可以是約30秒至約2分鐘。退火期之后一般是延伸期。延伸可進(jìn) 行足夠的時(shí)間量以允許聚合酶完成引物延伸至合適大小的擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR的循環(huán)數(shù)(一個(gè)循環(huán)包括變性、退火和延伸)決定擴(kuò)增的程度和隨后的擴(kuò)增產(chǎn) 物量。PCR導(dǎo)致DNA分子的指數(shù)擴(kuò)增。因此，理論上，在PCR的每一循環(huán)之后，產(chǎn)物的數(shù)量 是前一個(gè)循環(huán)中存在的產(chǎn)物的兩倍，直到PCR試劑耗竭并達(dá)到了不再產(chǎn)生其它擴(kuò)增產(chǎn)物的 平臺(tái)期。一般地，可進(jìn)行約20-30個(gè)循環(huán)的PCR，以達(dá)到這一平臺(tái)期。更一般地，可進(jìn)行約 25-30個(gè)循環(huán)，盡管循環(huán)數(shù)沒(méi)有特別地限制。對(duì)于一些實(shí)施方案，在PCR最后一個(gè)循環(huán)的最后階段之后在某些溫度溫育該反應(yīng) 是有利的。在一些實(shí)施方案中，可選擇延長(zhǎng)的延伸期。在其它實(shí)施方案中，可選擇在低溫 (例如，約4°C )溫育?？墒褂酶鞣N方法評(píng)估從多重反應(yīng)中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物混合物中擴(kuò)增的等位基因產(chǎn) 物，包括例如，檢測(cè)熒光標(biāo)記的產(chǎn)物、檢測(cè)放射性同位素標(biāo)記的產(chǎn)物、擴(kuò)增產(chǎn)物的銀染、或使 用DNA插入劑染料(諸如溴化乙錠(EtBr)和SYBR綠花菁染料)以顯現(xiàn)雙鏈擴(kuò)增產(chǎn)物。適 于與用于本教導(dǎo)的引物附著的熒光標(biāo)記有很多，可商業(yè)獲得，并且是本領(lǐng)域公知的。對(duì)于熒 光分析，可以使用至少一個(gè)熒光標(biāo)記的引物擴(kuò)增每一基因座。熒光檢測(cè)可比放射性標(biāo)記方 法和產(chǎn)物檢測(cè)更值得期待，例如，因?yàn)闊晒鈾z測(cè)不需要使用放射性材料，并且因此避免了與使用放射性材料相伴的管理和安全問(wèn)題。使用經(jīng)標(biāo)記的引物的熒光檢測(cè)也可在其它非放射 性檢測(cè)方法(諸如銀染和DNA插入劑)之上選擇，因?yàn)闊晒鈾z測(cè)方法一般比銀染和DNA插 入劑顯示更少的擴(kuò)增假象。這一部分原因是因?yàn)檫@樣的事實(shí)，即在熒光檢測(cè)中僅檢測(cè)在其 上附著了標(biāo)記的DNA擴(kuò)增鏈，而使用銀染和插入劑檢測(cè)方法則染色并檢測(cè)每一擴(kuò)增產(chǎn)物的 兩條鏈，這導(dǎo)致顯現(xiàn)了許多非特異性擴(kuò)增假象。此外，還存在與使用EtBr和SYBR相關(guān)的潛 在的健康風(fēng)險(xiǎn)。EtBr是已知的誘變劑；SYBR盡管是不如EtBr的誘變劑，但其通常懸浮在能 迅速通過(guò)皮膚的DMSO中。當(dāng)在多重反應(yīng)中使用引物的熒光標(biāo)記時(shí)，通常可使用至少三種不同的標(biāo)記來(lái)標(biāo)記 不同的引物。當(dāng)使用大小標(biāo)記物評(píng)估多重反應(yīng)產(chǎn)物時(shí)，用于制備大小標(biāo)記物的引物可以用 與在該反應(yīng)中擴(kuò)增目的基因座的引物不同的標(biāo)記來(lái)進(jìn)行標(biāo)記。由于自動(dòng)熒光成像和分析的 出現(xiàn)，可以達(dá)到多重?cái)U(kuò)增產(chǎn)物的更快的檢測(cè)和分析。在本發(fā)明教導(dǎo)的一些實(shí)施方案中，可以使用熒光團(tuán)來(lái)標(biāo)記多重?cái)U(kuò)增中的至少一種 引物，例如，通過(guò)共價(jià)結(jié)合至引物，因此產(chǎn)生熒光標(biāo)記的引物。在一些實(shí)施方案中，可以使用 不同的熒光團(tuán)標(biāo)記多重中用于不同靶基因座的引物，每一熒光團(tuán)產(chǎn)生取決于該熒光團(tuán)的發(fā) 射波長(zhǎng)的不同的著色產(chǎn)物。可在同一多重反應(yīng)中使用這些不同地標(biāo)記的引物，并且隨后一 起分析它們各自的擴(kuò)增產(chǎn)物?？蓸?biāo)記擴(kuò)增特定基因座的引物對(duì)的正向或反向引物之一，盡 管更通常標(biāo)記正向引物。以下是本領(lǐng)域公知的并且適于在本發(fā)明教導(dǎo)中使用的可能的熒光團(tuán)的一些實(shí) 例。該列表意在示例性并且不意味著是窮舉的。一些可能的熒光團(tuán)包括熒光素(FL)，其 在492nm處最大吸收并且在520nm處最大地發(fā)射；N，N, N，，N，-四甲基_6_羧基羅丹明 (TAMRA )，其在555nm處最大吸收并且在580nm處最大地發(fā)射；5-羧基熒光素(5-FAM )，其 在495nm處最大吸收并且在525nm處最大地發(fā)射；2，，7，-二甲氧基-4，，5，-二氯_6_羧 基熒光素(JOE )，其在525nm處最大吸收并且在555nm處最大地發(fā)射；6-羧基-X-羅丹明 (R0X )，其在585nm處最大吸收并且在605nm處最大地發(fā)射；CY3 ，其在552nm處最大吸收 并且在570nm處最大地發(fā)射；CY5 ，其在643nm處最大吸收并且在667nm處最大地發(fā)射；四 氯-熒光素(TET )，其在521nm處最大吸收并且在536nm處最大地發(fā)射；以及六氯-熒光素 (HEX )，其在535nm處最大吸收并且在556nm處最大地發(fā)射；NED ，其在546nm處最大吸收 并且在575nm處最大地發(fā)射；6-FAM ，其在約520nm處最大地發(fā)射；VIC ，其在約550nm處 最大地發(fā)射；PET 其在約590nm處最大地發(fā)射；以及LIZ ，其在約650nm處最大地發(fā)射。 參見(jiàn) SR Coticone 等，美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 6，780, 588 ；AMPFLSTR IDENTMLER PCR 擴(kuò)增試劑 盒用戶(hù)手冊(cè)，PP. 1-3, Applied Biosystems (2001) 0注意到上面列舉的發(fā)射和/或吸收波長(zhǎng) 是典型的并且僅可用于一般地指引作用；對(duì)于不同的應(yīng)用和在不同的條件下真實(shí)的峰波長(zhǎng) 可能不同。本發(fā)明教導(dǎo)的各實(shí)施方式可以包括單個(gè)多重?cái)U(kuò)增系統(tǒng)，其包含了至少4種不同的 染料。這些至少4種染料可以包含任意4種上述列出的染料，或任何其它4種本領(lǐng)域公知的 染料，或6-FAM 、VIC 、NED 和PET 。本教導(dǎo)的其它實(shí)施方案可包含包括至少5種不同 染料的單個(gè)多重系統(tǒng)。這些至少5種染料可以包含任意5種上述列出的染料，或任何其它 5種本領(lǐng)域公知的染料，或6-FAM 、VIC 、NED 、PET 和LIZ 。參見(jiàn)圖2，其為從16個(gè)基
13因座的多重?cái)U(kuò)增中應(yīng)用5種染料6-FAM 、VIC 、NEDtm、PET * LIZ 產(chǎn)生的DNA概況的 實(shí)例，如在實(shí)施例中所描述的那樣(沒(méi)有顯示LIZ 的擴(kuò)增峰，因?yàn)長(zhǎng)IZ 用于標(biāo)記大小標(biāo)準(zhǔn) 品)。本教導(dǎo)的其它實(shí)施方案可包含包括至少6種不同染料的單個(gè)多重系統(tǒng)。這些至少6 種染料可以包含任意6種上述列出的染料，或任何其它6種本領(lǐng)域公知的染料，或6-FAM 、 VIC 、NEDTM、PET 、LIZTM和在約620nm處具有最大發(fā)射的第6種染料(SID)。參見(jiàn)圖3?？稍诤Y選或非篩選介質(zhì)上分析PCR產(chǎn)物。在這些教導(dǎo)的一些實(shí)施方案中，例如，可 通過(guò)電泳分析PCR產(chǎn)物；例如毛細(xì)管電泳，如在H. Wenz等(1998) ,GENOME RES. 8 :69_80 (還 參見(jiàn)E. Buel等(1998)，J. FORENSIC SCI. 43 ⑴，第164-170頁(yè))中所描述的那樣；或平板 凝膠電泳，如在 M. Christensen 等(1999)，SCAND. J. CLIN. LAB. INVEST. 59(3) 167-177 中 所描述的那樣；或變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(例如，參見(jiàn)J. Sambrook等(1989)，MOLECULAR CLONING :ALAB0RAT0RY MANUAL,SECOND EDITION,Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor，N. Y.，第13. 45-13. 57頁(yè))。電泳中DNA片段的分離主要基于不同的 片段大小。還可通過(guò)色譜法分析擴(kuò)增產(chǎn)物，例如通過(guò)尺寸排阻色譜法(SEC)。一旦分離了擴(kuò)增的等位基因，則然后可顯現(xiàn)并分析例如在凝膠或毛細(xì)管中的這 些等位基因以及其它DNA(例如，DNA大小標(biāo)記物或等位基因梯)?？蓱?yīng)用本領(lǐng)域公知的 許多技術(shù)中的任一種完成DNA的顯現(xiàn)，例如諸如，銀染或通過(guò)應(yīng)用報(bào)告物，諸如如本文描 述的放射性同位素和熒光染料，或化學(xué)發(fā)光劑以及與可檢測(cè)底物聯(lián)合的酶。通常，多重基 因座的檢測(cè)方法可通過(guò)熒光。例如參見(jiàn)JW Schumm等，PROCEEDINGS FROM THE EIGHTH INTERNATIONALSYMPOSIUM ON HUMAN IDENTIFICATION, 1998 由 PromegaCorporation 出版， 第78-84頁(yè)；Ε. Buel等(1998)，同上。當(dāng)在多重反應(yīng)中使用熒光標(biāo)記的引物檢測(cè)每一基因 座時(shí)，可在擴(kuò)增之后應(yīng)用熒光測(cè)定檢測(cè)儀檢測(cè)標(biāo)記的產(chǎn)物。參見(jiàn)上面的熒光染料的描述。可通過(guò)與電泳中的大小標(biāo)準(zhǔn)品(諸如已知大小的DNA標(biāo)記物)相比較而確定DNA 樣品中在每一基因座上存在的等位基因大小。用于評(píng)估含有兩個(gè)或更多個(gè)多態(tài)性STR基 因座的多重?cái)U(kuò)增的標(biāo)記物還可包含基因座特異性等位基因梯或用于每一進(jìn)行評(píng)估的基因 座的等位基因梯的組合。例如參見(jiàn)C. Puers等(1993)，AM. J. HUM. GENET. 53 :953_958 ； C. Puers 等(1994)，GENOMICS 23 :260_264。還參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5，599，666 ；5，674，686 ；和 5，783，406，用于描述適于在檢測(cè)STR基因座中使用的一些等位基因梯，以及其中公開(kāi)的梯 構(gòu)建的一些方法。在構(gòu)建了單個(gè)基因座的等位基因梯后，可在與擴(kuò)增產(chǎn)物相同的時(shí)間電泳 該梯。每一等位基因梯與來(lái)自相應(yīng)基因座的等位基因共遷移。還可使用內(nèi)部泳道標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)評(píng)估本教導(dǎo)的多重反應(yīng)的產(chǎn)物，所述內(nèi)部泳道標(biāo)準(zhǔn)品 即配置以進(jìn)行電泳的特定類(lèi)型的大小標(biāo)記物，例如作為擴(kuò)增產(chǎn)物在相同的毛細(xì)管中。該內(nèi) 部泳道標(biāo)準(zhǔn)品可包含一系列的已知長(zhǎng)度片段。還可用熒光染料標(biāo)記該內(nèi)部泳道標(biāo)準(zhǔn)品，其 中所述熒光染料可與在擴(kuò)增反應(yīng)中的其它染料相區(qū)分。該泳道標(biāo)準(zhǔn)品可與經(jīng)擴(kuò)增的樣品或 大小標(biāo)準(zhǔn)品/等位基因梯混合，并且與任一進(jìn)行電泳以比較在凝膠電泳不同泳道中或在毛 細(xì)管電泳不同毛細(xì)管中的遷移。內(nèi)部泳道標(biāo)準(zhǔn)品遷移的不同可用于指示分離介質(zhì)性能的不 同。這一不同的定量以及與等位基因梯的關(guān)聯(lián)可提供在不同泳道或毛細(xì)管中電泳的擴(kuò)增產(chǎn) 物的校準(zhǔn)，并且校正未知樣品中等位基因的大小確定。當(dāng)使用熒光染料標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可使用熒光檢測(cè)儀器分析經(jīng)電泳并分離的產(chǎn) 物，所述儀器例如諸如是ABI PRISM 310或3130x1遺傳分析儀，或ABI PRISM 377DNA 測(cè)序儀(Applied Biosystems, Foster City, Calif.)；或 Hitachi FMB10 II 熒光 掃描儀(HitachiSoftware Engineering America, Ltd. , South San Francisco, Calif)。 在本教導(dǎo)的各實(shí)施方案中，可通過(guò)與諸如ABI PRISM 3130x1遺傳分析儀(Applied Biosystems)的電泳設(shè)備聯(lián)合的毛細(xì)管凝膠電泳方案分析PCR產(chǎn)物，并且可進(jìn)行經(jīng)電泳 的擴(kuò)增產(chǎn)物的等位基因分析，例如使用來(lái)自Applied Biosystems的GeneMapper ID Software v3. 2。在其它實(shí)施方案中，可在例如約4. 5%，29 1的丙烯酰胺雙丙烯酰胺， 8M尿素凝膠中電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所述凝膠如為ABI PRISM 377自動(dòng)熒光DNA測(cè)序 儀所制備的那樣。本發(fā)明的教導(dǎo)還涉及使用上述方法的試劑盒。在一些實(shí)施方案中，基礎(chǔ)試劑盒可 包括容器，其具有一個(gè)或更多個(gè)基因座特異性引物。試劑盒還可任選地包含使用說(shuō)明書(shū)。試 劑盒還可包含其它任選的試劑盒成分，例如諸如以下中的一種或更多種針對(duì)每一個(gè)特定 基因座的等位基因梯、用于擴(kuò)增的足量的酶、促進(jìn)擴(kuò)增的擴(kuò)增緩沖劑、促進(jìn)酶活性的二價(jià)陽(yáng) 離子溶液、在擴(kuò)增期間用于鏈延伸的dNTP、用于制備用于電泳的擴(kuò)增材料的上樣溶液、作為 模板對(duì)照的基因組DNA、保證材料如預(yù)期的那樣在分離介質(zhì)中遷移的大小標(biāo)記物、以及教導(dǎo) 用戶(hù)以及限制使用中的誤差的方案和手冊(cè)。各試劑在試劑盒中的量也可以依據(jù)許多因素而 不同，諸如該方法的最佳敏感性。提供用于手工應(yīng)用的測(cè)試試劑盒或使用自動(dòng)化檢測(cè)儀或 分析儀的測(cè)試試劑盒在這些教導(dǎo)的范圍之內(nèi)?？稍诤泻怂岬娜我鈽?biāo)本(諸如骨、毛發(fā)、血液、組織等)上進(jìn)行個(gè)人鑒定測(cè)試、或 DNA分型。可從該標(biāo)本提取DNA，并且在多重中使用一組引物擴(kuò)增該DNA的期望的STR基因 座集，以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物集，如本文所描述的那樣。在法庭測(cè)試中，可將特定標(biāo)本的擴(kuò)增模式 或DNA概況與取自假定受害者(假定的匹配源)的已知樣品進(jìn)行比較，或可與其中擴(kuò)增了 相同的STR基因座集的衍生自該假定受害者的家族成員(例如，母親和/或父親)的經(jīng)擴(kuò) 增的基因座模式進(jìn)行比較。STR基因座擴(kuò)增的模式可用于確定或排除該受害者的身份。在 親權(quán)測(cè)試中，測(cè)試標(biāo)本一般地可來(lái)自孩子并且可與來(lái)自假定的父親的STR基因座模式進(jìn)行 比較，和/或可與來(lái)自該孩子母親的STR基因座模式進(jìn)行匹配。STR基因座擴(kuò)增的模式可用 于確定或排除父親的身份。特定基因座的擴(kuò)增和比較還可用于育種背景中的親權(quán)測(cè)試，例 如用于牛、狗、馬和其它動(dòng)物。CR Primmer 等(1995)，M0L. EC0L. 4 :493_498。在臨床環(huán)境下，此類(lèi)STR標(biāo)記可用于例如在骨髓移植中監(jiān)測(cè)供體移植物移入的 程度。在醫(yī)院中，這些標(biāo)記還可用于標(biāo)本匹配和跟蹤。這些標(biāo)記還已進(jìn)入了其它科學(xué)領(lǐng) 域，諸如對(duì)人種和種族差異(DBGoldstein 等(1995)，PR0C. NATL. ACAD. SCI. U. S. Α. 92 6723-6727)、進(jìn)化和物種趨異、以及動(dòng)物和植物分類(lèi)群中的變異(MW Bruford等(1993)， CURR. BI0L. 3 :939_943)的群體生物學(xué)研究。本文引用的參考工作、專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)、科學(xué)文獻(xiàn)和其它印刷出版物、以及GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)序列的登錄號(hào)均在此通過(guò)弓I用全文并入本文。
實(shí)施例本教導(dǎo)的各方面可根據(jù)以下實(shí)施例進(jìn)一步理解，所述實(shí)施例不應(yīng)理解為以任何方 式限制本教導(dǎo)范圍。在一些實(shí)施方案中，在PCR混合物中使待分析的DNA樣品與STR及Amelogenin特異性引物集聯(lián)合，以擴(kuò)增基因座 D16S539，D18S51, D19S433, D21S11, D2S1338, D3S1358, D8S1179, FGA, THO1, VffA, Amelogenin, ^P 5 個(gè)新 STR 基因座 D10S1248, D12S391, D1S1656, D22S1045，和D2S441。根據(jù)本文提供的方法設(shè)計(jì)用于這些基因座的引物集，上文。用6-FAM 熒光標(biāo)記來(lái)標(biāo)記來(lái)自擴(kuò)增D10S1248、VWA、D16S539和D2S1338的引物集中每一個(gè)的一條引 物。用VIC 熒光標(biāo)記來(lái)標(biāo)記來(lái)自擴(kuò)增Amelogenin、D8S 1179、D21S 11和D18S51的引物 集中每一個(gè)的一條引物。用NED 熒光標(biāo)記來(lái)標(biāo)記來(lái)自擴(kuò)增D22S 1045、D19S433、THOl和 FGA的引物集中每一個(gè)的一條引物。用PET 熒光標(biāo)記來(lái)標(biāo)記來(lái)自擴(kuò)增D2S441、D3S1358、 D1S1656和D12S391的引物集中每一個(gè)的一條引物。第五個(gè)熒光標(biāo)記LIZ 用于標(biāo)記大小 標(biāo)準(zhǔn)品。然后使該反應(yīng)混合物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。從STR和Amelogenin基因座產(chǎn)生擴(kuò)增 產(chǎn)物，其中標(biāo)記的引物摻入擴(kuò)增產(chǎn)物中。擴(kuò)增產(chǎn)物因此被6-FAM 、viC 、NED 或PET 熒 光標(biāo)記進(jìn)行了標(biāo)記。擴(kuò)增后使所有或部分反應(yīng)混合物在單毛細(xì)管通道中進(jìn)行毛細(xì)管電泳。 還電泳了 LIZ 標(biāo)記的大小標(biāo)準(zhǔn)品。檢測(cè)從熒光標(biāo)記的發(fā)射并在單輸出中展示。來(lái)自應(yīng)用 5種染料(LIZ 標(biāo)記的大小標(biāo)準(zhǔn)品未顯示)擴(kuò)增16個(gè)基因座的DNA概況參見(jiàn)圖2。STR和 Amelogenin基因座通過(guò)該通道的遷移速率是它們的大小的函數(shù)。STR和Amelogenin擴(kuò)增 產(chǎn)物的大小以及它們標(biāo)記的顏色鑒定每一基因座上的等位基因。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可對(duì)本發(fā)明教導(dǎo)的各實(shí)施方案進(jìn)行許多改變和 修飾而不背離本教導(dǎo)的精神。預(yù)期所有此類(lèi)變形均在本教導(dǎo)的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
方法，其包括(a)在多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)中共擴(kuò)增至少一個(gè)待分析的DNA樣品的基因座集，其中所述反應(yīng)的產(chǎn)物是來(lái)自共擴(kuò)增的所述集中的基因座的經(jīng)擴(kuò)增的等位基因混合物，其中所述的基因座集包含10個(gè)STR基因座D16S539，D18S51，D19S433，D21S11，D2S1338，D3S1358，D8S1179，F(xiàn)GA，TH01，VWA；以及來(lái)自STR基因座D10S1248，D12S391，D1S1656，D22S1045，和D2S441的一個(gè)或更多個(gè)；(b)評(píng)估混合物中經(jīng)擴(kuò)增的等位基因，以確定在所述至少一個(gè)DNA樣品之內(nèi)的所述基因座集中所分析的基因座的每一個(gè)上存在的等位基因。
2.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)中的基因座集還包含可用于鑒定所述至少一個(gè) DNA樣品來(lái)源的性別的基因座。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述的DNA樣品來(lái)源是人類(lèi)，并且用于鑒定所述人類(lèi)性別的 基因座是Amelogenin基因座。
4.權(quán)利要求1的方法，在所述評(píng)估步驟之前還包括分離經(jīng)擴(kuò)增的等位基因的步驟。
5.權(quán)利要求4的方法，其中通過(guò)毛細(xì)管凝膠電泳分離所述經(jīng)擴(kuò)增的等位基因。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述的共擴(kuò)增步驟包括使用用于所述基因座集中每一基 因座的寡核苷酸引物對(duì)，所述引物對(duì)的每一個(gè)位于多重反應(yīng)中所述基因座集的基因座的側(cè)^r ο
7.權(quán)利要求6的方法，其中每一對(duì)寡核苷酸引物的至少一個(gè)引物是經(jīng)標(biāo)記的引物。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述經(jīng)標(biāo)記的引物的標(biāo)記是熒光標(biāo)記。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述的共擴(kuò)增步驟包括應(yīng)用至少5個(gè)熒光標(biāo)記的寡核苷酸 引物，其中所述至少5個(gè)標(biāo)記的引物具有分別共價(jià)地附著于其上的至少5種不同的熒光標(biāo)記。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述的共擴(kuò)增步驟包括應(yīng)用至少6個(gè)熒光標(biāo)記的寡核苷酸 引物，其中所述至少6個(gè)標(biāo)記的引物具有分別共價(jià)地附著于其上的至少6種不同的熒光標(biāo)記。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述的至少6種不同的熒光標(biāo)記包含在520nm處發(fā)射其 最大熒光的第一熒光標(biāo)記、在550nm處發(fā)射其最大熒光的第二熒光標(biāo)記、在575nm處發(fā)射其 最大熒光的第三熒光標(biāo)記、在590nm處發(fā)射其最大熒光的第四熒光標(biāo)記、在650nm處發(fā)射其 最大熒光的第五熒光標(biāo)記、以及在620nm處發(fā)射其最大熒光的第六熒光標(biāo)記。
12.權(quán)利要求1的方法，其中使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)共擴(kuò)增所選擇的基因座集中的每一 基因座。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述的待分析的至少一個(gè)DNA樣品制備自人組織。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述的人組織選自血液、精液、陰道細(xì)胞、毛發(fā)、唾液、尿、 骨、口腔樣品、含有胎盤(pán)細(xì)胞的羊膜水、含有胎兒細(xì)胞的羊膜水中的一種或更多種。
15.包含用于共擴(kuò)增待分析的至少一個(gè)DNA樣品的基因座集的寡核苷酸引物的試劑 盒；其中所述的基因座集可被共擴(kuò)增；其中所述的引物在一個(gè)或更多個(gè)容器中；并且其 中所述的基因座集包含Amelogein基因座，10個(gè)STR基因座D16S539，D18S51, D19S433, D21S11, D2S1338, D3S1358, D8S1179, FGA, THO1, VffA,以及 STR 基因座 D10S1248, D12S391, D1S1656, D22S1045，和 D2S441 的一個(gè)或更多個(gè)。
16.權(quán)利要求15的試劑盒，其中所述試劑盒中所有的寡核苷酸引物在一個(gè)容器中。
17.權(quán)利要求15的試劑盒，還包含用于至少一個(gè)多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)的試劑。
18.權(quán)利要求15的試劑盒，還包含具有至少一種大小標(biāo)準(zhǔn)品的容器。
19.權(quán)利要求18的試劑盒，其中所述的大小標(biāo)準(zhǔn)品是DNA標(biāo)記物。
20.權(quán)利要求18的試劑盒，其中所述的大小標(biāo)準(zhǔn)品是基因座特異性等位基因梯。
21.權(quán)利要求20的試劑盒，其中所述基因座特異性等位基因梯的每一梯級(jí)以及用于所 述基因座集的每一基因座的至少一個(gè)寡核苷酸引物具有共價(jià)地附著于其上的熒光標(biāo)記，并 且至少兩個(gè)寡核苷酸引物具有與所述容器中其它引物不同的共價(jià)地附著于其上的熒光標(biāo) 記。
22.權(quán)利要求21的試劑盒，其中至少5個(gè)標(biāo)記的引物具有分別共價(jià)地附著于其上的至 少5種不同的熒光標(biāo)記。
23.權(quán)利要求22的試劑盒，其中所述的至少5種不同的熒光標(biāo)記包含在520nm處發(fā)射 其最大熒光的第一熒光標(biāo)記、在550nm處發(fā)射其最大熒光的第二熒光標(biāo)記、在575nm處發(fā)射 其最大熒光的第三熒光標(biāo)記、在590nm處發(fā)射其最大熒光的第四熒光標(biāo)記、以及在650nm處 發(fā)射其最大熒光的第五熒光標(biāo)記。
24.權(quán)利要求21的試劑盒，其中至少6個(gè)標(biāo)記的引物具有分別共價(jià)地附著于其上的至 少6種不同的熒光標(biāo)記。
25.權(quán)利要求24的試劑盒，其中所述的至少6種不同的熒光標(biāo)記包含在520nm處發(fā)射 其最大熒光的第一熒光標(biāo)記、在550nm處發(fā)射其最大熒光的第二熒光標(biāo)記、在575nm處發(fā)射 其最大熒光的第三熒光標(biāo)記、在590nm處發(fā)射其最大熒光的第四熒光標(biāo)記、在650nm處發(fā)射 其最大熒光的第五熒光標(biāo)記、以及在620nm處發(fā)射其最大熒光的第六熒光標(biāo)記。
全文摘要
公開(kāi)了用于在單個(gè)多重反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增基因組DNA的至少11個(gè)特定STR基因座的方法和材料，還公開(kāi)了用于分析該反應(yīng)產(chǎn)物的方法和材料。本發(fā)明包含了用于在單個(gè)多重反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增16個(gè)特定基因座的方法和材料，包含10個(gè)AmpFISTR？SGMplus？STR基因座、Amelogenin基因座、以及5個(gè)新STR基因座，包括用于分析這些基因座的方法和材料。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101932726SQ200880122932
公開(kāi)日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2008年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月30日
發(fā)明者L·K·亨尼西, R·格林 申請(qǐng)人:應(yīng)用生物系統(tǒng)有限責(zé)任公司