專利名稱：畜禽去勢基因疫苗(dna疫苗)的基因工程體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明為構建生產(chǎn)用于家畜和家禽去勢基因疫苗(DNA疫苗)的基因工程體，屬生物高新技術領域的尖端產(chǎn)品。
去勢俗稱閹割，動物去勢后，行為溫馴、飼料利用率高，增重快，肉質(zhì)好，管理方便。幾個世紀以來，一直采取用手術摘除性腺的方法去勢，但手術去勢易引起創(chuàng)傷、感染，造成意外損失。用于性成熟的動物則更危險。
應用免疫中和(HIN)技術免疫去勢不存在這種危險，不僅可用于幼年動物，也可用于性成熟的動物。這種方法，不但操作簡便，且避免了手術去勢導致的出血、感染及應激造成的體重下降。
免疫去勢主要應用促黃體激素釋放激素(LHRH)。LHRH為一種由10個氨基酸組成的10肽激素，是一種高位調(diào)節(jié)激素，它由高位調(diào)節(jié)中樞下丘腦所分泌，作用于垂體，促進黃體生成素(LH)和促卵泡激素(FSH)的釋放，而后者則作用于動物性腺，促使性器官發(fā)育成熟，刺激排卵和精子生成。
為了充分利用LHRH生物活性，人們合成了很多LHRH類似物，有些是高活性類似物，主要用于刺激排卵。有些頡頏性類似物，能競爭性與垂體細胞的LHRH受體結合，從而抑制內(nèi)源LHRH的作用，阻斷LH和FSH釋放，抑制排卵。但是，鑒于激素作用的特點，大量長期用藥必將帶來不良的副作用，故多已棄而不用。
代之而起的是抗LHRH的HIN技術。LHRH被抗體中和后，使垂體LH和FSH的合成和分泌下降，從而抑制性器官的發(fā)育，最終最致萎縮，達到免疫去勢目的。見

圖1。這一技術具有以下優(yōu)點①一次注射即能有效地維持較長時間；②調(diào)節(jié)內(nèi)源性激素的釋放，無需持續(xù)給藥，沒有發(fā)生副作用的可能性，也不引起激素殘留；③對性成熟的動物來說，具有可逆性，免疫力消失后，可恢復生殖能力和性功能；④使用方便，費用低廉，適于推廣應用。
20世紀80年代以來，應用LHRH合成肽疫苗主動免疫多種動物的研究已有報道。發(fā)明者之一杜念興教授于80年代后期，指導研究生開展去勢疫苗研究，最早是劉功平等將人工合成的LHRH共價連接于牛血清白蛋白上，制成合成肽疫苗，用以免疫2月齡公免。結果免疫性功能喪失，睪丸萎縮，生精細胞水泡樣變性，生精管內(nèi)無精子生成；抗LHRH抗體顯著升高，睪酮水平下降。用抗LHRH抗體被動疫亦可使LH和睪酮水平降至最低水平。外國已有LHRH合成肽疫苗出售，但主要用于人類，治療前列腺癌、前列腺增生和前列腺肥大。因其生產(chǎn)成本高，價格十分昂貴，在獸醫(yī)上無法應用。
為了降低制苗成本，又進一步研究畜用和禽用兩種去勢基因工程疫苗。并完成了在家蠶桿狀病毒中表達的重組桿狀病毒的篩選和鑒定工作。在蠶體表達后，表達產(chǎn)物-HBsAg/LHRH融合蛋白在電鏡下呈病毒樣顆粒，具有良好的免疫原性。
但由于該疫苗需用家蠶生產(chǎn)，不適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，且提取工藝煩瑣，成本成本昂貴，因而未能轉化為生產(chǎn)力。繼之，將該HBs/LHRH基因轉入大腸桿菌表達，亦因表達水平不高，提取困難，而放棄。最終又構建了以硫氧還蛋白(TRX)為載體的LHRH基因工程亞單位疫苗。不僅表達水平高，且提取方便，生產(chǎn)成本低廉，免疫效果良好。現(xiàn)已申請中試，有可能成為第一個進入市場的去勢基因工程苗。發(fā)明專利申請?zhí)?0107831.3。
由于生命科學發(fā)展神速，近年來被譽為第三代苗的新型基因疫苗(亦稱DNA疫苗)一面世就引起世界性的重視?；蛞呙缭趧游锛毎麅?nèi)能持續(xù)表達2～3個月，不斷分泌免疫原。強化免疫效果。一次免疫有效期可達5個月。這是基因疫苗的最大優(yōu)點。目前國內(nèi)外尚未見有動物去勢基因疫苗的報道。
本發(fā)明的目的是提供用于生產(chǎn)畜禽去勢基因疫苗的基因工程體。使其表達產(chǎn)物在動物體內(nèi)能組裝成呈顆粒性多價免疫原，在顆粒表面暴露有多個LHRH表位，其免疫原性優(yōu)于常規(guī)基因工程亞單位苗。且該基因工程體的質(zhì)粒能在動物細胞內(nèi)持續(xù)表達2～3個月，不斷分泌免疫原，一次注射即可達到免疫去勢的目的。可用發(fā)酵生產(chǎn)，回收菌體，提取質(zhì)粒后，即可直接配苗。工藝簡單，適于大規(guī)模生產(chǎn)。生產(chǎn)成本低廉，使用方便，無激素殘留，無潛在險危，安全性好。
本發(fā)明畜禽去勢基因疫苗的基因工程體，其特征在于將畜、禽2個型的促黃體激素釋放激素(LHRH)基因分別插入人乙肝表面抗原基因(HBs)的第223密碼子之后，構建成2株HBs/LHRH融合基因，并將其分別插入能在真核細胞內(nèi)持續(xù)表達的pcDNA3.1質(zhì)粒，轉化感受態(tài)大腸桿菌，構建成畜、禽2株基因工程體-E.coli-pcDNA3.1-HBs/LHRH(M)和E.coli-pcDNA3.1-HBs/LHRH(A)畜用去勢基因苗的基因工程體菌種分類大腸埃希氏桿菌命名E.coli-pcDNA3.1-HBs/LHRH(M)保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏地址中國.北京.中關村.2714信箱 郵政編碼100080保藏號0711禽用去勢基因苗的基因工程體菌種分類大腸埃希氏桿菌命名E.coli-pcDNA3.1-HBs/LHRH(A)保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏地址中國.北京.中關村.2714信箱 郵政編碼100080保藏號0710其主基因為LHRH基因，它是由10個氨基酸殘基的小肽分子，哺乳動物(mammal.M)的LHRH化學組成和結構完全相同，禽類(avian.A)LHRH的第8位氨基酸與哺乳動物不同。其氨基酸組成和密碼子如下LHRH(M) 基因12345678910pGlu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly-NH25’-CAG CAC TGG TCC TAT GGA CTG CGC CCT GGA-3’LHRH(A) 基因pGlu His Trp Ser Tyr Gly Leu Glu Pro Gly-NH25’-CAG CAC TGG TCC TAT GGA CTG CAG CCT GGA-3’本基因工程體的構建過程為1 pBS-LHRH質(zhì)粒的構建1.1人工合成LHRH基因為了便于基因的操作及以后與HBs基因的嵌合，試驗設計的LHRH基因中，在5’端加有BamHI酶切位點，3’末端加有2個終止密碼子及Hind III酶切位點。設計方案如下LHRH(M)基因5’-AAGGATCCTCAGCACTGGTCCTATGGACTGCGCCCTGGATAATGAAAGCTTAT-3’BamHI3’-TTCCTAGGAGTCGTGACCAGGATACCTGACGCGGGACCTATTACTTCGAATA-5’LHRH(A)基因終止子 Hind III5’-AAGGATCCTCAGCACTGGTCCTATGGACTGCAGCCTGGATAATGAAAGCTTAT-3’BamHI3’-TTCCTAGGAGTCGTGACCAGGATACCTGACGTCGGACCTATTACTTTCGAATA-5’終止子 Hind III按上述設計要求，人工合成L1、L2、L33條寡核苷酸片段。L1為畜型(M)和禽型(A)所共有的正鏈，L2為M型的負鏈，L3為A型的負鏈。正鏈和負鏈之間有9個堿基是互補的。M型 L15’-AAGGATCCTCAGCACTGGTCCTATGGACTG-3’L2 3’-ATACCTGACGCGGGACCTATTACTTTCGAATA-5’A型 L1 5’-AAGGATCCTCAGCACTGGTCCTATGGACTG-3’L3 3’-ATACCTGACGTCGGACCTATTACTTTCGAATA-5’將上述人工合成寡核苷酸片段L1和L2，L1和L3退火、延伸、補齊后，即成以上設計的LHRH(M)和LHRH(A)2個基因。1.2構建pBS-LHRH質(zhì)粒將上述LHRH(M)基因和LHRH(A)基因分別用BamHI和HandIII雙酶切，回收帶粘性末端的LHRH基因。提取pBS質(zhì)粒，用BamHI和HandIII雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，分別與LHRH(M)和LHRH(A)基因連接后，獲得2株pBS-LHRH質(zhì)粒。將其轉化感受態(tài)大腸桿菌。經(jīng)酶切鑒定和序列分析，證實構建成功。見圖2。2 pBS-HBs/LHRH質(zhì)粒的構建提取pWR13-HBs質(zhì)粒，以SacI及BglII雙酶切，電泳回收HBs酶切片段。
分別用SacI及BamHI雙酶切上述構建的pBS-LHRH(M)和pBS-LHRH(A)2種質(zhì)粒，電泳回收pBS-LHRHs質(zhì)粒大片段。
將HBs片段與pBS-LHRH(M)和pBS-LHRH(A)質(zhì)粒片段連接，形成pBS-HBs/LHRH(M)和pBS-HBs/LHRH(A)2個重組質(zhì)粒。
將pBS-HBs/LHRH(M)和pBS-HBs/LHRH(A)2個重組質(zhì)粒分別轉化大腸桿菌DH5a，經(jīng)酶切篩選獲得2株帶LHRH和HBs融合基因的2株重組大腸桿-Ecoli-HBs/LHRH(M)和Ecoli-HBs/LHRH(A)。
提取pBS-HBs/LHRH(M)和pBS-HBs/LHRH(A)質(zhì)粒，用Bgl II、BamHI、HindIII單酶切和用BamHI和HindIII雙酶切鑒定，并用雙脫氧終止法測序分析結果完全符合設計要求，表明重組質(zhì)粒構建成功。見圖5。3 pcDNA3.1-HBs/LHRH質(zhì)粒的構建3.1 PCR擴增HBs/LHRH融合基因合成HBs/LHRH融合基因引物上游引物 下游引物 從上述2株重組大腸桿菌分別提取pBS-HBs/LHRH(M)和pBS-HBs/LHRH(A)質(zhì)粒。引物L0+L1以pBS-HBs/LHRH(M)為模板；L0+L2以pBS-HBs/LHRH(A)為模板，分別作PCR，擴增出HBs/LHRH(M)和HBs/LHRH(A)2株融合基因。3.2 pcDNA3.1-HBs/LHRH質(zhì)粒和基因工程體構建從E.coli-pcDNA3.1(+)重組大腸桿菌提取pcDNA3.1質(zhì)粒。用HindIII和EcoRI雙酶切，回收質(zhì)粒片段，分別與同樣雙酶切的上述PCR擴增產(chǎn)物連接，獲得pcDNA3.1-HBs/LHRH(M)和pcDNA3.1-HBs/LHRH(A)2株重組質(zhì)粒；轉化感受態(tài)大腸桿菌，獲得E.coli-pcDNA3.1-HBs/LHRH(M)和E.coli-pcDNA3.1-HBs/LHRH(A)2株基因工程體。從該基因工程體提取質(zhì)粒，用BamHI酶切者質(zhì)粒不被切開，用HindIII和EcoRI酶切時，質(zhì)粒被切開，用HindIII和EcoRI雙酶切者，則可見一帶720bp大小的小帶，用于生產(chǎn)去勢DNA苗的2株基因工程體。從重組質(zhì)粒中插入基因的3′起測序，結果與原設計完全符合，表明用于生產(chǎn)去勢DNA苗的2株基因工程體構建成功。見圖6。
本發(fā)明所構建的基因工程體，經(jīng)大量發(fā)酵后，回收菌體，提取質(zhì)粒，即可用以配制家畜和家禽去勢DNA疫苗(基因疫苗)。本疫苗與現(xiàn)有同類產(chǎn)品相比具有以下優(yōu)點和積極效果1.本基因工程體的表達產(chǎn)物-HBs/LHRH融合蛋白能組裝成大小20mm左右的病毒樣顆粒(VLP)。在顆粒表面暴露多個LHRH抗原表位，是一種多價顆粒性抗原，其免疫原性優(yōu)于游離的單價或2價、3價抗原。將表達產(chǎn)物設計成多價顆粒性抗原是本研究的閃光點。
2.本疫苗中的表達質(zhì)粒能在宿主肌肉細胞或上皮細胞內(nèi)，持續(xù)表達2～3個月，不斷分泌免疫原，強化免疫效果。一次注射即可達到免疫去勢目的。細胞內(nèi)的重組質(zhì)粒DNA，停止表達后，即能自行降解，不整合細胞DNA沒有激素和其他殘留物，無潛在危險，安全性好。
3.基因工程體發(fā)酵后，回收菌體，提取質(zhì)粒，即可直接配苗。生產(chǎn)工藝簡便，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，成本低廉。生產(chǎn)過程中，不排毒，不散毒，不污染環(huán)境。
4.2種DNA苗分別用于家畜和家禽，應用面廣，用以替代手術去勢，市場前景十分寬廣。還可打入國際市場，換取外匯。
5.目前國外生產(chǎn)的去勢疫苗為合成肽苗，因生產(chǎn)成本高，故主要用于治療人前列腺癌，前列腺肥大和前列腺增生。每注射一針需人民幣1000元，隔20天注射一次，一個療程需注射5次。本疫苗完全可應用于人，用以替代國外進口的合成肽疫苗，一次注射，即可達到一個療程的效果。對性成熟的人來說，免疫有效期過后，即可恢復性功能。
圖1LHRH免疫調(diào)控原理圖2pBS-LHRH重組質(zhì)粒的構建圖3pBS-LHRH重組質(zhì)粒的酶切鑒定ApBS-LHRH BpBS-LHRH+SmaI CpBS-LHRH+BamHIDpBS-LHRH+Hind II EpBS-LHRH+PstI圖4pBS-LHRH重組質(zhì)粒的序列分析圖5pBS-HBs/LHRH重組質(zhì)粒的構建圖6pcDNA3.1-HBs/LHRH重組質(zhì)粒的構建取200μl轉化大腸桿菌，涂布含Amp 50mg/ml的LB瓊脂平板，同時設未轉化的感受態(tài)大腸桿菌作對照(陰性對照)，接種后置37℃液箱，培養(yǎng)18h。2.6重組質(zhì)粒的酶切鑒定在LHRH基因插入位點BamHI和HindIII中，尚有SamI和PstI 2個位點。挑選轉化后的單個菌落接種含Amp的LB肉腸培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，分別用BamHI、HindIII、SamI和PstI單酶切后作瓊脂糖電泳，結果SmaI和PstI酶切位點消失，而BamHI和HindIII仍存在，表明克隆成功。見圖2和圖3。2.7重組質(zhì)粒的序列分析經(jīng)篩選獲得的陽性重組質(zhì)粒，以BamHI和Hind III雙酶切的片段克隆入M13噬菌體中，提取單鏈測序，結果見圖4?？寺』虻膲A基序列與設計的CHRH(M)和LHRH(A)完全符合。表明pBS-LHRHs質(zhì)粒構建成功。3 LHRH基因與HBsAg基因的的融合和pBS-HBs/LHRHs質(zhì)粒的構建3.1 HBsAg基因的回收參照《分子克隆實驗指南》的介紹的方法，大量提取pWR13-HBs質(zhì)粒(由本組徐文忠提供)，以SacI及BglII雙酶切，電泳回收0.7kb左右的HBs酶切片段。3.2 pBS-LHRHs質(zhì)粒的酶切、回收大量提取上述構建的pBS-LHRH(M)和pBS-LHRH(A)2種質(zhì)粒，分別用SacI及BamHI雙酶，按2.2法電泳回收質(zhì)粒大片段。3.3連接按2.3法將HBs片段與pBS-LHRH(M)和pBS-LHRH(A)質(zhì)粒片段連接，形成pBS-HBs/LHRH(M)和nBS-HBs/LHRH(A)2個重組質(zhì)粒。3.4轉化按2.4、2.5、2.6等程序將上述2個質(zhì)粒分別轉化大腸桿菌DH5a，經(jīng)酶切篩選獲得2株帶LHRH和HBs融合基因的2株重組大腸桿菌——Ecoli-HBs/LHRH(M)和Ecoli-HBs/LHRH(A)。3.5酶切鑒定分別提取pBS-HBs/LHRH(M)和pBS-HBs/LHRH(A)質(zhì)粒，用BglII、BamHI、HindIII單酶切和用BamHI和HindIII雙酶切，SacI和BglII切下的HBs片段，其兩個粘性末端可分別與以SacI和BamHI酶切的pBS-LHRH粘性末端相連。連接后融合部位BglII及BamHI位點消失，而HBs的5’端仍有一BamHI位點，LHRH基因3’有一Hind III位點。結果BglII不能切開；BamHI和Hind III單酶切能將質(zhì)粒切開；而在雙酶切時，則可見一條720bp的HBs/LHRH融合基因帶。表明重組質(zhì)粒構建成功。3.6序列分析重組質(zhì)粒用雙脫氧終止法測序從基因的3’-端開始讀起，通讀LHRH的基因后即為融合基因的序列，乙肝病毒表面抗原基因3’-端經(jīng)過改造加入了BglII接頭，使整個基因的閱讀框架為1 2 3 4 217 218 219 220 221 222 223 SerAsp Pro5’-ATG GAG AAC ACA ---ATT TTC TTT TGT CCT TGG GTATAC GAT CCTHBsAg基因………………………………………………………………………………………………………BglII/BamHI1 2 3 4 5 6 7 8 9 10CAG CAC TGG TCC TAT GGA CTG CGC CCT GGATAA-3’LHRH基因……………………………………………………………………………Stop序列分析結果與之完全符合。表明重組質(zhì)粒pBS-HBs/LHRH(M)和pBS-HBs/LHRH(A)構建成功，見圖5。4 pcDNA3.1-HBs/LHRH質(zhì)粒和去勢基因工程體構建的構建4.1 合成HBs/LHRH融合基因引物設計2對HBs/LHRHs融合基因引物，上游引物(L0)共用，下游引物L1用于擴增HBs/LHRH(A)融合基因；DL2用于擴增HBs/LHRH(A)融合基因。引物設計如下上游引物L0 下游引物 上述引物由上海博采生物技術公司合成。4.2 提取pBS-HBs/LHRHs質(zhì)粒從重組大腸桿菌Ecoli-HBs/LHRH(M)和Ecoli-HBs/LHRH(A)參照《分子克隆指南》介紹的方法，提取pBS-HBs/LHRH(M)和pBS-HBs/LHRH(A)質(zhì)粒，供作PCR的模板DNA。4.3 PCR擴增HBs/LHRHs基因取10×反應緩沖液(含15mmol/L MgCl2)3μl，2.5mmol/L dTNP 2ml，TaqDNA聚合酶3μl(1U)，上游引物和下游引物各1μl，模板DNA0.1μg，加滅菌雙蒸水25μl，在反應管內(nèi)混勻，置TECHNIE公司GENINS自動PCR儀。反應條件94℃變性5min 1個循環(huán)；94℃變性40s，60℃復性40s，72℃延伸45s，30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。各取10μl PCR產(chǎn)物與marker一起經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳后，用溴化乙錠染色，在紫外燈下觀察?？梢娨粭l730pb左右的帶。4.4 pcDNA3.1質(zhì)粒的提取參照《分子克隆實驗指南》所介紹的方法，用堿裂解法進行，用RNA酶消化RNA，經(jīng)酚氯仿抽提除去RNA酶，無水乙醇沉淀后，加適量TE緩沖液溶解，即獲得純化的pcDNA3.1質(zhì)粒。4.5 pcDNA3.1質(zhì)粒的酶切、回收上述純化質(zhì)粒用Hind III和Eco RI雙酶切，參照2.2方法回收酶切后的大片段。4.6 連接和轉化按2.3和2.4所示方法將PCR擴增的HBs/LHRH(M)和HBs/LHRH(A)基因與pcDNA3.1質(zhì)粒連接，獲得pcDNA3.1-HBs/LHRH(M)和pcDNA3.1-HBs/LHRH(A)2株重組質(zhì)粒。并按2.5所示方法轉化感受態(tài)大腸桿菌，獲得Ecoli-pcDNA3.1-HBs/LHRH(M)和Ecoli-pcDNA3.1-HBs/LHRH(A)2株用于生產(chǎn)畜用和禽用的去勢DNA苗的基因工程體。4.7 重組質(zhì)粒的酶切鑒定用Hind III和EcoRI雙酶切后的HBs/LHRH基因片段與同樣酶切的表達質(zhì)粒pcDNA3.1連接后，Hind III和EcoRI位點仍保留，而二者之間的BamHI位點消失。從上述2株基因工程體中提取質(zhì)粒，分別用Hind III、EcoRI、BamHI單酶切和用Hind III與EcoRI雙酶切。見圖6。用BamHI酶切者質(zhì)粒不被切開，用Hind III和EcoRI酶切時，質(zhì)粒被切開，用Hind III與EcoRI雙酶切者，則可見一帶720bp大小的小帶。表明重組質(zhì)粒構建成功。4.8重組質(zhì)粒的序列分析從重組質(zhì)粒中插入基因的3’起測序。由上海博生物技術公司測定。結果與原設計完全符合，表明生產(chǎn)畜用和禽用2株去勢DNA苗的基因工程體構建成功。見圖6。5生產(chǎn)和應用本發(fā)明提供的基因工程體大量發(fā)酵增殖后，回收重組大腸桿菌，提取質(zhì)粒，即可用于配制去勢基因疫苗。用以免疫性器官尚未發(fā)育的家畜或家禽，該重組質(zhì)粒能在宿主細胞內(nèi)持續(xù)表達HBs/LHRH融合蛋白2～3個月。誘導產(chǎn)生LHRH抗體，中和LHRH活性，抑制促黃體生成素(LH)和促卵泡激素(FSH)的合成和分泌，從而使性器官(睪丸和卵巢)發(fā)育停止，變性萎縮。一次注射即可達到免疫去勢目的?？杀苊馐中g去勢有可能引起創(chuàng)傷感染等不安全因素。即簡易快速，而又安全、可靠。
權利要求
1.本發(fā)明畜禽去勢基因疫苗(DNA疫苗)的基因工程體，其特征在于將畜、禽2個型的促黃體激素釋放激素(LHRH)基因分別插入人乙肝表面抗原基因(HBs)的第223密碼子之后，構建成2株HBs/LHRH融合基因，并將其分別插入能在真核細胞內(nèi)持續(xù)表達的pcDNA3.1質(zhì)粒，轉化感受態(tài)大腸桿菌，構建成畜、禽2株基因工程體-E.coli-pcDNA3.1-HBs/LHRH(M)和E.coli-pcDNA3.1-HBs/LHRH(A)畜用去勢基因苗的基因工程體菌種分類大腸埃希氏桿菌命名E.coli-pcDNA3.1-HBs/LHRH(M)保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏地址中國.北京.中關村.2714信箱 郵政編碼100080保藏號0711禽用去勢基因苗的基因工程體菌種分類大腸埃希氏桿菌命名E.coli-pcDNA3.1-HBs/LHRH(A)保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏地址中國.北京.中關村.2714信箱 郵政編碼100080保藏號0710
2.根據(jù)權利要求1所述的基因工程體，其特征在于由以下方法構建而成2.1 pBS-CHRH質(zhì)粒的構建首先人工合成畜型和禽型2個CHRH基因，設計的通式為5′-保證性堿基-內(nèi)切酶-保護框架堿基-LHRH基因-終止子-內(nèi)切酶-保護性堿基-3′具體設計如下LHRH(M)基因5′-AAGGATCCTCAGCACTGGTCCTATGGACTGCGCCCTGGATAATGAAAGCTTAT-3′BamHI3′-TTCCTAGGAGTCGTGACCAGGATACCTGACGCGGGACCTATTACTTCGAATA-5′終止子 HindIIILHRH(A)基因5′-AAGGATCCTCAGCACTGGTCCTATGGACTGCAGCCTGGATAATGAAAGCTTAT-3′BamHI3′-TTCCTAGGAGTCGTGACCAGGATACCTGACGTCGGACCTATTACTTTCGAATA-5′終止子 HindIII將上述2個型的LHRH基因分別插入pBS表達質(zhì)粒，分別構建成畜型和禽型pBS-LHRH質(zhì)粒，轉化感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)酶切鑒定和序列分析，證實構建成功；2.2 pBS-HBS/LHRH質(zhì)粒構建 從本課題保存的重組大腸桿菌-E.coli-pWR13-HBs，提取pWR13-HBs質(zhì)粒，酶切、回收HBs片段，插入上述構建pBS-LHRH(M)和pBS-LHRH(A)2種質(zhì)粒，構建成pBS-HBs/LHRH(M)和pBS-HBs/LHRH(A)2個重組質(zhì)粒，分別轉化大腸桿菌DH5a，獲得2株重組大腸桿菌-Ecoli-HBs/LHRH(M)和Ecoli-HBs/LHRH(A)，經(jīng)酶切鑒定和序列分析，結果完全符合設計要求，表明重組質(zhì)粒構建成功；2.3 pcDNA3.1-HBs/LHRH質(zhì)粒和基因工程體的構建 根據(jù)權利要求1基因設計通式，合成L0、L1和L23條引物上游引物 下游引物 L0和L1可擴增出畜型HBs/LHRH融合基因；L0和L2可擴增出禽型HBs/LHRH融合基因；以pBS-HBs/LHRH質(zhì)粒為模板，分別用L0和L1和L0和L2做引物，用PCR擴增出畜、禽2個型的HBs/LHRH融合基因，插入pcDNA3.1質(zhì)粒，獲得pBS-HBs/LHRH(M)和pBS-HBs/LHRH(A)2株重組質(zhì)粒，轉化感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)酶切鑒定和序列分析，證實本發(fā)明基因工程體-E.coli-pcDNA3.1-HBs/SS構建成功。
全文摘要
本發(fā)明畜禽去勢基因疫苗(DNA疫苗)的基因工程體,屬生物高新技術領域。其構建過程是:人工合成畜型的LHRH(M)和禽型LHRH(A)基因,構建pBS－LHRH質(zhì)粒。然后從pWR－HBs質(zhì)粒,切下HBs片段,將其插入pBS－LHRH質(zhì)粒,構建成pBS－HBs/LHRH質(zhì)粒。最后,用PCR從pBS－HBs/LHRH質(zhì)粒中,擴增出HBs/LHRH融合基因片段,將其插入pcDNA3.1質(zhì)粒,獲得pcDNA3.1－HBs/LHRH(M)和pcDNA3.1－HBs/LHRH(A)2株重組質(zhì)粒。分別轉化大腸桿菌,即構建成本發(fā)明的基因工程體——Ecoli－pcDNA3.1－HBs/LHRH(M)和Ecoli－pcDNA3.1－HBs/LHRH(A)。圖為:pcDNA3.1－HBs/LHRH重組質(zhì)粒構建。
文檔編號C12N15/79GK1384200SQ0210372
公開日2002年12月11日 申請日期2002年3月13日 優(yōu)先權日2002年3月13日
發(fā)明者杜念興, 李光富 申請人:杜念興, 李光富