專利名稱：玉米脅迫反應性nac轉錄因子及啟動子和使用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物的基因操縱領域，特別是調節(jié)基因活性以影響植物的發(fā)育和生長。
背景技術：
耐旱性是受多基因控制的復雜性狀?；蜷_關例如轉錄因子可對植物生理產生顯 著且特異的作用，是理想的調節(jié)靶標。脅迫應答NAC轉錄因子(SNAC)可控制許多對適應干 旱脅迫來說重要的下游基因的表達并最終可通過例如以下的一種或多種機制來增強耐旱 性減少氣孔器、延遲衰老和增加源庫強度(sink and sourcestrength)。文獻已顯示ABA 和干旱反應性NAC可增強擬南芥(Tran等，(2004) Plant Cell 16 =2481-2498)和水稻的耐 旱性(Hu等，(2006) PNAS 103(35) 12987-12992)。因此，還可將玉米的SNAC基因單獨使用 或與其它基因聯合使用以增強耐旱性。異源DNA序列在植物宿主中的表達依賴于被可操作地連接的、在所述植物宿主中 有功能的調節(jié)元件的存在。調節(jié)元件的選擇將決定異源DNA序列在生物體內何時何處表 達。當需要在細胞植物各處和/或發(fā)育始終持續(xù)表達時，采用組成型啟動子。相反地，當需 要響應刺激物的基因表達時，誘導型啟動子為所選的調節(jié)元件。當需要在特定的組織或器 官中表達時，可采用組織特異性或組織偏愛型啟動子。換句話說，這類啟動子可驅動在特定 組織或器官中唯一或優(yōu)先表達。這樣的組織特異性啟動子可為暫時組成性或誘導性的。在 任何情況下，可使轉化載體的表達構建體包含核心啟動子序列上游和/或下游的其它調節(jié) 序列，以引起異源核苷酸序列在轉基因植物中不同水平的表達。隨著該領域的發(fā)展以及可獲得基因的增多，對用多基因轉化的植物存在更大的需 求。這些多個外源基因通常需要被各別的調節(jié)序列控制。此外，在轉基因生物體中有些基 因應被組成性地調節(jié)而其它基因應在某些發(fā)育階段或某些位置表達。因此，需要具有各種 作用的多種調節(jié)序列。還需要多種調節(jié)序列以避免非所需的分子的相互作用，該相互作用可由采用相同 的調節(jié)序列控制超過一個基因引起。發(fā)明人在本文中公開了轉錄因子相關啟動子的分離和表征，所述轉錄因子可作為 用于分離的目標核苷酸序列表達的調節(jié)元件使用，從而作用于植物的各種性狀。作為備選 或除此之外，所述啟動子可用于驅動可評分的標記物(scorable marker)。發(fā)明簡述本發(fā)明的組合物和方法包含和采用涉及調節(jié)植物發(fā)育、形態(tài)及生理的玉米SNAC 轉錄因子。組合物還包含表達盒和表達載體，所述表達盒和表達載體包含本發(fā)明的ZmSNAC 序列和其中ZmSNAC表達被修飾的植物、植物細胞及植物部分。本發(fā)明的植物、植物細胞及 植物部分均相對于不按照本發(fā)明修飾的植物、植物細胞或植物部分可通過以下表型的改變 表現出增強的非生物脅迫耐受例如延遲卷葉、降低蒸騰速率、增加氣孔閉合和增強細胞膜 的穩(wěn)定性。
本文提供了用于改變植物中ZmSNAC多肽的水平的方法，所述方法包括將選定的 多核苷酸引入植物中。所述多核苷酸可被引入構建體中，所述構建體經過設計以調節(jié)植物 各處或靶組織中或靶向的發(fā)育階段中ZmSNAC多肽的水平或活性。附圖簡述

圖1提供了不同品種中NAC轉錄因子的氨基酸比對。包括ANAC(Atlg52890， SEQ ID NO 12) ；ATAF2(At5g08790, SEQ IDNO 13) ；ATAFl(Atlg01720, SEQ ID NO 14)； NAP (Atlg69490, SEQ ID NO 15) ；AtNAM(Atlg52880, SEQ ID NO 16) ；TIP(At5g24590, SEQ ID NO: 17) ； CUC2(At5g53950, SEQ ID NO 18) ；CUCl(At3gl5170, SEQ ID NO: 19)； CUC3 (Atlg76420, SEQ ID NO 20)；擬南芥 NACl (Atlg56010，SEQ ID NO 21) ；ZmSNACl (SEQ IDNO 2) ；ZmSNAC2(SEQ ID NO 4) ；ZmSNAC3(SEQ ID NO 6) ；ZmSNAC5(SEQ ID NO 10)； ZmSNAC4 (SEQ ID NO 8)和共有序列(SEQ ID NO :22)。圖2顯示了由所述ZmSNACl啟動子驅動的⑶S的表達。序列簡述SEQ ID NO :1和2提供了 ZmSNACl的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO :3和4提供了 ZmSNAC2的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO :5和6提供了 ZmSNAC3的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO :7和8提供了 ZmSNAC4的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO 9和10提供了 ZmSNAC5的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO 11 提供了 ZmSNACl 的啟動子序列。SEQ ID NO 12-21提供了附圖簡述中提及的擬南芥NAC蛋白。SEQ ID NO 22提供了擬南芥和玉米(Zea mays)NAC蛋白的共有序列。發(fā)明詳述現將就附圖更全面地描述本發(fā)明，附圖中顯示了本發(fā)明一部分但不是所有的實施 方案。事實上，本發(fā)明可具體化為多種不同形式并且不應理解為受限于本文所述的實施方 案；更準確地說，本發(fā)明提供這些實施方案以便該公開內容滿足適用的法律要求。本文各處 相似的數字表示相似的要素。本發(fā)明所屬領域的技術人員應想到本文所述的本發(fā)明的許多修改和其它實施方 案具有之前的說明和相關附圖中提出的教導的益處。因此，應理解的是本發(fā)明并不限制公 開的特定實施方案，而且修改和其它的實施方案意欲包括在所附權利要求的范圍內。盡管 本文采用了特定的術語，但其僅以一般性和描述性的方式使用并且無限制的目的。組合物本發(fā)明的組合物包括與調節(jié)植物發(fā)育、形態(tài)和生理有關的玉米SNAC轉錄因子多 肽和多核苷酸。具體而言，本發(fā)明提供了分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼SEQ ID N0:2、4、6、8和10所示氨基酸序列的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了分離的多肽，所述多肽 具有由本文所述多核苷酸(例如SEQ ID N0:l、3、5、7和9中所述的那些多核苷酸)編碼的 氨基酸序列。NAC轉錄因子由大范圍的植物種類中存在的基因編碼，該名稱來源于NAM轉錄因 子(無頂端分生組織(no apical meristem) ；Souer 等，(1996)Cell 85 159-170) ,ATAFl, 2轉錄因子和CUC2轉錄因子(杯狀子葉2 (cup-shaped cotyledon) ；Aida等，(1997)Plant Cell9 :841-857)。NAC轉錄因子的表達模式以及通過調節(jié)其表達賦予的突變表型 是相似的。高度保守的N端DNA結合域已被確定并且其結構已被表征(Ernst等，(2004) EMBO Reports 5(3) :297_303)。更多樣化的C端區(qū)包含轉錄激活域(Xie等，(2000) Genes Dev. 14 3024-3036 ；Duval 等，(2002)Plant Mol. Bio. 50 :237_248)。據顯示，NAC 轉錄因 子與涉及分生組織形成、器官分化、植物生長素信號傳導、根的生長以及生物和非生物脅 迫應答的許多基因相互作用(參見Olsen等，(2005) Trends in Plant Science 10(2) 1360-1385的綜述)。已在擬南芥中鑒定了 NAC的識別序列(NACRS)和核心結合序列(Tran 等，(2004)Plant Cell 16:2481-2498)。本發(fā)明包含分離或基本純化的多核苷酸或蛋白組合物?！胺蛛x的”或“純化的”多 核苷酸或蛋白或其生物活性部分大致上或基本上不含通常與所述多核苷酸或蛋白在其天 然存在的環(huán)境中共存或接觸的其他組分。因此，當通過重組技術制備時，分離的或純化的多 核苷酸或蛋白基本上不含其它的細胞物質或培養(yǎng)基，或者當用化學方法合成時，基本上不 含化學前體或其它的化學品?！胺蛛x的”多核苷酸最好不含在所述多核苷酸所來源生物體的 基因組DNA中天然地位于所述多核苷酸側翼的序列(最好是蛋白編碼序列)(即位于所述 多核苷酸的5’端和3’端的序列)。例如在不同的實施方案中，分離的多核苷酸可含有在 所述多核苷酸所來源的細胞的基因組DNA中天然地位于所述多核苷酸側翼的少于約5kb、 4kb、3kb、2kb、lkb、0. 5kb或0. Ikb的核苷酸序列?；静缓毎镔|的蛋白包括具有少于 約30%、20%、10%、5%或(干重)污染蛋白的蛋白制備物。當本發(fā)明的蛋白或其生物 活性部分通過重組方式制備時，最佳的是，培養(yǎng)基表示少于約30%、20%、10%、5 %或1 % (干重)的化學前體或非目標蛋白的化學物質。本發(fā)明還包括公開的多核苷酸的片段及變體和由此編碼的蛋白?！捌巍笔侵覆糠?多核苷酸或部分氨基酸序列以及由此編碼的蛋白。多核苷酸的片段可編碼保留了天然蛋白 的生物學活性的蛋白片段?；蛘?，多核苷酸的片段可用作雜交探針，所述探針通常并不編碼 保留生物學活性的片段蛋白。因此，核苷酸序列的片段可為至少約20個核苷酸、約50個核 苷酸、約100個核苷酸和多至編碼本發(fā)明的蛋白的全長多核苷酸。編碼本發(fā)明的NAC轉錄因子的生物活性部分的ZmSNAC多核苷酸片段應編碼至少 15、25、30、50、100、150、200、225、250、275、300或339個鄰接的氨基酸，或多至本發(fā)明的全 長多肽的氨基酸總數。SNAC多核苷酸的片段可用作通常不需要編碼具有生物活性的多肽的 雜交探針或PCR引物。因此，ZmSNAC多核苷酸片段可編碼SNAC轉錄因子的生物活性部分，或它可以是利 用以下公開的方法被用作雜交探針或PCR引物的片段。SNAC轉錄因子的生物活性部分可通 過以下方法制備分離本發(fā)明ZmSNAC多核苷酸之一的一部分，表達ZmSNAC蛋白的編碼部分 (例如通過體外重組表達)并評價編碼部分的活性。活性可通過DNA結合活性或蛋白相互 作用研究來評價，和/或通過在轉基因植物中表達ZMSNAC蛋白或所述蛋白的部分并評估所 述植物的表型來評價。作為ZmSNAC核苷酸序列片段的多核苷酸包含至少16個、20個、50個、75個、100 個、150 個、200 個、250 個、300 個、350 個、400 個、450 個、500 個、550 個、600 個、650 個、700 個、800個、900個或1000個鄰接的核苷酸，或多至本文公開的全長ZmSNAC多核苷酸中的核
苷酸數。
5
“變體”意指基本上相似的序列。對于多核苷酸，變體包含天然多核苷酸中一個或 多個位點處一個或多個核苷酸的缺失和/或添加，和/或天然多核苷酸中一個或多個位點 處一個或多個核苷酸的取代。本文所用“天然”多核苷酸或多肽分別包含天然存在的核苷 酸序列或氨基酸序列。對于多核苷酸，保守的變體包括由于遺傳密碼的簡并性而不改變編 碼的氨基酸序列的那些變體。諸如此類天然存在的變體可通過利用已知的分子生物學技術 (例如下文概述的聚合酶鏈式反應(PCR)和雜交技術)來鑒定。變體多核苷酸還包括合成 來源的多核苷酸，例如通過利用定點誘變得到但仍編碼本發(fā)明的ZmSNAC蛋白的那些多核 苷酸。通常，根據本文其它地方所述的序列比對程序和參數所確定，本發(fā)明的特定多核苷酸 的變體應具有相對于所述特定多核苷酸的至少約40 %、45 %、50 %、55 %、60 %、65 %、70 %、 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更大的序列 同一性。本發(fā)明的特定多核苷酸(即參考多核苷酸)的變體還可通過變體多核苷酸所編碼 的多肽與參考多核苷酸所編碼的多肽之間的序列同一性百分比的比較來評價。因此，例如 公開了分離的多核苷酸，其編碼的多肽與SEQ ID N0:2、4、6、8或10的多肽具有既定的序列 同一性百分比。任何兩條多肽之間的序列同一性百分比可利用本文其它地方所述的比對程 序和參數來計算。本發(fā)明的任何既定的多核苷酸對是通過比較它們所編碼的兩條多肽共有 的序列同一性百分比來評價，兩條編碼多肽之間的序列同一性百分比為至少約40%、45%、 50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%, 97%、98%、99%或更大的序列同一性?！白凅w”蛋白意指通過天然蛋白中一個或多個位點處一個或多個氨基酸的缺失或 添加和/或天然蛋白中一個或多個位點處一個或多個氨基酸的取代由天然蛋白衍生而來 的蛋白。本發(fā)明所包括的某些變體蛋白是有生物活性的，換句話說它們依然具有天然蛋白 所需的生物活性，即本文所述的轉錄因子活性。這樣的變體可由例如遺傳多態(tài)性或人為操 作產生。根據本文其它地方所述的序列比對程序和參數所確定，本發(fā)明的天然SNAC蛋白 的生物活性變體與天然蛋白的氨基酸序列具有至少約40%、45%、50%、55%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更大的 序列同一性。本發(fā)明的蛋白的生物活性變體可與所述蛋白相差少至1-15個氨基酸殘基、少 至1-10個(例如6-10個)、少至5個、少至4個、3個、2個或甚至1個氨基酸殘基。本發(fā)明的蛋白可以以各種方式被改變，包括氨基酸的取代、缺失、截短和插入。 用于這些操作的方法通常為本領域所了解。例如，可通過DNA的突變來制備SNAC蛋白 的氨基酸序列變體和片段。用于誘變和多核苷酸改變的方法為本領域所熟知。參見 例如 Kunkel (1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 488-492 ；Kunkel 等(1987)Methods inEnzymol. 154 :367_382 ；美國專利第 4，873，192 號；Walker 和 Gaastra 編輯· (1983) Techniques in Molecular Biology(MacMillan PublishingCompany, New York),以上 文獻在此引作參考。不影響目標蛋白的生物活性的合適的氨基酸取代的有關指南可參見 Dayhoff ^ W Il M (1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl. Biomed. Res. Found. , Washington, D. C.)，其在此引作參考。保守取代例如將一種氨基酸換成具有相 似性質的另一種氨基酸可為最佳的。因此，本發(fā)明的基因和多核苷酸包括天然存在的序列及突變形式兩者。同樣地，本
6發(fā)明的蛋白包括天然存在的蛋白及其變型和修飾形式。這樣的變體應仍具有所需的轉錄因 子活性。顯然，對編碼變體的DNA作出的突變決不能安排在閱讀框之外的序列中，而且最好 不應產生能引起mRNA 二級結構的互補區(qū)。本文包括的蛋白序列的缺失、插入和取代不期需對該蛋白的特性產生根本性的變 化。然而，當在進行所述取代、缺失或插入之前很難預測它們的確切效應時，本領域技術人 員應認識到該效應可通過常規(guī)的篩選測定法來評價。即活性可通過測定DNA結合活性或蛋 白之間的相互作用、瞬時研究中基因表達的激活情況或轉基因植物中基因表達的效應來評 價。變體多核苷酸和蛋白還包括通過誘變方法和重組方法(例如DNA改組(DNA shuffling))得到的序列和蛋白。利用所述方法可操作一種或多種不同的NAC編碼序列， 以產生具有所需性能的新型NAC多肽。重組多核苷酸文庫是以這種方式由一群相關序 列的多核苷酸產生，所述多核苷酸包含具有基本的序列同一性并可在體內外被同源重組 的序列區(qū)。例如，采用該方法，編碼目標結構域的序列基序可在本發(fā)明的ZmSNAC基因與 其它已知的NAC基因之間被改組，以得到編碼具有增強的目標性能的蛋白的新基因。用 于此類DNA改組的策略為本領域已知。參見例如Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA91 10747-10751 ；Stemmer(1994)Nature 370 389-391 ；Crameri 等(1997)Nature Biotech. 15 :436_438 ；Moore 等(1997)J. Mol. Biol. 272 :336_347 ；Zhang 等(1997)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 :4504_4509 ；Crameri 等(1998)Nature 391 :288_291 ；PCT
發(fā)明者N·J·貝特, X·牛 申請人:先鋒高級育種國際公司