專利名稱：新型霍亂弧菌菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型霍亂弧菌菌株，及其制備和作為具有誘導(dǎo)抗菌抗毒免疫的口服活菌苗的應(yīng)用。
霍亂的免疫特征以抗菌免疫為主，抗菌與針對霍亂毒素的抗毒免疫協(xié)同作用，刺激腸道粘膜產(chǎn)生分泌性抗體。自然感染霍亂可以獲得有效而穩(wěn)固的免疫力，持續(xù)時(shí)間長達(dá)三年之久，所以近年來許多研究者致力于發(fā)展模擬霍亂自然感染過程的口服活菌苗。其研制有兩條途徑一是以其它腸道菌為受體菌表達(dá)霍亂的有效保護(hù)性抗原；二是將霍亂弧菌產(chǎn)毒株的主要毒力基因失活，保留有效抗原基因，構(gòu)建霍亂減毒活菌苗。目前具有代表性的是美國馬里蘭大學(xué)菌苗發(fā)展中心(CVD)研制的CVD系列，較為成熟的CVD103-HgR(出發(fā)菌株為569B，CVC，Inaba)和CVD111(出發(fā)菌株為N16117，EVC，Ogawa)目前已經(jīng)或正在進(jìn)行大量的臨床及現(xiàn)場實(shí)驗(yàn)，此外還有Peru-14、Peru-15等也顯示有較好的保護(hù)力。但是，溶原性噬菌體CTXΦ的存在及其水平轉(zhuǎn)移無疑給減毒活菌苗在現(xiàn)場應(yīng)用的生物安全性帶來了潛在的隱患，因?yàn)樗梢栽谶m當(dāng)?shù)臈l件下攜帶ctxAB水平轉(zhuǎn)移，如果在自然界中可能遇到菌苗株并感染，則可使活菌苗獲得毒力。盡管這一概率很低，但從菌苗的生物安全性角度，是一個必須考慮的問題。
IEM101是本室從天然不含CTXΦ基因組的El Tor型菌株中篩選的一株菌苗候選株，動物實(shí)驗(yàn)安全無毒，有較好保護(hù)力；人體志愿者一次口服免疫，無致瀉性，可定居4-9天，能刺激機(jī)體產(chǎn)生血清和腸道局部特異性保護(hù)抗體，無明顯不良反應(yīng)，是較為理想的菌苗候選株。但是，由于該候選株不含毒素基因，故不引起抗毒免疫，而霍亂毒素B亞單位可刺激機(jī)體產(chǎn)生良好的抗毒免疫，同時(shí)該亞單位只起到與GM1受體結(jié)合的作用而無致瀉性。
研究表明，CTXΦ在染色體上的溶原整合狀態(tài)可以使該菌獲得對同種噬菌體再感染產(chǎn)生抗性的能力，即噬菌體免疫。該免疫是由RS2序列中的rstR基因介導(dǎo)的，它是一種抑制基因，編碼抑制蛋白，抑制rstA基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而rstA與CTXΦ的整合復(fù)制有關(guān)，從而一方面維持了CTXΦ的溶原整合狀態(tài)，另一方面使再進(jìn)入菌細(xì)胞的CTXΦ基因組不能復(fù)制與整合，并且這種免疫由于CTXΦ家族成員中rstR基因的不同而表現(xiàn)為生物型特異性。因此，在發(fā)展具有不感染CTXΦ，避免獲得毒力恢復(fù)的生物安全性霍亂活菌苗方面，rstR具有重要的作用。
2、按照以上項(xiàng)1所述的霍亂弧菌菌株，其特征是以IEM101為出發(fā)菌株，構(gòu)建thyA基因精確缺失的營養(yǎng)缺陷株IEM101-T。IEM101是不含CTX基因組的E1 Tor型菌株。
3、按照以上項(xiàng)1所述的霍亂弧菌菌株，其特征是用PCR方法獲得大腸桿菌的thyA基因和El Tor來源的rstR基因，ctxB基因系從質(zhì)粒pBR中酶切獲得。
4、根據(jù)以上項(xiàng)1所述的霍亂弧菌菌株，特征在于用去除了氨芐青霉素抗性基因的平衡質(zhì)粒，使克隆的基因高拷貝的表達(dá)。
5、根據(jù)以上項(xiàng)1所述的霍亂弧菌菌株，特征在于加入了新的功能基因或替換其它基因進(jìn)行菌苗改造。
6、根據(jù)以上項(xiàng)1所述的霍亂弧菌菌株，特征在于加入或替換其它rstR基因，和/或加入其它保護(hù)性抗原基因而構(gòu)建成腸道多價(jià)菌苗。
7、以上項(xiàng)1-6中任一項(xiàng)的霍亂弧菌菌株，它是IEM108。
8、以上項(xiàng)1-6中任一項(xiàng)的霍亂弧菌菌株在制備預(yù)防和/或治療霍亂的疫苗中的用途。
9、以上項(xiàng)1-6中任一項(xiàng)的霍亂弧菌菌株的一種制備方法，其特征是將所述thyA基因的PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒載體連接，再將ctxB基因連入，然后電擊入以不含CTX基因組的霍亂弧菌菌株為出發(fā)菌株構(gòu)建的thyA基因精確缺失的營養(yǎng)缺陷株，獲得含有重組質(zhì)粒的營養(yǎng)缺陷株。再將rstR基因的PCR產(chǎn)物連入重組質(zhì)粒，去除大部分氨卞抗性基因后，電擊入thyA基因精確缺失的營養(yǎng)缺陷株，獲得含有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。
10、制備生物安全性霍亂弧菌口服活菌苗的方法，其特征是將以上項(xiàng)1-6中任一項(xiàng)的菌株接種于普通LB(pH7.6)中，37℃培養(yǎng)所得的菌懸液直接口服，或按常規(guī)方法將該菌液凍干后，懸浮于0.85％Nacl溶液中即可。
本發(fā)明的詳細(xì)描述在實(shí)施方案中，本發(fā)明以天然不含CTX基因組的IEM101(它是從自然水體中篩選的一株天然不含CTX基因組的EVC菌苗候選株，對家兔、乳鼠、小白鼠等實(shí)驗(yàn)動物安全無毒，有較好保護(hù)力，人體志愿者一次口服免疫，可定居4-9天，能刺激機(jī)體產(chǎn)生血清和腸道局部特異性保護(hù)抗體，無明顯不良反應(yīng)和腹瀉現(xiàn)象)為出發(fā)菌株，利用基因重組技術(shù)以及質(zhì)粒-染色體致死平衡系統(tǒng)，構(gòu)建一高效、無毒并具備生物安全性的基因工程活菌苗。首先，利用同源重組技術(shù)精確缺失霍亂弧菌染色體上的thyA基因(胸苷酸合成酶基因)，進(jìn)而用以thyA基因?yàn)檫x擇壓力的染色體質(zhì)粒致死平衡系統(tǒng)高效表達(dá)介導(dǎo)噬菌體免疫的rstR基因和誘導(dǎo)抗毒免疫的ctxB基因，構(gòu)建成能表達(dá)CTB(霍亂毒素亞單位)，并能阻止CTXET感染而重獲毒力的霍亂弧菌抗菌抗毒口服活菌苗，并通過家兔主動保護(hù)試驗(yàn)評價(jià)其免疫原性和主動保護(hù)力；通過RstR抑制接合轉(zhuǎn)移率的方式來進(jìn)行其安全性評價(jià)。本發(fā)明的菌株已于2002年8月9日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No.0786。
本發(fā)明的內(nèi)容與要點(diǎn)本發(fā)明包括霍亂弧菌菌株、其構(gòu)建方法及使用方法。所說的霍亂弧菌菌株不僅可用作霍亂口服活菌苗菌株，還可用作廉價(jià)的表達(dá)系統(tǒng)，用于生產(chǎn)多肽、蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子等生物活性物質(zhì)及表達(dá)異源抗原構(gòu)建腸道多價(jià)菌苗。
一.thyA基因精確定位缺失的霍亂弧菌IEM101-T的構(gòu)建。菌苗的起始材料為天然不含CTXΦ基因組即無毒的O1群El Tor型霍亂弧菌IEM101菌株(中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院流行病學(xué)微生物學(xué)研究所保存)。利用自殺質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組技術(shù)精確定位缺失IEM101染色體上的thyA結(jié)構(gòu)基因內(nèi)部BglII+StyI 540bp的片段。IEM101-T在不含胸腺嘧啶的LB培養(yǎng)基中不生長，當(dāng)在培養(yǎng)基中添加胸腺嘧啶(最低值5μg/ml)或?qū)в型暾鹴hyA基因的質(zhì)粒電擊入其中均可恢復(fù)其在LB中的生長。
二.霍亂弧菌以thyA基因?yàn)檫x擇壓力的染色體-質(zhì)粒致死平衡系統(tǒng)的構(gòu)建。用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增大腸桿菌的thyA基因，將該P(yáng)CR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒載體pUC19上，再電擊入IEM101-T中，恢復(fù)IEM101-T在普通LB中的生長，從而認(rèn)為大腸桿菌的thyA基因能反式互補(bǔ)霍亂弧菌IEM101-T的功能缺陷。質(zhì)粒穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)證明其穩(wěn)定存在，且霍亂弧菌IEM101的thyA基因與大腸桿菌的thyA基因核苷酸酸同源性為32.8％，意味著兩個功能相同的基因發(fā)生再次同源重組的機(jī)率幾乎為零，保證了外源基因在該系統(tǒng)中的穩(wěn)定表達(dá)。
三.霍亂弧菌生物安全性抗菌抗毒口服活菌苗的構(gòu)建(圖3)。XbaI酶切質(zhì)粒pBR，獲取1.15kb的ctxB基因，將其連接到克隆有大腸桿菌thyA基因的pXXB106中thyA的下游得重組質(zhì)粒pUTBL1。GM1-ELISA檢測pUTBL1中ctxB表達(dá)情況。ctxB相對于thyA有兩種插入方向，分別選取ctxB表達(dá)良好的同向(pUTBL1-5)和反向(pUTBL1-6)克隆子電擊入IEM101-T中考察ctxB是否會影響thyA的表達(dá)進(jìn)而影響菌的生長，同時(shí)以IEM101作對照。細(xì)菌生長曲線表明同向克隆子pUTBL1-5能更好的反式互補(bǔ)IEM101-T的功能缺陷(圖2)，故用于進(jìn)一步克隆。將介導(dǎo)噬菌體免疫的rstR基因連入pUTBL1-5獲重組質(zhì)粒pUTBL2(

圖1)，經(jīng)限制性內(nèi)切酶切除大部分氨卞基因片段自連后電擊入IEM101-T，構(gòu)建成能夠抵抗CTXΦ感染的霍亂弧菌抗菌抗毒口服活菌苗IEM108。
四.本發(fā)明中菌株的特征1、IEM108的生物學(xué)性狀(1)血清型霍亂弧菌EVC小川型。
(2)生化反應(yīng)發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、半乳糖、麥芽糖、左旋糖、甘露醇、糊精和可溶性淀粉，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；不發(fā)酵木膠糖、水楊素、肌醇、衛(wèi)矛醇和阿拉伯糖；溶血試驗(yàn)陽性。
(3)噬菌體-生物型1a。
2、IEM108毒力測定家兔小腸節(jié)扎測毒將IEM108接種于5ml產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，37℃靜止培養(yǎng)48小時(shí)，離心集菌，菌沉淀用生理鹽水稀釋至108cfu，取1ml注入節(jié)扎腸段內(nèi)，同時(shí)分別以生理鹽水和產(chǎn)毒菌株569B作陰性和陽性對照，結(jié)果IEM108的腸段積液量為0ml/cm(大于1.0ml/cm為陽性)。
1、IEM108免疫原性檢測用IEM101和IEM108分別免疫家兔，檢測不同時(shí)期血清抗CT-IgG和血清殺弧菌抗體滴度，結(jié)果見表1和表2。
表1. 免疫后不同時(shí)期血清抗CTB-IgG抗體效價(jià)免疫 后 不 同 時(shí) 期(天)免疫菌株 6天10天 14天 21天 28天IEM1080 1168131551415514155IEM1010 0 0 0 0注表中數(shù)值為三只兔子血清效價(jià)的幾何平均值。
說明IEM108能較好地表達(dá)CTB，并刺激機(jī)體產(chǎn)生高滴度的抗體，具有良好的免疫原性。
表2. 免疫后不同時(shí)期血清殺弧菌抗體滴度免 疫 后 不 同 時(shí) 期(天)免疫菌 0天6天 10天 14天 21天 28天株IEM108 0 1401640180616401640IEM101 0 1401453164014531227注表中數(shù)值為各組抗體滴度的幾何平均值。
結(jié)果表明IEM101和IEM108均能刺激機(jī)體產(chǎn)生較高滴度的血清殺弧菌抗體，但在IEM108中抗毒免疫和抗菌免疫發(fā)生了協(xié)同作用，抗體滴度高，持續(xù)時(shí)間長，說明IEM108比IEM101更具優(yōu)勢。
1、家兔主動保護(hù)試驗(yàn)IEM101和IEM108經(jīng)兔腸道免疫28天后，用表3中所列的毒株及不同劑量的純品CT攻毒，兔腸段反應(yīng)見表3及圖4，5。
表3. 家兔主動保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果攻毒物與劑量 免疫菌的腸積液量(ml/cm)IEM101IEM108CT(μg)1 0.3 02 0.5(2/2) 03 0.9(2/2) 04 0.8(2/2) 0395(cfu)1070 01060 01050 0濱-43(cfu)1080.17 01070 01060 01050 01119(cfu)1080.34 01070 01060 0吳江-2(cfu)1080.86(1/2) 01070.17 01060 01050 0生理鹽水 0 0注括號中的分母為實(shí)驗(yàn)家兔數(shù)，分子為腸積液量≥0.5ml/cm的家兔數(shù)。腸道積液量≥0.5ml/cm判定為無保護(hù)作用，＜0.5ml/cm判定為有保護(hù)作用。
5.IEM108抵抗CTXET轉(zhuǎn)染的生物安全性評價(jià)IEM108的生物安全性通過該菌株內(nèi)存在的功能性rstR抑制具有同型RS區(qū)的重組自殺質(zhì)粒pKRSe的復(fù)制，從而降低其接合轉(zhuǎn)移入IEM108的頻率來評價(jià)，同時(shí)以克隆有不同型的古典型來源RS區(qū)的重組自殺質(zhì)粒pKRSn作對照。結(jié)果見表4。
表4. IEM101及IEM108的接合轉(zhuǎn)移率接 平均受體菌供體菌合 CmrGetr受體菌計(jì)接合轉(zhuǎn)移 接合次 菌計(jì)數(shù) 數(shù)(個率 轉(zhuǎn)移數(shù) (個/ml) /ml)率含pKRSn I 6.163×1055.77×1091.107×10-48.25的SM10II 3.18×1042.53×1081.257×10-4×10-5λpir III 1.46×1041.311×1091.114×10-4IEM101 含pKRSe I 1.213×1058.87×1091.368×10-52.0×的SM10II 1.300×1043.33×1083.901×10-510-5λpir III 2.506×1043.43×1097.3×10-6含pKRSn I 4.15×1022.43×1071.708×10-51.45的SM10II 7.25×1012.416×1073.0×10-6×105λpir III 1.75×1017.5×1052.333×10-5IEM108 含pKRSe I 0 7.933×10702.56的SM10II 0 6.78×1070 ×10-7λpir III 1.75×1012.28×1077.6×10-7從表中可以看出，就IEM101而言，pKRSn和pKRSe接合頻率相當(dāng)，均為10-5，而IEM108對兩者的接合頻率要相差兩個數(shù)量級，換個角度講，pKRSn接合入IEM108和IEM101的頻率相同，均為10-5，pKRSe接合入IEM108的頻率明顯低于IEM101，前者為10-7，后者為10-5，造成該差別的原因是IEM108中克隆的El Tor來源的rstR基因，該結(jié)果間接說明所克隆的rstR基因能有效阻止ElTor來源的CTX對IEM108的再感染，從而提高了IEM108的生物安全性，使其更具現(xiàn)場應(yīng)用的潛力和優(yōu)勢。
本發(fā)明在將rstR基因引入thyA平衡質(zhì)粒中時(shí)，考慮到目前的主要流行菌株仍為El Tor型菌株，另外也有O139菌株，而分子流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)O139菌株攜帶的溶原性噬菌體CTX幾乎都是CTXET。據(jù)目前所知，只有El Tor型菌株和O139菌株能自發(fā)或經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生感染性CTX顆粒。CTX溶原性的古典菌株還沒有產(chǎn)生CTX顆粒的報(bào)道(原因尚不明)。因此我們選擇將CTXET的rstR克隆入平衡質(zhì)粒中。另外，對IEM108采取質(zhì)粒-染色體致死平衡系統(tǒng)的策略，一方面是基于出發(fā)菌株IEM101本身對人體安全，可采取直接加入保護(hù)基因的菌苗構(gòu)建加法原則，另一方面用以pUC18為基本框架(去除了氨芐青霉素抗性)的平衡質(zhì)粒，可使克隆的基因高拷貝的表達(dá)，更重要的是可以方便地加入新的功能基因或替換其它基因，使對菌苗的改造變得容易，也就是我們可以方便地加入或替換其它rstR基因、以及加入其它保護(hù)性抗原基因而構(gòu)建腸道多價(jià)菌苗。
圖3是重組質(zhì)粒pUTBL3的構(gòu)建圖。
圖4是IEM101家兔主動免疫保護(hù)結(jié)果，1-4吳江-2 108-5cfu，9-111119 108-6cfu，15-18純品CT 1-4μg圖5是IEM108家兔主動免疫保護(hù)結(jié)果，5-8濱-43 108-5cfu，12-14395107-5cfu，19生理鹽水。
圖6是重組質(zhì)粒pUTBL1酶切鑒定結(jié)果
1.ctxB片斷2.pXXB106/XbaI3.λDNA/HindIII 4.pUTBL1/EcoRI5.pUTBL1/XbaI圖7是PCR檢測pUTBL2陽性克隆子1.濱-432-4.pUTBL2陽性克隆子5.λDNA/HindIII圖8是IEM101-T中提取的重組質(zhì)粒pUTBL3的酶切鑒定圖。
1.λDNA/HindIII2-5.IEM101-T中提取的重組質(zhì)粒pUTBL3圖9是重組質(zhì)粒pKRSe的構(gòu)建圖。
圖10是重組質(zhì)粒pKRSe酶切鑒定結(jié)果圖。
1.RS2片段 2.pKTN701/XbaI+SacI 3.λDNA/HindIII 4.pKRSe/SacI
實(shí)施例2.重組質(zhì)粒pUTBL1的構(gòu)建pXXB106質(zhì)粒為本室構(gòu)建的含有大腸桿菌thyA基因的重組質(zhì)粒(來自pUC19)，以此為出發(fā)質(zhì)粒將ctxB基因克隆入該質(zhì)粒。用XbaI從質(zhì)粒pBR中切取1.15kb的ctxB片段，透析袋純化后克隆入XbaI酶切并去磷酸化的pXXB106質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化JM109，涂氨芐抗性的LBA平皿，ctxB(1.15kb)探針原位雜交篩選陽性克隆子。隨機(jī)挑取10個陽性克隆子，提取質(zhì)粒，酶切鑒定如圖6所示。
實(shí)施例3.GM1-ELISA檢測pUTBL1中ctxB的表達(dá)情況在LB中擴(kuò)增上述隨機(jī)挑取的10個陽性克隆子，調(diào)整其OD600約為1.3左右，均收集3ml的菌液，菌沉淀用PBS洗兩次后再加0.3ml的PBS反復(fù)凍融五次，離心取上清待測。陰性對照為JM109，陽性對照為569B，結(jié)果顯示十個克隆子均可以較好地表達(dá)CTB，結(jié)果見表5。
表5. GM1-ELISA法檢測pUTBL1中CTB表達(dá)待檢菌株 OD600OD492P/NJM1091.3320.14 14(pUTBL1-1)JM1091.3680.12 12(pUTBL1-2)JM1091.3580.16 16(pUTBL1-3)JM1091.2830.33 33(pUTBL1-4)JM1091.3580.42 42(pUTBL1-5)JM1091.3520.44 44(pUTBL1-6)JM1091.3080.39 39(pUTBL1-7)JM1091.3760.38 38(pUTBL1-8)JM1091.2780.32 32(pUTBL1-9)JM109(pUTBL1-10 1.2960.31 31)569B 1.3220.07 7JM1091.3520.01 -實(shí)施例4.考察pUTBL1中thyA基因的反式互補(bǔ)作用考慮到pUTBL1中ctxB的插入方向可能會影響thyA基因的表達(dá)，進(jìn)而影響其對IEM101-T的功能互補(bǔ)作用，所以我們選擇了pUTBL1-5和pUTBL1-6兩個ctxB表達(dá)良好，但插入方向不同的克隆子電擊入IEM101-T，觀察其生長狀況。分別將IEM101-T(pUTBL1-5)、IEM101-T(pUTBL1-6)及IEM101單菌落在LB中培養(yǎng)到對數(shù)生長期，調(diào)整其OD600均為0.3左右。然后分別取300μl加入到含30mlLB的三角瓶中37℃振蕩培養(yǎng)，測定其不同培養(yǎng)時(shí)間的OD600，繪制生長曲線如圖2。從曲線可以看出，IEM101-T(pUTBL1-5)的生長曲線與IEM101基本一致，但I(xiàn)EM101-T(pUTBL1-6)生長曲線低伏，說明細(xì)菌生長緩慢，提示thyA的表達(dá)可能受到ctxB的影響，因而不能較好的實(shí)現(xiàn)功能互補(bǔ)，故我們選擇pUTBL1-5進(jìn)一步克隆。
實(shí)施例5.重組質(zhì)粒pUTBL2的構(gòu)建PCR擴(kuò)增O1群El Tor型國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)株濱-43的全長rstR基因，EcoRI酶切純化后連入EcoRI酶切并去磷酸化處理的PUTBL1-5質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化JM109，涂氨芐抗性的LBA平皿。用rstR引物PCR法檢測陽性克隆子，并提取質(zhì)粒酶切鑒定如圖1，圖7。rstR基因引物序列如下P上5’CCG AAT TCA CTC ACC TIG TAT TCG 3’P下5’CGG AAT TCT CGA CAT CAA ATG GCA TG 3’為克隆方便在引物的5’端加有EcoRI酶切位點(diǎn)，見劃線處。擴(kuò)增參數(shù)預(yù)變性94℃4分鐘；后續(xù)30個循環(huán)94℃30秒，63℃30秒，72℃40秒；最后72℃延伸6分鐘，擴(kuò)增產(chǎn)物長847bp。
實(shí)施例6.pUTBL2質(zhì)粒用PvuI酶切去除0.8kb的片段，破壞氨芐抗性基因后自連，連接產(chǎn)物電擊入IEM101-T受體菌，即完成菌苗構(gòu)建，命名為IEM108。將IEM108在普通LB中連續(xù)過夜培養(yǎng)25次，均能穩(wěn)定提取到質(zhì)粒pUTBL3，即pUTBL2去除氨芐抗性基因，見圖8。此時(shí)該質(zhì)粒的穩(wěn)定存在依賴于大腸桿菌的thyA基因?qū)魜y弧菌thyA缺失株的功能互補(bǔ)。
實(shí)施例7.重組質(zhì)粒pKRSe的構(gòu)建(圖9)用PstI對質(zhì)粒pCT5A11進(jìn)行其酶切，酶切產(chǎn)物純化后，3’突出端用T4 DNA聚合酶修平，再純化后用SacI切，取3.6kb的片段純化后備用。自殺質(zhì)粒載體pKTN701先用XbaI切，經(jīng)KlenowI大片段修平5’突出端，純化后再用SacI酶切，純化備用。載體和片段按1∶3的摩爾比例進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化SM10λpir，涂氯霉素抗性的LBA平皿，用rstR引物PCR法篩選陽性克隆子，提取質(zhì)粒酶切鑒定如圖10。
實(shí)施例8.接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)將分別含重組自殺質(zhì)粒pKRSn和pKRSe的大腸桿菌SM10λpir(供體菌)與受體菌IEM101和IEM108的單菌落在37℃活化過夜，以1∶100的比例各轉(zhuǎn)種到另一管3mlLB中，37℃振蕩培養(yǎng)2小時(shí)后按1∶9的比例混勻，低速離心集菌棄上清，菌沉淀用新鮮LB洗兩次后用適量LB重懸，取100-200μ1直接加到經(jīng)紫外線照射滅菌平貼于LBA平板表面的微孔濾膜上(0.45μm)，37℃培養(yǎng)6小時(shí)后，洗下膜上細(xì)菌，適當(dāng)稀釋后涂氯霉素抗性的慶大平皿。隨機(jī)挑取單菌落用pKTN701探針作菌落原位雜交，以IEM101(或IEM108)和含pKTNL的SM10作陰性和陽性對照，證實(shí)獲得的氯霉素、慶大霉素抗性(CmrGetr)菌落為已發(fā)生接合轉(zhuǎn)移的霍亂菌株。同時(shí)從膜上洗下的接合菌液10倍系列稀釋(通常稀釋到10-6-10-8)，涂不含氯霉素的慶大平皿，以確定接合體系中的受體菌數(shù)，計(jì)算接合轉(zhuǎn)移率。
本發(fā)明中所使用的限制性內(nèi)切酶、連接酶、地高辛試劑盒和化學(xué)試劑等均可在市場上購得。
權(quán)利要求
1.一種新型霍亂弧菌菌株，其特征在于導(dǎo)入了能夠介導(dǎo)噬菌體免疫的rstR基因和能夠誘導(dǎo)保護(hù)性抗毒免疫的ctxB基因，二者在已不含CTX基因組的霍亂弧菌菌株為出發(fā)菌株構(gòu)建的，以thyA基因?yàn)檫x擇壓力的質(zhì)粒染色體致死平衡系統(tǒng)中高效表達(dá)。
2.按照權(quán)利要求1所述的霍亂弧菌菌株，其特征是以IEM101為出發(fā)菌株，構(gòu)建thyA基因精確缺失的營養(yǎng)缺陷株IEM101-T。
3.按照權(quán)利要求1所述的霍亂弧菌菌株，其特征是用PCR方法獲得大腸桿菌的thyA基因和El Tor來源的rstR基因，ctxB基因系從質(zhì)粒pBR中酶切獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的霍亂弧菌菌株，特征在于用去除了氨芐青霉素抗性基因的平衡質(zhì)粒，使克隆的基因高拷貝的表達(dá)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的霍亂弧菌菌株，特征在于加入新的功能基因或替換其它基因進(jìn)行菌苗改造。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的霍亂弧菌菌株，特征在于加入或替換其它rstR基因，和/或加入其它保護(hù)性抗原基因而構(gòu)建成腸道多價(jià)菌苗。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的霍亂弧菌菌株，它是IEM108。
8.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的霍亂弧菌菌株在制備預(yù)防和/或治療霍亂的疫苗中的用途。
9.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的霍亂弧菌菌株的制備方法，其特征是將所述thyA基因的PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒載體連接，再將ctxB基因連入，然后電擊入以不含CTX基因組的霍亂弧菌菌株為出發(fā)菌株構(gòu)建的thyA基因精確缺失的營養(yǎng)缺陷株，獲得含有重組質(zhì)粒的營養(yǎng)缺陷株。再將rstR基因的PCR產(chǎn)物連入重組質(zhì)粒，去除大部分氨卞抗性基因后，電擊入thyA基因精確缺失的營養(yǎng)缺陷株，獲得含有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。
10.制備生物安全性霍亂弧菌口服活菌苗的方法，其特征是將權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的菌株接種于普通LB(pH7.6)中，37℃培養(yǎng)所得的菌懸液直接口服，或按常規(guī)方法將該菌液凍干后，懸浮于0.85％Nacl溶液中即可。
全文摘要
本發(fā)明提供了一可用于防治人霍亂病的具有生物安全性的口服活菌苗候選株IEM108。其特征在于以天然不含CTXφ基因組的El Tor型菌苗候選株IEM101為基礎(chǔ)，首先構(gòu)建以thyA基因?yàn)檫x擇壓力的霍亂染色體質(zhì)粒致死平衡系統(tǒng)，再將El Tor型來源的rstR基因?qū)肫渲?，以提高其阻止CTX
文檔編號C12N1/21GK1397639SQ0212941
公開日2003年2月19日 申請日期2002年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月21日
發(fā)明者闞飆, 梁未麗, 祁國明, 章麗娟, 李 杰, 劉延清, 高守一 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所