專利名稱：一種d-核糖發(fā)酵過程的調(diào)控方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種D-核糖發(fā)酵過程的調(diào)控方法。
背景技術(shù)：
D-核糖的制備方法包括從天然物質(zhì)中提取分離、化學(xué)合成和微生物發(fā)酵等方法。從天然物中提取分離D-核糖，提取過程繁雜、制造成本高，不適合規(guī)模化生產(chǎn)。就合成法而言，人們先后嘗試了從D-阿拉伯糖(Gehrke and Aichner，1927)、D-葡萄糖酸(Steiger，1936)、D-葡萄糖(Korczynski A et al.1979)、L-谷氨酸和D-木糖(Lacourt Gadras，et al.1992)合成D-核糖，20世紀(jì)八十年代以前，國內(nèi)外主要采用由葡萄糖化學(xué)合成法進(jìn)行D-核糖的工業(yè)化生產(chǎn)，即由葡萄糖經(jīng)氧化、置換、轉(zhuǎn)化、再置換、酸化、內(nèi)酯化、還原等七步反應(yīng)制得D-核糖，該法不僅步驟復(fù)雜、所用設(shè)備多、收率低、制造成本高，而且其所涉及的貢電極還原反應(yīng)還會造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。進(jìn)入20世紀(jì)九十年代后，人們開始使用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)D-核糖，發(fā)酵法在常溫常壓下進(jìn)行，原材料來源廣泛，又避免了化學(xué)合成法的環(huán)境污染，被稱為生產(chǎn)D-核糖的最佳方法，也是具有很大的工業(yè)化生產(chǎn)潛力的方法。
發(fā)酵法生產(chǎn)過程是一個(gè)非常復(fù)雜的化學(xué)變化和生理變化綜合過程，提高發(fā)酵水平有兩條途徑，一是篩選出優(yōu)良的菌種，二是得出與目的菌株相匹配的最佳培養(yǎng)條件、控制手段。前者是建立在代謝控制發(fā)酵研究上的菌種選育技術(shù)，后者是建立在生化反應(yīng)工程基礎(chǔ)上的發(fā)酵控制技術(shù)。只有兩者緊密地結(jié)合才能最終實(shí)現(xiàn)高水平的發(fā)酵生產(chǎn)。
長期以來，人們較多地將工作重點(diǎn)放在高產(chǎn)菌株的選育上，有關(guān)發(fā)酵過程進(jìn)行優(yōu)化與控制的研究較少。實(shí)際生產(chǎn)中所需的一些培養(yǎng)控制條件、技術(shù)指標(biāo)往往在搖瓶條件下獲得，這種低水平的研究方法客觀上制約了菌種潛力的進(jìn)一步發(fā)揮。不僅如此，由于在搖瓶條件下無法對目的微生物生理生化特性、營養(yǎng)供給及操作、發(fā)酵設(shè)備三方面之間建立起有機(jī)的聯(lián)系，當(dāng)反應(yīng)器規(guī)模發(fā)生變化時(shí)，發(fā)酵結(jié)果常常不能重復(fù)。而這一點(diǎn)也正是有些發(fā)酵產(chǎn)品隨著生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大(從搖瓶到中試至大生產(chǎn))過程發(fā)酵水平降低的根本所在。
對發(fā)酵過程進(jìn)行優(yōu)化控制的目的，是同時(shí)獲得最高的產(chǎn)物濃度、最高的生產(chǎn)強(qiáng)度(通常為每立升發(fā)酵液每小時(shí)轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的量，常以g/L·h為單位)和最高的轉(zhuǎn)化率。而當(dāng)試圖用分批發(fā)酵獲得更高的產(chǎn)物濃度時(shí)，必然意味著轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強(qiáng)度的進(jìn)一步下降。近年來發(fā)酵行業(yè)中關(guān)于發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化控制和流加發(fā)酵最優(yōu)化的研究，為提高分批發(fā)酵的生產(chǎn)水平提供了可能的途徑。在一定的初糖濃度下發(fā)酵，在發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化控制條件下，通過流加方式提高總糖濃度，并維持發(fā)酵過程的糖濃度于合適的水平，就有可能同時(shí)獲得高的轉(zhuǎn)化率、高的生產(chǎn)強(qiáng)度和高的產(chǎn)物濃度。
對D-核糖發(fā)酵而言，多年來人們的目光多集中在優(yōu)良菌株的篩選、培養(yǎng)基配方的改進(jìn)等方面，對于需要通過氧化磷酸化途徑才能形成的D-核糖發(fā)酵顯得尤其重要的發(fā)酵參數(shù)(如溶氧、通氣量與pH值、罐壓及攪拌轉(zhuǎn)速)的綜合控制，在以往的文獻(xiàn)中只是很模糊地提及，或只是對其中的某個(gè)參數(shù)進(jìn)行報(bào)道。如發(fā)酵過程中pH的控制，多為只控制發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH值或只提及某個(gè)最佳pH值(Asain and Kono 1984；Asain et al1978；Sasajima and Yoneda 1989)，而對整個(gè)發(fā)酵過程的pH控制，未見論述；又如闡述了在發(fā)酵過程中控制高溶氧水平有利于D-核糖的積累，但并未揭示出發(fā)酵各階段對氧的需求(P.De Wulf E.J.Vandamme，J ApplMicrobiol 1997)；現(xiàn)有核糖高產(chǎn)菌株的發(fā)酵周期比較長，一般在60～90小時(shí)，有的甚至超過了100小時(shí)(P.De Wulf E.J.Vandamme，ApplMicrobiol Biotechmol 1997，48141～148)，見表一。盡管有些菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中積累的D-核糖含量高達(dá)90g/L以上，由于對發(fā)酵過程沒有有效的控制，多數(shù)發(fā)酵周期長達(dá)72小時(shí)以上，甚至144小時(shí)(見表1)，其生產(chǎn)強(qiáng)度不能令人滿意。
表一不同菌株的核糖發(fā)酵周期
目前D-核糖發(fā)酵生產(chǎn)法中，多采用的微生物為芽孢桿菌屬的菌株，其中以使用枯草芽孢桿菌屬和短小芽孢桿菌屬的菌株居多。而關(guān)于這些菌株D-核糖發(fā)酵過程的優(yōu)化控制尚未出現(xiàn)成熟的方法。
D-核糖發(fā)酵是一門年輕的學(xué)科，對其發(fā)酵過程進(jìn)行優(yōu)化控制研究，確定其最佳的優(yōu)化控制條件，是發(fā)酵工業(yè)實(shí)現(xiàn)高效穩(wěn)定生產(chǎn)的前提。

發(fā)明內(nèi)容要解決的問題本發(fā)明的目的是提供一種利用芽孢桿菌屬微生物所進(jìn)行的D-核糖發(fā)酵過程的有效調(diào)控方法。
技術(shù)方案影響D-核糖發(fā)酵的因素可分為兩類一類是發(fā)酵過程的環(huán)境參數(shù)，如溫度、罐壓、攪拌轉(zhuǎn)速、pH值、溶氧等，另一類是關(guān)鍵變量，如菌體生長量、底物消耗速率、產(chǎn)物形成速率等。
本發(fā)明采用先進(jìn)的發(fā)酵過程集散控制系統(tǒng)-FPC型集散控制系統(tǒng)(DCS)，對第一類環(huán)境參數(shù)進(jìn)行在線控制和監(jiān)測，并結(jié)合定時(shí)取樣測定發(fā)酵過程第二類關(guān)鍵變量的方式，對核糖發(fā)酵過程的控制進(jìn)行系統(tǒng)研究，確定核糖發(fā)酵不同階段各個(gè)參數(shù)的最佳控制條件，在此基礎(chǔ)上對流加補(bǔ)糖的控制條件進(jìn)行了探索，確定了一種以溶氧、pH值控制為主線，綜合控制發(fā)酵過程中各種參數(shù)、并適時(shí)流加補(bǔ)糖的有效調(diào)控方法。
更具體地說，本發(fā)明的D-核糖發(fā)酵過程的調(diào)控方法具有以下特征以發(fā)酵過程集散控制系統(tǒng)-FPC型集散控制系統(tǒng)(DCS)在線控制D-核糖發(fā)酵的培養(yǎng)溫度、攪拌轉(zhuǎn)速、罐壓以及發(fā)酵不同階段的pH值、溶氧量，并定時(shí)取樣測定發(fā)酵過程中菌體細(xì)胞濃度、底物濃度以及產(chǎn)物生成量，在糖濃度低于臨界值時(shí)流加補(bǔ)糖，保持發(fā)酵過程始終處于最佳狀態(tài)。
該方法是一種以控制溶氧、pH值為主線，以控制菌體生長量、底物消耗速率及產(chǎn)物生成速率等關(guān)鍵變量為主要內(nèi)容，并適時(shí)流加補(bǔ)糖的發(fā)酵控制方法。
該方法通過使用發(fā)酵過程集散控制系統(tǒng)-FPC型集散控制系統(tǒng)(DCS)在線綜合控制溶氧、pH值以及發(fā)酵過程中其它參數(shù)(如培養(yǎng)溫度、罐壓、攪拌轉(zhuǎn)速)，確定并保持最佳發(fā)酵條件；通過測定菌體細(xì)胞濃度、底物濃度以及產(chǎn)物生成量，取得發(fā)酵過程中菌體生長速率、底物消耗速率和產(chǎn)物生成速率等關(guān)鍵變量的變化規(guī)律，并結(jié)合不同初糖濃度發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果，確定最佳發(fā)酵初糖濃度、流加補(bǔ)糖時(shí)機(jī)和補(bǔ)糖方式。在此基礎(chǔ)上，以最佳發(fā)酵條件，最佳發(fā)酵初糖濃度進(jìn)行發(fā)酵，并在發(fā)酵過程中適時(shí)補(bǔ)糖(葡萄糖)，由此完成優(yōu)化控制的核糖發(fā)酵過程。
以上所說的發(fā)酵過程包括使用各種微生物發(fā)酵制備D-核糖的過程，其中優(yōu)選的是使用芽孢桿菌屬菌株的發(fā)酵制備D-核糖的過程。
在上述方法中，其中所說的發(fā)酵過程中的培養(yǎng)溫度在36～38℃范圍內(nèi)，罐壓在0.5～0.8kg/cm2范圍內(nèi)，攪拌轉(zhuǎn)速在180～220轉(zhuǎn)/分范圍內(nèi)。
在上述方法中，其中所說的發(fā)酵不同階段的最佳pH值范圍分別為發(fā)酵前期(0～18小時(shí))6.50～7.0；發(fā)酵中后期(18小時(shí)以后)6.00～6.50。
在上述方法中，其中所說的發(fā)酵不同階段的最佳溶氧范圍分別為發(fā)酵前期(0～18小時(shí))18～30％；發(fā)酵中后期(18小時(shí)以后)20～35％。
在上述方法中，其中所說的糖濃度的臨界值為2.5％，流加補(bǔ)糖的方式是以100-130升/小時(shí)的流速流加葡萄糖溶液，使發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖含量恒定在2.5％-3.0％的范圍內(nèi)，所流加的葡萄糖溶液的濃度為30-50％，體積為發(fā)酵罐體積的10-20％。
發(fā)酵過程控制包括穩(wěn)定操作條件和優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)兩個(gè)方面，前者可通過常規(guī)調(diào)節(jié)回路來實(shí)現(xiàn)，而系統(tǒng)的優(yōu)化控制需根據(jù)發(fā)酵過程的關(guān)鍵變量的變化規(guī)律，對罐溫、罐壓、pH、溶氧等進(jìn)行尋優(yōu)計(jì)算，以確定這些變量的最優(yōu)控制策略。對此，采用常規(guī)儀表無法實(shí)現(xiàn)。而采用集散控制系統(tǒng)進(jìn)行生化過程自動控制具有簡單、可靠、高性能的特點(diǎn)。
本發(fā)明的方法中使用的FPC型集散控制系統(tǒng)(DCS)(如圖1所示)由上位機(jī)和智能儀表、遠(yuǎn)程I/O模塊構(gòu)成，通過過程總線取得聯(lián)系。控制軟件是在WIN98環(huán)境下用VISUAL BASIC6.0開發(fā)的組態(tài)控制軟件。其中使用的上位機(jī)是工控機(jī)，控制柜直接通過智能儀表進(jìn)行控制。
智能儀表的功能是變送、數(shù)顯、PID自整定控制、手操、無擾動切換、RS485通訊；遠(yuǎn)程I/O模塊的功能是A/D變換、I/O輸入輸出、RS485通訊；智能儀表和遠(yuǎn)程I/O模塊主要完成各參數(shù)實(shí)時(shí)測定和控制。通過測量變送器對發(fā)酵過程攪拌電流、罐溫、罐壓、進(jìn)氣流量、pH、溶氧、泡沫等進(jìn)行實(shí)時(shí)測量，所有數(shù)據(jù)通過現(xiàn)場總線送上位機(jī)分析、儲存。同時(shí)上位機(jī)根據(jù)控制要求按設(shè)定值進(jìn)行連續(xù)控制，主要控制量有罐溫、罐壓、進(jìn)氣流量、pH、溶氧、消泡、補(bǔ)料等，并通過分析定時(shí)存儲，并及時(shí)在顯示器上顯示，如果有異常立即報(bào)警，實(shí)現(xiàn)對發(fā)酵過程環(huán)境參數(shù)進(jìn)行全面監(jiān)測和閉環(huán)控制，使發(fā)酵生產(chǎn)的可再現(xiàn)性提高。
FPC型集散控制系統(tǒng)(DCS)具有如下功能(1)、數(shù)據(jù)采集和處理對罐溫、罐壓、進(jìn)氣流量、pH、溶氧、消泡、補(bǔ)料等發(fā)酵參數(shù)，實(shí)現(xiàn)可靠的在線測量，并通過分析定時(shí)存儲，及時(shí)在顯示器上顯示，如果有異常立即報(bào)警，實(shí)現(xiàn)對發(fā)酵過程環(huán)境參數(shù)進(jìn)行全面監(jiān)測和閉環(huán)控制。
(2)、發(fā)酵過程順序控制按邏輯功能完成發(fā)酵過程滅菌、接種培養(yǎng)、進(jìn)出料等相應(yīng)閥門的開、關(guān)，攪拌電機(jī)的啟停等操作，使之既安全又減低勞動強(qiáng)度，從而提高運(yùn)行可靠性。
(3)、直接數(shù)字控制和設(shè)定值控制對罐溫、罐壓、進(jìn)氣流量、pH值等參數(shù)可很方便地實(shí)現(xiàn)各種反饋控制(如PID控制、串接控制、自適應(yīng)控制等)，并可根據(jù)優(yōu)化操作要求去改變設(shè)定值。
(4)、優(yōu)化控制通過罐溫的優(yōu)化、pH值的優(yōu)化及氧傳遞過程的優(yōu)化等，確定發(fā)酵優(yōu)化控制的條件，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵生產(chǎn)的可控性操作，提高發(fā)酵產(chǎn)率、縮短發(fā)酵時(shí)間。
該系統(tǒng)的主要儀表選型如下溫度防水型鉑熱電阻Pt100；
壓力電容式壓力變送器、隔膜式壓力表；流量旋渦流量變送器(抗震型)、玻璃浮子流量計(jì)；泡沫電容式數(shù)字物位開關(guān)；pH耐高溫pH值測量系統(tǒng)(瑞士Mettler Toledo公司傳感器、新加坡EUTECH INSTRUMENTS公司產(chǎn)的送變器)溶氧耐高溫溶氧測量系統(tǒng)(瑞士Mettler Toledo公司傳感器、新加坡EUTECH INSTRUMENTS公司產(chǎn)的送變器)攪拌電流電流互感器控制儀表帶RS485通信的小型智能調(diào)節(jié)儀表調(diào)節(jié)閥氣動薄膜調(diào)節(jié)閥、耐高溫耐腐蝕的電磁閥按照中國專利法和其實(shí)施細(xì)則的規(guī)定，本發(fā)明的短小芽孢桿菌P8069和枯草芽孢桿菌S6023已于2002年12月5日保藏在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號分別為CGMCC0845和CGMCC0846。
有益效果通過對D-核糖發(fā)酵過程的優(yōu)化控制，包括以溶氧和pH值的控制為主線，對發(fā)酵過程各種參數(shù)進(jìn)行綜合參數(shù)、并適時(shí)補(bǔ)糖等控制方法，D-核糖產(chǎn)糖水平可提高20～34％，發(fā)酵周期縮短至42～50小時(shí)，發(fā)酵罐的裝填系數(shù)由70％提高至80％以上，并且發(fā)酵過程易于控制、重復(fù)性增強(qiáng)。


圖1是本發(fā)明的集散控制系統(tǒng)總體結(jié)構(gòu)圖。
具體實(shí)施方式
以下以非限制性實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。以下各實(shí)施例中使用的葡萄糖含有1分子結(jié)晶水，折純含量為90％。
實(shí)施例1使用短小芽孢桿菌(B.pumilus)CGMCC0845。在由山梨醇2.0％(w/w)，玉米漿2.0％，酵母膏0.1％，磷酸氫二鉀0.3％，磷酸二氫鉀0.1％，硫酸鎂0.05％組成的350L種子培養(yǎng)基(pH7.0)中，控制種子罐罐壓1.0kg/cm2，轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度36℃，培養(yǎng)16小時(shí)后接入由葡萄糖16.0％(w/w)，玉米漿2.6％，酵母膏0.1％，硫酸銨0.7％，硫酸錳0.005％，碳酸鈣2.2％組成的3200L發(fā)酵培養(yǎng)基(pH7.0)中控制攪拌轉(zhuǎn)速180轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度36℃。在發(fā)酵前期0～18小時(shí)，控制在pH6.5～7.0、溶氧20～25％；發(fā)酵中后期控制在pH6.3～6.5、溶氧25～30％。發(fā)酵前18小時(shí)，葡萄糖消耗緩慢，主要是菌體生長階段。發(fā)酵18小時(shí)后，葡萄糖消耗開始加快，D-核糖開始積累，菌體生長速度略有下降。到24小時(shí)時(shí)，菌體生長進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體生長量達(dá)到15g濕菌體/100ml發(fā)酵液。隨著葡萄糖消耗速度的加快，產(chǎn)物積累，進(jìn)入快速產(chǎn)糖期，這一階段的糖耗速度很快約為每小時(shí)0.6～0.8％，產(chǎn)物形成進(jìn)入高峰期，轉(zhuǎn)化率約可達(dá)到50～55％(重量轉(zhuǎn)化率)有時(shí)甚至達(dá)到60％以上。在發(fā)酵培養(yǎng)32小時(shí)，發(fā)酵液中的葡萄糖降至2.5～3.0％，此時(shí)，控制發(fā)酵液中的糖濃度在2.5～3.0％范圍內(nèi)，以120升/小時(shí)流速開始流加補(bǔ)糖，流加的糖濃度為40％，體積550L。流加補(bǔ)糖結(jié)束后，維持上述控制條件，繼續(xù)培養(yǎng)45小時(shí)，葡萄糖耗盡，pH值和溶氧直線上升，發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液中D-核糖的含量為90.60g/L，發(fā)酵液體積為4050L。
比較實(shí)施例1-1(不補(bǔ)糖，控制條件相同，初糖濃度提高)使用短小芽孢桿菌CGMCC0845。用與實(shí)施例1培養(yǎng)基組成相同、培養(yǎng)條件相同的350L種子培養(yǎng)基，36℃培養(yǎng)18小時(shí)后，接入由葡萄糖21.88％(w/v)，玉米漿2.5％，干酵母0.1％，硫酸銨0.6％，硫酸錳0.005％，碳酸鈣2.2％組成的3200L發(fā)酵培養(yǎng)基(pH7.0)中。發(fā)酵不同階段各個(gè)參數(shù)的控制條件與實(shí)施例1完全相同，發(fā)酵培養(yǎng)45小時(shí)，發(fā)酵液中D-核糖的含量為73.65g/L，發(fā)酵液體積為3500L。
比較實(shí)施例1-2(不補(bǔ)糖，控制條件簡化，初糖濃度提高)使用短小芽孢桿菌CGMCC0845。用與實(shí)施例1培養(yǎng)基組成相同、培養(yǎng)條件相同的350L種子培養(yǎng)基，36℃培養(yǎng)18小時(shí)后，接入由葡萄糖21.88％(w/v)，玉米漿2.5％，干酵母0.1％，硫酸銨0.6％，硫酸錳0.005％，碳酸鈣2.2％組成的3200L發(fā)酵培養(yǎng)基(pH7.0)中?？刂茢嚢柁D(zhuǎn)速180轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度36℃，按1∶0.9的通風(fēng)量，在36℃下通氣攪拌培養(yǎng)52小時(shí)，發(fā)酵液中D-核糖的含量為69.60g/L，發(fā)酵液體積為3500L。
實(shí)施例2使用枯草芽孢桿菌(B.subtilis)CGMCC0846。在由葡萄糖2.0％(w/w)，酵母膏0.3％，玉米漿0.05％，磷酸氫二鉀0.3％，磷酸二氫鉀0.1％，硫酸鎂0.05％(pH7.0)組成的350L種子培養(yǎng)基中，控制種子罐罐壓1.0kg/cm2，轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度36℃，培養(yǎng)18小時(shí)后，接入由葡萄糖16.0％(w/w)，玉米漿2.6％，硫酸銨0.7％，硫酸錳0.005％，碳酸鈣2.2％組成的3200L發(fā)酵培養(yǎng)基(pH7.0)中。控制攪拌轉(zhuǎn)速180轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度36℃。在發(fā)酵前期0～18小時(shí)，控制在pH6.5～7.0、溶氧18～22％；發(fā)酵中后期控制在pH6.0～6.2、溶氧20～25％、；在36℃、0.60kg/cm2的下通氣攪拌培養(yǎng)。發(fā)酵前18小時(shí)，葡萄糖消耗緩慢，主要是菌體生長階段。發(fā)酵18小時(shí)后，葡萄糖消耗開始加快，D-核糖開始積累，菌體生長速度略有下降。到24小時(shí)時(shí)，菌體生長進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體生長量達(dá)到16g濕菌體/100ml發(fā)酵液。隨著葡萄糖消耗速度的加快，產(chǎn)物積累，進(jìn)入快速產(chǎn)糖期，這一階段的糖耗速度很快約為每小時(shí)0.7～0.9％，產(chǎn)物形成進(jìn)入高峰期，轉(zhuǎn)化率約可達(dá)到50～55％(重量轉(zhuǎn)化率)有時(shí)甚至達(dá)到60％以上。在發(fā)酵培養(yǎng)33小時(shí)，發(fā)酵液中的葡萄糖降至2.5～2.8％，這時(shí)，控制發(fā)酵液中的糖濃度在2.5～2.8％范圍內(nèi)，以120升/小時(shí)的速度，開始流加補(bǔ)糖，流加的糖濃度為45％，體積600L。補(bǔ)糖結(jié)束后，維持上述控制條件，發(fā)酵培養(yǎng)46小時(shí)，葡萄糖耗盡，發(fā)酵結(jié)束，此時(shí)發(fā)酵液中D-核糖的含量為91.35g/L，發(fā)酵液體積為4100L。
比較實(shí)施例2-1(不補(bǔ)糖，控制條件相同，初糖濃度提高)使用枯草芽孢桿菌CGMCC0846。用與實(shí)施例1培養(yǎng)基組成相同、培養(yǎng)條件相同的350L種子培養(yǎng)基，36℃培養(yǎng)18小時(shí)后，接入由葡萄糖21.88％(w/v)，玉米漿2.6％，硫酸銨0.7％；硫酸錳0.005％，碳酸鈣2.2％組成的3200L發(fā)酵培養(yǎng)基(pH7.0)中。發(fā)酵不同階段各參數(shù)的控制與實(shí)施例4相同，發(fā)酵培養(yǎng)42小時(shí)，葡萄糖耗盡發(fā)酵結(jié)束，此時(shí)發(fā)酵液中D-核糖的含量為75.60g/L，發(fā)酵液體積為3500L。
比較實(shí)施例2-2(不補(bǔ)糖，控制條件簡化，初糖濃度提高)使用枯草芽孢桿菌CGMCC0846。用與實(shí)施例1培養(yǎng)基組成相同、培養(yǎng)條件相同的350L種子培養(yǎng)基，36℃培養(yǎng)18小時(shí)后，接入由葡萄糖21.88％(w/v)，玉米漿2.6％，硫酸銨0.7％，硫酸錳0.005％，碳酸鈣2.2％組成的3200L發(fā)酵培養(yǎng)基(pH7.0)中?？刂茢嚢柁D(zhuǎn)速180轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度36℃，按1∶0.8的通風(fēng)量，在36℃下通氣攪拌培養(yǎng)56小時(shí)，發(fā)酵液中D-核糖的含量為68.60g/L，發(fā)酵液體積為3500L。
實(shí)施例3使用短小芽孢桿菌ATCC31093。在由山梨醇2.0％，玉米漿2.0％，磷酸氫二鉀0.3％，磷酸二氫鉀0.1％，酪氨酸和苯丙氨酸各100μg/ml(pH7.0)組成的350L種子培養(yǎng)基中，控制種子罐罐壓1.0kg/cm2，轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度36℃，培養(yǎng)16小時(shí)后接入由葡萄糖16.0％(w/w)，干酵母1.2％，硫酸銨0.6％，硫酸錳0.005％，碳酸鈣2.2％，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸各50μg/ml組成的3200L發(fā)酵培養(yǎng)基(pH7.0)中，采用與實(shí)施例1相同的發(fā)酵控制條件，在發(fā)酵培養(yǎng)33小時(shí)，發(fā)酵液中的葡萄糖降至2.5～3.0％，控制發(fā)酵液中的糖濃度在2.5～3.0％范圍內(nèi)，以120升/小時(shí)的流速開始流加補(bǔ)糖，流加的糖濃度為40％，體積550L。發(fā)酵培養(yǎng)48小時(shí)，葡萄糖耗盡，pH、溶氧直線上升，發(fā)酵結(jié)束，此時(shí)發(fā)酵液中D-核糖的含量為89.79g/L，發(fā)酵液體積為4050L。
比較實(shí)施例3-1(不補(bǔ)糖，控制條件相同，初糖濃度提高)使用短小芽孢桿菌ATCC31093。用與實(shí)施例3培養(yǎng)基組成相同、培養(yǎng)條件相同的350L種子培養(yǎng)基，36℃培養(yǎng)18小時(shí)后，接入由葡萄糖21.88％(w/v)，干酵母1.2％，硫酸銨0.7％，硫酸錳0.005％，碳酸鈣2.2％，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸各50μg/ml組成的3200L發(fā)酵培養(yǎng)基(pH7.0)中。除不進(jìn)行流加補(bǔ)糖外，發(fā)酵不同階段各個(gè)參數(shù)的控制條件與實(shí)施例1完全相同，發(fā)酵培養(yǎng)45小時(shí)，葡萄糖耗盡，pH、溶氧直線上升，發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵液中D-核糖的含量為75.65g/L，發(fā)酵液體積為3500L。
比較實(shí)施例3-2(不補(bǔ)糖，控制條件簡化，初糖濃度提高)使用短小芽孢桿菌ATCC31093。用與實(shí)施例3培養(yǎng)基組成相同、培養(yǎng)條件相同的350L種子培養(yǎng)基，36℃培養(yǎng)18小時(shí)后，接入由葡萄糖21.88％(w/v)，干酵母1.2％，硫酸銨0.7％，硫酸錳0.005％，碳酸鈣2.2％色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸各50μg/ml組成的3200L發(fā)酵培養(yǎng)基(pH7.0)中?？刂茢嚢柁D(zhuǎn)速180轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度36℃，按1∶0.8的通風(fēng)量，在36℃下通氣攪拌培養(yǎng)58小時(shí)，發(fā)酵液中D-核糖的含量為66.79g/L，發(fā)酵液體積為3500L。
實(shí)施例4使用枯草芽孢桿菌IFO13621。用與實(shí)施例3培養(yǎng)基組成相同、培養(yǎng)條件相同的350L種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度36℃，培養(yǎng)18小時(shí)后接入由葡萄糖16％(w/v)，干酵母1.0％，硫酸銨0.6％，硫酸錳0.005％，碳酸鈣2.2％，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸各50μg/ml組成的3200L發(fā)酵培養(yǎng)基(pH7.0)中，采用與實(shí)施例2相同的發(fā)酵控制條件，在發(fā)酵培養(yǎng)32小時(shí)，發(fā)酵液中的葡萄糖降至2.5～3.0％，控制發(fā)酵液中的糖濃度在2.5～3.0％范圍內(nèi)，以120升/小時(shí)的流速開始流加補(bǔ)糖，流加的糖濃度為40％，體積400L。發(fā)酵培養(yǎng)48小時(shí)，葡萄糖耗盡，pH、溶氧直線上升，發(fā)酵結(jié)束，此時(shí)發(fā)酵液中D-核糖的含量為85.29g/L，發(fā)酵液體積為4100L。
比較實(shí)施例4-1(不補(bǔ)糖，控制條件相同，初糖濃度提高)使用枯草芽孢桿菌IFO13621。用與實(shí)施例4培養(yǎng)基組成相同、培養(yǎng)條件相同的350L種子培養(yǎng)基，36℃培養(yǎng)18小時(shí)后，接入由葡萄糖21.88％(w/v)，干酵母1.0％，硫酸銨0.6％，硫酸錳0.005％，碳酸鈣2.2％，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸各50μg/ml組成的3200L發(fā)酵培養(yǎng)基(pH7.0)中。發(fā)酵不同階段各個(gè)參數(shù)的控制條件與實(shí)施例2完全相同，發(fā)酵培養(yǎng)45小時(shí)，葡萄糖耗盡，pH、溶氧直線上升，發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液中D-核糖的含量為70.15g/L，發(fā)酵液體積為3500L。
比較實(shí)施例4-2(不補(bǔ)糖，控制條件簡化，初糖濃度提高)使用枯草芽孢桿菌IFO13621。用與實(shí)施例4培養(yǎng)基組成相同、培養(yǎng)條件相同的350L種子培養(yǎng)基，36℃培養(yǎng)18小時(shí)后，接入由葡萄糖21.88％(w/v)，干酵母1.0％，硫酸銨0.7％，硫酸錳0.005％，碳酸鈣2.2％，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸各50μg/ml組成的3200L發(fā)酵培養(yǎng)基(pH7.0)中?？刂茢嚢柁D(zhuǎn)速180轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度36℃，按1∶0.8的通風(fēng)量，在36℃下通氣攪拌培養(yǎng)58小時(shí)，發(fā)酵液中D-核糖的含量為65.27g/L，發(fā)酵液體積為3500L。
權(quán)利要求
1.一種D-核糖發(fā)酵過程的調(diào)控方法，其特征在于以發(fā)酵過程集散控制系統(tǒng)-FPC型集散控制系統(tǒng)(DCS)在線控制D-核糖發(fā)酵的培養(yǎng)濕度、攪拌轉(zhuǎn)速、罐壓以及發(fā)酵不同階段的pH值、溶氧量，并定時(shí)取樣測定發(fā)酵過程中菌體細(xì)胞濃度、底物濃度以及產(chǎn)物生成量，在糖濃度低于臨界值時(shí)流加補(bǔ)糖(葡萄糖)，保持發(fā)酵過程始終處于最佳狀態(tài)。
2.按權(quán)利要求1的方法，其中所說的發(fā)酵過程是芽孢桿菌屬菌株的發(fā)酵過程。
3.按權(quán)利要求1或2的方法，其中所說的發(fā)酵過程中的培養(yǎng)溫度在36～38℃范圍內(nèi)，罐壓在0.5～0.8kg/cm2范圍內(nèi)，攪拌轉(zhuǎn)速在180～220轉(zhuǎn)/分范圍內(nèi)。
4.按權(quán)利要求1或2的方法，其中所說的發(fā)酵不同階段的最佳pH值范圍分別為發(fā)酵前期(0～18小時(shí))6.50～7.0；發(fā)酵中后期(18小時(shí)以后)6.00～6.50。
5.按權(quán)利要求1或2的方法，其中所說的發(fā)酵不同階段的最佳溶氧范圍分別為發(fā)酵前期(0～18小時(shí))18～30％；發(fā)酵中后期(18小時(shí)以后)20～35％。
6.按權(quán)利要求1或2的方法，其中所說的糖濃度的臨界值為2.5％，流加補(bǔ)糖的方式是以100-130升/小時(shí)的流速流加葡萄糖溶液，使發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖含量恒定在2.5％-3.0％的范圍內(nèi)，所流加的葡萄糖溶液的濃度為30-50％，體積為發(fā)酵罐體積的10-20％。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種D－核糖發(fā)酵過程優(yōu)化的調(diào)控方法。該方法是一種以控制溶氧、pH值為主線，以控制菌體生長量、底物消耗速率及產(chǎn)物生成速率等關(guān)鍵變量為主要內(nèi)容，并適時(shí)流加補(bǔ)糖的發(fā)酵控制方法，在5000l發(fā)酵罐發(fā)酵結(jié)果表明，應(yīng)用該方法，D－核糖產(chǎn)糖水平可提高20～34％，發(fā)酵周期縮短至42～50小時(shí)，發(fā)酵罐的裝填系數(shù)由70％提高至80％以上，并且發(fā)酵過程易于控制、重復(fù)性增強(qiáng)。
文檔編號C12P19/00GK1508256SQ0215649
公開日2004年6月30日 申請日期2002年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月18日
發(fā)明者高潤香, 李文濂, 梁是森, 王威 申請人:誠志生命科技有限公司