專利名稱：含抗體乳的除菌方法以及含有除菌處理后的含抗體乳的制品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含抗體乳的除菌方法，以及含有通過該方法除菌后的含抗體乳的免疫賦活劑以及食品、飲料、營養(yǎng)補(bǔ)充劑、飼料、餌料、藥品、保健品和化妝品。
背景技術(shù)：
含抗體乳(又稱為“免疫乳”)，例如在涉及抑制胃腸道的混合細(xì)菌感染的特開昭54-113425號(hào)公報(bào)，或在涉及抗炎劑的特開昭57-188523號(hào)公報(bào)中公開的那樣，是給牛接種由26種細(xì)菌制造的疫苗使之免疫后由牛乳制造的物質(zhì)，是無限接近于人的母乳的自然食品。
眾所周知所述含抗體乳中以高活性狀態(tài)含有將人易感染的多種細(xì)菌無害化的抗體成分和抗炎因子等功能性成分，因此對(duì)于風(fēng)濕、高血壓、高膽固醇、變態(tài)反應(yīng)、便秘等有效，能夠增強(qiáng)老年人和癌癥患者等的免疫力。
另外，也在討論口服攝取含抗體乳預(yù)防輪狀病毒感染的可能性。據(jù)說口服給予抗輪狀病毒抗體對(duì)于預(yù)防病毒感染有效，而且抗體具有高抗體效價(jià)和中和活性時(shí)，也可以期待某種程度的治療效果。(T.Ebina等，Med.Microbiol.Immunol.，174，177(1985)；H.Hilpert等，J.Infect.Dis.，156，158(1987))而且，最近本申請(qǐng)的發(fā)明人之一鈴木等提示通過用免疫的6種腸道病毒(CVA9、CVA16、CVB3、CVB5、E11和E18)中，特別是眾所周知由病毒引發(fā)心肌炎、心房心肌炎的CVB3的抗原進(jìn)行免疫得到的含抗體乳被動(dòng)免疫，能夠提高腸道粘膜的防御功能(鈴木等，“感染癥學(xué)雜志(The Journal of the Japanese Association for InfectiousDiseases)”，第73卷第2號(hào)，第122～129頁(1998))。
如上所述，含抗體乳對(duì)于預(yù)防或治療各種疾病具有很大的可能性。但是，多數(shù)情況下擠奶得到的含抗體乳中含有雜菌，因此不能直接飲用或添加到各種食品中，與一般的牛乳制造中所負(fù)有的義務(wù)同樣，必須進(jìn)行滅菌或除菌處理。
這時(shí)，考慮適用一般的牛乳制造中使用的加熱滅菌法。但是，根據(jù)考察加熱滅菌后乳中抗體活性消失的結(jié)果，采用63℃、30分鐘低溫滅菌(保持滅菌)法，抗體活性減少到6～8成，而且如果采用130℃、2秒以上的超高溫滅菌法(通常市售的牛乳的滅菌處理法；ultra-hightemperature heating“UHT”)，抗體活性完全失活。因此，加熱滅菌后將含抗體乳用于飲料等時(shí)，不得不采用低溫滅菌法(特開平4-66050號(hào)公報(bào)；大田賓，“化學(xué)與生物(Kagaku to Seibutsu)”37(2)，107-112(1999))。
但是，采用低溫滅菌法未必可以說是能夠充分滅菌，恐怕殘留的菌會(huì)繁殖，因此在保存性方面存在難點(diǎn)，另外還存在約內(nèi)氏病(Johne’sdisease)等公共衛(wèi)生方面的問題。
因此，討論適用不需要加熱的過濾除菌法。作為除菌對(duì)象的菌體的大小為1～5μm。但是，即使使用篩分濾器型的孔徑為1μm以下的膜濾器，也不能充分除菌，另一方面，如果使濾器的孔徑更小，則堵塞問題變得嚴(yán)重，在實(shí)用方面存在問題。
因此，需要開發(fā)一種新型過濾除菌法，其抗體的透過率優(yōu)良，另一方面滿足既能夠完全除菌又能夠防止濾器堵塞兩方面要求。
發(fā)明公開本發(fā)明的目的在于提供一種過濾除菌的方法，能夠保持含抗體乳的抗體活性，同時(shí)能夠有效地過濾除去乳中的雜菌，達(dá)到近似無菌的狀態(tài)。
另外，本發(fā)明的課題在于提供一種以在保持抗體活性的同時(shí)除菌后的含抗體乳作為有效成分的免疫賦活劑，以及添加了含抗體乳的食品、飲料、營養(yǎng)補(bǔ)充劑、飼料、餌料、藥品、保健品和化妝品。
本發(fā)明人等不僅悉心研究了用于過濾除菌的濾器的孔徑，而且也悉心研究了濾器層的結(jié)構(gòu)等，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過使用特定微孔濾器的過濾除菌法，能夠得到與加熱滅菌幾乎同等水平的無菌或近似無菌的含抗體乳，從而完成了本發(fā)明。
也就是說，本發(fā)明涉及含抗體乳的除菌方法，其特征在于，從用選自病原體或其代謝產(chǎn)物的1種或2種以上抗原致敏使體內(nèi)產(chǎn)生抗體的?？苿?dòng)物擠取的含抗體乳的除菌處理中，進(jìn)行脫脂處理后，使用陶瓷微粒形成的，包括具有濾孔且厚度為40～150μm的濾膜以及支撐體的微孔濾器進(jìn)行過濾。
另外，本發(fā)明還涉及上述除菌方法，其特征在于，陶瓷微粒的平均粒徑為0.2～2.0μm，濾孔的平均孔徑為0.4～2.0μm，上述微孔濾器采用交叉流動(dòng)方式。
另外，本發(fā)明還涉及上述除菌方法，其中，微孔濾器是SteriloxMF(法國Societe des Ceramiques Techniques公司的商標(biāo))。
另外，本發(fā)明還涉及上述除菌方法，其中，病原體是引發(fā)消化系統(tǒng)或呼吸系統(tǒng)疾病的細(xì)菌或病毒。
而且，本發(fā)明還涉及免疫賦活劑，其中含有采用上述方法除菌處理后的含抗體乳作為有效成分。
另外，本發(fā)明還涉及食品、飲料、營養(yǎng)補(bǔ)充劑、飼料、餌料、藥品、保健品和化妝品，其中含有采用上述方法除菌處理后的含抗體乳。
以下，詳細(xì)說明本發(fā)明。
(1)含抗體乳是從以細(xì)菌、病毒、真菌、立克次氏體等病原體(特別是消化系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的感染性細(xì)菌、病毒)及其代謝產(chǎn)物作為抗原，促升給予(booster dose；追加抗原給予)后的雌性?？苿?dòng)物擠取的乳。
作為所述含抗體乳，優(yōu)選將疫苗給予雌性?？苿?dòng)物使之致敏后，以致敏細(xì)菌或病毒及其代謝產(chǎn)物作為抗原，給予充分量，然后由該動(dòng)物擠取的乳。
本發(fā)明中，作為使雌性牛等致敏的抗原，可以例舉使誘發(fā)感染癥的細(xì)菌或病毒等病原體本身、以及這些病原體的代謝產(chǎn)物等的1種或2種以上無害化(失活)得到的疫苗。
其中，作為形成抗原的細(xì)菌，可以例舉金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、化膿性鏈球菌A型、產(chǎn)氣菌、大腸菌、腸炎菌、綠膿桿菌、肺炎桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、綠色鏈球菌、普通變形桿菌、痢疾桿菌、鏈球菌B群、肺炎雙球菌、變異鏈球菌、痤瘡菌等。
另外，作為病毒，可以例舉腸道病毒、輪狀病毒、口蹄疫(手足口病)病毒、流感病毒等，但是在本發(fā)明中并不限于此，而且也不限于各種病毒的任何一種類型。
另外，作為用含有上述所有細(xì)菌性和病毒性抗原的抗原制作的多效疫苗免疫的雌性?？苿?dòng)物，可以例舉牛、山羊和羊等，沒有特別的限定。
作為抗原給予的細(xì)菌性抗原量通常為1×106～1×1020個(gè)，優(yōu)選108～1010個(gè)。
用于免疫的病毒量為0.001mg～100mg/1次，優(yōu)選0.1mg～10mg/1次。
本發(fā)明的免疫可以按照常規(guī)方法進(jìn)行。免疫一般通過間隔給定的時(shí)間將給定量的抗原注射到?？苿?dòng)物的適當(dāng)部位進(jìn)行。間隔給定的免疫間隔，進(jìn)行部分采血，測(cè)定抗體的效價(jià)，同時(shí)繼續(xù)免疫達(dá)到所需的效價(jià)，在抗體達(dá)到所需的效價(jià)后結(jié)束免疫。另外，為了提高抗體效價(jià)，有必要反復(fù)給予抗原獲得追加免疫，上述免疫間隔是指為了所述追加免疫給予抗原的間隔。
從如上所述使體內(nèi)產(chǎn)生抗體后的?？苿?dòng)物擠取的乳(含抗體乳)根據(jù)需要除去對(duì)人體顯示毒性活性的細(xì)菌性毒素或者進(jìn)行解毒。
細(xì)菌性毒素，特別是發(fā)熱性毒素，由脂多糖(LPS)代表的來源于革蘭氏陰性細(xì)菌的內(nèi)毒素(endotoxin)以及超級(jí)抗原代表的來源于革蘭氏陽性細(xì)菌的外毒素構(gòu)成。
這些細(xì)菌性毒素是食物中毒或發(fā)熱等的原因，而且嚴(yán)重的情況下有時(shí)會(huì)導(dǎo)致患者休克或死亡。
內(nèi)毒素大致能夠通過用反滲透膜或超濾膜過濾除去，但是由于內(nèi)毒素與抗體的分離困難，一般情況下膜過濾法不適用于含抗體乳。
另一方面，作為通過吸附除去內(nèi)毒素的方法，只要是使六亞甲基二異氰酸酯與固定有多粘菌素B等抗生素的纖維交聯(lián)瓊脂糖珠粒反應(yīng)得到的珠粒(特開平4-114661號(hào)公報(bào)；東レ社制“トレミキシソ”)、固定有組氨酸或其衍生物的材料(例如，氨基酸、亞氨基二乙酸、含氮雜環(huán)化合物(特開昭54-183172號(hào)公報(bào)等))以及透明質(zhì)酸和陰離子樹脂構(gòu)成的材料(特開昭54-67024號(hào)公報(bào))等含有以前公知的化合物等吸附來源于革蘭氏陰性細(xì)菌的內(nèi)毒素的材料，沒有特別的限定，均可以用于吸附毒素。
來源于革蘭氏陽性細(xì)菌的外毒素已知金黃色葡萄球菌的外毒素(腸毒素A、B、C或中毒性休克綜合癥毒素-1)等。作為其特征，多為分泌型的蛋白質(zhì)性外毒素。只要是含有帶脲鍵或硫脲鍵的化合物(特開平10-85330號(hào)公報(bào)，特開平10-147533號(hào)公報(bào)，特開平10-225515號(hào)公報(bào))等以前公知的化合物，吸附來源于革蘭氏陽性細(xì)菌的外毒素的吸附結(jié)構(gòu)，沒有特別的限定，均可用作這些外毒素的吸附結(jié)構(gòu)。
(2)脫脂處理擠取的含抗體乳中的脂肪球徑分布通常為0.1～22μm，平均為3μm。另一方面，作為除菌對(duì)象的雜菌的菌體大小如上所述通常為1～5μm，因此與脂肪球大小幾乎相同。因此，使用濾膜根據(jù)大小進(jìn)行分離很困難，因而作為采用微孔濾器的精密過濾處理的前階段，有必要進(jìn)行脫脂處理，例如使用離心分離機(jī)根據(jù)比重的差異分離脂肪球與乳中的抗體或酪蛋白(0.04～0.3μm)。
(3)過濾除菌處理使用下述特定的微孔濾器，對(duì)通過上述脫脂處理得到的乳脂肪成分0.1％以下的脫脂乳進(jìn)行過濾除菌，制造除菌后的含抗體乳。
微孔濾器，包括支撐濾膜的支撐體，整體由氧化鋁等陶瓷制。其濾器部分是陶瓷微粒凝集形成，且具有濾孔的厚度為40～150μm，優(yōu)選60～100μm的濾膜。這種厚度的濾膜可以通過將2張或3張以上厚度薄的濾膜層壓制作。
該微孔濾器優(yōu)選供給液(濃縮液)流動(dòng)的方向與透過液流動(dòng)的方向正交的方式，即所謂交叉流動(dòng)(十字流)方式。
在既能提高除菌率又能防止堵塞的方面，微孔濾器的陶瓷微粒的平均粒徑優(yōu)選為0.2～2.0μm，特別優(yōu)選0.4～1.8μm，濾器的平均孔徑優(yōu)選為0.4～2.0μm，特別優(yōu)選0.8～1.6μm。
作為滿足所述條件的微孔濾器，有法國Societe des CeramiquesTechniques(簡(jiǎn)稱SCT)公司制造的“Sterilox MF(商標(biāo))”，可以購入使用。
適于本發(fā)明方法的微孔濾器的結(jié)構(gòu)例如如圖1所示。
圖1是也能表示內(nèi)部結(jié)構(gòu)的微孔濾器的部分截面?zhèn)纫晥D以及濾膜的截面結(jié)構(gòu)的放大圖。微孔濾器(1)具備多根沿箭頭方向流動(dòng)的供給液的流路(4)，各流路(4)周圍的界面由濾膜層(2)以及支撐它的網(wǎng)眼稀疏的陶瓷制支撐體(3)構(gòu)成，濾膜層(2)通過將由非常細(xì)小的陶瓷微粒形成且具有濾孔的濾膜第2層(2a)和濾膜第1層(2b)層壓得到。流路(4)中流入的含抗體乳(6)中抗體和酪蛋白通過濾膜(2)，另一方面，含有大量雜菌的濃縮液(5)直接被排出，分離雜菌。另外，也可以循環(huán)對(duì)濃縮液進(jìn)行再次過濾。
雜菌的菌體大小通常為1～5μm，由于濾膜的空隙不一致，且其厚度為40～150μm，因此即使是比濾孔小的雜菌也不能通過濾器，可以從含抗體乳中分離出來。
而且，如果使用交叉流動(dòng)型濾器，使乳沿著濾膜的表面平行地高速流動(dòng)，分離成通過膜的透過液和不通過膜而濃縮的濃縮液，則能夠防止雜菌引起微的孔濾器堵塞，除菌效率高，而且能夠進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定的過濾除菌處理。
圖2是表示過濾除菌處理的一個(gè)實(shí)例的流程圖。也就是說，含抗體乳從原乳罐(11)通過泵(12)經(jīng)由熱交換器(13)加熱至適當(dāng)?shù)姆蛛x溫度后，輸送至離心分離機(jī)(14)，分離成脂肪成分和脫脂乳。接著，脫脂乳通過泵(15)經(jīng)由熱交換器(16)加熱至適當(dāng)?shù)姆蛛x溫度，通過泵(17)輸送至微孔濾器(18)。通過濾膜的透過液是除去了雜菌的乳。另一方面，未通過膜的濃縮液是含雜菌多的乳。
采用交叉流動(dòng)方式過濾的場(chǎng)合，乳透過濾膜的力是透過液側(cè)的壓力與濃縮液側(cè)的壓力的壓差(trans-membrane pressure)引起的，這會(huì)使膜整體產(chǎn)生壓力損失。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)已知采用低壓差運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)能夠?qū)е履さ亩氯舆t等優(yōu)良的性能。因此，使用交叉流動(dòng)方式的微孔濾器時(shí)，為了使膜整體以最適條件進(jìn)行運(yùn)轉(zhuǎn)，通常優(yōu)選用小的塑料球填充作為空洞的透過液側(cè)的通路，并用泵調(diào)整透過液側(cè)的壓力，使過濾膜的外側(cè)象濃縮液側(cè)那樣以平行流高度循環(huán)，通過微孔濾器的全部流路使?jié)饪s液側(cè)的壓力與透過液側(cè)的壓力的差(壓差)達(dá)到一定，通過“一定壓差(uniform trans-membrane pressureUTP)”使過濾裝置運(yùn)轉(zhuǎn)。
另外，已知微粒或微生物等多種物質(zhì)在水中浸漬時(shí)具有特有的ζ電位(界面動(dòng)電勢(shì))，因此也可以使微孔濾器成為具有ζ電位的濾器，同時(shí)利用電吸附效果。
作為微孔濾器過濾步驟，可以適當(dāng)選擇將含抗體乳用微孔濾器僅過濾1次的方法、將通過微孔濾器的透過液用微孔濾器再過濾1次或數(shù)次的方法、使?jié)饪s液返回至原料側(cè)再次循環(huán)至微孔濾器的方法等通常用微孔濾器處理的方法。
希望維持高除菌率的場(chǎng)合，可以通過反復(fù)過濾實(shí)現(xiàn)這一目的。
除菌過濾處理時(shí)乳的溫度優(yōu)選為40～55℃，特別優(yōu)選為45～50℃。這是因?yàn)橥ㄟ^將乳加熱，脂肪球容易變形，從而容易透過。加熱低于40℃時(shí)，上述效果少，超過55℃時(shí)恐怕會(huì)導(dǎo)致成分的變化，因此希望在加熱進(jìn)行微孔濾器處理后，盡可能迅速地將透過液冷卻。
另外，過濾除菌后的含抗體乳可以通過制成粉末，在保持高抗體效價(jià)的同時(shí)，長(zhǎng)時(shí)間保存，例如1年以上。
作為粉末化的方法，優(yōu)選不進(jìn)行加熱處理的冷凍干燥(FD)法或50℃以下的減壓噴霧干燥法，這樣不會(huì)使抗體效價(jià)降低。
通過將這樣得到的液狀或粉狀的過濾除菌后的含抗體乳適當(dāng)添加混合在各種原料中，可以制造免疫賦活劑以及帶有抗體的食品、飲料、營養(yǎng)補(bǔ)充劑、飼料、餌料、藥品、保健品和化妝品。
(4)免疫賦活劑本發(fā)明的免疫賦活劑可以適用于預(yù)防、治療或緩解感染癥。作為免疫賦活劑的劑型，可以采用藥品領(lǐng)域公知的任意形態(tài)。例如，除液體制劑以外，還可以制成片劑、膠囊(如果是顯示腸溶性的材料，則更優(yōu)選)粉末、溶膠、凝膠、顆粒和用脂質(zhì)體包合等劑型。
制成各種制劑時(shí)，能夠以藥學(xué)上允許的量使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種賦形劑或添加劑等。根據(jù)其形態(tài)和制劑形態(tài)等，可以采用各種給藥途徑給藥，例如口服或者經(jīng)由靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)和鼻咽等給藥。
另外，對(duì)于口服攝取困難的疾病患者等，也可以作為用于經(jīng)肛門給藥或經(jīng)鼻飼管、腸道直接給藥等的營養(yǎng)補(bǔ)充劑使用。
(5)在食品等中的使用如上所述除菌處理后的含抗體乳可以添加到食品等中，提高這些物質(zhì)的附加價(jià)值。
食品可以采取固體、液體、溶膠、凝膠、粉末和顆粒等所有形態(tài)，可以采用本技術(shù)領(lǐng)域公知的任意制法制造。例如西式點(diǎn)心類、日式點(diǎn)心類、中式點(diǎn)心類、冰點(diǎn)心、冷食品、餐后甜點(diǎn)、酸乳酪、油脂類、乳制品奶油類、醬類(paste)、畜肉(或魚肉)制品類、魚肉膏制品、山珍海味類、填塞菜品、用調(diào)料煮的魚貝類小菜、肉類加工品、面類、調(diào)料等。
可以添加的飲料主要是牛奶、果實(shí)飲料，以及液體酸乳酪、乳酸菌飲料(直接飲用)、酸乳飲料(稀釋用)等乳性飲料，甜酒等米曲飲料，豆奶、咖啡、可可茶等種實(shí)類飲料，未發(fā)酵茶(綠茶)、半發(fā)酵茶(烏龍茶)、發(fā)酵茶(紅茶)等芽葉類飲料，以及碳酸飲料等。
藥品可以采用本技術(shù)領(lǐng)域公知的任意形態(tài)。例如除液體制劑以外，還可以制成片劑、膠囊(如果是顯示腸溶性的材料，則更優(yōu)選)粉末、溶膠、凝膠、顆粒和用脂質(zhì)體包合等的劑型。
制成各種制劑時(shí)，能夠以藥學(xué)上允許的量使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種賦形劑或添加劑等。根據(jù)其形態(tài)和制劑形態(tài)等，可以采用各種給藥途徑給藥，例如口服或者經(jīng)由靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)和鼻咽等給藥。
另外，對(duì)于口服攝取困難的疾病患者等，也可以作為用于經(jīng)肛門給藥或經(jīng)鼻飼管、腸道直接給藥等的營養(yǎng)補(bǔ)充劑使用。
保健品是指藥事法第2條定義的口中清涼劑、腋臭防止劑、痱子粉類、生發(fā)劑(養(yǎng)發(fā)劑)、除毛劑、染發(fā)劑、浴用劑、藥用化妝品和藥用牙膏類等。
齲齒菌的抗體等可以用于牙膏、漱口水和口香糖等口腔用組合物。
而且，作為家畜、家禽和魚等飼養(yǎng)動(dòng)物的高活性免疫賦活劑，可以混合到飼料、餌料、藥品等中。
另外，可以將齲齒菌的抗體添加到口腔用組合物中，且可以將抗毛發(fā)角蛋白抗體(H.UchiwaJ.Soc.Cosmet.Chem.，48，209(1997))、痤瘡菌的抗體等添加到化妝品、藥品相關(guān)的商品中。
本發(fā)明中使用的香料包括食品、營養(yǎng)補(bǔ)充劑、飼料、餌料、藥品、保健品和化妝品等用的香料。香料能夠以香精(水溶性香料)、油(油溶性香料)、乳化香料、粉末香料等各種形態(tài)使用。
含有采用本發(fā)明的過濾除菌方法得到的含抗體乳是指可以在例如飲食品等的制造結(jié)束前的工序中使飲食品等含有含抗體乳，作為其方法，可以適當(dāng)選擇例如50℃以下的低溫下混合、分散等公知的方法。
另外，添加含抗體乳之后，應(yīng)盡快冷卻至室溫以下。
本發(fā)明的免疫賦活劑能夠以食品、營養(yǎng)補(bǔ)充劑、飼料、餌料、藥品、保健品和化妝品等各種形態(tài)適用于各種感染癥。作為可以適用的感染癥，例如呼吸系統(tǒng)感染、口腔感染、消化系統(tǒng)感染、咽部感染等，也可以在其它感染癥的情況下給藥。
過濾除菌后的含抗體乳(液體)的攝取量為每天每1kg體重1～20g，優(yōu)選5～10g的范圍。例如，作為健康食品攝取時(shí)，優(yōu)選將45g用50℃的水稀釋到5倍(225g水溶液)，早晚2次，與普通牛奶同樣飲用(450g乳溶液/60kg體重＝7g乳溶液/kg體重)。


圖1是本發(fā)明使用的優(yōu)選微孔濾器的部分截面?zhèn)纫晥D。
圖2是本發(fā)明優(yōu)選的含抗體乳的過濾處理流程圖。
圖1和圖2中的符號(hào)如下所述。
1、18微孔濾器2濾膜2a 濾膜第2層2b 濾膜第1層3支撐體4流路5濃縮液6含抗體乳11 原乳罐12、15、17 泵13、16 熱交換機(jī)14 離心分離機(jī)發(fā)明的最佳實(shí)施方式其次，結(jié)合實(shí)施例和比較例更具體地說明本發(fā)明，但是這些實(shí)施例不能以任何含義限定本發(fā)明。
試驗(yàn)例1抗菌性的含抗體乳(1)多效抗原的制備培養(yǎng)細(xì)菌后(37℃、48小時(shí))，在60℃下將培養(yǎng)基加熱2小時(shí)，殺滅細(xì)菌。用蒸餾水洗滌滅菌培養(yǎng)基，離心分離，回收細(xì)胞。將殺滅的各細(xì)菌的細(xì)胞混合，制備多效抗原。
表1菌性抗原細(xì)菌美國模式培養(yǎng)物保藏號(hào)金黃色葡萄球菌 11631表皮葡萄球菌155化膿性鏈球菌 A1型 8671同上 A3型 10389同上 A5型 12347同上 A8型 12349同上 A12型11434同上 A14型12972同上 A18型12357同上 A22型10403產(chǎn)氣菌 884大腸菌 26腸炎菌 13076綠膿桿菌7700肺炎桿菌9590鼠傷寒沙門氏菌 13311流感嗜血桿菌9333綠色鏈球菌 6249普通變形桿菌13315痢疾桿菌11835鏈球菌B群肺炎雙球菌變異鏈球菌痤瘡菌1型痤瘡菌2型(2)抗菌性含抗體乳的生產(chǎn)采用下述方式將上述(1)制備的多效抗原(5ml的細(xì)菌，20×108個(gè)/ml)給予健康的牛，開始給予抗原后的第5周以后，由免疫后的牛擠乳。
〔抗原的給予方式〕i)給予方法肌肉注射ii)給予間隔給予開始后的第1周～第4周，1次/周給予開始后的第5周以后，2次/月(3)抗菌性含抗體乳的過濾除菌處理以下，基于圖2進(jìn)行說明。
將上述(2)得到的當(dāng)日運(yùn)送到牛乳工廠的抗菌性含抗體乳500升，用泵(12)由罐(11)輸送到熱交換器(13)中，加熱至48℃。
接著，使用離心分離機(jī)(14)(テトラパツク公司制“29AE型”)，在48℃下，以離心力7400g(離心力Max.7440G)進(jìn)行脫脂處理，除去脂肪成分。
接著，用泵(15)將脫脂處理后的含抗體乳20升輸送到熱交換器(16)中，加熱至48℃后，用泵(17)輸送到過濾裝置(テトラパツク公司制精密過濾系統(tǒng)“Tetra alcrossM”)上安裝的微孔濾器中。
微孔濾器是具有下述性能的法國Societe des CeramiquesTechniques公司制造的陶瓷濾器“Sterilox MF”。

過濾的處理溫度為50℃，濾器透過流量為410升/h·m2，使含抗體乳沿著濾器表面高速移動(dòng)。
使裝置運(yùn)轉(zhuǎn)約13分鐘，連續(xù)除去細(xì)菌含量多的濃縮液2升，得到透過液(過濾除菌后的抗菌性含抗體乳)18升。
實(shí)施例2抗病毒性的含抗體乳
(1)用于抗病毒性含抗體乳的抗原的制作與鈴木等“感染癥學(xué)雜志”(第73卷第2號(hào)，第122～129頁(1999))記載的方法同樣進(jìn)行制作。也就是，使柯薩奇病毒(Coxsackievirus)A9型(CVA9(Bozek株))感染LLC-MK2細(xì)胞，使用含2％胎牛血清(FBS)的最小必需培養(yǎng)基(MEM，GIBCO BRL公司產(chǎn)品)培養(yǎng)2天。
在通過10000g 30分鐘的離心得到的培養(yǎng)上清液中加入30％聚乙二醇和0.4％NaCl，在4℃下靜置16小時(shí)。
10000g離心30分鐘后，將沉渣再次用STE液〔0.15M NaCl，0.15MTris-HCl，0.15M EDTA-2Na(pH7.4)〕懸濁。接著，將該懸濁液疊加到30％和60％(W/V)蔗糖不連續(xù)梯度中，以100000g在4℃下離心2.5小時(shí)。
回收60％蔗糖界面上的區(qū)域(band)，用β-丙內(nèi)酯(和光純藥社制)進(jìn)行失活處理，以其作為用于含抗體乳的病毒抗原。
(2)抗病毒性含抗體乳的生產(chǎn)將免疫病毒抗原(0.5mg/ml protein)10ml與弗羅因德氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant，三光純藥社制)一起給母牛皮內(nèi)接種。
免疫以2周為間隔進(jìn)行，采用ELISA法確認(rèn)血中的抗體上升后，使之妊娠。
分娩后，擠乳，得到脂肪含量為3.8％的抗病毒性含抗體乳。
(3)抗病毒性含抗體乳的過濾除菌處理與上述實(shí)施例1同樣，對(duì)上述(2)得到的抗病毒性含抗體乳20升進(jìn)行過濾除菌處理，得到透過液(抗病毒性過濾除菌的含抗體乳)18升。
比較例1抗菌性含抗體乳的加熱滅菌處理分別采用低溫滅菌法(63℃，30分鐘)、高溫短時(shí)間(HTST)滅菌法(77℃，15秒)和超高溫加熱(UHT)滅菌法(150℃，1秒)，對(duì)上述實(shí)施例1得到的過濾除菌前的抗菌性含抗體乳進(jìn)行加熱滅菌。
〔雜菌的殘留試驗(yàn)〕實(shí)施例1得到的抗菌性含抗體乳中所含雜菌的殘留測(cè)定用樣品使用注射器利用密閉系統(tǒng)由微孔濾器的透過液和濃縮液的各隔膜采集(共計(jì)3次，3個(gè)樣品)，在下述培養(yǎng)條件①～③下進(jìn)行雜菌的殘留試驗(yàn)。
另外，對(duì)于比較例1得到的加熱滅菌處理后的含抗體乳以及完全沒有進(jìn)行除菌處理的含抗體乳也進(jìn)行同樣的試驗(yàn)。
培養(yǎng)開始2周后，將臨床用巰基乙酸鹽(TGC)培養(yǎng)基中可以見到混濁的樣品判斷為菌繁殖陽性。另外，將心臟浸劑(HI)瓊脂培養(yǎng)基中可以見到菌落繁殖的樣品判斷為菌繁殖陽性。結(jié)果如表2所示。
〔培養(yǎng)條件〕①100ml玻璃瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)(表2中，用“100ml TGC”表示)在裝有臨床用巰基乙酸鹽(TGC)培養(yǎng)基100ml的150ml玻璃瓶中加入被測(cè)體10ml，這種樣品準(zhǔn)備2只。1只在30℃，另1只在37℃的溫度下培養(yǎng)2周，觀察液體培養(yǎng)基有無混濁。
②10ml試管內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)(表2中，用“10ml TGC”表示)在裝有臨床用巰基乙酸鹽(TGC)培養(yǎng)基10ml的30ml試管中加入被測(cè)體1ml，這種樣品準(zhǔn)備2只。1只在30℃，另1只在37℃的溫度下培養(yǎng)2周，觀察液體培養(yǎng)基有無混濁。
③心臟浸劑瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)試驗(yàn)(表2中，用“HI瓊脂培養(yǎng)基”表示)在心臟浸劑(HI)瓊脂培養(yǎng)基中滴加被測(cè)體0.1ml，37℃下培養(yǎng)，每天觀察有無菌落的繁殖。
〔免疫球蛋白(IgG)的殘留試驗(yàn)〕實(shí)施例1的過濾除菌后的含抗體乳、比較例1的加熱滅菌后的含抗體乳以及完全沒有進(jìn)行除菌處理的含抗體乳的IgG殘留率分別如表2所示。另外，IgG含量通過免疫擴(kuò)散法測(cè)定。
表2 菌殘留以及IgG殘留率37℃培養(yǎng) 30℃培養(yǎng) 37℃培養(yǎng)IgGNo. 被測(cè)體殘留率100ml 10ml 100ml 10ml HI (％)TGC TGCTGC TGC瓊脂培養(yǎng)基「濾過除菌」(實(shí)施例1)1.透過液①- - --- 1002.透過液②- - --- 1003.透過液③- - --- 100「加熱滅菌」(比較例1)4.低溫滅菌(63℃、30分) + + +++ 755.HTST滅菌(75℃、15秒) + + +++ 756.UHT滅菌(150℃、1秒) - - --- 07.未進(jìn)行除菌處理 + + +++ 100的含抗體乳(注)+菌陽性、-菌陰性如表2所示，實(shí)施例1的用“Sterilox MF”(商品名)過濾后的過濾除菌含抗體乳(透過液①、②、③)無限接近于無菌，而且IgG100％殘留。
確認(rèn)未進(jìn)行除菌處理的含抗體乳(被測(cè)體No.7)、加熱滅菌處理中低溫滅菌(63℃，30分鐘；被測(cè)體No.4)以及HTST滅菌(77℃，15秒；被測(cè)體No.5)的含抗體乳均沒有菌的繁殖。
另一方面，雖然確認(rèn)UHT滅菌(150℃，1秒；被測(cè)體No.6)的含抗體乳中沒有菌的繁殖，但是也不存在IgG。由這些結(jié)果可以得知，采用加熱滅菌法難以制造無菌或近似無菌的“IgG沒有熱劣化的含抗體乳”。
由上述內(nèi)容可以得知，將含抗體乳脫脂后，只有用”Sterilox MF”(商品名)過濾除菌，才能制造“無菌或近似無菌，且IgG抗體沒有熱劣化的含抗體乳”。
比較例2將微孔濾器由“Sterilox MF”(商品名)更換為“Membralox MF”(法國Societe des Ceramiques Techniques公司制造的陶瓷制濾器的商品名)，在與實(shí)施例1同樣的條件下對(duì)脫脂后的含抗體乳進(jìn)行除菌處理。其中，“Membralox MF”雖然是交叉流動(dòng)方式的濾器，但是與“Sterilox MF”相比，濾膜的厚度僅有一半，而且所述濾膜為單層。透過流量為480升/h·m2(處理溫度50℃)。除菌試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。可以得知沒有充分除菌。
表3 使用Membralox MF的抗細(xì)菌性含抗體乳的除菌試驗(yàn)結(jié)果濾過后的含抗體乳 37℃培養(yǎng) 30℃培養(yǎng)No.
試管序號(hào) 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5① + + + + + + + + + +② + + + + + + + + + +③ + + + + + + + + + +④ + + - + + + + + + +⑤ + + - - - + + + + +⑥ + + + + + + + + + +⑦ - + - + + + + + + +⑧ + + + + + + + + + +⑨ - + + + + - + - + -(注1)+表示用巰基乙酸鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)14天后，呈繁殖陽性。
-表示用巰基乙酸鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)14天后，呈繁殖陰性。(注2)試管序號(hào)①～⑨是過濾得到的透過液的級(jí)分序號(hào)。另外，橫欄中1～5的數(shù)字表示將相同級(jí)分序號(hào)的樣品分裝在5個(gè)試管中，在37℃和30℃這2種條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
比較例3將微孔濾器由“Sterilox MF”(商品名)更換為下述醋酸纖維素濾器，在與實(shí)施例1同樣的條件下對(duì)脫脂后的含抗體乳進(jìn)行除菌處理。
Membrane Filter Cellulose Acetate(Toyo Roshi Kaisha，Ltd.)(直徑90mm，平面狀)(孔徑0.45μm、0.8μm、1μm和5μm 4種)單獨(dú)或組合使用上述醋酸纖維素濾器，對(duì)脫脂后的含抗體乳進(jìn)行過濾。
結(jié)果如表4所示。使用孔徑0.8μm以上的濾器，能夠過濾，但是不能充分除菌。另外，孔徑0.45μm以下，則堵塞，不能過濾。
表4 用醋酸纖維素濾器的除菌試驗(yàn)結(jié)果No. 濾器的孔徑(μm)組合 能否濾過 除菌①5μm○ ×②5μm后、1μm○ ×③5μm后、1μm后、 0.8μm○ ×④5μm后、0.45μm × -⑤5μm后、1μm后、0.45μm × -⑥5μm后、1μm后、0.8μm后、0.45μm × -⑦0濾紙(1μm) × -(注)○能濾過、×不能濾過、-未測(cè)定實(shí)施例3含有過濾除菌后的抗病毒性含抗體乳的液狀酸乳酪的制造在生乳和脫脂乳粉的混合乳原料中，接種使用嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)配制的引酵物5％，在40℃下培養(yǎng)直到pH達(dá)到4.2，得到液狀酸乳酪。
在無菌填充室中，將該液狀酸乳酪90重量份、以及實(shí)施例2得到的過濾除菌后的抗病毒性含抗體乳10重量份，填充到滅菌后的容器中，制造帶有抗病毒抗體的液狀酸乳酪。
按照下述方法，測(cè)定上述帶有抗病毒抗體的液狀酸乳酪的中和抗體效價(jià)。
比較例4含有低溫滅菌后的抗病毒性含抗體乳的液狀酸乳酪的制造在無菌填充室中，將與實(shí)施例3同樣得到的液狀酸乳酪原液90重量份、以及對(duì)實(shí)施例2得到的過濾除菌前的抗病毒性含抗體乳進(jìn)行低溫滅菌(63℃，30分鐘)后的物質(zhì)10重量份混合，填充到滅菌后的罐狀容器中，制造帶有抗病毒抗體的液狀酸乳酪。
按照下述方法，測(cè)定上述帶有抗病毒抗體的液狀酸乳酪的中和抗體效價(jià)。
實(shí)施例4含有過濾除菌后的抗病毒性含抗體乳的運(yùn)動(dòng)飲料的制造按照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，在無菌填充室中，將按照表5所示成分和配比制造的加熱滅菌后的運(yùn)動(dòng)飲料98重量份、以及實(shí)施例2得到的過濾除菌后的抗病毒性含抗體乳2重量份，填充到滅菌后的罐狀容器中，制造運(yùn)動(dòng)飲料。另外，表5中的數(shù)值單位均為重量份。
按照下述方法，測(cè)定上述帶有抗病毒抗體的運(yùn)動(dòng)飲料的中和抗體效價(jià)。
其中，運(yùn)動(dòng)飲料(Sport drink)是指主要目的在于補(bǔ)充因運(yùn)動(dòng)等損失的體內(nèi)的水分、電解質(zhì)等的飲料。在1965年前后，美國為了緩解足球選手由于劇烈運(yùn)動(dòng)引起的脫水，開發(fā)了這種飲料。在運(yùn)動(dòng)飲料中，添加用于補(bǔ)充能量的糖類3～6％、其它無機(jī)鹽類、香料等。為了使水分有效地吸收到體內(nèi)，大多數(shù)運(yùn)動(dòng)飲料的滲透壓與體液的滲透壓幾乎相等，因此也稱為“等滲飲料”。
表5 運(yùn)動(dòng)飲料成分配比(重量％)濃縮橙汁0.200砂糖1.8異構(gòu)化糖5.5枸櫞酸 0.14鹽 0.08枸櫞酸鈉0.07氯化鉀 0.04磷酸二氫鈣 0.013谷氨酸鈉0.004氯化鎂 0.003抗壞血酸0.1乳化香料0.11香精0.2過濾除菌后的抗病毒性含 2.0抗體乳(實(shí)施例2)水 余量合計(jì)100.0％〔中和抗體效價(jià)的測(cè)定方法〕將LLC-MK2細(xì)胞分別注入微孔板中，形成單層時(shí)進(jìn)行中和反應(yīng)。制作下述表6的飲食品樣品①～④的2倍梯度稀釋系列，等量加入100倍濃度的組織培養(yǎng)感染量(100×TCID50/ml)的稀釋病毒，在37℃下使之反應(yīng)。反應(yīng)后，使細(xì)胞感染，在37℃下培養(yǎng)，以可見細(xì)胞變性的稀釋倍數(shù)作為中和抗體效價(jià)?？滤_奇病毒A9型(CVA9)的中和抗體效價(jià)如表6所示。
過濾除菌后的抗病毒性含抗體乳對(duì)CVA9顯示32000(215)倍以上的高抵抗力。
根據(jù)這些結(jié)果可以得知，通過過濾除菌，能夠制造無菌或近似無菌的中和抗體效價(jià)高的含抗體乳，另外即使將其添加到食品、飲料中，中和抗體效價(jià)也不降低。
表6 柯薩奇病毒A9型(CVA9)的中和抗體效價(jià)各種飲食品樣品 柯薩奇病毒A9①過濾除菌后的抗病毒性含抗體215乳(實(shí)施例2)②含有過濾除菌后的抗病毒性含212抗體乳的酸乳酪(實(shí)施例3)③含有過濾除菌后的抗病毒性含29抗體乳的運(yùn)動(dòng)飲料(實(shí)施例4)④含有低溫滅菌后的抗病毒性含28抗體乳的酸乳酪(比較例4)工業(yè)實(shí)用性由于本發(fā)明能夠產(chǎn)生下述有利效果，因此具有工業(yè)實(shí)用性。
(1)采用本發(fā)明的除菌方法，能夠保持從?？苿?dòng)物擠取的含抗體乳的抗體活性高，同時(shí)以完全或近似完全的水平除去乳中的雜菌。另外，即使高速進(jìn)行過濾處理，也不會(huì)發(fā)生濾器的堵塞，能夠高效地進(jìn)行除菌處理。
(2)含有用本發(fā)明除菌方法處理后的含抗體乳的免疫賦活劑由于抗體效價(jià)高，而且沒有混入雜菌，因此是效果和安全性優(yōu)良的免疫賦活劑。
(3)含有用本發(fā)明的除菌方法處理后的含抗體乳的食品、飲料、營養(yǎng)補(bǔ)充劑、飼料、餌料、藥品、保健品和化妝品等由于抗體效價(jià)高，而且沒有混入雜菌，因此免疫賦活效果和安全性優(yōu)良，能夠方便地預(yù)防、治愈、治療或緩解細(xì)菌、病毒等各種病原體或其代謝產(chǎn)物引起的感染或發(fā)病。
權(quán)利要求
1.含抗體乳的除菌方法，其特征在于，從用選自病原體或其代謝產(chǎn)物的1種或2種以上抗原致敏使體內(nèi)產(chǎn)生抗體的?？苿?dòng)物擠取的含抗體乳的除菌處理中，進(jìn)行脫脂處理后，使用陶瓷微粒形成的、包括具有濾孔且厚度為40～150μm的濾膜以及支撐體的微孔濾器進(jìn)行過濾。
2.如權(quán)利要求1所述的除菌方法，其中，陶瓷微粒的平均粒徑為0.2～2.0μm，濾孔的平均孔徑為0.4～2.0μm。
3.如權(quán)利要求1所述的除菌方法，其中，微孔濾器采用交叉流動(dòng)方式。
4.如權(quán)利要求1所述的除菌方法，其中，微孔濾器是Sterilox MF(法國Societe des Ceramiques Techniques公司的商標(biāo))。
5.如權(quán)利要求1所述的除菌方法，其中，病原體是引發(fā)消化系統(tǒng)或呼吸系統(tǒng)疾病的細(xì)菌或病毒。
6.免疫賦活劑，其中，含有進(jìn)行了權(quán)利要求1所述的除菌處理的含抗體乳作為有效成分。
7.食品、飲料、營養(yǎng)補(bǔ)充劑、飼料、餌料、藥品、保健品和化妝品，其中，含有進(jìn)行了權(quán)利要求1所述的除菌處理的含抗體乳。
全文摘要
本發(fā)明涉及含抗體乳的除菌方法，其特征在于，從用選自病原體或其代謝產(chǎn)物的1種或2種以上抗原致敏使體內(nèi)產(chǎn)生抗體的?？苿?dòng)物擠取的含抗體乳的除菌處理中，進(jìn)行脫脂處理后，使用陶瓷微粒形成的、包括具有濾孔且厚度為40～150μm的濾膜以及支撐體的微孔濾器進(jìn)行過濾。本發(fā)明提供過濾除菌的方法，該方法能夠保持含抗體乳的抗體活性，同時(shí)有效過濾除去乳中的雜菌達(dá)到近似無菌狀態(tài)的水平；并且提供以除菌后的含抗體乳作為有效成分的免疫賦活劑，以及添加了含抗體乳的食品、飲料等。
文檔編號(hào)A23L1/305GK1482861SQ01821365
公開日2004年3月17日 申請(qǐng)日期2001年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月26日
發(fā)明者三原智, 莊田雅樹, 橋爪秀一, 龜井優(yōu)德, 鈴木達(dá)夫, 一, 夫, 德, 樹 申請(qǐng)人:小川香料株式會(huì)社, 森永制果株式會(huì)社