專利名稱：大豆過氧化物酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從大豆殼中提取過氧化物酶的方法，尤其涉及從大豆殼中提取和純化大豆過氧化物酶(SBP，Soybean hull Peroxidase)的方法。
過氧化物酶為一類有共同活性的酶，但并不都具有相同或相似的結(jié)構(gòu)和作用機理。大多數(shù)過氧化物酶含F(xiàn)e(III)-原卟啉IX輔基，屬氧化血紅素蛋白質(zhì)。血紅素(鐵卟啉)的基本結(jié)構(gòu)成分是由吡咯組成的卟吩，帶上側(cè)鏈后形成卟啉，再和一分子鐵構(gòu)成卟啉化合物即為血紅素。有關(guān)血紅素衍生物的變化均在卟啉環(huán)的側(cè)鏈上進行。血紅素作為過氧化物酶的輔基，在這類酶蛋白中是電子傳遞的載體。在過氧化物酶中，以辣根過氧化物酶(HRP，Horseradish Peroxidase)的結(jié)構(gòu)和作用機理研究的比較透徹，在含鐵過氧化物酶中也有代表性，它代表一大類非特異的過氧化物酶。
HRP為結(jié)合了氧化血紅素的糖蛋白。除鐵外，每分子中還含有兩個Ca2+。肽鏈由308個氨基酸殘基組成。另有8個糖鏈(占分子量的18％)分別與13、57、158、186、198、214、255和268的Asp殘基連接，他們分布在分子表面。大豆過氧化物酶(SBP)和辣根過氧化物酶(HRP)在一級結(jié)構(gòu)上具有較大的類似性，共有123個不變的氨基酸殘基，遠端His42和近端His170(HRP)附近的氨基酸殘基高度保守，分子內(nèi)的二硫鍵數(shù)目和位置基本相同。
雖然過氧化物酶價格昂貴，但仍在食品加工、日化、臨床診斷等方面獲得了廣泛的應(yīng)用。因此獲得低廉的過氧化物酶產(chǎn)品具有重要的經(jīng)濟價值。大豆種皮是大豆加工過程中的廢棄物，原料價廉易得，從其中提取SBP作為現(xiàn)在廣泛應(yīng)用的HRP的替代產(chǎn)品，具有重要的意義。SBP的提取及純化方法，文獻上鮮有報道。劉穩(wěn)等人(劉穩(wěn)，方靖，高培基。豆殼過氧化物酶的分離純化及其性質(zhì)研究。中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，1998，14，577-582)曾利用親和色譜法制備SBP，但柱子的壽命較短，制備SBP的成本太高。
第六步取上述有酶活力的部分對pH4.5-6.0的20mmol/L醋酸緩沖液透析，濃縮。
用同一緩沖液平衡DEAE-Sephadex A-25離子交換柱，然后，將濃縮液過柱，0-0.6mol/L NaCl梯度洗脫，測定280nm紫外吸收和酶活，收集有酶活的部分；第七步取上述有酶活力的部分對pH4.5-6.0的20mmol/L醋酸緩沖液透析，超濾濃縮，再經(jīng)Sephadex G-100凝膠過濾，合并有酶活力的部分，制得大豆過氧化物酶，該酶由一條多肽鏈組成，分子量為38,000，酶的等電點為3.9，其RZ＞2.8；在上述制備大豆過氧化物酶的方法中，第四步、第五步和第六步的順序可以顛倒。
上述的20mmol/L磷酸緩沖液pH為6.8。
上述的浸泡時間為12-15小時。
上述的第二步中的濾液以6000轉(zhuǎn)/分離心40分鐘。
上述的超濾濃縮是指用Amicon，PM10000的超濾膜超濾。
上述的20mmol/L醋酸緩沖液pH為5.6。
通過上述步驟制備的大豆過氧化物酶，經(jīng)產(chǎn)品的純度的檢驗、分子量的測定、酶的等電點、氨基酸組份分析、電子吸收光譜、大豆殼過氧化物酶活力的測定、酶的理化性質(zhì)等實驗的檢測(見附圖及實施例)，具有純度高、活性高的特點，且離子交換柱和凝膠柱可多次使用，有效地降低了大豆過氧化物酶的制備成本。
圖2.活性組分的Sephadex G-100的凝膠色譜圖。
圖3.SBP的等電聚焦IEF(Isoelectric focusing)圖。條帶1為SBP；條帶2為pI標準物(戊基葡糖苷酶，3.50；甲基紅，3.75；胰蛋白酶抑制劑，4.55；β-乳球蛋白A，5.20；碳酸酐酶B(牛)，5.85；碳酸酐酶B(人)，6.55；肌紅蛋白酸帶，6.85；肌紅蛋白堿帶，7.35；酸性晶狀體凝集素，8.15；中性晶狀體凝集素，8.45；堿性晶狀體凝集素，8.65；胰蛋白酶原，9.30).
圖4.SBP的UV-VIS吸收光譜.
圖5.SBP的最適pH。
圖6.SBP的最適溫度。
圖7.SBP的pH穩(wěn)定性。
圖8.SBP的熱穩(wěn)定性。
用Amicon，PM10000的超濾膜超濾濃縮至15mL，濃縮液經(jīng)徑高比1∶10，床體積為100cm3的Bio-Gel P-60凝膠過濾，測定酶活力，合并有酶活力的部分；第六步取上述有酶活力的部分對pH5.6的20mmol/L醋酸緩沖液透析，然后用Amicon，PM10000的超濾膜超濾，濃縮至15mL，用同一緩沖液平衡DEAE-Sephadex A-25離子交換柱，然后，將濃縮液經(jīng)徑高比1∶10，床體積為100cm3過柱，0-0.6mol/L NaCl梯度洗脫，測定280nm紫外吸收和酶活，收集有酶活的部分；第七步取上述有酶活力的部分對pH5.6的20mmol/L醋酸緩沖液透析，然后用Amicon，PM10000的超濾膜超濾，濃縮至10mL，濃縮液再經(jīng)徑高比1∶10，床體積為100cm3的Sephadex G-100凝膠過濾，合并有酶活力的部分，制得大豆過氧化物酶；(2)大豆過氧化物酶產(chǎn)品的檢驗1.純度的檢驗聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，確定酶的純度。檢驗方法如下垂直板電泳分離膠濃度10％，3.5％的濃縮膠，SDS-不連續(xù)系統(tǒng)，電泳條件恒流，開始10mA，進入分離膠，改為25mA，電泳約8小時。考馬斯亮蘭R250染色。電泳圖譜入

圖1。顯示一條蛋白帶。表明，SBP成分單一，不含多個同工酶組分。2.分子量的測定采取電泳和分子篩兩種方法進行測定。
垂直板電泳分離膠濃度10％，3.5％的濃縮膠，SDS-不連續(xù)系統(tǒng)，電泳條件恒流，開始10mA，進入分離膠，改為25mA，電泳約8小時?？捡R斯亮蘭R250染色。結(jié)果見圖1。電泳圖譜中顯示一條蛋白帶。分子量為38,000。
用Sephadex G-100凝膠過濾，從標準蛋白質(zhì)分子量曲線求得酶的分子量。見圖2。根據(jù)酶蛋白從Sephadex G-100的洗脫體積，按Andrews方法求得酶蛋白的分子量為39,500。
兩種測量結(jié)果表明，SBP分子由一條多肽鏈組成。分子量約為38,000。3.酶的等電點用等電聚焦IEF(Isoelectric focusing)電泳方法測酶等點電。膠濃度5.0％，膠厚1.5mm，內(nèi)含0.8％載體兩性電解質(zhì)(pH3.5-10)，正極電泳液為1mol/L磷酸，負極為1mol/L NaOH溶液。電泳條件恒壓200V，2小時后升壓至400V，再2小時后升壓800V，電泳至電流基本不再降低為止。考馬斯亮蘭R250染色。以LKB標準等電點Marker作參照。見圖3。用IEF電泳測得酶的等點電為3.9，屬于酸性蛋白質(zhì)。4.氨基酸組份分析樣品經(jīng)5.7mol/L恒沸鹽酸水解上氨基酸自動分析儀(Hitachi 835)測定，半胱氨酸核蛋氨酸殘基以過甲酸氧化、色氨酸殘基以堿水解后測定。結(jié)果見表1。氨基酸組成分析表明，SBP富含酸性氨基酸(Asx和Glx)，Asx、Glx約占氨基酸殘基殘基總量的26％，這與其等電點酸性相符合，Ser和Thr的含量也相當多。5.電子吸收光譜取純化酶高蛋白組分，在UV-3100紫外可見分光光度計上進行230-700nm范圍掃描，可得出圖4。結(jié)果表明，此法獲得的大豆殼過氧化物酶，其RZ大于2.8。從圖4可以看出，此酶在404nm處有一典型的索爾(Soret)帶，在508nm，638nm處有其吸收峰(α，β帶)，這些譜帶是SBP中血紅素輔基定域于卟啉的π-π*躍遷的反映。6.大豆殼過氧化物酶活力的測定以鄰甲氧基酚為底物，反應(yīng)體系為3.0mL的50mmol/L醋酸緩沖液(pH4.5)中含8mmol/L鄰甲氧基酚，0.5mmol/L過氧化氫，0.1mL酶液，30℃下檢測470nm的吸光度的變化。鄰甲氧基聯(lián)酚的消光系數(shù)ε＝26，600 L.mol-1.cm-1。以每分鐘轉(zhuǎn)化1umol底物定義為一個酶活單位。結(jié)果表明，此純化方法獲得的酶，酶活共為1150U.7.酶的部分理化性質(zhì)最適pH以不同pH的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液配制底物，于30℃測定不同pH時的酶活力。在pH3-8范圍內(nèi)，SBP的pH曲線顯示一個較寬的峰，最適pH在4.2附近，見圖5。
溫度效應(yīng)在pH4.2的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液中，于不同溫度測定酶活力，SBP氧化鄰甲氧基酚的最適溫度為45℃，見圖6。
pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性將SBP(50ug/mL)在不同pH的緩沖液中于30℃放置24h后，在最適pH條件下測定剩余活力，結(jié)果見圖7。表明酶在pH2.5-12之間都很穩(wěn)定，說明該酶具有較強的抗酸、堿性。于不同溫度(60、70、90℃)分別保溫15、30、60min，立即冷卻后在最適溫度測定剩余酶活力殘余68％，保溫15min時半失活溫度為90℃。結(jié)果見圖8。表1大豆過氧化物酶的氨基酸組成
1)Asx天冬氨酸Asp和天冬酰胺Asn的總量。Glx谷氨酸Glu和谷氨酰胺Gln的總量。表2SBP的抑制劑
酶的抑制劑在測定酶活的反應(yīng)體系中添加不同的金屬離子或化合物至終濃度2mmol/L，考察其對酶活的影響，結(jié)果見表2。CN-，F(xiàn)e3+，F(xiàn)e2+，S2O32-，S2O42-和HSO3-對酶有較強烈的抑制作用，而重金屬離子Ag+，Hg2+，Pb2+，Cu2+，Cr3+以及SDS和EDTA對酶活力無顯著的影響。同時也試驗了幾種有機溶劑對酶活性的影響，結(jié)果見表3。表3有機溶劑對SBP活性的影響
1)分析中，溶劑的終濃度為50％(V/V).
酶的底物的特異性植物來源的過氧化物酶多是非特異性的氧化還原酶，其底物特異性不強。我們的研究結(jié)果表明，來源于大豆種皮的SBP的底物范圍較寬，以H2O2為電子受體，在所測定的底物范圍內(nèi)，除具有一般過氧化物酶的性質(zhì)(如氧化聯(lián)苯三酚，對甲酚，2，4，6-三甲酚，苯胺，對甲苯胺，抗壞血酸，鐵氰化物，NADH等)外，還可以氧化愈創(chuàng)木酚，12，3-二甲氧基酚，2，6-二甲氧基酚，3，4-二甲氧基酚，3，5-二甲氧基酚，1，2，4-三甲氧基酚，阿魏酸，咖啡酸，異丁香酚，和丁香醛聯(lián)氮，結(jié)果見表4。表4SBP對底物的氧化作用
1)a)有新吸收峰出現(xiàn)。(d)底物的吸收峰消失。(i)在吸收峰處，吸收強度增大。吸收變化表示為++++(很快)，+++(較快)，++(快)，+(慢)，+/-(較慢)，-(無變化)。實例二(1)大豆過氧化物酶的制備及純化第一步將新鮮的大豆殼1000g浸泡于5000mL pH5.2的20mmol/L磷酸緩沖液中，以5000轉(zhuǎn)/分用組織搗碎器攪碎，0-4℃條件下浸泡15小時，過濾；第二步將上述濾液以5000轉(zhuǎn)/分離心50分鐘，取上清液，加固體硫酸氨分級，沉淀；第三步將30％-80％飽和度的沉淀對pH5.8的20mmol/L磷酸緩沖液透析，然后用Amicon，PM10000的超濾膜超濾，濃縮至25mL；第四步取上述濃縮液，經(jīng)徑高比1∶10，床體積為100cm3的DEAE-Sephadex A-50離子交換柱層析，0-1.5mol/L NaCl梯度洗脫，測定280nm紫外光吸收和酶活力，合并有酶活力的部分；第五步取上述有酶活力的部分對pH4.6的20mmol/L醋酸緩沖液透析，然后用Amicon，PM10000的超濾膜超濾，濃縮至15mL，用同一緩沖液平衡DEAE-Sephadex A-25離子交換柱，然后，將濃縮液經(jīng)徑高比1∶10，床體積為100cm3過柱，0-0.6mol/L NaCl梯度洗脫，測定280nm紫外吸收和酶活，收集有酶活的部分；第六步取上述有酶活力的部分對pH5.8的20mmol/L磷酸緩沖液充分透析，然后用Amicon，PM10000的超濾膜超濾濃縮至15mL，濃縮液經(jīng)徑高比1∶10，床體積為100cm3的Bio-Gel P-60凝膠過濾，測定酶活力，合并有酶活力的部分；第七步取上述有酶活力的部分對pH5.6的20mmol/L醋酸緩沖液透析，然后用Amicon，PM10000的超濾膜超濾，濃縮至10mL，濃縮液再經(jīng)徑高比1∶10，床體積為100cm3的Sephadex G-100凝膠過濾，合并有酶活力的部分，制得大豆過氧化物酶；(2)大豆過氧化物酶產(chǎn)品的檢驗此法獲得的產(chǎn)品經(jīng)與實例一相同的酶活測定方法測定，總酶活為1010U.其他性質(zhì)同實例一的產(chǎn)品。實例三(1)大豆過氧化物酶的制備及純化第一步將新鮮的大豆殼100g浸泡于500mL pH7.8的20mmol/L磷酸緩沖液中，以8000轉(zhuǎn)/分用組織搗碎器攪碎，0-4℃條件下浸泡20小時，過濾；第二步將上述濾液以9000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，取上清液，加固體硫酸氨分級，沉淀；第三步將30％-80％飽和度的沉淀對pH7.4的20mmol/L磷酸緩沖液透析，然后用Amicon，PM10000的超濾膜超濾，濃縮至25mL；第四步取上述濃縮液對pH6.8的20mmol/L磷酸緩沖液充分透析，然后用Amicon，PM10000的超濾膜超濾濃縮至15mL，濃縮液經(jīng)徑高比1∶10，床體積為100cm3的Bio-Gel P-60凝膠過濾，測定酶活力，合并有酶活力的部分；第五步取上述有酶活力的部分，濃縮至15mL，經(jīng)徑高比1∶10，床體積為100cm3的DEAE-Sephadex A-50離子交換柱層析，0-1.5mol/LNaCl梯度洗脫，測定280nm紫外光吸收和酶活力，合并有酶活力的部分；第六步取上述有酶活力的部分對pH6.0的20mmol/L醋酸緩沖液透析，然后用
Amicon，PM10000的超濾膜超濾，濃縮至15mL，用同一緩沖液平衡DEAE-Sephadex A-25離子交換柱，然后，將濃縮液經(jīng)徑高比1∶10，床體積為100cm3過柱，0-0.6mol/L NaCl梯度洗脫，測定280nm紫外吸收和酶活，收集有酶活的部分；第七步取上述有酶活力的部分對pH5.6的20mmol/L醋酸緩沖液透析，然后用Amicon，PM10000的超濾膜超濾，濃縮至10mL，濃縮液再經(jīng)徑高比1∶10，床體積為100cm3的Sephadex G-100凝膠過濾，合并有酶活力的部分，制得大豆過氧化物酶；(2)大豆過氧化物酶產(chǎn)品的檢驗此法獲得的產(chǎn)品經(jīng)與實例一相同的酶活測定方法測定，總酶活為860U.其他性質(zhì)同實例一的產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1.一種大豆過氧化物酶的制備方法，其特征在于，按以下步驟進行第一步將新鮮的大豆殼按固液1∶5的比例浸泡于pH5-8的20mmol/L磷酸緩沖液中，以5000-9000轉(zhuǎn)/分用組織搗碎器攪碎，0-4℃條件下浸泡10-48小時，過濾；第二步將上述濾液以5000-10000轉(zhuǎn)/分離心30-50分鐘，取上清液，加固體硫酸氨分級，沉淀；第三步將30％-80％飽和度的沉淀對pH5-8的20mmol/L磷酸緩沖液透析，然后超濾濃縮；第四步取上述濃縮液經(jīng)DEAE-Sephadex A-50離子交換柱層析，0-1.5mol/L NaCl梯度洗脫，測定280nm紫外光吸收和酶活力，合并有酶活力的部分；第五步取上述有酶活力的部分對pH5-8的20mmol/L磷酸緩沖液充分透析，超濾濃縮，經(jīng)Bio-Gel P-60凝膠過濾，測定酶活力，合并有酶活力的部分；第六步取上述有酶活力的部分對pH4.5-6.0的20mmol/L醋酸緩沖液透析，濃縮。用同一緩沖液平衡DEAE-Sephadex A-25離子交換柱，然后，將濃縮液過柱，0-0.6mol/L NaCl梯度洗脫，測定280nm紫外吸收和酶活，收集有酶活的部分；第七步取上述有酶活力的部分對pH4.5-6.0的20mmol/L醋酸緩沖液透析，濃縮，再經(jīng)Sephadex G-100凝膠過濾，合并有酶活力的部分，制得大豆過氧化物酶，該酶由一條多肽鏈組成，分子量為38,000，酶的等電點為3.9，其RZ＞2.8；在上述制備大豆過氧化物酶的方法中，第四步、第五步和第六步的順序可以顛倒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大豆過氧化物酶的制備方法，其特征在于，所述的20mmol/L磷酸緩沖液pH為6.8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大豆過氧化物酶的制備方法，其特征在于，所述的浸泡時間為12-15小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大豆過氧化物酶的制備方法，其特征在于，所述的第二步中的濾液以6000轉(zhuǎn)/分離心40分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大豆過氧化物酶的制備方法，其特征在于，所述的超濾濃縮是指用Amicon，PM10000的超濾膜超濾。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大豆過氧化物酶的制備方法，其特征在于，所述的20mmol/L醋酸緩沖液pH為5.6。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大豆過氧化物酶的制備方法，其分離純化步驟如下新鮮的大豆殼抽提液經(jīng)高速離心，取上清液，用固體硫酸氨分級，沉淀；經(jīng)DEAE－Sephadex A－50離子交換柱層析，Bio－Gel P－60凝膠過濾，DEAE－SephadexA－25二次離子交換和Sephadex G－100凝膠過濾、純化，制得大豆過氧化物酶。該酶由一條多肽鏈組成，分子量約為38,000，酶的等電點為3.9，其RZ＞2.8。該方法具有純度高、活性高的特點，且離子交換柱和凝膠柱可多次使用，有效地降低了SBP的制備成本。
文檔編號C12N9/08GK1424398SQ02151529
公開日2003年6月18日 申請日期2002年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月31日
發(fā)明者張為燦, 劉穩(wěn), 高培基 申請人:山東大學(xué)