專(zhuān)利名稱(chēng)：核酸、包含該核酸的探針以及利用該探針的篩選方法
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及核酸、探針以及利用該探針的篩選方法，更具體而言，本發(fā)明涉及核酸、包含該核酸的探針以及利用該探針進(jìn)行基因診斷的篩選方法。
2.相關(guān)技術(shù)描述對(duì)于在染色體上定位人基因組以制作染色體圖譜的基因定位方法，普遍實(shí)行利用人和嚙齒類(lèi)動(dòng)物之間體細(xì)胞雜交或者染色體部分缺失的克隆圖，分析其余的人特定染色體或者染色體的一部分的方法，以及將克隆基因用作Southern印跡探針的方法。
近來(lái)，利用所謂原位雜交，將從基因組DNA克隆并標(biāo)記的基因或DNA標(biāo)志用作探針，在玻片上的染色體樣本中直接形成分子雜交物，檢測(cè)存在基因的部分，以便有效獲得有關(guān)許多基因(例如人基因)的特定位置以及序列相互順序的信息。
對(duì)于原位雜交，一種方法是利用放射性同位素(主要為3H)標(biāo)記DNA作為探針，通過(guò)放射自顯影檢測(cè)其位點(diǎn)，以及利用熒光顯微鏡檢測(cè)標(biāo)記DNA探針的熒光信號(hào)的方法。
后者熒光原位雜交方法(以下記作FISH方法)的優(yōu)點(diǎn)在于，不使用RI設(shè)備，操作程序簡(jiǎn)單，短時(shí)間內(nèi)(2天)在染色體帶上精確進(jìn)行細(xì)微定位。
目前，利用這些方法開(kāi)發(fā)了可用于多種疾病/綜合癥的探針，進(jìn)行臨床診斷。例如，已知一種適用于多種染色體FISH方法的檢查探針，針對(duì)具有微缺失的先天性畸形綜合癥。該探針檢查靶疾病的基因，如果檢查結(jié)果是陽(yáng)性(即存在缺失等)，則作出確診。
例如，上述探針對(duì)普-威(Prader Willi)綜合癥有效，因?yàn)榇蠹s60％的患者帶有缺失。
如上所述，已經(jīng)在該疾病基因的部分克隆中找到有用的探針。然而，還有自發(fā)性疾病，除疾病的身體表現(xiàn)和癥狀以外，尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)其有效的檢查和診斷方法。如果能夠利用引起疾病的基因和/或同系物發(fā)現(xiàn)探針，其在基因診斷領(lǐng)域會(huì)很有益處。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明目的在于提供核酸、利用該核酸的有用探針以及利用該探針的篩選方法。
為達(dá)此目的，本發(fā)明人對(duì)有關(guān)先天性畸形綜合癥和基因的關(guān)系進(jìn)行了多種研究，找到了探針以及利用本發(fā)明這種探針的篩選方法。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，該核酸是(a)包含序列表中No.1序列的1-39726位堿基序列所示的堿基序列的核酸，或者(b)其中1-39726位堿基序列的部分堿基序列缺失、置換或者添加，并具有80％堿基序列同源性的核酸。
此外，根據(jù)本發(fā)明的第二方面，核酸是(a)包含序列表中No.2序列1-8511位堿基序列所示的堿基序列的核酸，或者(b)其中1-8511位堿基序列的部分堿基序列缺失、置換或者添加，并具有80％堿基序列同源性的核酸。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面，該探針包含本發(fā)明的第一或第二方面定義的核酸。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的探針用于診斷索托斯綜合癥(Sotossyndrome)。
根據(jù)本發(fā)明的第四方面，該肽片段是(a)包含序列表中No.3序列的1-309位氨基酸序列所示的氨基酸序列的肽片段，或者(b)其中No.3序列所示的部分氨基酸序列缺失、置換或者添加，并具有80％堿基序列同源性的肽片段。
根據(jù)本發(fā)明的第五方面，該肽片段是(a)包含序列表中No.4序列1-2696位氨基酸序列所示的氨基酸序列的肽片段，或者(b)其中No.4序列所示的部分氨基酸序列缺失、置換或者添加，并具有80％的堿基序列同源性的肽片段。
根據(jù)本發(fā)明的第六方面，該探針包含本發(fā)明的第四或第五方面定義的肽片段。
根據(jù)本發(fā)明，用于診斷索托斯綜合癥的探針，其特征在于，該探針包含人染色體5上的以下(a)或(b)(a)包含序列表中No.5序列的1-190位堿基序列所示的堿基序列的核酸，或者(b)其中1-190位堿基序列的部分堿基序列缺失、置換或添加，并具有80％的堿基序列同源性的核酸。
根據(jù)本發(fā)明，用于診斷索托斯綜合癥的探針，其特征在于，該探針包含人染色體5上的下列(a)或(b)(a)包含序列表中No.6序列的1-275位堿基序列所示的堿基序列的核酸，或者(b)其中1-275位堿基序列的部分堿基序列缺失、置換或添加，并具有80％的堿基序列同源性的核酸。
根據(jù)本發(fā)明，用于診斷索托斯綜合癥的探針，其特征在于，該探針包含人染色體5上的下列(a)和(b)之間的任何序列(a)包含序列表中No.5序列的1-190位堿基序列所示的堿基序列的核酸，以及(b)其中序列表中No.6序列的1-275位堿基序列的部分堿基序列的核酸。
根據(jù)本發(fā)明的第七方面，該篩選方法特征在于，利用本發(fā)明的第三、第四或第七至第十方面定義的探針。
根據(jù)本發(fā)明，在該篩選方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，利用至少一種選自原位雜交方法、Southern印跡方法、基于巨陣列(macroarray)的雜交方法以及堿基序列測(cè)定方法(雙脫氧鏈終止方法等)中的方法進(jìn)行篩選。
根據(jù)本發(fā)明，在該篩選方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，該原位雜交方法為熒光原位雜交方法。
附圖簡(jiǎn)述本發(fā)明將參考附圖進(jìn)行描述，其中

圖1顯示物理圖譜；圖2顯示NSD1的各種突變；圖3顯示一名患者的永生化成淋巴細(xì)胞系的直接序列測(cè)定結(jié)果；圖4顯示FISH分析結(jié)果；圖5a顯示序列表1的堿基序列；圖5b是顯示序列表1堿基序列的圖5a的續(xù)圖；圖5c是顯示序列表1堿基序列的圖5b的續(xù)圖；圖5d是顯示序列表1堿基序列的圖5c的續(xù)圖；圖5e是顯示序列表1堿基序列的圖5d的續(xù)圖；圖5f是顯示序列表1堿基序列的圖5e的續(xù)圖；圖5g是顯示序列表1堿基序列的圖5f的續(xù)圖；圖5h是顯示序列表1堿基序列的圖5g的續(xù)圖；圖5i是顯示序列表1堿基序列的圖5h的續(xù)圖；圖5j是顯示序列表1堿基序列的圖5i的續(xù)圖；圖5k是顯示序列表1堿基序列的圖5j的續(xù)圖；圖5l是顯示序列表1堿基序列的圖5k的續(xù)圖；圖5m是顯示序列表1堿基序列的圖51的續(xù)圖；圖5n是顯示序列表1堿基序列的圖5m的續(xù)圖；圖6a顯示序列表2的堿基序列；圖6b是顯示序列表2堿基序列的圖6a的續(xù)圖；圖6c是顯示序列表2堿基序列的圖6b的續(xù)圖；圖6d是顯示序列表2堿基序列的圖6c的續(xù)圖；圖6e是顯示序列表2堿基序列的圖6d的續(xù)圖；圖7a顯示序列表4的氨基酸序列；圖7b是顯示序列表4氨基酸序列的圖7b的續(xù)圖；圖8顯示序列表5的堿基序列；以及圖9顯示序列表6的堿基序列。
發(fā)明詳述首先闡述本發(fā)明的核酸。本發(fā)明的核酸是(a)包含序列表中No.1序列的1-39726位堿基序列所示的堿基序列的核酸，或者(b)其中1-39726位堿基序列的部分堿基序列缺失、置換或者添加，并具有80％、優(yōu)選90％、更優(yōu)選95％堿基序列同源性的核酸。這樣的核酸來(lái)源于人的染色體5的NSD1，并與NSD1的一部分互補(bǔ)。具體而言，該核酸與包含NSD1的外顯子1、外顯子2和內(nèi)含子的基因組DNA互補(bǔ)。本發(fā)明的核酸也包括其中堿基序列1-39726位的部分堿基序列缺失、置換或添加，并具有80％、優(yōu)選90％、更優(yōu)選95％堿基序列同源性的核酸。即使該部分缺失、置換或添加，如下所述后者的核酸也可用作探針。
此外，本發(fā)明的核酸包含序列表中No.2序列的1-8511位堿基序列所示的堿基序列。該核酸來(lái)源于人的染色體5的NSD1，并與NSD1的一部分互補(bǔ)。具體而言，這是與包括NSD1的外顯子1-23的cDNA互補(bǔ)的核酸。本發(fā)明的核酸也包括其中堿基序列1-8511位的部分堿基序列缺失、置換或添加，并具有80％、優(yōu)選90％、更優(yōu)選95％堿基序列同源性的核酸。
另外，No.2序列所示堿基序列對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如下。該氨基酸序列如序列表的No.4序列所示。No.1序列所示的堿基序列的翻譯區(qū)，即對(duì)應(yīng)于NSD1第二外顯子的氨基酸序列如No.3序列所示。
根據(jù)本發(fā)明，該肽片段是(a)包含序列表中No.3序列1-309位氨基酸序列所示的氨基酸序列的肽片段，或者(b)其中No.3氨基酸序列所示的部分氨基酸序列缺失、置換或者添加，并具有80％、優(yōu)選90％、更優(yōu)選95％氨基酸序列同源性的肽片段。根據(jù)本發(fā)明，該肽片段也是(a)包含序列表中No.4序列1-2696位氨基酸序列所示的氨基酸序列的肽片段，或者(b)其中No.4氨基酸序列所示的部分氨基酸序列缺失、置換或者添加，并具有80％、優(yōu)選90％、更優(yōu)選95％氨基酸序列同源性的肽片段。該氨基酸序列可用于利用抗原抗體反應(yīng)的免疫學(xué)檢查。
關(guān)于上述核酸的純化和分離方法如下所述。無(wú)特別限制的情況下，上述核酸可通過(guò)以下方法純化并分離。該核酸包括NSD1的外顯子1和2，根據(jù)以下方法通過(guò)亞克隆名為RP1-118m12的PAC克隆而獲得。首先，純化PAC DNA。然后利用Midi-Prep柱(Qiagen，Chatsworth，CA)分離純化的PAC DNA，利用限制性內(nèi)切酶例如Sau3AI進(jìn)行部分消化。再根據(jù)廠家說(shuō)明書(shū)(Stratagene，La Jolla，CA)制備SuperCosl粘粒載體，并利用T4DNA連接酶與消化的PAC DNA連接。利用Gigapack IIIgold extract(Stratagene)包裝連接反應(yīng)產(chǎn)物，轉(zhuǎn)染至XL1-Blue MR宿主細(xì)胞。利用PCR，通過(guò)STS定位方法(STS content mapping)構(gòu)建基因組序列。從而獲得本發(fā)明的核酸。
此外，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何方法確定DNA的堿基序列。例如，可利用末端終止方法等確定堿基序列。
本發(fā)明探針的使用方法為，直接或利用PCR方法擴(kuò)增上述核酸，通過(guò)印跡固化到聚合物膜上，然后進(jìn)行雜交。按照常見(jiàn)方式雜交，不特別限于但可包括，例如Southern印跡方法、原位雜交方法、基于微陣列的方法以及堿基序列測(cè)定方法。從快速、準(zhǔn)確篩選的觀點(diǎn)來(lái)看，優(yōu)選原位雜交方法。原位雜交方法有熒光原位雜交方法(以下稱(chēng)作FISH方法)、放射性同位素原位雜交方法等。從無(wú)需RI設(shè)備的觀點(diǎn)來(lái)看，優(yōu)選FISH方法。FISH方法一般在玻片上制備染色體樣本，與標(biāo)記探針雜交，然后直接通過(guò)顯微鏡研究。
用于本發(fā)明探針雜交的支持介質(zhì)可為薄膜、粉末、微粒物質(zhì)、凝膠、小珠、纖維、玻璃、懸浮液、乳濁液等。其可填充到合適的柱子中使用。其中，優(yōu)選薄膜，例如硝酸纖維素膜或尼龍膜。
闡述用于本發(fā)明探針的標(biāo)記的例子?？梢岳帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)記。該標(biāo)記不特別限于但包括，例如放射性原子(如32P、35S等)、生物素基團(tuán)、親和素基團(tuán)、酶、熒光標(biāo)記等。就利用抗原-抗體系統(tǒng)而言，標(biāo)記可包含抗原，這也在本發(fā)明范圍內(nèi)。
本發(fā)明的核酸與正常染色體5的一部分互補(bǔ)結(jié)合。然而，如果染色體5異常，即缺失異常，本發(fā)明的核酸不與這種異常染色體5結(jié)合。如果利用上述特性將本發(fā)明的核酸用作探針，可以確定染色體5的異常。因此，本發(fā)明的探針還可用作索托斯綜合癥的診斷探針，60％的索托斯綜合癥患者具有染色體5的缺失。
本發(fā)明用于診斷索托斯綜合癥的探針，包含人染色體5上的下列(a)或(b)(a)包含序列表中No.5序列的1-190位堿基序列所示的堿基序列的核酸，或者(b)其中1-190位堿基序列的部分堿基序列缺失、置換或添加，并具有80％的堿基序列同源性的核酸。
本發(fā)明用于診斷索托斯綜合癥的探針，包含人染色體5上的下列(a)或(b)(a)包含序列表中No.6序列的1-275位堿基序列所示的堿基序列的核酸，或者(b)其中1-275位堿基序列的部分堿基序列缺失、置換或添加，并具有80％的堿基序列同源性的核酸。
本發(fā)明用于診斷索托斯綜合癥的探針，包含人染色體5上的下列(a)和(b)之間的任何序列(a)包含序列表中No.5序列的1-190位堿基序列所示的堿基序列的核酸，以及(b)其中序列表中No.6序列的1-275位堿基序列的部分堿基序列的核酸。
為此使用的這些探針取決于本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)，其中堿基序列發(fā)生缺失，其處于索托斯綜合癥患者染色體5上序列表中No.5和6序列之間。因此，序列5的堿基序列本身可用作探針，序列6的堿基序列本身可用作探針。此外，由于索托斯綜合癥患者沒(méi)有處于正常人上述序列5和6之間的序列，因此其中的任何序列都可用來(lái)診斷索托斯綜合癥。探針的堿基長(zhǎng)度取決于篩選方法，沒(méi)有特別限制，為5kb或5kb以上。特別地，優(yōu)選5-15kb，更優(yōu)選7-12kb。
雖然正常人存在上述序列5和6的序列，但是因?yàn)樗魍兴咕C合癥患者染色體的一個(gè)拷貝缺失，因此可以根據(jù)這些事實(shí)進(jìn)行基因診斷。
提供以下實(shí)施例闡述而非意在限制本發(fā)明。
以下實(shí)施例意在闡述本發(fā)明的實(shí)施方案，在不背離本發(fā)明權(quán)利要求書(shū)所要求的精神和范圍的情況下，當(dāng)然可能適當(dāng)?shù)馗淖儽景l(fā)明。
實(shí)施例1索托斯綜合癥(SS，OMIM 117550)，亦稱(chēng)大腦性巨人癥，是神經(jīng)性疾病，特征在于出生前-兒童期過(guò)度發(fā)育及骨齡超前、顱骨寬大的獨(dú)特面相、肢端肥大外形及下頜突出、偶然的腦異常及發(fā)作、以及智力遲鈍。
雖然大多數(shù)病例為單個(gè)發(fā)生的，但也已知該疾病有偶爾的親-子傳播。估計(jì)SS患者具有3.9％的良性/惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。首先，從de novot(5；8)(q35；q24.1)患者的5q35斷點(diǎn)通過(guò)定位克隆分離NSD1基因。該基因編碼2,696個(gè)氨基酸，具有SET、PHD指狀和PWWP結(jié)構(gòu)域，并與核受體(NRs)相互作用。在直接測(cè)序檢驗(yàn)的38名SS患者中，在NSD1檢測(cè)到4個(gè)de novo點(diǎn)突變(10.5％)，包括一個(gè)無(wú)義突變(1310C->A，S437X)、一個(gè)單堿基缺失(3536delA)、一個(gè)單堿基插入(5998insT)和一個(gè)拼接供體位點(diǎn)突變(6135+1G->A)。此外，在可以獲得其分裂中期和/或分裂間期細(xì)胞而供FISH研究的30名SS患者中，鑒定出涉及NSD1的20個(gè)亞顯微缺失(66.7％)。總體來(lái)說(shuō)，估計(jì)77％的SS患者具有NSD1突變。此結(jié)果表明，NSD1的單倍體不全性導(dǎo)致索托斯綜合癥，NSD1在人的生長(zhǎng)和大腦發(fā)育中具有重要作用。
接收了一名女孩(患者BP)，患有與de novo相互易位(46，XX，t(5；8)(q35；q24.1))有關(guān)的索托斯綜合癥(SS)。由于另一種易位[t(5；15)(q35；q24.1)]以及涉及5q35的缺失[del(5)(q35.1qter)]分別與SS或SS樣外形有關(guān)，5q35區(qū)可能帶有SS的基因座位。為此克隆了5q35斷點(diǎn)。首先關(guān)注FGFR4，因?yàn)槠涠ㄎ挥?q35-qter，已知其基因家族的突變與某些顱面及生長(zhǎng)異常有關(guān)。然后分離包括FGFR4的PAC克隆(RP1-251c21)，并通過(guò)FISH分析確認(rèn)其包括5q35斷點(diǎn)。此后構(gòu)建包括該斷點(diǎn)的基于BAC/PAC/粘粒的物理圖譜，以確認(rèn)該斷點(diǎn)附近的其它基因(圖1a)。FISH分析表明，RP1-118m12及其粘粒亞克隆(c2b，c4D，c6A和c6B)橫跨該斷點(diǎn)(圖1b)。通過(guò)物理圖譜內(nèi)的草圖(draft)/完整序列(AC027314為CTC-286c20，AC008570為CTC-549a4)鑒定另一個(gè)基因JAZ(Genbank登錄號(hào)XM 012279)。測(cè)序了12名患者的JAZ編碼區(qū)，但均未發(fā)現(xiàn)核苷酸的改變。利用對(duì)應(yīng)于c6B的部分基因組序列(AC02314)進(jìn)行BlastN檢索，鑒定小鼠Nsd1基因的同源序列。因?yàn)榫幋a核受體(NR)結(jié)合蛋白質(zhì)的Nsd1可能與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有關(guān)，其人類(lèi)直向同源物(Ortholog)NSD1成為引人注目的候選基因，并被分離。分離的NSD1具有8,088-bp開(kāi)放閱讀框架，由至少23個(gè)外顯子組成(Genbank登錄號(hào)AF395588)。
斷點(diǎn)位于NSD1之內(nèi)，因?yàn)槔胏6B的FISH分析，在患者的der(5)和der(8)染色體上都產(chǎn)生分裂信號(hào)，并且每個(gè)信號(hào)的強(qiáng)度幾乎相等(圖1a和b)。圖1a顯示物理圖譜，其中粗黑線表示BAC/PAC粘?？寺?，紅線和藍(lán)線分別表示利用FISH分析的包括5q35斷點(diǎn)的克隆，以及完整基因組序列。箭頭表示候選基因。圖1b顯示利用粘粒c6B對(duì)患者BP染色體的FISH分析，其中紅色和黃色箭頭分別表示正常染色體5以及衍生的染色體5和8的信號(hào)。設(shè)計(jì)40套引物，擴(kuò)增該基因的全部編碼區(qū)。通過(guò)直接測(cè)序，分析總共38名無(wú)關(guān)的正常SS患者的基因組DNA。
然后，在包括患者BP的39名患者中的4名患者中鑒定出四個(gè)不同的NSD1點(diǎn)突變(圖2，表1)。圖2顯示NSD1的基因組結(jié)構(gòu)以及在索托斯綜合癥患者中檢測(cè)的突變。特定區(qū)域以彩色框顯示，其中淡藍(lán)色為NR-相互作用結(jié)構(gòu)域(NID-L)，粉紅色為NR-相互作用結(jié)構(gòu)域(NID+L)，藍(lán)色為PHD指狀結(jié)構(gòu)域，綠色為PWWP結(jié)構(gòu)域，紅色為SET結(jié)構(gòu)域。突變包括外顯子5的一個(gè)無(wú)義突變(1310C->A，S437X)、外顯子5的一個(gè)單堿基缺失(3536delA)、外顯子19的一個(gè)單堿基插入(5998insT)以及內(nèi)含子20中拼接供體位點(diǎn)的一個(gè)堿基置換(6151+1G->A)。由于其確認(rèn)為父子關(guān)系的各自親代中沒(méi)有該變化，這四個(gè)突變均為de novo類(lèi)型。預(yù)測(cè)無(wú)義突變TCA(Ser)->TAA(終止)導(dǎo)致NSD1蛋白質(zhì)在437位氨基酸處截短(S437X)。缺失(3536delA)在nt 3651-3653處產(chǎn)生過(guò)早的終止密碼子，插入(5998insT)也在nt 6022-6024處產(chǎn)生過(guò)早的終止密碼子。預(yù)測(cè)拼接位點(diǎn)突變(6151+1G->A)跳過(guò)外顯子20，產(chǎn)生較短cDNA，導(dǎo)致只在外顯子19后增加9個(gè)氨基酸的截短蛋白質(zhì)。通過(guò)對(duì)患者的永生類(lèi)淋巴母細(xì)胞系進(jìn)行RT-PCR以及直接測(cè)序，確認(rèn)較短cDNA缺失外顯子20(圖3)。圖3a顯示RT-PCR分析結(jié)果，其中黑色和紅色箭頭分別表示正常的471-bp產(chǎn)物和異常的329-bp產(chǎn)物。此外，符號(hào)Pt為患者24，符號(hào)Wt為正常對(duì)照，符號(hào)+為使用逆轉(zhuǎn)錄酶，符號(hào)-為不使用逆轉(zhuǎn)錄酶。圖3b中，上面的線表示外顯子19、20和21，小紅圈表示拼接供體位點(diǎn)處的突變。329bp產(chǎn)物的序列分析表明跳過(guò)外顯子20，導(dǎo)致移框以及外顯子21的第10個(gè)密碼子處產(chǎn)生新的終止密碼子。盡管外顯子5或外顯子23中鑒定出其它5個(gè)堿基置換(3個(gè)同義和2個(gè)非同義改變)，其在正常對(duì)照中也常見(jiàn)，可能為多態(tài)性，即單核苷酸多態(tài)性(SNPs)(表1)。令人吃驚的是，39名患者中有29名在這5個(gè)SNP位點(diǎn)均顯示純合形式。這些資料有力提示，存在涉及NSD1的缺失，而12名正常對(duì)照個(gè)體的數(shù)據(jù)符合Hardy-Weinberg平衡。對(duì)于可得到其分裂中期和/或分裂間期細(xì)胞的30名患者，利用RP1-118m12為探針，F(xiàn)ISH分析檢測(cè)到其中20名(66.7％)有缺失(圖4)，其中紅色和黃色箭頭分別表示正常染色體5上的信號(hào)，而缺失染色體5上沒(méi)有信號(hào)。FISH分析連同點(diǎn)突變數(shù)據(jù)(4/38)提示，此組中77％的SS患者具有NSD1突變(表1)。鑒定的改變都是導(dǎo)致蛋白質(zhì)截短的缺失(半合子)或雜合突變。因此，很可能NSD1的單倍體不全性(haploinsufficency)是索托斯綜合癥的主要原因。
NSD1是雙功能核蛋白質(zhì)，充當(dāng)核受體輔阻遏物，并通過(guò)與NRs的配基-結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用而充當(dāng)共活化物。人SD1具有兩個(gè)不同的NR-相互作用結(jié)構(gòu)域(稱(chēng)為NID-L和NID+L)，以及其它保守的結(jié)構(gòu)域，例如SET(su(var)3-9，enhancer-of-zestem trutgirax)、PWWP(脯氨酸-色氨酸-脯氨酸)及PHD(植物同源結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì))的指狀結(jié)構(gòu)域。SS患者中觀察到的兩個(gè)蛋白質(zhì)截短(PT)突變(S437X和3536delA)，可能導(dǎo)致PHD-I、PHD-II、PWWP-II、SET以及PHD-II結(jié)構(gòu)域丟失。單堿基插入(5998insT)和拼接位點(diǎn)突變(6151+1G＞A)可能丟失SET和PHD-III結(jié)構(gòu)域(圖2)。這些發(fā)現(xiàn)提示，SS患者中涉及的蛋白質(zhì)截短的SET和PHD-III結(jié)構(gòu)域的微小缺失對(duì)該蛋白質(zhì)的功能極其重要。
PHD指狀結(jié)構(gòu)域可與其它蛋白質(zhì)相互作用，并與染色質(zhì)的調(diào)節(jié)有關(guān)。
最近，從與t(5；11)(q35；p15.5)有關(guān)的兒童急性骨髓性白血病(AML)分離出NSD1-來(lái)源的嵌合蛋白質(zhì)，其中NSD1在其內(nèi)含子5處融合NUP98。推測(cè)患者BP的染色體斷裂位于內(nèi)含子2。因此可以提示，兩種病癥之間的突變類(lèi)型不同，即組成型蛋白質(zhì)截短突變與形成融合基因的體細(xì)胞突變。
在核苷酸水平，NSD1與從Wolf-Hirschhorn綜合癥(WHS)的165-kc微小缺失區(qū)分離的WHSC1(NSD2)具有75％的同源性。WHS(OMIM 194190)的特征在于多種畸形、嚴(yán)重的生長(zhǎng)停滯、智力缺陷以及4p的半合子缺失(單倍體不全性)。此外，NSD2通過(guò)t(4；14)融合IgH基因時(shí)，導(dǎo)致一種多發(fā)性骨髓瘤?？赡軆煞N基因(NSD1和NSD2)對(duì)人的生長(zhǎng)、大腦發(fā)育以及細(xì)胞生長(zhǎng)都很重要。
由于在一個(gè)母親和兩個(gè)女兒、兩個(gè)兄弟以及三個(gè)親屬(單卵雙生女孩及其兄弟)中記述了SS，可以認(rèn)為SS是遺傳上異種的，因此假定為常染色體隱性遺傳。還記述了另一患者，為de novo t(3；6)(p21；p21)、mos dup(20)(p11.2-p12.1)[12/66]以及t(2；12)(q33.3；q15)mat。因此，提示另一SS位點(diǎn)帶有染色體斷點(diǎn)或裂片。
但是，上述數(shù)據(jù)表明大多數(shù)(多達(dá)77％)的SS患者具有NSD1突變。索托斯綜合癥NSD1缺陷的發(fā)現(xiàn)將促進(jìn)SS的診斷，并將明了對(duì)人智力遲鈍和生長(zhǎng)異常機(jī)制的理解。
物理圖譜構(gòu)建如前所述，利用STSs通過(guò)PCR篩選人PAC文庫(kù)RPCI-1，-3。從橫跨斷點(diǎn)的PAC制備粘粒亞克隆。利用Midi-PrepTM柱(Qiagen，Chatsworth，CA)分離純化的PAC DNA，利用Sau3AI進(jìn)行部分消化。根據(jù)廠家說(shuō)明書(shū)(Stratagene，La Jolla，CA)制備SuperCos1粘粒載體，并利用T4DNA連接酶與消化的PAC DNA連接。利用Gigapack III goldextract(Stratagene)包裝連接反應(yīng)產(chǎn)物，轉(zhuǎn)染至XL1-Blue MR宿主細(xì)胞(Stratagene)。參考草圖/完整的基因組序列，利用PCR借助于STS定位(STS content mapping)構(gòu)建重疊群(contig)。利用Midi-PrepTM柱提取BAC/PAC/粘粒DNA。利用BAC的T7/SP6引物或者粘粒的T7/T3引物從克隆-末端序列得到新的STSs。使用2μgBAC/PACDNA或者1μg粘粒DNA為模板以及40pmol引物，利用ABI PrismTMBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(PEApplied Biosystems，F(xiàn)oster，CA)進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。
通過(guò)96℃ 10秒、50℃ 5秒以及60℃ 4分鐘，50次循環(huán)，進(jìn)行測(cè)序循環(huán)。
FISH分析利用BAC/PAC/粘粒DNA，對(duì)SS患者和正常對(duì)照的分裂中期染色體和/或分裂間期細(xì)胞進(jìn)行FISH分析。利用SpectrumGreenTM-11-dUTP或SpectrumOrangeTM-11-dUTP(Vysis，Downers Grove，IL)通過(guò)切口平移標(biāo)記克隆的DNA，76℃變性10分鐘。將探針-雜交混合物(10μl)作用于染色體上，37℃溫育16小時(shí)，然后如前所述洗滌。利用配備帶單波長(zhǎng)激發(fā)濾光片的四片濾光器(a quad filter set)的ZeissAxioskop顯微鏡(84000，Chroma Technology Corp.，Brattleboro，VT)，進(jìn)行熒光顯微攝影。利用冷的CCD照相機(jī)(TEA/CCD-1317-G1，Princeton Instruments，Trenton，NJ)以及IPLab/MAC軟件(Scanalytics，Inc.，F(xiàn)airfax，VA)采集并合并圖像。
患者及親代樣本在得到通知同意后，從單一發(fā)生的索托斯綜合癥患者的外周血白細(xì)胞或類(lèi)淋巴母細(xì)胞系提取DNA。還從幾個(gè)病例的親代采集了樣本。除一名患者(日本-巴基斯坦人)以外，所有患者都是日本人出身。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)Ethical Committee for Gene Research of NagasakiUniversity School of Medicine批準(zhǔn)。
突變分析利用PCR擴(kuò)增包括編碼區(qū)的22個(gè)NSD1外顯子(外顯子2-23)。在包含1×PCR緩沖液(含1.5mM MgCl2)、0.2mM每種dNTP、1μM每種引物以及2.5U TaqGold聚合酶(PE Applied Biosystems)的50μl體積中進(jìn)行PCR，95℃ 30秒、50℃ 30秒、72℃ 1分鐘，循環(huán)35次。
利用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen，Chatsworth，CA)純化PCR產(chǎn)物，用BigDye Terminator化學(xué)法通過(guò)如前所述標(biāo)準(zhǔn)程序(PEApplied Biosystems)進(jìn)行雙鏈測(cè)序。
RT-PCR分析利用Trizol試劑(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)，從患者及正常對(duì)照建立的類(lèi)淋巴母細(xì)胞系制備總RNA。
利用隨機(jī)六聚體以及SuperscriptTMRT-PCR第一鏈合成系統(tǒng)(Gibco-BRL)，按照廠家規(guī)程進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用引物NSD1PT1F5’-ATTTGTGAATGAGTATGTGG-3’(nt 5898-5917)以及NSD1RT1R5’-CTAAAACACTCATCTTCTCG-3’(nt 6349-6368)，退火溫度48℃，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，利用PCR擴(kuò)增cDNA。PCR產(chǎn)物直接測(cè)序。
Genbank登錄號(hào)人NSD1，AF395588；NSD2，XM 055926；FGFR4，XM 030308；JAZ，XM 012279；小鼠Nsd1，NM 008739；BAC克隆CTC-286c20，AC027314，CTC-549a4，AC008570。
表1索托斯綜合癥患者中鑒定的NSD1突變以及NSD1的SNPs
SNP，單核苷酸多態(tài)性；*，由FISH數(shù)據(jù)估計(jì)實(shí)施例2接下來(lái)，利用包含序列表的序列5和6的探針，檢測(cè)受試者是否為索托斯綜合癥患者。利用與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行FISH分析。
具體地，利用RPCI-11 147K7和RPCI-11 1006E8進(jìn)行FISH分析。可以容易地從基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得RPCI-11 147K7和RPCI-11 1006E8。
其結(jié)果為，60％的索托斯綜合癥患者中確認(rèn)有缺失。因此，人們發(fā)現(xiàn)利用此探針可以進(jìn)行基因診斷。
最后，可按類(lèi)似方法，可以類(lèi)似的方式利用FISH分析確診患者是否患有索托斯綜合癥，其中將本發(fā)明有關(guān)NSD1區(qū)的核酸用作探針。
本發(fā)明的核酸和利用該核酸的探針具有有利作用，可用于基因診斷和基因治療。
特別地，根據(jù)本發(fā)明利用熒光原位雜交，不使用RI設(shè)備，操作程序簡(jiǎn)單，更為出色的一點(diǎn)是短時(shí)間(2天)內(nèi)在染色體帶上精確進(jìn)行詳細(xì)定位，故也可用于快速、安全的基因診斷。
序列表<110>head of university of nagasaki<120>核酸、包含該核酸的探針以及利用該探針的篩選方法<130>U2001P165<160>4<210>1<211>39726<212>核酸<213>人類(lèi)染色體<400>1tttgatgatg ggttctgcct ttgccatttc agacacattt tctataaatc aagctagctg 60aatctacagc tctggagggt tttttttttt ttttttttga gacagaatct cgctctgtca 120cccaggctgg agtgcactga tgtgatcttg ggtcactgca acctctgcct cccggcttca 180agagattctc ctacctaagc ctgccaagta gctgggatta caggcgtgca ccaccacgct 240cagctaattt ttgtagtttt agtagagagg ggatttcgcc atattggcca ggctggtttc 300aaactcctga cctcaagtga tctgcccacc tcggcctccc aaagtgctgg gattacaggc 360gtgagccacc agacctggcc tctgggtttt tttttttttt tttgagacag agccttacta 420tgtcacccag gctggagtgc agtggcgcga tctcagctca ctgcaacctc cgcctcccgg 480gttcaagcga ttcttctgtc tcagcctccc gagtagctgg gactacaggt gcccgccacc 540acgcccagct aatttttgta tttttagtag agacagggtt tcaccgtgtt agccgggatg 600gtcttgatct cctgaccttg tgatctgccc gctttggcct cccaaagtgc tgggattaca 660ggcgtgagcc accgtgtccg gccaacgccc agctaatttt ttgtagagat gaggtttcgt 720tgcccagtct ggtcttcaac tcctgccctc cagtgatcca 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CAATGAATGT CGCACAGGAA TCCATACCTG TTTTGTATGT AAGCAGAGTG 4920GGGAAGATGT TAAAAGGTGC CTTCTACCCT TGTGTGGAAA GTTTTACCAT GAAGAGTGTG 4980TCCAGAAGTA CCCACCCACT GTTATGCAGA ACAAGGGCTT CCGGTGCTCC CTCCACATCT 5040GTATAACCTG TCATGCTGCT AATCCAGCCA ATGTTTCTGC ATCTAAAGGT CGGCTGATGC 5100GCTGTGTCCG CTGTCCTGTG GCATACCACG CCAATGACTT TTGCCTGGCT GCTGGGTCAA 5160AGATCCTTGC ATCTAATAGT ATCATCTGCC CTAATCACTT TACCCCTAGG CGGGGCTGCC 5220GAAATCATGA GCATGTTAAT GTTAGCTGGT GCTTTGTGTG CTCAGAAGGA GGCAGCCTTC 5280TGTGCTGTGA TTCTTGCCCT GCTGCTTTTC ATCGTGAATG CCTGAACATT GATATCCCTG 5340AAGGAAACTG GTATTGCAAC GACTGTAAAG CAGGCAAAAA GCCACACTAC AGGGAGATTG 5400TCTGGGTAAA AGTTGGACGA TACAGGTGGT GGCCAGCTGA GATCTGCCAT CCTCGAGCTG 5460TTCCTTCCAA CATTGATAAG ATGAGACATG ATGTGGGAGA GTTCCCAGTC CTCTTTTTTG 5520GATCTAATGA CTATTTGTGG ACTCACCAAG CCCGAGTCTT CCCTTACATG GAGGGTGACG 5580TGAGCAGCAA GGATAAGATG GGCAAAGGAG TGGATGGGAC ATATAAAAAA GCTCTTCAGG 5640AAGCTGCAGC AAGGTTTGAG GAATTAAAGG CCCAAAAAGA GCTAAGACAG CTGCAGGAAG 5700ACCGAAAGAA TGACAAGAAG CCACCACCTT ATAAACATAT AAAGGTAAAC CGTCCTATTG 5760GCAGGGTACA GATCTTCACT GCAGACTTAT CTGAAATACC CCGTTGCAAC TGTAAAGCTA 5820CTGATGAGAA CCCCTGTGGG ATAGACTCTG AATGCATCAA CCGCATGCTG CTCTATGAGT 5880GCCACCCCAC AGTGTGTCCT GCCGGAGGGC GCTGTCAAAA CCAGTGCTTT TCCAAGCGCC 5940AATATCCAGA GGTTGAAATT TTCCGCACAT TACAGCGGGG TTGGGGTCTA CGGACAAAAA 6000CAGATATTAA AAAGGGTGAA TTTGTGAATG AGTATGTGGG TGAGCTTATA GATGAAGAAG 6060AATGCAGAGC TCGAATTCGC TATGCTCAAG AACATGATAT CACTAATTTC TATATGCTCA 6120CCCTAGACAA AGACCGAATC ATTGATGCTG GTCCCAAAGG AAACTATGCT CGGTTCATGA 6180ATCATTGCTG CCAGCCCAAC TGTGAAACAC AGAAGTGGTC TGTGAATGGA GATACCCGTG 6240TAGGCCTTTT TGCACTAAGT GACATTAAAG CAGGCACTGA ACTTACCTTC AACTACAACC 6300TAGAATGTCT TGGGAATGGA AAGACTGTTT GCAAATGTGG AGCCCCGAAC TGCAGTGGCT 6360TCTTGGGTGT AAGGCCAAAG AATCAACCCA TTGCCACGGA AGAAAAGTCA AAGAAATTCA 6420AGAAGAAGCA ACAGGGAAAG CGCAGGACCC AGGGTGAAAT CACAAAGGAG CGAGAAGATG 6480AGTGTTTTAG TTGTGGGGAT GCTGGCCAGC TCGTCTCCTG CAAGAAACCA GGCTGCCCAA 6540AAGTTTACCA CGCAGACTGT CTCAATCTGA CCAAGCGACC AGCAGGGAAA TGGGAATGTC 6600CGTGGCATCA GTGTGACATC TGCGGGAAGG AAGCAGCCTC CTTCTGTGAG ATGTGCCCCA 6660GCTCCTTTTG TAAGCAGCAT CGAGAAGGGA TGCTTTTCAT TTCCAAACTG GATGGGCGTC 6720TGTCTTGTAC TGAGCATGAC CCCTGTGGGC CCAATCCTCT GGAACCTGGG GAGATCCGTG 6780AGTATGTGCC TCCCCCAGTA CCGCTGCCTC CAGGGCCAAG CACTCACCTG GCAGAGCAAT 6840CAACAGGAAT GGCTGCTCAG GCACCCAAAA TGTCAGATAA ACCTCCTGCT GACACCAACC 6900AGATGCTGTC GCTCTCCAAA AAAGCTCTGG CAGGGACTTG TCAGAGGCCA CTGCTACCTG 6960AAAGACCTCT TGAGAGAACT GACTCCAGGC CCCAGCCTTT AGATAAGGTC AGAGACCTCG 7020CTGGGTCAGG GACCAAATCC CAATCCTTGG TTTCCAGCCA GAGGCCACTG GACAGGCCAC 7080CAGCAGTGGC AGGACCAAGA CCCCAGCTAA GCGACAAACC CTCTCCAGTG ACCAGCCCAA 7140GCTCCTCACC CTCAGTCAGG TCCCAACCAC TGGAAAGACC TCTGGGGACG GCTGACCCAA 7200GGCTGGATAA ATCCATAGGT GCTGCCAGCC CAAGGCCCCA GTCACTGGAG AAAACCTCAG 7260TTCCCACTGG CCTGAGACTT CCGCCGCCAG ACAGACTGCT CATTACTAGC AGTCCCAAAC 7320CCCAGACTTC AGACAGGCCT ACTGACAAAC CCCATGCCTC TTTGTCCCAG AGACTCCCAC 7380CTCCTGAGAA AGTACTATCA GCTGTGGTCC AGACCCTTGT AGCTAAAGAA AAAGCACTGA 7440GGCCTGTGGA CCAGAATACT CAGTCAAAAA ATAGAGCTGC TTTGGTGATG GATCTCATAG 7500ACCTAACTCC TCGCCAGAAG GAGCGGGCAG CTTCACCTCA TCAGGTCACA CCACAGGCTG 7560ATGAGAAGAT GCCAGTGTTG GAGTCAAGTT CATGGCCTGC CAGCAAAGGT CTGGGGCATA 7620TGCCGAGAGC TGTTGAGAAA GGCTGTGTGT CAGATCCTCT TCAGACATCT GGGAAAGCAG 7680CAGCCCCTTC AGAGGACCCC TGGCAAGCTG TTAAATCACT CACCCAGGCC AGACTTCTTT 7740CTCAGCCTCC TGCCAAGGCC TTTTTATATG AGCCAACAAC TCAGGCCTCA GGAAGAGCTT 7800CTGCAGGGGC TGAGCAGACC CCAGGGCCTC TTAGCCAATC CCCGGGCCTG GTGAAGCAGG 7860CGAAGCAGAT GGTCGGAGGC CAGCAACTAC CTGCACTTGC CGCCAAGAGT GGGCAATCTT 7920TTAGGTCTCT CGGGAAGGCC CCAGCCTCCC TCCCCACTGA AGAAAAGAAG TTGGTAACCA 7980CAGAGCAAAG TCCCTGGGCC CTGGGAAAAG CCTCATCACG GGCAGGGCTC TGGCCCATAG 8040TGGCTGGACA GACACTGGCA CAGTCTTGCT GGTCTGCTGG GAGCACACAG ACATTGGCAC 8100AGACTTGCTG GTCTCTTGGA AGAGGGCAAG ACCCCAAACC AGAGCAAAAT ACACTTCCAG 8160CTCTTAACCA GGCTCCTTCC AGTCACAAGT GTGCAGAATC AGAACAGAAG TAGTACCAAT 8220CAATGTCACA TGAACAAACA AGCTGCCCCC AGGGTACCAT TTGGGGAGGG GAAATCTTTT 8280CTTTCTTTCC CCCTTAAAAA AAAACACATC TGCCCCGAAC ACTTTCCCAC TGTTATTCTT 8340TCCTCATATC CCAACACTCA GAACTCTTGT GACATTAGCC AGTGGGGGCT TATGGTTGTG 8400TGAACCATGT ATGAAAATCC AGTGGGCCCC AACCAAGGAG ACAGACAGAC TTGGGTCTCT 8460TTCCCCCAAC TTTTCCACAT GGTCATCGTG AAATAAAAAG TCCACTCTGG A8511<210>3<211>309<212>氨基酸序列<213>人類(lèi)染色體<400>3MDQTCELPRR NCLLPFSNPV NLDAPEDKDS PFGNGQSNFS EPLNGCTMQL STVSGTSQNA 60YGQDSPSCYI PLRRLQDLAS MINVEYLNGS ADGSESFQDP EKSDSRAQTP IVCTSLSPGG 120PTALAMKQEP SCNNSPELQV KVTKTIKNGF LHFENFTCVD DADVDSEMDP EQPVTEDESI 180EEIFEETQTN ATCNYETKSE NGVKVAMGSE QDSTPESRHG AVKSPFLPLA PQTETQKNKQ 240RNEVDGSNEK AALLPAPFSL GDTNITIEEQ LNSINLSFQD DPDSSTSTLG NMLELPGTSS 300SSTSQELPF 309<210>4<211>2696<212>氨基酸序列<213>人類(lèi)染色體<400>4MDQTCELPRR NCLLPFSNPV NLDAPEDKDS PFGNGQSNFS EPLNGCTMQL STVSGTSQNA 60YGQDSPSCYI PLRRLQDLAS MINVEYLNGS ADGSESFQDP EKSDSRAQTP IVCTSLSPGG 120PTALAMKQEP SCNNSPELQV KVTKTIKNGF LHFENFTCVD DADVDSEMDP EQPVTEDESI 180EEIFEETQTN ATCNYETKSE NGVKVAMGSE QDSTPESRHG AVKSPFLPLA PQTETQKNKQ 240RNEVDGSNEK AALLPAPFSL GDTNITIEEQ LNSINLSFQD DPDSSTSTLG NMLELPGTSS 300SSTSQELPFC QPKKKSTPLK YEVGDLIWAK FKRRPWWPCR ICSDPLINTH SKMKVSNRRP 360YRQYYVEAFG DPSERAWVAG KAIVMFEGRH QFEELPVLRR RGKQKEKGYR HKVPQKILSK 420WEASVGLAEQ YDVPKGSKNR KCIPGSIKLD SEEDMPFEDC TNDPESEHDL LLNGCLKSLA 480FDSEHSADEK EKPCAKSRAR KSSDNPKRTS VKKGHIQFEA HKDERRGKIP ENLGLNFISG 540DISDTQASNE LSRIANSLTG SNTAPGSFLF SSCGKNTAKK EFETSNGDSL LGLPEGALIS 600KCSREKNKPQ RSLVCGSKVK LCYIGAGDEE KRSDSISICT TSDDGSSDLD PIEHSSESDN 660SVLEIPDAFD RTENMLSMQK NEKIKYSRFA ATNTRVKAKQ KPLISNSHTD HLMGCTKSAE 720PGTETSQVNL SDLKASTLVH KPQSDFTNDA LSPKFNLSSS ISSENSLIKG GAANQALLHS 780KSKQPKFRSI KCKHKENPVM AEPPVINEEC SLKCCSSDTK GSPLASISKS GKVDGLKLLN 840NMHEKTRDSS DIETAVVKHV LSELKELSYR SLGEDVSDSG TSKPSKPLLF SSASSQNHIP 900IEPDYKFSTL LMMLKDMHDS KTKEQRLMTA QNLVSYRSPG RGDCSTNSPV GVSKVLVSGG 960STHNSEKKGD GTQNSANPSP SGGDSALSGE LSASLPGLLS DKRDLPASGK SRSDCVTRRN 1020CGRSKPSSKL RDAFSAQMVK NTVNRKALKT ERKRKLNQLP SVTLDAVLQG DRERGGSLRG 1080GAEDPSKEDP LQIMGHLTSE DGDHFSDVHF DSKVKQSDPG KISEKGLSFE NGKGPELDSV 1140MNSENDELNG VNQVVPKKRW QRLNQRRTKP RKRMNRFKEK ENSECAFRVL LPSDPVQEGR 1200DEFPEHRTPS ASILEEPLTE QNHADCLDSA GPRLNVCDKS SASIGDMEKE PGIPSLTPQA 1260ELPEPAVRSE KKRLRKPSKW LLEYTEEYDQ IFAPKKKQKK VQEQVHKVSS RCEEESLLAR 1320GRSSAQNKQV DENSLISTKE EPPVLEREAP FLEGPLAQSE LGGGHAELPQ LTLSVPVAPE 1380VSPRPALESE ELLVKTPGNY ESKRQRKPTK KLLESNDLDP GFMPKKGDLG LSKKCYEAGH 1440LENGITESCA TSYSKDFGGG TTKIFDKPRK RKRQRHAAAK MQCKKVKNDD SSKEIPGSEG 1500ELMPHRTATS PKETVEEGVE HDPGMPASKK MQGERGGGAA LKENVCQNCE KLGELLLCEA 1560QCCGAFHLEC LGLTEMPRGK FICNECRTGI HTCFVCKQSG EDVKRCLLPL CGKFYHEECV 1620QKYPPTVMQN KGFRCSLHIC ITCHAANPAN VSASKGRLMR CVRCPVAYHA NDFCLAAGSK 1680ILASNSIICP NHFTPRRGCR NHEHVNVSWC FVCSEGGSLL CCDSCPAAFH RECLNIDIPE 1740GNWYCNDCKA GKKPHYREIV WVKVGRYRWW PAEICHPRAV PSNIDKMRHD VGEFPVLFFG 1800SNDYLWTHQA RVFPYMEGDV SSKDKMGKGV DGTYKKALQE AAARFEELKA QKELRQLQED 1860RKNDKKPPPY KHIKVNRPIG RVQIFTADLS EIPRCNCKAT DENPCGIDSE CINRMLLYEC 1920HPTVCPAGGR CQNQCFSKRQ YPEVEIFRTL QRGWGLRTKT DIKKGEFVNE YVGELIDEEE 1980CRARIRYAQE HDITNFYMLT LDKDRIIDAG PKGNYARFMN HCCQPNCETQ KWSVNGDTRV 2040GLFALSDIKA GTELTFNYNL ECLGNGKTVC KCGAPNCSGF LGVRPKNQPI ATEEKSKKFK 2100KKQQGKRRTQ GEITKEREDE CFSCGDAGQL VSCKKPGCPK VYHADCLNLT KRPAGKWECP 2160WHQCDICGKE AASFCEMCPS SFCKQHREGM LFISKLDGRL SCTEHDPCGP NPLEPGEIRE 2220YVPPPVPLPP GPSTHLAEQS TGMAAQAPKM SDKPPADTNQ MLSLSKKALA GTCQRPLLPE 2280RPLERTDSRP QPLDKVRDLA GSGTKSQSLV SSQRPLDRPP AVAGPRPQLS DKPSPVTSPS 2340SSPSVRSQPL ERPLGTADPR LDKSIGAASP RPQSLEKTSV PTGLRLPPPD RLLITSSPKP 2400QTSDRPTDKP HASLSQRLPP PEKVLSAVVQ TLVAKEKALR PVDQNTQSKN RAALVMDLID 2460LTPRQKERAA SPHQVTPQAD EKMPVLESSS WPASKGLGHM PRAVEKGCVS DPLQTSGKAA 2520APSEDPWQAV KSLTQARLLS QPPAKAFLYE PTTQASGRAS AGAEQTPGPL SQSPGLVKQA 2580KQMVGGQQLP ALAAKSGQSF RSLGKAPASL PTEEKKLVTT EQSPWALGKA SSRAGLWPIV 2640AGQTLAQSCW SAGSTQTLAQ TCWSLGRGQD PKPEQNTLPA LNQAPSSHKC AESEQK 2696<210>5<211>190<212>核酸<213>人類(lèi)染色體<400>5gtcacattag ctaggacttc cagtacaatg ctgaaaagga gtagtgagga gacatccttg 60ccttatccct gatcttagta ggaatgcttc aagtttttca ccattaggta tgatattagt 120ggcaggtttt ttgtagatgt tctttctgaa gttgaggaag ttcccctcta ttcctagttt 180gctggaaggc 190<210>6<211>275<212>核酸<213>人類(lèi)染色體<400>6Actttttgaa agtttcattt aggtgctatc atttaaaaaa tcagaagata tcacttaaga 60atccagcatt ctagtttctt tcgaaaaatc agaagatctg gcaacactag gcccacattc 120cggcatggca acaaccagct agagcggtgc tggctgttcc ccctctgtgg ggcttgtgct 180ctggtttctg aagtcctaac cctcaccagg cccaactgcc acctacgcca gctgcatggc 240ccctacactg tgtctctgca cgaggcagcc ccaat 27權(quán)利要求
1.包含以下(a)或(b)的核酸(a)包含序列表中No.1序列的1-39726位堿基序列所示的堿基序列的核酸，或者(b)其中1-39726位堿基序列的部分堿基序列缺失、置換或添加，并具有80％的堿基序列同源性的核酸。
2.包含以下(a)或(b)的核酸(a)包含序列表中No.2序列的1-8511位堿基序列所示的堿基序列的核酸，或者(b)其中1-8511位堿基序列的部分堿基序列缺失、置換或添加，并具有80％的堿基序列同源性的核酸。
3.包含權(quán)利要求1或2所要求的核酸的探針。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的探針，其中該探針用于診斷索托斯綜合癥。
5.包含以下(a)或(b)的肽片段(a)包含序列表中No.3序列的1-309位氨基酸序列所示的氨基酸序列的肽片段，或者(b)其中No.3序列所示的部分氨基酸序列缺失、置換或添加，并具有80％的堿基序列同源性的肽片段。
6.包含以下(a)或(b)的肽片段(a)包含序列表中No.4序列的1-2696位氨基酸序列所示的氨基酸序列的肽片段，或者(b)其中No.4序列所示的部分氨基酸序列缺失、置換或添加，并具有80％的堿基序列同源性的肽片段。
7.包含權(quán)利要求5或6所要求的肽片段的探針。
8.用于診斷索托斯綜合癥的探針，其中該探針包含人染色體5上的下列(a)或(b)(a)包含序列表中No.5序列的1-190位堿基序列所示的堿基序列的核酸，或者(b)其中1-190位堿基序列的部分堿基序列缺失、置換或添加，并具有80％的堿基序列同源性的核酸。
9.用于診斷索托斯綜合癥的探針，其中該探針包含人染色體5上的下列(a)或(b)(a)包含序列表中No.6序列的1-275位堿基序列所示的堿基序列的核酸，或者(b)其中1-275位堿基序列的部分堿基序列缺失、置換或添加，并具有80％的堿基序列同源性的核酸。
10.用于診斷索托斯綜合癥的探針，其中該探針包含人染色體5上處于下列(a)和(b)之間的任何序列(a)包含序列表中No.5序列的1-190位堿基序列所示的堿基序列的核酸，以及(b)其中序列表中No.6序列的1-275位堿基序列的部分堿基序列的核酸。
11.篩選方法，其特征在于利用權(quán)利要求3、4和7-10中任何一項(xiàng)所要求的探針。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中利用至少一種選自原位雜交方法、Southern印跡方法以及堿基序列測(cè)定方法中的方法進(jìn)行篩選。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中原位雜交方法為熒光原位雜交方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及核酸，其為(a)包含序列表中No.1序列的1－39726位堿基序列所示的堿基序列的核酸，或者(b)其中1－39726位堿基序列的部分堿基序列缺失、置換或者添加，并具有80％堿基序列同源性的核酸。此外，本發(fā)明還涉及包含上述核酸的探針，以及利用該探針進(jìn)行的篩選。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1428346SQ0215719
公開(kāi)日2003年7月9日 申請(qǐng)日期2002年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月19日
發(fā)明者松本直通, 新川詔夫 申請(qǐng)人:長(zhǎng)崎大學(xué)