專利名稱：介導(dǎo)rna干涉的小rna分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及介導(dǎo)靶特異的核酸修飾(如RNA干涉和/或DNA甲基化)所需的雙鏈(ds)RNA分子的序列和結(jié)構(gòu)特征。
背景技術(shù)：
向線蟲C.elegans中注射dsRNA導(dǎo)致在序列上與注射的dsRNA高度同源的基因特異性沉默(Fire等人，1998)，在這一發(fā)現(xiàn)后，提出術(shù)語“RNA干涉”(RNAi)。之后也在昆蟲、青蛙(Oelgeschlager等人，2000)和包括小鼠在內(nèi)的其他動物(Svoboda等人，2000；Wianny和Zernicka-Goetz，2000)中觀察到RNAi，在人類中也可能存在。RNAi與植物中共抑制和真菌中抑制(quelling)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)機制密切相關(guān)(Catalanotto等人，2000；Cogoni和Macino，1999；Dalmay等人，2000；Ketting和Plasterk，2000；Mourrain等人，2000；Smardon等人，2000)，RNAi機制的一些組分也是共抑制引起的轉(zhuǎn)錄后沉默所必需的(Catalanotto等人，2000；Dernburg等人，2000；Ketting和Plasterk，2000)。最近也對這一主題進行了綜述(Bass，2000；Bosher和Labouesse，2000；Fire，1999；Plasterk和Ketting，2000；Sharp，1999；Sijen和kooter，2000)，參見2000年3月2日發(fā)行的《植物分子生物學(xué)》第43卷的完整內(nèi)容。
在植物中，除了PTGS之外，導(dǎo)入的轉(zhuǎn)基因也能通過RNA指導(dǎo)的胞嘧啶DNA甲基化導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄基因沉默(參見Wassenegger，2000)。植物中短至30bp的基因組靶標(biāo)以RNA指導(dǎo)的方式甲基化(Pelissier，2000)。DNA甲基化在哺乳動物中也存在。
RNAi和共抑制的自然功能似乎是保護基因組免受移動遺傳因子(例如在有活性時在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生異常RNA或dsRNA的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和病毒)的入侵(Jensen等人，1999；Ketting等人，1999；Ratcliff等人，1999；Tabara等人，1999)。特異性mRNA降解阻止轉(zhuǎn)座子和病毒的復(fù)制，盡管某些病毒通過表達抑制PTGS的蛋白質(zhì)能克服或阻止這一過程(Lucy等人，2000；Voinnet等人，2000)。
dsRNA只觸發(fā)與dsRNA相同的區(qū)域內(nèi)的同源RNA特異性降解(Zamore等人，2000)。dsRNA被加工為21-23nt RNA片段，靶RNA切割位點規(guī)則地間隔21-23nt。因此提示21-23nt片段是靶標(biāo)識別的指導(dǎo)RNA(Zamore等人，2000)。在細(xì)胞裂解前用dsRNA轉(zhuǎn)染黑尾果蠅(D.melanogaster Schneider)2細(xì)胞，在由該細(xì)胞制備的提取物中也檢測到這種短RNA(Hammond等人，2000)，然而，顯示序列特異性核酸活性的級分也含有相當(dāng)一部分殘余dsRNA。觀察到從加工的dsRNA中分離的21-23nt片段在一定程度上能介導(dǎo)特異性mRNA降解，這進一步支持了21-23nt片段在指導(dǎo)mRNA切割中的作用(Zamore等人，2000)。大小相似的RNA分子也在顯示PTGS的植物組織中積累(Hamilton和Baulcombe，1999)。
在此，我們利用建立的果蠅(Drosophila)體外系統(tǒng)(Tuschl等人，1999；Zamore等人，2000)進一步研究RNAi機制。我們證實，當(dāng)短21nt和22nt RNA與3’突出端堿基配對時，它們作為序列特異性mRNA降解的指導(dǎo)RNA。在該系統(tǒng)中短30bp dsRNA不能介導(dǎo)RNAi，因為它們不再加工為21nt和22nt RNA。此外，我們還確定了相對于21和22nt短干涉RNA(siRNA)的靶RNA切割位點，并且證實，dsRNA加工的方向決定了是有義還是反義靶RNA能被產(chǎn)生的siRNP內(nèi)切核酸酶復(fù)合物切割。此外，siRNA也可能是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的重要工具，例如通過引導(dǎo)DNA甲基化使哺乳動物基因沉默。
在人類體內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(HeLa細(xì)胞)中進行的其它實驗表明，長度優(yōu)選地為19-25個核苷酸的雙鏈RNA分子具有RNAi活性。因此，與果蠅的結(jié)果不同，24和25nt長雙鏈DNA分子對于RNAi也是有效的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供能夠介導(dǎo)靶特異性RNA干涉或其它靶特異性核酸修飾(如DNA甲基化)的新型試劑，這種試劑與現(xiàn)有試劑相比具有更高的效能和安全性。
一種分離的雙鏈RNA分子提供了這一問題的解決方案，其中每條RNA鏈的長度為19-25，特別是19-23個核苷酸，其中該RNA分子能夠介導(dǎo)靶特異性核酸修飾，特別是RNA干涉和/或DNA甲基化。優(yōu)選地，至少一條鏈具有1-5個核苷酸、更優(yōu)選地1-3個核苷酸、最優(yōu)選地2個核苷酸的3’-突出端。另一條鏈可以是平端，或者具有可達6個核苷酸的3’突出端。如果dsRNA的兩條鏈都正好是21或22nt，當(dāng)兩端都是平端時(0nt突出)，也能觀察到一定程度的RNA干涉。該RNA分子優(yōu)選地是合成RNA分子，基本上不含細(xì)胞提取物，例如果蠅胚胎中存在的污染物。此外，該RNA分子優(yōu)選地基本上不含任何非靶特異的污染物，特別是非靶特異的RNA分子，例如細(xì)胞提取物中存在的污染物。
此外，本發(fā)明還涉及分離的雙鏈RNA分子的用途，其中每條RNA鏈的長度為19-25個核苷酸，用于介導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞中，特別是人類細(xì)胞中靶特異的核酸修飾，特別是RNAi。
驚奇地發(fā)現(xiàn)，合成的短雙鏈RNA分子，特別是具有突出3’端的，是序列特異的RNAi的介體，介導(dǎo)高效的靶-RNA切割，其中切割位點靠近指導(dǎo)短RNA覆蓋的區(qū)域的中心。
優(yōu)選地，RNA分子的每條鏈的長度為20-22個核苷酸(或者在哺乳動物細(xì)胞中為20-25個核苷酸)，其中每條鏈的長度可以相同或者不同。3’-突出端的長度優(yōu)選地達到1-3個核苷酸，其中每條鏈的突出端長度可以相同或者不同。RNA-鏈優(yōu)選地含有3’-羥基。5’-端優(yōu)選地含有磷酸、二磷酸、三磷酸或羥基。最有效的dsRNA由配對的兩條21nt鏈組成，使得dsRNA的兩端存在1-3nt，特別是2nt的3’突出端。
siRNA指導(dǎo)的靶RNA切割反應(yīng)是高度序列特異的。然而，不是siRNA的所有位點對于靶標(biāo)識別都有相同的作用。在siRNA雙鏈體中心的錯配最為關(guān)鍵，基本上消除靶RNA切割。相反，與單鏈靶RNA互補的siRNA鏈的3’核苷酸(例如位點21)對于靶標(biāo)識別的特異性就沒有作用。此外，與靶RNA具有相同極性的siRNA鏈的未配對2nt 3’突出端的序列對于靶RNA切割并不重要，因為只有反義siRNA鏈才能指導(dǎo)靶標(biāo)識別。因此，從單鏈突出核苷酸起，只有反義siRNA的倒數(shù)第二個位點(例如位點20)需要匹配靶向的有義mRNA。
令人吃驚的是，本發(fā)明的雙鏈RNA分子在血清或用于細(xì)胞培養(yǎng)的生長培養(yǎng)基中顯示很高的體內(nèi)穩(wěn)定性。為了進一步提高穩(wěn)定性，可以穩(wěn)定3’突出端使其免受降解，例如，可以加以選擇，使其由嘌呤核苷酸，特別是腺苷或鳥苷核苷酸組成。此外，嘧啶核苷酸置換為修飾類似物，例如尿苷2nt 3’突出端置換為2’-脫氧胸苷可以耐受，不影響RNA干涉的效率。不含2’羥基可以顯著提高突出端在組織培養(yǎng)基中的核酸酶抗性。
在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案中，RNA分子可含有至少一種修飾的核苷酸類似物。該核苷酸類似物可位于基本上不影響靶特異性活性(如RNAi介導(dǎo)活性)的位置上，例如位于雙鏈RNA分子的5’端和/或3’端區(qū)。特別是，摻入修飾的核苷酸類似物可以穩(wěn)定突出端。
優(yōu)選的核苷酸類似物選自糖修飾或骨架修飾的核糖核苷酸。然而應(yīng)當(dāng)指出，核堿基修飾的核糖核苷酸也是合適的，即核糖核苷酸，其含有非天然存在的核堿基代替天然存在的核堿基，如5-位修飾的尿苷或胞苷，例如5-(2-氨基)丙基尿苷、5-溴尿苷；8-位修飾的腺苷和鳥苷，例如8-溴鳥苷；去氮雜核苷酸，例如7-去氮雜-腺苷；O-和N-烷基化核苷酸，例如N6-甲基腺苷。在優(yōu)選的糖修飾的核糖核苷酸中，2’OH-基被替換為選自H、OR、R、鹵素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN的基團，其中R是C1-C6烷基、烯基或炔基，鹵素是F、Cl、Br或I。在優(yōu)選的骨架修飾的核糖核苷酸中，與相鄰核糖核苷酸連接的磷酯基團被替換為一個修飾的基團，例如硫代磷酸酯(phosphothioate)基。應(yīng)當(dāng)指出，上述修飾可以組合。
為了介導(dǎo)靶特異的RNAi和/或DNA甲基化，本發(fā)明的雙鏈RNA分子的序列必須與核酸靶分子具有足夠的同一性。優(yōu)選地，該序列與RNA分子雙鏈部分中的希望的靶分子至少50％，特別是至少70％相同。在RNA分子的雙鏈部分中，同一性更優(yōu)選地至少85％，最優(yōu)選地100％。一種雙鏈RNA分子與預(yù)定的核酸靶分子(如mRNA靶分子)的同一性可以如下確定I=-nL×100]]>其中I是百分同一性，n是dsRNA的雙鏈部分中與靶標(biāo)相同的核苷酸數(shù)，L是dsRNA的雙鏈部分與靶標(biāo)的序列重疊的長度。
此外，也可包括3’突出端，特別是長度為1-3個核苷酸的突出端，確定雙鏈RNA分子與靶序列的同一性。在此情況中，與靶序列的序列同一性優(yōu)選地至少50％，更優(yōu)選地至少70％，最優(yōu)選地至少85％。例如，來自3’突出端的核苷酸和來自雙鏈5’和/或3’端的可達2個核苷酸可以修飾，而活性沒有顯著喪失。
本發(fā)明的雙鏈RNA分子可以用包括下列步驟的方法制備(a)合成兩條RNA鏈，每條長度為19-25個，例如19-23個核苷酸，其中該RNA鏈能形成雙鏈RNA分子，優(yōu)選地至少一條鏈具有1-5個核苷酸的3’-突出端，(b)在一定條件下結(jié)合合成的RNA鏈，其中形成一種雙鏈RNA分子，它能介導(dǎo)靶特異的核酸修飾，特別是RNA干涉和/或DNA甲基化。
合成RNA分子的方法在本領(lǐng)域中眾所周知。在本文中，具體是指如Verma和Eckstein(1998)所述的化學(xué)合成法。
由合成的DNA模板或者由分離自重組細(xì)菌的DNA質(zhì)粒進行酶轉(zhuǎn)錄也能制備單鏈RNA。一般使用噬菌體RNA聚合酶，如T7、T3或SP6 RNA聚合酶(Milligan和Uhlenbeck(1989))。
本發(fā)明的另一個方面涉及一種介導(dǎo)細(xì)胞或生物中的靶特異性核酸修飾(特別是RNA干涉和/或DNA甲基化)的方法，包括下列步驟(a)在可以發(fā)生靶特異性核酸修飾的條件下使細(xì)胞或生物接觸本發(fā)明的雙鏈RNA分子，和
(b)將雙鏈RNA完成的靶特異性核酸修飾導(dǎo)向含有基本對應(yīng)于雙鏈RNA的序列部分的靶核酸。
優(yōu)選地，接觸步驟(a)包括將雙鏈RNA分子導(dǎo)入靶細(xì)胞中，例如分離的靶細(xì)胞，例如細(xì)胞培養(yǎng)物，單細(xì)胞微生物，或多細(xì)胞生物內(nèi)的一個靶細(xì)胞或多個靶細(xì)胞。更優(yōu)選地，該導(dǎo)入步驟包括載體介導(dǎo)的輸送，例如利用脂質(zhì)體載體或通過注射。
本發(fā)明的方法可用來確定細(xì)胞或生物中一種基因的功能，乃至調(diào)節(jié)細(xì)胞或生物中一種基因的功能，它能夠介導(dǎo)RNA干涉。細(xì)胞優(yōu)選地是真核細(xì)胞或細(xì)胞系，例如植物細(xì)胞或動物細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞，例如胚細(xì)胞、多能干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞，例如畸胎癌細(xì)胞或病毒感染的細(xì)胞。生物優(yōu)選地是真核生物，例如植物或動物，如哺乳動物，特別是人類。
本發(fā)明的RNA分子針對的靶基因可能與病理狀態(tài)有關(guān)。例如，該基因可能是病原體相關(guān)基因，例如病毒基因，腫瘤相關(guān)基因，或自身免疫病相關(guān)基因。靶基因也可能是在重組細(xì)胞或遺傳改變的生物中表達的異源基因。通過確定或調(diào)節(jié)，特別是抑制這種基因的功能，可能獲得在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域或在醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有價值的信息和治療效益。
dsRNA通常作為藥用組合物施用?？捎靡阎椒ㄟM行施用，其中向體外或體內(nèi)的希望的靶細(xì)胞中導(dǎo)入核酸。常用的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)包括磷酸鈣、DEAE-葡聚糖、電穿孔、顯微注射和病毒法(Graham，F(xiàn).L.和van der Eb，A.J.(1973)Virol.52，456；McCutchan，J.H.和Pagano，J.S.(1968)，J.Natl.Cancer Inst.41，351；Chu，G.等人(1987)，Nucl.AcidsRes.15，1311；Fraley，R.等人(1980)，J.Biol.Chem.255，10431；Capecchi，M.R.(1980)，Cell 22，479)。向細(xì)胞中導(dǎo)入DNA的一種最新技術(shù)是使用陽離子脂質(zhì)體(Felgner，P.L.等人(1987)，Proc.Natl.Acad.Sci USA 84，7413)。市售的陽離子脂制劑有，例如Tfx 50(Promega)或Lipofectamin2000(Life Technologies)。
因此，本發(fā)明也涉及一種藥用組合物，其含有至少一種上述雙鏈RNA分子作為活性劑和一種藥用載體。該組合物可在人類醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)學(xué)中用于診斷和治療用途。
為用于診斷或治療，該組合物可以是溶液形式，例如可注射溶液，乳膏、軟膏、片劑、懸液等。該組合物可以用任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ┯?，例如注射、口服、局部、鼻、直腸給藥等。載體可以是任何合適的藥用載體。優(yōu)選地使用能提高RNA分子進入靶細(xì)胞的效能的載體。這類載體的合適的例子有脂質(zhì)體，特別是陽離子脂質(zhì)體。更加優(yōu)選的施用方法是注射。
RNAi法的另一個優(yōu)選用途是對真核細(xì)胞或真核非人類生物的功能分析，優(yōu)選的是哺乳動物細(xì)胞或生物，最優(yōu)選的是人類細(xì)胞，例如細(xì)胞系，如HeLa或293，或嚙齒動物，例如大鼠或小鼠。通過用與預(yù)定靶基因同源的適當(dāng)雙鏈RNA分子或編碼適當(dāng)雙鏈RNA分子的DNA分子轉(zhuǎn)染，能夠在靶細(xì)胞，例如細(xì)胞培養(yǎng)物或靶生物中獲得特定敲除表型。驚奇地發(fā)現(xiàn)，存在短雙鏈RNA分子不會引起宿主細(xì)胞或宿主生物的干擾素反應(yīng)。
因此，本發(fā)明的另一個主題是顯示靶基因特異的敲除表型的真核細(xì)胞或真核非人類生物，其中包含至少一種內(nèi)源靶基因的表達至少部分缺陷，其中用能夠抑制至少一種內(nèi)源靶基因表達的至少一種雙鏈RNA分子或用編碼能夠抑制至少一種內(nèi)源靶基因表達的至少一種雙鏈RNA分子的DNA轉(zhuǎn)染該細(xì)胞或生物。應(yīng)當(dāng)指出，由于RNAi的特異性，本發(fā)明能夠靶特異性地敲除幾種不同的內(nèi)源基因。
細(xì)胞或非人類生物，特別是人類細(xì)胞或非人類哺乳動物的基因特異性敲除表型可以在分析方法中使用，例如復(fù)雜生理過程的功能和/或表型分析，如基因表達譜和/或蛋白質(zhì)組的分析。例如，人們可以在培養(yǎng)的細(xì)胞中制備人類基因的敲除表型，假定它們是備選剪接過程的調(diào)節(jié)劑。這類基因具體包括SR剪接因子家族的成員，如ASF/SF2、SC35、SRp20、SRp40或SRp55。另外也能分析SR蛋白對預(yù)定的其它剪接基因(如CD44)的mRNA譜的影響。優(yōu)選地利用基于寡核苷酸的芯片通過高通量方法進行這種分析。
利用基于RNAi的敲除技術(shù)，可以抑制靶細(xì)胞或靶生物中內(nèi)源靶基因的表達。內(nèi)源基因可以用編碼靶蛋白或靶蛋白變體或突變形式的外源靶核酸(例如基因或cDNA)補充，外源核酸任選地可與編碼可檢測肽或多肽(例如親和標(biāo)記物，特別是多親和標(biāo)記物)的另一種核酸序列融合。靶基因的變體或突變形式不同于內(nèi)源靶基因，因為由于單個或多個氨基酸的置換、插入和/或缺失，它們編碼在氨基酸水平上與內(nèi)源基因產(chǎn)物不同的基因產(chǎn)物。變體或突變形式可具有與內(nèi)源靶基因相同的生物活性。另一方面，變異或突變的靶基因也可能具有不同于內(nèi)源靶基因的生物活性，例如活性部分缺失、活性完全缺失、活性提高等。
這種互補可以如下完成共表達外源核酸編碼的多肽，例如含有靶蛋白和親和標(biāo)記物的融合蛋白和用于敲除靶細(xì)胞中內(nèi)源基因的雙鏈RNA分子。這種共表達可以利用一種合適的表達載體或者利用表達載體的組合實現(xiàn)，該載體表達外源核酸編碼的多肽(例如標(biāo)記物修飾的靶蛋白)和雙鏈RNA分子。在靶細(xì)胞中從頭合成的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物將含有外源基因產(chǎn)物，例如修飾的融合蛋白。為了避免RNAi雙鏈分子抑制外源基因產(chǎn)物表達，編碼外源核酸的核苷酸序列在與雙鏈RNA分子同源的序列部分中可能在DNA水平上改變(在氨基酸水平上引起或不引起突變)。此外，也可以用來自其它種(例如來自小鼠)的相應(yīng)核苷酸序列補充內(nèi)源靶基因。
本發(fā)明的細(xì)胞或生物的優(yōu)選用途是對基因表達譜和/或蛋白質(zhì)組的分析。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，對一種或幾種靶蛋白的變體或突變形式進行分析，其中利用如上所述的外源靶核酸將這種變體或突變形式重新導(dǎo)入細(xì)胞或生物中。內(nèi)源基因敲除與利用突變的(例如部分缺失的)外源靶標(biāo)拯救相組合比使用敲除細(xì)胞具有優(yōu)勢。而且，這種方法還特別適用于鑒定靶蛋白的功能域。在另一個優(yōu)選實施方案中，例如對至少兩種細(xì)胞或生物的基因表達譜和/或蛋白質(zhì)組和/或表型特征進行比較。這些生物選自(i)一種對照細(xì)胞或?qū)φ丈?，沒有靶基因抑制，(ii)一種細(xì)胞或生物，具有靶基因抑制，和(iii)一種細(xì)胞或生物，具有靶基因抑制加外源靶核酸的靶基因互補。
本發(fā)明的方法和細(xì)胞也適用于鑒定和/或表征藥理試劑的方法，例如從一組待測物質(zhì)中鑒定新的藥理試劑，和/或表征已知藥理試劑的作用機制和/或副作用。
因此，本發(fā)明也涉及一種鑒定和/或表征作用于至少一種靶蛋白的藥理試劑的系統(tǒng)，其包括(a)一種真核細(xì)胞或真核非人類生物，它能表達至少一種編碼該靶蛋白的內(nèi)源靶基因，(b)至少一種雙鏈RNA分子，它能抑制所述至少一種內(nèi)源靶基因的表達，和(c)一種待測物質(zhì)或一組待測物質(zhì)，其中將要鑒定和/或表征這種待測物質(zhì)或組合的藥理學(xué)性質(zhì)。
如上所述的系統(tǒng)優(yōu)選地還包括(d)至少一種編碼靶蛋白或其變體或其突變形式的外源靶核酸，其中該外源靶核酸在核酸水平上不同于內(nèi)源靶基因，因此與內(nèi)源靶基因的表達相比，外源靶核酸的表達受雙鏈RNA分子的抑制大大減少。
此外，RNA敲除互補法還可用于制備目的，例如從真核細(xì)胞，特別是哺乳動物細(xì)胞，更具體地是從人類細(xì)胞中親和純化蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物。在本發(fā)明的實施方案中，外源靶核酸優(yōu)選地編碼與親和標(biāo)記物融合的靶蛋白。
該制備方法可以用于高分子量蛋白質(zhì)復(fù)合物的純化，其分子量優(yōu)選地≥150kD，更優(yōu)選地≥500kD，任選地可含有核酸，如RNA。具體例子有由U4/U6 snRNP顆粒的20kD、60kD和90kD蛋白質(zhì)組成的異源三聚蛋白質(zhì)復(fù)合物，由分子量14、49、120、145和155kD的5種蛋白質(zhì)組成的來自17S U2 snRNP的剪接因子SF3b，含有U4、U5和U6 snRNA分子和大約30種蛋白質(zhì)的25S U4/U6/U5三-snRNP顆粒，其分子量約為1.7MD。
該方法適用于哺乳動物細(xì)胞，特別是人類細(xì)胞的功能蛋白質(zhì)組分析。
下面，通過下列附圖和實施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明。


圖1短至38bp的雙鏈RNA能介導(dǎo)RNAi。
(A)用于靶向Pp-Luc mRNA的dsRNA的圖示。制備覆蓋29-504bp的三個系列的平端dsRNA。標(biāo)出了dsRNA有義鏈的第一個核苷酸相對于Pp-Luc mRNA起始密碼子的位置(p1)。(B)RNA干涉測定(Tuschl等人，1999)。靶Pp-Luc與對照Rr-luc活性之比用緩沖液對照(黑條)標(biāo)準(zhǔn)化。dsRNA(5nM)在果蠅裂解液中25℃預(yù)溫育15分鐘，之后加入7-甲基-鳥苷-加帽的Pp-luc和Rr-luc mRNA(～50pM)。繼續(xù)溫育1小時，然后通過雙螢光素酶測定(Promega)分析。數(shù)據(jù)是至少4次獨立實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
圖229bp dsRNA不再加工為21-23nt片段。在果蠅裂解液中內(nèi)部32P-標(biāo)記的dsRNA(5nM)加工后形成21-23mer的時程。標(biāo)出了dsRNA的長度和來源。RNA分子量標(biāo)記(M)加于左道中，并標(biāo)出片段大小。時間為0時的雙條帶是由于dsRNA的不完全變性。
圖3短dsRNA只切割mRNA靶標(biāo)一次。
(A)10nM帽32P-標(biāo)記的有義或反義RNA與p133系列的10nMdsRNA在果蠅裂解液中溫育1小時，產(chǎn)生的穩(wěn)定5’切割產(chǎn)物的變性凝膠電泳。帽標(biāo)記的靶RNA部分核酸酶T1消化并部分堿性水解(OH)產(chǎn)生長度標(biāo)記物。dsRNA針對的區(qū)域在兩端表示為黑條。顯示了111bp長dsRNA的主要切割位點之間的20-23nt間隔。水平箭頭表明不是由于RNAi引起的非特異性切割。(B)有義和反義靶RNA上切割位點的位置。加帽177nt有義和180nt反義靶RNA的序列以反平行方向表示，使得互補序列彼此相對。不同dsRNA針對的區(qū)域用位于有義與反義靶序列之間的不同顏色的線條標(biāo)出。切割位點用環(huán)形標(biāo)出大環(huán)為強切割，小環(huán)為弱切割。32P-放射性標(biāo)記的磷酸基以星號標(biāo)記。
圖421和22nt RNA片段通過RNase III樣機制產(chǎn)生。
(A)dsRNA加工后～21nt RNA的序列。定向克隆dsRNA加工產(chǎn)生的～21nt RNA片段并測序。來源于dsRNA有義鏈的寡核糖核苷酸用藍線表示，來源于反義鏈的用紅線表示。如果在多個克隆中含有相同的序列，則使用粗線，右側(cè)的數(shù)字是指頻率。dsRNA介導(dǎo)的靶RNA切割位點用橙色環(huán)形表示，大環(huán)表示強切割，小環(huán)表示弱切割(參見圖3B)。有義鏈之上的環(huán)形表示有義靶標(biāo)內(nèi)的切割位點，dsRNA下面的環(huán)形表示反義靶標(biāo)中的切割位點。在來源于dsRNA 3’端的～21nt片段中鑒定出高達5個其它核苷酸。這些核苷酸主要是C、G或A殘基的隨機組合，最可能是在dsRNA組成鏈的T7轉(zhuǎn)錄過程中以非模板方式添加的。(B)～21nt RNA的核苷酸組成的二維TLC分析?！?1nt RNA如下產(chǎn)生內(nèi)部放射性標(biāo)記的504bp Pp-luc dsRNA在果蠅裂解液中溫育，凝膠純化，然后用核酸酶P1(最上一行)或核糖核酸酶T2(最下一行)消化為單核苷酸。在存在指定α-32P核苷三磷酸之一的情況下，通過轉(zhuǎn)錄在內(nèi)部放射性標(biāo)記dsRNA。放射性通過磷成像檢測。核苷5’-一磷酸、核苷3’-一磷酸、核苷5’，3’-二磷酸和無機磷酸鹽分別表示為pN、Np、pNp和Pi。黑色環(huán)形表示非放射性載體核苷酸的UV吸收點。用T4多核苷酸激酶和γ-32P-ATP使核苷3’-一磷酸5’磷酸化，制備放射性標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)，通過與該標(biāo)準(zhǔn)共遷移鑒定3’，5’-二磷酸(紅色環(huán)形)。
圖5合成的21和22nt RNA介導(dǎo)靶RNA切割。
(A)對照52bp dsRNA和合成21和22nt dsRNA的圖示。21和22nt短干涉RNA(siRNA)的有義鏈用藍色表示，反義鏈用紅色表示。除了雙鏈體5的22nt反義鏈之外，siRNA的序列來源于52和111bpdsRNA的克隆片段(圖4A)。雙鏈體6和7中的siRNA是111bp dsRNA加工反應(yīng)所特有的。在雙鏈體1和3的合成反義鏈序列中存在兩個3’突出核苷酸，以綠色表示。對照52bp dsRNA的兩條鏈都通過體外轉(zhuǎn)錄制備，一部分轉(zhuǎn)錄物可能包括非模板3’核苷酸添加。siRNA雙鏈體指導(dǎo)的靶RNA切割位點表示為橙色環(huán)形(見圖4A的圖例)，如圖5B所示確定。(B)有義和反義靶RNA上切割位點的位置。靶RNA序列如圖3B所示。對照52bp dsRNA(10nM)或21和22nt RNA雙鏈體1-7(100nM)與靶RNA一起在果蠅裂解液中25℃溫育2.5小時。穩(wěn)定的5’切割產(chǎn)物在凝膠上分析。切割位點在圖5A中標(biāo)出。52bp dsRNA針對的區(qū)域或有義或反義鏈在凝膠旁邊以黑線標(biāo)出。切割位點全都位于與dsRNA相同的區(qū)域內(nèi)。為了精確確定反義鏈的切割位點，使用較低百分比的凝膠。
圖6短dsRNA上的長3’突出端抑制RNAi。
(A)52bp dsRNA構(gòu)建體的圖示。有義和反義鏈的3’延伸分別以藍色和紅色表示。靶RNA上的切割位點用類似于圖4A的橙色環(huán)形表示，如圖6B所示確定。(B)有義和反義靶RNA上切割位點的位置。靶RNA序列如圖3B所示。dsRNA(10nM)與靶RNA一起在果蠅裂解液中25℃溫育2.5小時。穩(wěn)定的5’酶切產(chǎn)物在凝膠上分析。主要切割位點用水平箭頭標(biāo)出，也在圖6A中表示。52bp dsRNA針對的區(qū)域在凝膠兩側(cè)以黑線表示。
圖7建議的RNAi模型。
預(yù)測RNAi從dsRNA(有義鏈為黑色，反義鏈為紅色)主要加工為21和22nt短干擾RNA(siRNA)開始。如果dsRNA上存在短的突出3’核苷酸，它們可能有利于短dsRNA的加工。有待表征的dsRNA加工蛋白用綠色和藍色橢圓形表示，在dsRNA上以不對稱方式裝配。在我們的模型中，假定的藍色蛋白或蛋白域與siRNA鏈以3’-5’方向結(jié)合，而假定的綠色蛋白或蛋白域總是結(jié)合相對的siRNA鏈。這些蛋白質(zhì)或亞組與siRNA雙鏈體結(jié)合，并且保持其方向，這取決于dsRNA加工反應(yīng)的方向。只有與藍色蛋白結(jié)合的siRNA序列才能指導(dǎo)靶RNA切割。內(nèi)切核酸酶復(fù)合物被稱為小干擾核糖核蛋白復(fù)合物或siRNP。在此我們假定，切割dsRNA的內(nèi)切核酸酶也可切割靶RNA，這可能是通過暫時置換不用于靶標(biāo)識別的被動siRNA鏈。靶RNA然后在序列互補指導(dǎo)siRNA識別的區(qū)域中心切割。
圖8報道構(gòu)建體和siRNA雙鏈體。
(a)顯示來自質(zhì)粒pGL2-對照、pGL-3-對照和pRL-TK(Promega)的螢火蟲(Pp-luc)和海腎(Rr-luc)螢光素酶報道基因區(qū)。顯示SV40調(diào)節(jié)元件、HSV胸苷激酶啟動子和兩個內(nèi)含子(線)。GL3螢光素酶的序列與GL2有95％相同，但RL與這兩者完全無關(guān)。在轉(zhuǎn)染的哺乳動物細(xì)胞中由pGL2表達螢光素酶比由pGL3表達大約低10倍。SiRNA雙鏈體針對的區(qū)域在螢光素酶基因編碼區(qū)下用黑線表示。(b)顯示針對GL2、GL3和RL螢光素酶的siRNA雙鏈體的有義(上)和反義(下)序列。GL2和GL3 siRNA雙鏈體只有3個單核苷酸置換(以灰色框出)的不同。合成含有反向GL2序列的雙鏈體invGL2作為非特異對照。2’-脫氧胸苷的2nt 3’突出端表示為TT；uGL2類似于GL2 siRNA，但是含有核糖尿苷3’突出端。
圖9siRNA雙鏈體引起的RNA干涉。
靶與對照螢光素酶之比用緩沖液對照(bu，黑線)標(biāo)準(zhǔn)化；灰線表示Photinus pyralis(Pp-luc)GL2或GL3螢光素酶與Renillareniformis(Rr-luc)RL螢光素酶之比(左軸)，白線表示RL與GL2或GL3之比(右軸)。圖a、c、e、g、i描述用pGL2-對照和pRL-TK報道質(zhì)粒的組合進行的實驗，圖b、d、f、h、j使用pGL3-對照和pRL-TK報道質(zhì)粒。用于干涉實驗的細(xì)胞系在每張圖的頂部標(biāo)出。在標(biāo)準(zhǔn)化之前及在所檢測的不同細(xì)胞系之間，緩沖液對照(bu)的Pp-luc/Rr-luc比分別為pGL2/pRL0.5-10，pGL3/pRL0.03-1。作圖的數(shù)據(jù)是三次獨立實驗的平均值±S.D.。
圖1021nt siRNA、50bp和500bp dsRNA對HeLa細(xì)胞中螢光素酶表達的影響。
長dsRNA的確切長度在線條下面標(biāo)出。圖a、c、e描述用pGL2-對照和pRL-TK報道質(zhì)粒進行的實驗，圖b、d、f使用pGL3-對照和pRL-TK報道質(zhì)粒。數(shù)據(jù)是兩次獨立實驗的平均值±S.D.。(a)，(b)絕對Pp-luc表達，以任意發(fā)光單位作圖。(c)，(d)Rr-luc表達，以任意發(fā)光單位作圖。(e)，(f)標(biāo)準(zhǔn)化靶標(biāo)與對照螢光素酶之比。siRNA雙鏈體的螢光素酶活性之比用緩沖液對照(bu，黑線)標(biāo)準(zhǔn)化；50或500bpdsRNA的發(fā)光比分別用來自人源化GFP(hG，黑線)的50或500bpdsRNA的發(fā)光比標(biāo)準(zhǔn)化。應(yīng)當(dāng)指出，靶向GL2和GL3的49與484bpdsRNA之間的總體序列差異不足以使GL2與GL3靶標(biāo)之間具有特異性(49bp片段中有43nt連續(xù)同一性，484bp片段中有239nt最長連續(xù)同一性)。
圖1121-nt siRNA雙鏈體3’突出端的變異。
(A)實驗策略概述。顯示了加帽的和聚腺苷酸化的有義靶mRNA，并且顯示了有義和反義siRNA的相對位置。根據(jù)8個不同的反義鏈，制備了8個系列的雙鏈體。siRNA序列和突出核苷酸的數(shù)量以1nt的幅度改變。(B)在5nM平端dsRNA存在下，用黑尾果蠅胚胎裂解液中的對照螢光素酶(Renilla reniformis，Rr-luc)標(biāo)準(zhǔn)化的靶螢光素酶(Photinus pyralis，Pp-luc)的相對發(fā)光。在dsRNA存在下測定的發(fā)光比用緩沖液對照(bu，黑線)獲得的發(fā)光比標(biāo)準(zhǔn)化。標(biāo)準(zhǔn)化的發(fā)光比小于1表明有特異性干涉。(C-J)8個系列21-nt siRNA雙鏈體的標(biāo)準(zhǔn)化干涉比。siRNA雙鏈體的序列在條圖之上顯示。每張圖顯示由特定反義指導(dǎo)siRNA和5種不同的有義siRNA形成的一組雙鏈體的干涉比。突出核苷酸的數(shù)量(3’突出端，正數(shù)；5’突出端，負(fù)數(shù))在x軸上標(biāo)出。數(shù)據(jù)點是至少3次獨立實驗的平均值，誤差條代表標(biāo)準(zhǔn)差。
圖12siRNA雙鏈體有義鏈長度的變化。
(A)實驗圖示。3條21-nt反義鏈與8個有義siRNA配對。這些siRNA的3’端長度改變。反義siRNA的3’突出端為1-nt(B)、2-nt(C)或3-nt(D)，而每個系列的有義siRNA突出端不同。標(biāo)出了siRNA雙鏈體的序列和相應(yīng)的干涉比。
圖13保留2-nt 3’突出端的siRNA雙鏈體的長度變化。
(A)實驗圖示。21-nt siRNA雙鏈體在序列上與圖11H或圖12C所示相同。這些siRNA雙鏈體延伸到有義siRNA的3’端(B)或有義siRNA的5’端(C)。標(biāo)出了siRNA雙鏈體的序列和各自的干涉比。
圖14siRNA核糖殘基的2’-羥基的置換。
將siRNA雙鏈體鏈中的2’-羥基(OH)置換為2’-脫氧(d)或2’-O-甲基(Me)。3’端的2-nt和4-nt 2’-脫氧置換分別表示為2-nt d和4-nt d。尿苷殘基置換為2’-脫氧胸苷。
圖15具有2-nt 3’突出端的21-nt siRNA雙鏈體對有義和反義靶RNA切割的作圖。
(A)32P(星號)帽標(biāo)記的有義和反義靶RNA和siRNA雙鏈體的圖示。有義和反義靶RNA切割的位置分別在siRNA雙鏈體之上和之下用三角形標(biāo)出。(B)靶RNA切割位點的作圖。10nM靶標(biāo)與100nMsiRNA雙鏈體在黑尾果蠅胚胎裂解液中溫育2小時后，在測序凝膠上分析5’帽標(biāo)記的底物和5’切割產(chǎn)物。長度標(biāo)記物通過靶RNA的部分RNase T1消化(T1)和部分堿性水解(OH-)產(chǎn)生。圖左側(cè)的粗線表示與靶標(biāo)同向的siRNA鏈1和5所覆蓋的區(qū)域。
圖16指導(dǎo)siRNA的5’端決定靶RNA切割位置。
(A，B)實驗策略圖示。所有siRNA雙鏈體中的反義siRNA相同，但是通過改變3’端有義鏈有18-25nt的不同(A)，或者通過改變5’端有18-23nt的不同(B)。有義和反義靶RNA切割位置分別在siRNA雙鏈體之上和之下用三角形標(biāo)出。(C，D)利用帽標(biāo)記的有義(上圖)或反義(下圖)靶RNA對靶RNA切割的分析。只顯示帽標(biāo)記的5’切割產(chǎn)物。標(biāo)出了siRNA雙鏈體的序列，有義siRNA鏈的長度在圖上部標(biāo)出。圖(C)中用破折號標(biāo)記的對照道顯示在不含siRNA情況下溫育的靶RNA。標(biāo)記物如圖15所述。(D)下圖中的箭頭指出相差1nt的靶RNA切割位點。
圖17siRNA雙鏈體3’突出端的序列變異。
2-nt 3’突出端(NN，灰色)如圖所示在序列和組成上有變化(T，2’-脫氧胸苷，dG，2’-脫氧鳥苷，星號，野生型siRNA雙鏈體)。標(biāo)準(zhǔn)化的干涉比如圖11所述確定。野生型序列與圖14所示相同。
圖18靶標(biāo)識別的序列特異性。
顯示了錯配siRNA雙鏈體的序列，修飾的序列片段或單核苷酸以灰色在下面列出。參照雙鏈體(ref)和siRNA雙鏈體1-7含有2’-脫氧胸苷2-nt突出端。胸苷修飾的參照雙鏈體的沉默率與野生型序列相當(dāng)(圖17)。標(biāo)準(zhǔn)化的干涉比如圖11所述確定。
圖19保留2-nt 3’突出端的siRNA雙鏈體的長度變化。
siRNA雙鏈體延伸至有義siRNA的3’側(cè)(A)或有義siRNA的5’側(cè)(B)。標(biāo)出了siRNA雙鏈體的序列和各自的干涉比。對于HeLa SS6細(xì)胞，靶向GL2螢光素酶的siRNA雙鏈體(0.84μg)用pGL2-對照和pRL-TK質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染。為了進行對比，標(biāo)出了在黑尾果蠅裂解液中檢測到的siRNA雙鏈體的體外RNAi活性。
實施例1合成小RNA介導(dǎo)的RNA干涉1.1.實驗方法1.1.1體外RNAi體外RNAi和裂解液的制備如前所述進行(Tuschl等人，1999；Zamore等人，2000)。使用新溶解的肌酸激酶(Roche)對于最佳ATP再生至關(guān)重要。在25℃下，經(jīng)過15分鐘的延長預(yù)溫育時間，用5nM的dsRNA濃度進行RNAi翻譯測定(圖1)，之后加入體外轉(zhuǎn)錄、加帽并且聚腺苷酸化的Pp-luc和Rr-luc報道m(xù)RNA。繼續(xù)溫育1小時，利用雙螢光素酶測定(Promega)和單光3010C發(fā)光計(PharMingen)分析Pp-luc和Rr-luc蛋白的相對含量。
1.1.2RNA合成由攜帶T7或SP6啟動子序列的PCR模板體外轉(zhuǎn)錄RNA使用標(biāo)準(zhǔn)方法，例如參見(Tuschl等人，1998)。合成的RNA用Expedite RNA亞磷酰胺(Proligo)制備。3’接頭寡核苷酸用二甲氧基三苯甲基-1，4-苯二甲醇-琥珀酰-氨丙基-CPG合成。寡核糖核苷酸在3ml 32％氨/乙醇(3/1)中55℃去保護4小時(Expedite RNA)或55℃ 16小時(3’和5’接頭DNA/RNA嵌合寡核苷酸)，然后脫硅烷化，如前所述凝膠純化(Tuschl等人，1993)。包含長3’突出端的dsRNA制品的RNA轉(zhuǎn)錄物由有義方向含有T7啟動子、反義方向含有SP6啟動子的PCR模板產(chǎn)生。用GCGTAATACGACTCACTATAGAACAATTGCTTTTACAG(下劃線標(biāo)出T7啟動子)作為5’引物，用ATTTAGGTGACACTATAGGCATAAAGAATTGAAGA(下劃線標(biāo)出SP6啟動子)作為3’引物，用線性化Pp-luc質(zhì)粒(pGEM-luc序列)(Tuschl等人，1999)作為模板，PCR擴增有義和反義靶RNA的轉(zhuǎn)錄模板；T7轉(zhuǎn)錄的有義RNA為177nt長，在相對于起始密碼子的位點113-273之間含有Pp-luc序列，之后在3’端是SP6啟動子序列的17nt互補序列。通過只含單啟動子序列的兩種不同PCR產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄，制備用于形成平端dsRNA的轉(zhuǎn)錄物。
利用苯酚/氯仿抽提進行dsRNA退火。等摩爾濃度的有義和反義RNA(50nM-10μM，取決于長度和含量)在0.3M NaOAc(pH6)中90℃溫育30秒，然后在室溫下用等體積的苯酚/氯仿抽提，之后用氯仿抽提除去殘余的苯酚。加入2.5-3倍體積的乙醇沉淀產(chǎn)生的dsRNA。沉淀溶解于裂解緩沖液(100mM KCl，30mM HEPES-KOH，pH7.4，2mM Mg(OAc)2)中，在1×TAE緩沖液中通過標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖凝膠電泳證實dsRNA的質(zhì)量。具有17nt和20nt 3’突出端的52bp dsRNA(圖6)在95℃下溫育1分鐘退火，迅速冷卻到70℃，然后在3個小時內(nèi)緩慢冷卻到室溫(50μl退火反應(yīng)，1μM標(biāo)準(zhǔn)濃度，300mM NaCl，10mMTris-HCl，pH7.5)。然后用苯酚/氯仿抽提dsRNA，乙醇沉淀，溶解于裂解緩沖液中。
用1mM ATP、CTP、GTP、0.1或0.2mM UTP和0.2-0.3μM32P-UTP(3000 Ci/mmol)，或者用是放射性標(biāo)記核苷三磷酸的各自的比例而不是UTP的比例轉(zhuǎn)錄用于制備dsRNA的內(nèi)部32P-放射性標(biāo)記的RNA(圖2和圖4)。靶RNA的帽子的標(biāo)記如前所述進行。靶RNA在帽子標(biāo)記后凝膠純化。
1.1.3切割位點作圖標(biāo)準(zhǔn)RNAi反應(yīng)如下進行預(yù)溫育10nM dsRNA 15分鐘，隨后加入10nM帽子標(biāo)記的靶RNA。再溫育2小時(圖2A)或2.5小時(圖5B和6B)后，通過蛋白酶K處理終止反應(yīng)(Tuschl等人，1999)。然后在8％或10％測序凝膠上分析樣品。21和22nt合成RNA雙鏈體以100nM終濃度使用(圖5B)。
1.1.4～21nt RNA的克隆在不含靶RNA的情況下，在果蠅裂解液中溫育放射性標(biāo)記的dsRNA，產(chǎn)生21nt RNA(200μl反應(yīng)，1小時溫育，50nM dsP111，或100nM dsP52或dsP39)。然后用蛋白酶K處理反應(yīng)混合物(Tuschl等人，1999)，在變性15％聚丙烯酰胺凝膠上分離dsRNA加工產(chǎn)物。切下大小范圍至少為18-24nt的條帶，洗脫到0.3M NaCl中，在4℃下在硅化試管中過夜。通過乙醇沉淀回收RNA，去磷酸化(30μl反應(yīng)，30分鐘，50℃，10U堿性磷酸酶，Roche)。通過苯酚/氯仿抽提終止反應(yīng)，乙醇沉淀RNA。3’接頭寡核苷酸(pUUUaaccgcatccttctcx大寫，RNA；小寫，DNA；p，磷酸；x，4-羥甲基芐基)與去磷酸化的～21ntRNA連接(20μl反應(yīng)，30分鐘，37℃，5μM 3’接頭，50mM Tris-HCl，pH7.6，10mM MgCl2，0.2mM ATP，0.1mg/ml乙酰BSA，15％DMSO，25U T4 RNA連接酶，Amersham-Pharmacia)(Pan和Uhlenbeck，1992)。加入等體積的8M尿素/50mM EDTA終止混合物終止連接反應(yīng)，直接加樣到15％凝膠上。連接產(chǎn)率超過50％。從凝膠中回收連接產(chǎn)物，并5’-磷酸化(20μl反應(yīng)，30分鐘，37℃，2mM ATP，5U T4多核苷酸激酶，NEB)。通過苯酚/氯仿抽提終止磷酸化反應(yīng)，乙醇沉淀回收RNA。然后，5’接頭(tactaatacgactcactAAA大寫，RNA；小寫，DNA)如上所述與磷酸化連接產(chǎn)物連接。凝膠純化新的連接產(chǎn)物，在用作載體的反轉(zhuǎn)錄引物(GACTAGCTGGAATTCAAGGATGCGGTTAAA，下劃線，EcoRI位點)存在下，從凝膠切片中洗脫。反轉(zhuǎn)錄(15μl反應(yīng)，30分鐘，42℃，150U Superscript II反轉(zhuǎn)錄酶，Life Technologies)之后用CAGCCAACGGAATTCATACGACTCACTAAA(下劃線，EcoRI位點)作為5’引物和3’RT引物進行PCR。經(jīng)苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀純化PCR產(chǎn)物。然后用EcoRI(NEB)消化PCR產(chǎn)物，用T4 DNA連接酶(高濃度，NEB)連環(huán)化。在低熔點瓊脂糖凝膠上分離大小為200-800bp的多聯(lián)體，利用標(biāo)準(zhǔn)的熔化和苯酚抽提法從凝膠中回收，乙醇沉淀。在標(biāo)準(zhǔn)條件下與Taq聚合酶72℃溫育15分鐘，補平未配對的末端，用TOTO TA克隆試劑盒(Invitrogen)將DNA產(chǎn)物與pCR2.1-TOPO載體直接連接。利用PCR和M13-20和M13反向測序引物篩選集落。直接對PCR產(chǎn)物進行委托測序(Sequence Laboratories GttingenGmbH，德國)。每個克隆平均獲得4-5條21mer序列。
1.1.5 2D-TLC分析放射性標(biāo)記、凝膠純化的siRNA的核酸酶P1消化和2D-TLC如(Zamore等人，2000)所述進行。采用2μg/μl載體tRNA和30U核糖核酸酶T2(Life Technologies)，在10mM乙酸銨(pH4.5)中以10μl反應(yīng)體積進行核酸酶T2消化，50℃ 3小時。非放射性標(biāo)準(zhǔn)的遷移通過UV影像法測定。T2消化產(chǎn)物與使用γ-32P-ATP和T4多核苷酸激酶經(jīng)商品核苷3’-一磷酸的5’-32P-磷酸化制備的標(biāo)準(zhǔn)共遷移，由此證實核苷-3’，5’-二磷酸的身份(數(shù)據(jù)未顯示)。
1.2結(jié)果與討論1.2.1dsRNA加工為21和22nt RNA片段的長度要求由黑尾果蠅合胞體胚胎制備的裂解液概述了體外RNAi，提供了一個用于生化分析RNAi機制的新型工具(Tuschl等人，1999；Zamore等人，2000)。RNAi對dsRNA的長度要求的體外和體內(nèi)分析揭示，在降解靶mRNA上，短dsRNA(＜150bp)比長dsRNA效率更低(Caplen等人，2000；Hammond等人，2000；Ngo等人，1998；Tuschl等人，1999)。mRNA降解效率降低的原因尚不清楚。因此我們在最佳條件下，在果蠅裂解液中，檢查了靶RNA降解對dsRNA的精確長度要求(Zamore等人，2000)。合成了幾個系列的dsRNA，它們針對螢火蟲螢光素酶(Pp-luc)報道RNA。用雙螢光素酶測定(Tuschl等人，1999)監(jiān)測靶RNA表達的特異性抑制(圖1A和1B)。對于短至38bp的dsRNA，我們檢測到靶RNA表達的特異性抑制，但是29-36bp的dsRNA在該方法中無效。此作用與靶位點無關(guān)，與dsRNA長度(即長dsRNA)相關(guān)的Pp-luc mRNA表達的抑制程度比短dsRNA更有效。
曾經(jīng)提出，dsRNA加工產(chǎn)生的21-23nt RNA片段是RNA干涉和共抑制的介體(Hamilton和Baulcombe，1999；Hammond等人，2000；Zamore等人，2000)。因此我們分析了大小為501-29bp的dsRNA亞組的21-23nt片段形成率。對于39-501bp長dsRNA，容易地檢測到果蠅裂解液中21-23nt片段的形成(圖2)，但是29bp dsRNA明顯延遲。這一發(fā)現(xiàn)與21-23nt片段在指導(dǎo)mRNA切割上的作用一致，為RNAi缺乏30bp dsRNA提供了一種解釋。21-23mer形成的長度信賴性可能反映了一種生物學(xué)相關(guān)的控制機制，其通過規(guī)則細(xì)胞RNA的分子內(nèi)堿基配對的短結(jié)構(gòu)阻止不希望的RNAi激活。
1.2.2 39bp dsRNA介導(dǎo)靶RNA在單個位點處的切割向果蠅裂解液中加入dsRNA和5’-加帽的靶RNA導(dǎo)致靶RNA的序列特異性降解(Tuschl等人，1999)。靶mRNA只在與dsRNA相同的區(qū)域內(nèi)切割，許多靶切割位點相隔21-23nt(Zamore等人，2000)。因此，特定dsRNA的切割位點數(shù)預(yù)計大約對應(yīng)于dsRNA的長度除以21。我們對在帽子處5’放射性標(biāo)記的有義和反義靶RNA上的靶切割位點作圖(Zamore等人，2000)(圖3A和3B)。在測序凝膠上分離穩(wěn)定的5’切割產(chǎn)物，通過與來自靶RNA的部分RNase T1和堿性水解梯度比較，確定切割位點。
與以前的發(fā)現(xiàn)(Zamore等人，2000)一致，所有靶RNA切割位點都位于與dsRNA相同的區(qū)域內(nèi)。有義或反義靶標(biāo)只被39bp dsRNA切割一次。每個切割位點都與dsRNA覆蓋的區(qū)域的5’端相距10nt(圖3B)。與39bp dsRNA有相同5’端的52bp dsRNA除了位于第一個位點下游23和24nt的兩個較弱切割位點之外，在有義靶標(biāo)上還產(chǎn)生相同的切割位點，距與dsRNA相同的區(qū)域的5’端10nt。反義靶標(biāo)只切割一次，與各自dsRNA覆蓋的區(qū)域的5’端相距10nt。圖1所示的38-49bp dsRNA的切割位點作圖顯示，第一個和主要的切割位點總是位于dsRNA覆蓋的區(qū)域的7-10nt下游(數(shù)據(jù)未顯示)。這提示，靶RNA切割點取決于dsRNA末端，可能意味著加工為21-23mer從雙鏈體末端開始。
較長的111bp dsRNA在有義和反義靶標(biāo)上的切割位點比預(yù)期的更多，大多數(shù)似乎以20-23nt的間隔聚簇(圖3A和3B)。對于較短的dsRNA，在有義靶標(biāo)上的第一個切割位點與dsRNA覆蓋的區(qū)域的5’端相距10nt，在反義靶標(biāo)上的第一個切割位點與dsRNA覆蓋的區(qū)域的5’端相距9nt。還不清楚是什么導(dǎo)致這種混亂的切割，但是一種可能性是，較長的dsRNA不僅可以從末端開始加工，而且也可在內(nèi)部加工，或者存在我們還不清楚的一些dsRNA加工的特異性決定簇。以前也注意到21-23nt間隔的不規(guī)則性(Zamore等人，2000)。為了更好地了解dsRNA加工和靶RNA識別的分子基礎(chǔ)，我們決定分析果蠅裂解液中39、52和111bp dsRNA加工產(chǎn)生的21-23nt片段的序列。
1.2.3 dsRNA通過RNase III樣機制加工為21和22nt RNA為了表征21-23nt RNA片段，我們檢查了該RNA片段的5’和3’端。對凝膠純化的21-23nt RNA進行高碘酸鹽氧化，隨后進行β-排除，表明存在末端2’和3’羥基。21-23mer對堿性磷酸酶處理也有反應(yīng)性，表明存在5’端磷酸基團。5’磷酸和3’羥基端的存在提示，dsRNA能被類似于大腸桿菌RNase III的酶活性加工(綜述見Dunn，1982；Nicholson，1999；Robertson，1990；Robertson，1982)。
利用T4 RNA連接酶將3’和5’接頭寡核苷酸與純化的21-23mer連接，進行21-23nt RNA片段的定向克隆。反轉(zhuǎn)錄連接產(chǎn)物，PCR擴增，連環(huán)化，克隆并測序。從39、52和111bp dsRNA的dsRNA加工反應(yīng)中測序超過220個短RNA(圖4A)。我們發(fā)現(xiàn)下列長度分布1％18nt，5％19nt，12％20nt，45％21nt，28％22nt，6％23nt，2％24nt。對加工片段5’端核苷酸的序列分析表明，含有5’鳥苷的寡核苷酸被低估。這種情況最可能是由于加入了T4 RNA連接酶，該酶將5’磷酸化鳥苷識別為供體寡核苷酸；在3’端未見明顯的序列偏差。來源于雙鏈體有義或反義鏈3’端的許多～21nt片段含有在使用T7RNA聚合酶合成RNA過程中非模板添加核苷酸產(chǎn)生的3’核苷酸。有意思的是，也克隆了相當(dāng)數(shù)量的內(nèi)源果蠅～21nt RNA，其中一些來自LTR和非LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(數(shù)據(jù)未顯示)。這與RNAi在轉(zhuǎn)座子沉默中的作用一致。
～21nt RNA存在于覆蓋完整dsRNA序列的聚簇基團中(圖4A)。顯然，加工反應(yīng)通過產(chǎn)生交錯的3’末端切割dsRNA，這是RNase III切割的另一個特征。對于39bp dsRNA，在每條包含突出3’端的dsRNA組成鏈中發(fā)現(xiàn)兩簇～21nt RNA，而在有義和反義靶標(biāo)上只檢測到一個切割位點(圖3A和3B)。如果～21nt片段在介導(dǎo)mRNA降解的復(fù)合物中作為單鏈指導(dǎo)RNA存在，可以假定至少存在兩個靶切割位點，但這不是事實。這提示，～21nt RNA可能以雙鏈形式存在于內(nèi)切核酸酶復(fù)合物中，但是只有一條鏈能用于靶RNA識別和切割。根據(jù)～21nt雙鏈體與核酸酶復(fù)合物結(jié)合的方向可以簡單地確定～21nt鏈之一在靶切割中的用途。該方向取決于原始dsRNA的加工方向。
與39bp dsRNA相比，52bp和111bp dsRNA的～21mer簇尚未確定。這些簇覆蓋25-30nt的區(qū)域，最可能代表～21nt雙鏈體的幾個不同的亞群，因此指導(dǎo)在幾個鄰近位點的靶切割。這些切割區(qū)仍然主要有20-23nt的間隔。決定怎樣規(guī)則的dsRNA才能被加工為～21nt片段的原則尚不清楚，但是以前發(fā)現(xiàn)，使用尿苷能改變切割位點的大約21-23nt的間隔(Zamore等人，2000)。大腸桿菌RNase III切割dsRNA的特異性似乎主要由抗決定簇控制，即，在相對于切割位點的特定位置處排除某些特異堿基對(Zhang和Nicholson，1997)。
為了檢測加工的～21nt RNA片段中存在糖-、堿基-還是帽-修飾，我們在裂解液中溫育放射性標(biāo)記的505bp Pp-luc dsRNA 1小時，分離～21nt產(chǎn)物，用P1或T2核酸酶消化為單核苷酸。然后用2D薄層層析法分析核苷酸混合物(圖4B)。P1或T2消化顯示，4種天然核糖核苷酸都沒有修飾。我們以前曾經(jīng)分析了～21nt片段中的腺苷-肌苷轉(zhuǎn)化(溫育2小時后)，檢測到程度較小(＜0.7％)的脫氨基作用(Zamore等人，2000)；在裂解液中溫育較短時間(1小時)使肌苷部分減至幾乎無法檢測的水平。可切割磷酸二酯鍵3’的RNase T2產(chǎn)生核苷3’-磷酸和核苷3’，5’-二磷酸，因而表明存在5’端一磷酸。檢測到全部4種核苷3’，5’-二磷酸，提示核苷酸間鍵的切割沒有或只有較低的序列特異性。總之，～21nt片段沒有修飾，是由dsRNA產(chǎn)生的，因此在5’端存在5’-一磷酸和3’-羥基。
1.2.4合成21和22nt RNA介導(dǎo)靶RNA切割對dsRNA加工產(chǎn)物的分析表明，～21nt片段是通過具有RNase III切割反應(yīng)所有特征的一種反應(yīng)產(chǎn)生的(Dunn，1982；Nicholson，1999；Robertson，1990；Robertson，1982)。RNase III在dsRNA的兩條鏈上產(chǎn)生兩個交錯的切口，形成大約2nt的3’突出端。我們化學(xué)合成了21和22nt RNA，它們在序列上與某些克隆的～21nt片段相同，并且檢測了它們介導(dǎo)靶RNA降解的能力(圖5A和5B)。21和22nt RNA雙鏈體在裂解液中以100nM濃度溫育，濃度比52bp對照dsRNA高10倍。在這種條件下，易于檢測到靶RNA切割。21和22nt雙鏈體的濃度從100nM降到10nM仍能引起靶RNA切割。然而，雙鏈體濃度從100nM提高到1000nM不能進一步提高靶切割，這可能是由于裂解液內(nèi)存在一種限制蛋白因子。
與不介導(dǎo)RNAi的29或30bp dsRNA不同，具有2-4nt突出3’端的21和22nt dsRNA介導(dǎo)靶RNA的高效降解(雙鏈體1、3、4、6，圖5A和5B)。平端21或22nt dsRNA(雙鏈體2、5、7，圖5A和5B)降解靶標(biāo)的能力降低，表明突出的3’端對于RNA-蛋白質(zhì)核酸酶復(fù)合物的重建至關(guān)重要?！?1nt雙鏈體與蛋白質(zhì)成分的高親和力結(jié)合可能需要單鏈突出端。5’端磷酸盡管在dsRNA加工后存在，但不是介導(dǎo)靶RNA切割所需的，在合成的短RNA中缺乏。
合成21和22nt雙鏈體指導(dǎo)有義及反義靶標(biāo)在短雙鏈體覆蓋的區(qū)域內(nèi)切割。這是一個重要結(jié)果，因為形成兩對～21nt片段簇的39bpdsRNA(圖2)只切割有義或反義靶標(biāo)一次而不是兩次。我們提出～21nt雙鏈體的兩條鏈只有一條能指導(dǎo)靶RNA切割，核酸酶復(fù)合物中～21nt雙鏈體的方向取決于dsRNA加工的最初方向，從而解釋了這一結(jié)果。然而，向體外系統(tǒng)輸送已經(jīng)加工好的～21nt雙鏈體可以以對稱RNA雙鏈體的兩個可能方向形成活性序列-特異性核酸酶復(fù)合物。這導(dǎo)致有義及反義靶標(biāo)在與21nt RNA雙鏈體相同的區(qū)域內(nèi)切割。
靶切割位點位于與21或22nt指導(dǎo)序列互補的第一個核苷酸的11或12nt下游，即切割位點靠近21或22nt RNA所覆蓋的區(qū)域的中心(圖4A和4B)。替換22nt雙鏈體有義鏈的兩個核苷酸(比較圖5A中的雙鏈體1和3)只將反義靶標(biāo)的切割位點替換了兩個核苷酸。替換有義和反義鏈的兩個核苷酸使切割位點位移兩個核苷酸(比較雙鏈體1和4)。我們預(yù)測能設(shè)計一對21或22nt RNA，它們幾乎在任何特定位點均能切割靶RNA。
21和22nt RNA指導(dǎo)的靶RNA切割的特異性似乎是強烈的，因為未檢測到異常的切割位點(圖5B)。然而應(yīng)當(dāng)指出，21和22nt RNA雙鏈體3’突出端存在的核苷酸在底物識別方面的作用可能比靠近切割位點的核苷酸要小。這是基于以下發(fā)現(xiàn)活性雙鏈體1或3的3’突出端中的3’核苷酸(圖5A)不與靶標(biāo)互補。現(xiàn)在利用21和22nt RNA能容易地進行RNAi特異性的詳細(xì)分析。
根據(jù)具有突出3’端的21和22nt RNA介導(dǎo)RNA干涉的證據(jù)，我們提出將～21nt RNA命名為“短干涉RNA”或siRNA，將各自的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物命名為“小干涉核糖核蛋白顆?！被騭iRNP。
1.2.5短dsRNA上的20nt 3’突出端抑制RNAi我們表示，平端短dsRNA似乎從dsRNA的末端開始加工。在我們對RNAi中dsRNA長度依賴性的研究過程中，我們也分析了具有17-20nt突出3’端的dsRNA，我們吃驚地發(fā)現(xiàn)它們還不如平端dsRNA有效。對于可達100bp的dsRNA，長3’端的抑制作用特別明確，但是更長的dsRNA就沒有這么明顯。根據(jù)天然凝膠分析(數(shù)據(jù)未顯示)，這種作用是由于dsRNA形成不好。我們檢驗了長突出3’端的抑制作用是否能作為將dsRNA加工只定向于短RNA雙鏈體兩端之一的工具。
我們合成了52bp模型dsRNA的4種組合平端、只在有義鏈上的3’延伸、只在反義鏈上的3’延伸和在兩條鏈上的雙3’延伸，并在裂解液中溫育后對靶RNA切割位點作圖(圖6A和6B)。當(dāng)雙鏈體反義鏈的3’端延伸時，有義靶標(biāo)的第一個和主要的切割位點丟失，反之亦然，當(dāng)雙鏈體有義鏈的3’端延伸時，反義靶標(biāo)的強切割位點丟失。兩條鏈的3’延伸使52bp dsRNA實際上失活?！?0nt 3’延伸使dsRNA失活的一種解釋是單鏈RNA-結(jié)合蛋白的結(jié)合，這能干擾dsRNA加工因子之一在該末端的結(jié)合。該結(jié)果也與我們的模型一致，在我們的模型中，在裝配的siRNP中只有siRNA雙鏈體的一條鏈能指導(dǎo)靶RNA切割。指導(dǎo)RNA切割的鏈的方向取決于dsRNA加工反應(yīng)的方向。具有3’交錯末端可能有利于加工復(fù)合物的裝配。在有義鏈3’端的阻斷只允許從反義鏈的相對3’端開始dsRNA加工。隨后產(chǎn)生siRNP復(fù)合物，其中只有siRNA雙鏈體的反義鏈能指導(dǎo)有義靶RNA切割。情況相反時同樣如此。
至于較長的dsRNA(≥500bp，數(shù)據(jù)未顯示)，長3’延伸的抑制作用不明顯，這提示我們，長dsRNA也可能含有內(nèi)部dsRNA加工信號，或者可能由于多種切割因子的結(jié)合而協(xié)同加工。
1.2.6 dsRNA指導(dǎo)的mRNA切割的模型新的生物化學(xué)數(shù)據(jù)更新了dsRNA如何靶向mRNA進行破壞的模型(圖7)。雙鏈RNA首先加工為主要長21和22nt的短RNA雙鏈體，其具有類似于RNase III樣反應(yīng)的交錯3’端(Dunn，1982；Nicholson，1999；Robertson，1982)。根據(jù)加工RNA片段的21-23nt長度，曾經(jīng)推測RNase III樣活性可能參與RNAi(Bass，2000)。在RNase III反應(yīng)產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)，在siRNA的末端存在5’磷酸和3’羥基，這進一步支持了這一假說(Dunn，1982；Nicholson，1999)。細(xì)菌RNase III和真核同源物——釀酒酵母中的Rnt1p和粟酒酵母中的Pac1p在核糖體RNA和snRNA和snoRNA的加工中起作用(參見，例如Chanfreau等人，2000)。
關(guān)于來自植物、動物或人類的RNase III同源物的生物化學(xué)，人們知之甚少。主要通過數(shù)據(jù)庫指導(dǎo)的序列分析或cDNA的克隆鑒定了兩個RNase III酶家族。第一個RNase III家族的代表是1327個氨基酸長的黑尾果蠅蛋白drosha(Acc.AF116572)。C端由兩個RNase III和一個dsRNA結(jié)合域組成，N端功能未知。在C.elegans(Acc.AF160248)和人類(Acc.AF189011)中也發(fā)現(xiàn)了密切同源物(Filippov等人，2000；Wu等人，2000)。drosha樣人RNase III(Wu等人，2000)最近已經(jīng)克隆并表征。該基因在人類組織和細(xì)胞系中普遍表達，該蛋白質(zhì)位于細(xì)胞的核和核仁中。根據(jù)反義抑制研究推斷的結(jié)果，提出了該蛋白質(zhì)在rRNA加工中的作用。第二類的代表是編碼1822個氨基酸長的蛋白質(zhì)的C.elegans基因K12H4.8(Acc.S44849)。該蛋白質(zhì)含有一個N端RNA解旋酶基序，之后是2個RNase III催化域和一個dsRNA結(jié)合基序，類似于drosha RNase III家族。在粟酒酵母(Acc.Q09884)、A.thaliana(Acc.FA187317)、黑尾果蠅(Acc.AE003740)和人類(Acc.AB028449)中具有密切同源物(Filippov等人，2000；Jacobsen等人，1999；Matsuda等人，2000)。K12H4.8 RNase III/解旋酶可能是參與RNAi的候選物。
在C.elegans中進行遺傳篩選鑒定了rde-1和rde-4，它們是RNAi激活所必需的，對轉(zhuǎn)座子移動或共抑制沒有影響(Dernburg等人，2000；Grishok等人，2000；Ketting和Plasterk，2000；Tabara等人，1999)。這引出一種假說這些基因?qū)τ赿sRNA加工非常重要，但是不參與mRNA靶降解。這兩種基因的功能仍然未知，rde-1基因產(chǎn)物是類似于兔蛋白elF2C的蛋白質(zhì)家族的一員(Tabara等人，1999)，rde-4的序列還未有描述。將來對這些蛋白質(zhì)的生物化學(xué)表征將揭示其分子功能。
加工為siRNA雙鏈體似乎從平端dsRNA或具有短(1-5nt)3’突出端的dsRNA的末端開始，以大約21-23nt的幅度加工。短dsRNA上的長(～20nt)3’交錯末端抑制RNAi，這可能是通過與單鏈RNA結(jié)合蛋白相互作用。在短dsRNA側(cè)翼的單鏈區(qū)抑制RNAi，以及短30bpdsRNA缺乏siRNA形成，可以解釋mRNA中常見的結(jié)構(gòu)區(qū)為什么不導(dǎo)致RNAi激活。
不希望被理論所束縛，我們假設(shè)dsRNA加工蛋白或其亞組在加工反應(yīng)后仍與siRNA雙鏈體結(jié)合。siRNA雙鏈體相對于這些蛋白質(zhì)的方向決定兩條互補鏈的哪一條在指導(dǎo)靶RNA降解中起作用?；瘜W(xué)合成的siRNA雙鏈體指導(dǎo)有義及反義靶RNA的切割，因為它們能以兩種可能的方向之一與蛋白質(zhì)成分結(jié)合。
合成21和22nt siRNA雙鏈體能用于有效的mRNA降解，這一重要發(fā)現(xiàn)為功能基因組學(xué)以及生物醫(yī)學(xué)研究中基因表達的序列特異性調(diào)節(jié)提供了新的工具。在由于PKR反應(yīng)激活而不能使用長dsRNA的哺乳動物系統(tǒng)中，siRNA可能有效(Clemens，1997)。因此，siRNA雙鏈體是反義或核酶治療劑的一種新的備選劑。
實施例2人組織培養(yǎng)物中的RNA干涉2.1方法2.1.1RNA制備用Expedite RNA亞磷酰胺和胸苷亞磷酰胺(Proligo，德國)化學(xué)合成21nt RNA。合成的寡核苷酸去保護并凝膠純化(實施例1)，之后經(jīng)Sep-Pak C18柱(Waters，Milford，MA，USA)純化(Tuschl，1993)。針對GL2(Acc.X65324)和GL3螢光素酶(Acc.U47296)的siRNA序列對應(yīng)于相對于起始密碼子第一個核苷酸的編碼區(qū)152-173，針對RL(Acc.AF025846)的siRNA對應(yīng)于起始密碼子之后的區(qū)119-129。較長的RNA用T7 RNA聚合酶由PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄，然后用凝膠和Sep-Pak純化。49和484bp GL2或GL3 dsRNA分別對應(yīng)于相對于翻譯起點的位點113-161和113-596。50和501bp RL dsRNA分別對應(yīng)于位點118-167和118-618。針對人源化GFP(hG)的dsRNA合成的PCR模板從pAD3(Kehlenbach，1998)中擴增，因此50和501bp hG dsRNA分別對應(yīng)于相對起始密碼子的位點118-167和118-618。
為使siRNA退火，20μM單鏈在退火緩沖液(100mM乙酸鉀，30mM HEPES-KOH pH7.4，2mM乙酸鎂)中90℃溫育1分鐘，然后37℃ 1小時。對于50和500bp dsRNA，37℃溫育步驟延長過夜，退火反應(yīng)分別以8.4μM和0.84μM的鏈濃度進行。
2.1.2細(xì)胞培養(yǎng)S2細(xì)胞在25℃下在補充了10％FBS、100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的Schneider’s果蠅培養(yǎng)基(Life Technologies)中繁殖。293、NIH/3T3、HeLa S3、COS-7細(xì)胞在37℃下在補充了10％FBS、100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞定期傳代，以保持指數(shù)生長。轉(zhuǎn)染前24小時，在大約80％平鋪時，哺乳動物細(xì)胞用胰蛋白酶消化，用不含抗生素的新鮮培養(yǎng)基1∶5稀釋(1-3×105細(xì)胞/ml)，轉(zhuǎn)移到24孔板中(500μl/孔)。S2細(xì)胞在分裂前不用胰蛋白酶消化。如廠商對于粘附細(xì)胞系所述，用Lipofectamine 2000試劑(Life Technologies)進行轉(zhuǎn)染。每孔加入配制于脂質(zhì)體中的1.0μg pGL2-對照(Promega)或pGL3-對照(Promega)、0.1μg pRL-TK(Promega)和0.28μg siRNA雙鏈體或dsRNA；終體積為每孔600μl。細(xì)胞在轉(zhuǎn)染20小時后溫育，此后似乎健康。然后用雙螢光素酶測定(Promega)監(jiān)測螢光素酶表達。在1.1μg hGFP編碼pAD3和0.28μg invGL2 inGL2 siRNA共轉(zhuǎn)染后，通過對哺乳動物細(xì)胞系的熒光顯微鏡檢，測定轉(zhuǎn)染率，為70-90％。報道質(zhì)粒在XL-1 Blue(Stratagene)中擴增，用Qiagen EndoFree Maxi質(zhì)粒試劑盒純化。
2.2結(jié)果與討論為了檢驗siRNA是否也能在組織培養(yǎng)中介導(dǎo)RNAi，我們合成了具有對稱2nt 3’突出端的21nt siRNA雙鏈體，它們針對編碼海腎(Renilla reniformis)和螢火蟲(Photinus pyralis，GL2和GL3)螢光素酶兩種序列變體的報道基因(圖8a，b)。siRNA雙鏈體與報道質(zhì)粒組合pGL2/pRL或pGL3/pRL利用陽離子脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染黑尾果蠅Schneider S2細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染20小時后測定螢光素酶活性。在檢測的所有細(xì)胞系中，我們在同源siRNA雙鏈體存在下觀察到報道基因表達特異性減少(圖9a-j)。顯然，絕對螢光素酶表達水平不受非同源siRNA影響，表明21nt RNA雙鏈體沒有有害的副作用(對于HeLa細(xì)胞，例如圖10a-d)。在黑尾果蠅Schneider S2細(xì)胞中(圖9a，b)，螢光素酶完全特異性抑制。在報道基因表達強50-100倍的哺乳動物細(xì)胞中，特異性抑制不完全(圖9c-j)。同源siRNA致使GL2表達減少3-12倍，GL3表達減少9-25倍，RL表達減少1-3倍。對于293細(xì)胞，RLsiRNA對RL螢光素酶的靶向無效，但是GL2和GL3靶特異性反應(yīng)(圖9i，j)。293細(xì)胞中沒有RL表達減少可能是由于其表達比檢測的其它任何哺乳動物細(xì)胞系高5-20倍，和/或由于RNA二級結(jié)構(gòu)或結(jié)合蛋白質(zhì)，靶序列的可接近性受限。然而，同源siRNA雙鏈體對GL2和GL3螢光素酶的特異靶向表明RNAi在293細(xì)胞中也起作用。
除了uGL2之外，所有siRNA雙鏈體的2nt 3’突出端都由(2’-脫氧)胸苷組成。3’突出端中尿苷置換為胸苷在黑尾果蠅體外系統(tǒng)中良好耐受，突出端序列對靶標(biāo)識別而言并不重要。選擇胸苷突出端，因為推斷它能提高組織培養(yǎng)基中和轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)siRNA的核酸酶抗性。實際上，在檢測的所有細(xì)胞系中，胸苷修飾的GL2 siRNA略強于未修飾的uGL2 siRNA(圖9a，c，e，g，i)?？梢韵胂?，進一步修飾3’突出端核苷酸可能對siRNA雙鏈體的輸送和穩(wěn)定性有其它好處。
在共轉(zhuǎn)染實驗中，對于組織培養(yǎng)基的終體積，使用25nM siRNA雙鏈體(圖9，10)。siRNA濃度提高為100nM不能提高特異性沉默作用，但是由于質(zhì)粒DNA與siRNA之間脂質(zhì)體包封的競爭，開始影響轉(zhuǎn)染率(數(shù)據(jù)未顯示)。siRNA濃度降至1.5nM不會降低特異性沉默作用(數(shù)據(jù)未顯示)，即使siRNA只比DNA質(zhì)粒濃縮2-20倍。這表明，siRNA是介導(dǎo)基因沉默的非常有效的試劑，在濃度比常規(guī)反義或核酶基因靶向?qū)嶒炇褂玫臐舛鹊蛶讉€數(shù)量級時，siRNA是有效的。
為了監(jiān)測較長dsRNA對哺乳動物細(xì)胞的作用，制備了與報道基因同源的50和500bp dsRNA。用來自人源化GFP(hG)的dsRNA作為非特異性對照(Kehlenbach，1998)。當(dāng)dsRNA與siRNA雙鏈體含量相同地(不濃縮)共轉(zhuǎn)染時，報道基因的表達強烈且非特異性地降低。以HeLa細(xì)胞為代表性實例說明了這一結(jié)果(圖10a-d)。50bp dsRNA共轉(zhuǎn)染使絕對螢光素酶活性非特異地降低10-20倍，500bp dsRNA共轉(zhuǎn)染使其降低20-200倍。對于COS-7和NIH/3T3細(xì)胞也觀察到類似的非特異性作用。對于293細(xì)胞，只有用500bp dsRNA才觀察到10-20倍非特異性降低。＞30bp dsRNA使報道基因表達非特異性降低被認(rèn)為是干擾素反應(yīng)的一部分。
奇怪的是，盡管報道基因表達強烈地非特異性降低，但我們可重復(fù)地檢測到其它序列特異的、dsRNA介導(dǎo)的沉默。然而，只有在相對報道基因活性用hG dsRNA對照標(biāo)準(zhǔn)化時，特異性沉默作用才明顯(圖10e，f)。在檢測的其它3種哺乳動物細(xì)胞系中也觀察到同源dsRNA引起的2-10倍的特異性降低(數(shù)據(jù)未顯示)。dsRNA(356-1662bp)的特異性沉默作用以前在CHO-K1細(xì)胞中有報道，但是檢測2-4倍特異性降低所需的dsRNA的量比我們的實驗大約高20倍(Ui-Tei，2000)。CHO-K1細(xì)胞的干擾素反應(yīng)似乎也有缺陷。在另一篇報告中，利用螢光素酶/lacZ報道分子組合和829bp特異性lacZ或717bp非特異性GFP dsRNA檢測293、NIH/3T3和BHK-21細(xì)胞的RNAi(Caplen，2000)。在這種情況下無法檢測RNAi可能是由于螢光素酶/lacZ報道分子測定法的低敏感性和靶標(biāo)與對照dsRNA的長度差異。我們的結(jié)果綜合起來表明，RNAi在哺乳動物細(xì)胞中有活性，但是，如果干擾素系統(tǒng)被＞30bp的dsRNA激活，則沉默作用難以檢測。
總之，我們第一次在哺乳動物細(xì)胞中證明了siRNA介導(dǎo)的基因沉默。短siRNA的應(yīng)用在人類組織培養(yǎng)的基因功能滅活和基因特異治療劑的研制中具有廣闊前景。
實施例3RNA干涉對基因表達的特異性抑制3.1材料與方法3.1.1RNA制備和RNAi測定化學(xué)RNA合成、退火和基于螢光素酶的RNAi測定如實施例1或2或以前的公開文獻所述進行(Tuschl等人，1999；Zamore等人，2000)。所有siRNA雙鏈體都針對螢火蟲螢光素酶，螢光素酶mRNA序列來源于如(Tuschl等人，1999)所述的pGEM-luc(GenBank acc.X65316)。在加入mRNA之前，siRNA雙鏈體在黑尾果蠅RNAi/翻譯反應(yīng)液中溫育15分鐘。基于翻譯的RNAi測定至少一式三份進行。
為了對有義靶RNA切割作圖，產(chǎn)生177-nt轉(zhuǎn)錄物，其對應(yīng)于在相對于起始密碼子的位點113-273之間的螢火蟲螢光素酶序列，隨后為SP6啟動子序列的17-nt互補序列。為了對反義靶RNA切割作圖，由模板產(chǎn)生166-nt轉(zhuǎn)錄物，它是利用5’引物TAATACGACTCACTATAGAGCCCATATCGTTTCATA(下劃線標(biāo)出T7啟動子)和3’引物AGAGGATGGAACCGCTGG由質(zhì)粒序列PCR擴增的。靶序列對應(yīng)于在相對于起始密碼子的位點50-215之間的螢火蟲螢光素酶序列的互補序列。鳥苷?；D(zhuǎn)移酶標(biāo)記如前所述進行(Zamore等人，2000)。為了對靶RNA切割作圖，在標(biāo)準(zhǔn)條件下(Zamore等人，2000)，100nM siRNA雙鏈體與5-10nM靶RNA在黑尾果蠅胚胎裂解液中25℃溫育2小時。加入8倍體積的蛋白酶K緩沖液(200mMTris-Hcl pH7.5，25mM EDTA，300mM NaCl，2％w/v十二烷基硫酸鈉)終止反應(yīng)。加入蛋白酶K(E.M.Merck，溶于水)至終濃度為0.6mg/ml。反應(yīng)液然后在65℃下溫育15分鐘，用苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)抽提，用3倍體積的乙醇沉淀。樣品置于6％測序凝膠上。長度標(biāo)準(zhǔn)通過帽標(biāo)記的有義或反義靶RNA的部分RNase T1消化和部分堿水解產(chǎn)生。
3.2結(jié)果3.2.1 21nt siRNA雙鏈體中3’突出端的變異如上所述，位于siRNA雙鏈體3’末端的2個或3個未配對核苷酸在靶RNA降解上比相應(yīng)的平端雙鏈體更有效。為了更全面地分析末端核苷酸的功能，我們合成了5種21nt有義siRNA，每一個均用相對于靶RNA的一個核苷酸展示，而且合成了8種21nt反義siRNA，每一個均用相對于靶標(biāo)的一個核苷酸展示(圖11A)。通過組合有義和反義siRNA，產(chǎn)生8個系列的siRNA雙鏈體，它們具有合成的突出末端，覆蓋7nt 3’突出端到4nt 5’突出端的范圍。用雙螢光素酶測定系統(tǒng)測定siRNA雙鏈體的干涉(Tuschl等人，1999；Zamore等人，2000)。siRNA雙鏈體針對螢火蟲螢光素酶mRNA，海腎螢光素酶mRNA作為內(nèi)部控制。在siRNA雙鏈體存在下測定靶標(biāo)與對照螢光素酶活性的發(fā)光比，用不含dsRNA時的發(fā)光比標(biāo)準(zhǔn)化。為了比較，在圖11B中顯示長dsRNA(39-504bp)的干涉比。長dsRNA在5nM濃度下(圖11A)，siRNA雙鏈體在100nM濃度下(圖11C-J)測定干涉比。選擇100nM的siRNA濃度，因為5nM 504bp dsRNA的完全加工將產(chǎn)生120nM總siRNA雙鏈體。
21nt siRNA雙鏈體介導(dǎo)RNAi的能力依賴于突出核苷酸或形成的堿基對的數(shù)量。含有4-6個3’突出核苷酸的雙鏈體不能介導(dǎo)RNAi(圖11C-F)，含有2個或2個以上5’突出核苷酸的雙鏈體同樣不能(圖11G-J)。具有2nt 3’突出端的雙鏈體在介導(dǎo)RNA干涉上最有效，但是沉默率也是序列依賴性的，具有2nt 3’突出端的不同siRNA雙鏈體觀察到高達12倍的差異(比較圖11D-H)。具有平端、1nt 5’突出端或1-3nt 3’突出端的雙鏈體有時有功能。具有7nt 3’突出端的siRNA雙鏈體所觀察到的較小的沉默作用(圖11C)可能是由于長3’突出端的反義作用，而不是由于RNAi。長dsRNA(圖11B)與最有效的21nt siRNA雙鏈體(圖11E，G，H)之間RNAi效率的比較表明，100nM濃度的單siRNA雙鏈體能與5nM 504bp dsRNA一樣有效。
3.2.2與恒定21-nt反義siRNA配對的有義siRNA的長度變化為了研究siRNA長度對RNAi的影響，我們制備了3個系列的siRNA雙鏈體，使3種21nt反義鏈與8種18-25nt有義鏈結(jié)合。在每個siRNA雙鏈體系列中，反義siRNA的3’突出端固定為1、2或3nt，而有義siRNA的3’端不同(圖12A)。我們發(fā)現(xiàn)，與有義siRNA的長度無關(guān)，具有反義siRNA的2-nt 3’突出端的雙鏈體(圖12C)比具有1-nt或3-nt 3’突出端的雙鏈體更有活性(圖12B，D)。在具有反義siRNA的1-nt 3’突出端的第一個系列中，含有21-nt和22-nt有義siRNA的雙鏈體(它們分別攜帶有義siRNA的1-nt和2-nt 3’突出端)最具活性。含有19-25nt有義siRNA的雙鏈體也能介導(dǎo)RNA，但程度較低。類似地，在具有反義siRNA的2-nt突出端的第二個系列中，具有2-nt 3’突出端的21-nt siRNA雙鏈體最具活性，其他任何與18-25nt有義siRNA的結(jié)合都有顯著的活性。在具有3-nt反義siRNA 3’突出端的最后一個系列中，只有含20-nt有義siRNA和2-nt有義3’突出端的雙鏈體能減少靶RNA表達。這些結(jié)果綜合起來表明，siRNA的長度以及3’突出端的長度非常重要，具有2-nt 3’突出端的21-nt siRNA雙鏈體最適于RNAi。
3.2.3具有恒定2-nt 3’突出端的siRNA雙鏈體的長度變化然后我們檢查了通過保留對稱2-nt 3’突出端同時改變兩條siRNA鏈長度的影響(圖13A)。制備兩個系列的siRNA雙鏈體，包括圖11H的21-nt siRNA雙鏈體作為參照。通過在有義siRNA的3’端(圖13B)或在反義siRNA的3’端(圖13C)延長堿基配對的片段，雙鏈體的長度在20-25bp間不等。20-23bp雙鏈體引起靶螢光素酶活性的特異性抑制，但是21-nt siRNA雙鏈體比其它任何雙鏈體有效性至少高8倍。24-和25-nt siRNA雙鏈體不引起任何可檢測的干涉。由于雙鏈體兩端的變化產(chǎn)生類似的作用，序列特異的影響較小。
3.2.4 2’-脫氧和2’-O-甲基修飾的siRNA雙鏈體為了評估siRNA核糖殘基對于RNAi的重要性，檢測了含有21-ntsiRNA和2-nt 3’突出端以及2’-脫氧或2’-O-甲基修飾的鏈的雙鏈體(圖14)。2-nt 3’突出端置換為2’-脫氧核苷酸沒有影響，甚至置換配對區(qū)內(nèi)與突出端相鄰的另外兩個核糖核苷酸產(chǎn)生具有明顯活性的siRNA。因此，siRNA雙鏈體的42nt中的8nt置換為DNA殘基，活性沒有損失。然而，一條或兩條siRNA鏈完全置換為2’-脫氧殘基消除了RNAi，置換為2’-O-甲基殘基同樣如此。
3.2.5靶RNA切割位點的確定以前確定了22-nt siRNA雙鏈體和21-nt/22-nt雙鏈體的靶RNA切割位點。發(fā)現(xiàn)靶RNA切割位點位于siRNA雙鏈體覆蓋的區(qū)域的中心，在與21-或22-nt siRNA指導(dǎo)序列互補的第一個核苷酸的11或12nt下游。具有2-nt 3’突出端的5種不同21-nt siRNA雙鏈體(圖15A)與5’帽標(biāo)記的有義或反義靶RNA在黑尾果蠅裂解液中溫育(Tuschl等人，1999；Zamore等人，2000)。5’切割產(chǎn)物在測序凝膠上分析(圖15B)。切割的有義靶RNA的量與通過基于翻譯的實驗測定的siRNA雙鏈體的效率有關(guān)，siRNA雙鏈體1、2、4(圖15B和11H，G，E)切割靶RNA比雙鏈體3和5更快(圖15B和11F，D)。顯然，5’切割產(chǎn)物和輸入靶RNA的總放射性隨著時間的增長不是恒定的，而且5’切割產(chǎn)物不積累。推測起來，由于缺乏5’-帽子的任一條poly(A)尾，切割產(chǎn)物一從siRNA-內(nèi)切核酸酶復(fù)合物上釋放，即快速降解。
有義和反義靶RNA的切割位點都位于siRNA雙鏈體覆蓋的區(qū)域的中間。根據(jù)雙鏈體沿靶序列的1-nt置換來看，5種不同雙鏈體產(chǎn)生的每種靶標(biāo)的切割位點有1-nt不同。靶標(biāo)精確地在靶位點11nt下游切割，靶位點與序列互補的指導(dǎo)siRNA的3’-核苷酸互補(圖15A，B)。
為了確定是指導(dǎo)siRNA的5’端還是3’端控制靶RNA切割，我們設(shè)計了實驗策略，在圖16A和B中概述。一種21-nt反義siRNA，在該研究中保持不變，與5’或3’端修飾的有義siRNA配對。有義和反義靶RNA的切割位點如上所述確定。有義siRNA的3’端的改變(監(jiān)測1-nt5’突出端到6-nt 3’突出端)不影響有義或反義靶RNA的切割位點(圖16C)。有義siRNA的5’端的改變不影響有義靶RNA的切割(圖16D，上圖)，預(yù)計是因為反義siRNA未改變。然而，反義靶RNA切割受到影響，并且強烈依賴于有義siRNA的5’端(圖16D，下圖)。當(dāng)有義siRNA大小為20或21nt時，只切割反義靶標(biāo)，切割位點時相差1-nt，表明靶標(biāo)識別的siRNA的5’端控制靶RNA的切割。當(dāng)從與指導(dǎo)siRNA的5’核苷酸配對的靶核苷酸開始以下游方向計數(shù)時，該位點位于核苷酸10與11之間(參見圖15A)。
3.2.6序列效應(yīng)和3’突出端的2’-脫氧置換對于siRNA的功能，2-nt 3’突出端是優(yōu)選的。我們希望了解突出核苷酸的序列對于靶標(biāo)識別是否有作用，或者這是否只是內(nèi)切核酸酶復(fù)合物(RISC或siRNP)重建所需的一個特征。我們合成了有義和反義siRNA，其具有AA、CC、GG、UU和UG 3’突出端，包括2’-脫氧修飾TdG和TT。野生型siRNA在有義3’突出端中含有AA，在反義3’突出端中含有UG(AA/UG)。所有siRNA雙鏈體在干涉測定中都起作用，使靶表達至少降低5倍(圖17)。最有效的siRNA雙鏈體是序列型NN/UG、NN/UU、NN、TdG和NN/TT(N，任何核苷酸)，使靶表達降低10倍以上。含有AA、CC或GG的反義siRNA 3’突出端的siRNA雙鏈體比野生型序列UG或突變UU活性低2-4倍。這種RNAi效率的降低可能是由于倒數(shù)第二個3’核苷酸對序列特異性靶標(biāo)識別的作用，因為3’端核苷酸由G變?yōu)閁沒有影響。
有義siRNA 3’突出端序列的改變沒有顯示任何依賴序列的作用，這是預(yù)料到的，因為有義siRNA對于有義靶mRNA的識別不一定有作用。
3.2.7靶標(biāo)識別的序列特異性為了檢驗靶標(biāo)識別的序列特異性，我們向siRNA雙鏈體的配對片段內(nèi)引入序列改變，并測定沉默率。通過顛倒3-或4-nt長的短片段或點突變，引入序列改變(圖18)。為了避免干擾堿基配對的siRNA雙鏈體結(jié)構(gòu)，一條siRNA鏈的序列改變在互補siRNA鏈中補償。為了降低合成成本，所有2-nt 3’突出端序列都是TT(T，2’-脫氧胸苷)。TT/TT參照siRNA雙鏈體在RNAi方面與野生型siRNA雙鏈體AA/UG相當(dāng)(圖17)。用基于翻譯的發(fā)光測定法定量介導(dǎo)報道m(xù)RNA破壞的能力。顯示含有反向序列片段的siRNA雙鏈體靶向螢火蟲螢光素酶報道分子的能力顯著降低(圖18)。位于反義siRNA 3’端與中心之間的序列改變完全消除了靶RNA識別，但是靠近反義siRNA 5’端的突變顯示程度較低的沉默。與預(yù)測的靶RNA切割位點正對的A/U堿基對顛換，或者遠離預(yù)測位點的一個核苷酸的顛換，阻止靶RNA的切割，因此表明，siRNA雙鏈體中心的單突變區(qū)別錯配的靶標(biāo)。
3.3討論siRNA是不僅在昆蟲細(xì)胞中，而且在哺乳動物細(xì)胞中，用于滅活基因表達的有價值的試劑，具有廣闊的治療應(yīng)用前景。我們系統(tǒng)分析了在黑尾果蠅胚胎裂解液中促進高效靶RNA降解所需的siRNA雙鏈體的結(jié)構(gòu)決定簇，從而提出了最有效的siRNA雙鏈體的設(shè)計原則。完美的siRNA雙鏈體能夠沉默基因表達，假定使用含量相當(dāng)?shù)目俁NA，其效率相當(dāng)于500bp dsRNA。
3.4siRNA使用指南高效沉默的siRNA雙鏈體優(yōu)選地由21-nt反義siRNA組成，應(yīng)當(dāng)選擇它們形成具有2-nt 3’突出端的19bp雙螺旋。2-nt 3’突出核糖核苷酸的2’-脫氧置換不影響RNAi，但是有助于降低RNA合成的成本，并且可提高siRNA雙鏈體的RNAse抗性。然而，更廣泛的2’-脫氧或2’-O-甲基修飾降低了siRNA介導(dǎo)RNAi的能力，這可能是通過干擾SiRNAP裝配的蛋白質(zhì)結(jié)合。
靶標(biāo)識別是一個高度序列特異性的過程，由與靶標(biāo)互補的siRNA介導(dǎo)。指導(dǎo)siRNA的3’-核苷酸對于靶標(biāo)識別的特異性沒有作用，而3’突出端的倒數(shù)第二個核苷酸影響靶RNA切割，錯配使RNAi降低2-4倍。指導(dǎo)siRNA的5’端似乎也比3’端更能容許錯配的靶RNA識別。位于靶RNA切割位點對面的siRNA中心的核苷酸是重要的特異性決定簇，甚至單核苷酸改變也能使RNAi降至不可檢測的水平。這提示，在基因靶向?qū)嶒炛?，siRNA雙鏈體能區(qū)別突變的或多態(tài)性等位基因，這可能成為未來治療發(fā)展的重要特征。
當(dāng)有義和反義siRNA與內(nèi)切核酸酶復(fù)合物或其定型復(fù)合物的蛋白質(zhì)成分結(jié)合時，認(rèn)為兩者起不同的作用；該復(fù)合物中siRNA雙鏈體的相對方向決定了哪條鏈能用于靶標(biāo)識別。合成siRNA雙鏈體在雙螺旋結(jié)構(gòu)上二重對稱，但序列不對稱。siRNA雙鏈體在黑尾果蠅裂解液中與RNAi蛋白的結(jié)合將形成兩種不對稱復(fù)合物。在這種假定的復(fù)合物中，有義和反義siRNA的手性環(huán)境不同，因此功能不同。這種預(yù)測顯然不適用于回文siRNA序列，或者能結(jié)合為同型二聚體的RNAi蛋白。為了使可影響有義與反義靶向siRNP之比的序列效應(yīng)達到最小，我們建議使用含有相同3’突出序列的siRNA序列。我們推薦將有義siRNA突出端的序列調(diào)節(jié)為反義3’突出端的序列，因為有義siRNA在一般的敲除實驗中沒有靶標(biāo)。有義和反義切割的siRNP重建的不對稱性可能(部分地)導(dǎo)致RNAi效率的改變，用該研究使用的具有2-nt 3’突出端的多種21-nt siRNA雙鏈體觀察到這種改變(圖14)。此外，靶位點處的核苷酸序列和/或靶RNA結(jié)構(gòu)的可接近性可能導(dǎo)致這些siRNA雙鏈體的效率的改變。
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權(quán)利要求
1.分離的雙鏈RNA分子，其中每條RNA鏈的長度為19-25個核苷酸，該RNA分子能夠靶特異性核酸修飾。
2.權(quán)利要求1的RNA分子，其中至少一條鏈具有1-5個核苷酸的3’-突出端。
3.權(quán)利要求1或2的RNA分子，它能靶特異性RNA干涉和/或DNA甲基化。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的RNA分子，其中每條鏈的長度為19-23個，特別是20-22個核苷酸。
5.權(quán)利要求2-4中任一項的RNA分子，其中3’-突出端為1-3個核苷酸。
6.權(quán)利要求2-5中任一項的RNA分子，其中為避免降解穩(wěn)定3’-突出端。
7.權(quán)利要求1-6中任一項的RNA分子，它含有至少一個修飾的核苷酸類似物。
8.權(quán)利要求7的RNA分子，其中修飾的核苷酸類似物選自糖修飾或骨架修飾的核糖核苷酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8的RNA分子，其中該核苷酸類似物是糖修飾的核糖核苷酸，2’-OH基被置換為選自H、OR、R、鹵素、SH、SR1、NH2、NHR、NR2或CN的基團，其中R是C1-C6烷基、烯基或炔基，鹵素是F、Cl、Br或I。
10.權(quán)利要求7或8的RNA分子，其中該核苷酸類似物是含有硫代磷酸酯基的骨架修飾的核糖核苷酸。
11.權(quán)利要求1-10中任一項的RNA分子，其序列與預(yù)定的mRNA靶分子有至少50％的同一性。
12.權(quán)利要求11的RNA分子，其中同一性至少為70％。
13.一種制備權(quán)利要求1-12中任一項的雙鏈RNA分子的方法，包括下列步驟(a)合成兩條RNA鏈，每條長度為19-25個核苷酸，其中該RNA鏈能夠形成雙鏈RNA分子，(b)在一定條件下結(jié)合合成的RNA鏈，其中形成一種雙鏈RNA分子，它能靶特異性核酸修飾。
14.權(quán)利要求13的方法，其中化學(xué)合成RNA鏈。
15.權(quán)利要求13的方法，其中酶促合成RNA鏈。
16.一種介導(dǎo)細(xì)胞或生物中靶特異性核酸修飾的方法，包括下列步驟(a)在可發(fā)生靶特異性核酸修飾的條件下使細(xì)胞或生物接觸權(quán)利要求1-12中任一項的雙鏈RNA分子，和(b)將雙鏈RNA完成的靶特異性核酸修飾導(dǎo)向含有基本對應(yīng)于該雙鏈RNA的序列部分的靶核酸。
17.權(quán)利要求16的方法，其中核酸修飾是RNA干涉和/或DNA甲基化。
18.權(quán)利要求16和17的方法，其中所述接觸包括向可發(fā)生靶特異性核酸修飾的靶細(xì)胞中導(dǎo)入所述雙鏈RNA分子。
19.權(quán)利要求18的方法，其中這種導(dǎo)入包括載體介導(dǎo)的輸送或注射。
20.權(quán)利要求16-19中任一項的方法的用途，用于確定細(xì)胞或生物中一種基因的功能。
21.權(quán)利要求16-19中任一項的方法的用途，用于調(diào)節(jié)細(xì)胞或生物中一種基因的功能。
22.權(quán)利要求20或21的用途，其中該基因與一種病理狀態(tài)有關(guān)。
23.權(quán)利要求22的用途，其中該基因是一種病原體相關(guān)基因。
24.權(quán)利要求23的用途，其中該基因是一種病毒基因。
25.權(quán)利要求22的用途，其中該基因是一種腫瘤相關(guān)基因。
26.權(quán)利要求22的用途，其中該基因是一種自身免疫病相關(guān)基因。
27.含有至少一種權(quán)利要求1-12中任一項的雙鏈RNA分子作為活性劑和一種藥用載體的藥用組合物。
28.用于診斷的權(quán)利要求27的組合物。
29.用于治療的權(quán)利要求27的組合物。
30.一種顯示靶基因特異性敲除表型的真核細(xì)胞或真核非人類生物，其中用至少一種能夠抑制內(nèi)源靶基因表達的雙鏈RNA分子或用編碼能夠抑制至少一種內(nèi)源靶基因表達的至少一種雙鏈RNA分子的DNA轉(zhuǎn)染該細(xì)胞或生物。
31.權(quán)利要求30的細(xì)胞或生物，它是一種哺乳動物細(xì)胞。
32.權(quán)利要求31的細(xì)胞或生物，它是一種人類細(xì)胞。
33.權(quán)利要求30-32中任一項的細(xì)胞或生物，其用至少一種編碼靶蛋白或靶蛋白變體或突變形式的外源靶核酸進一步轉(zhuǎn)染，其中該外源靶核酸在核酸水平上不同于內(nèi)源靶基因，因此與內(nèi)源靶基因的表達相比，外源靶核酸的表達受雙鏈RNA分子的抑制大大減少。
34.權(quán)利要求33的細(xì)胞或生物，其中外源靶核酸與編碼可檢測肽或多肽的另一種核酸序列融合。
35.權(quán)利要求30-34中任一項的細(xì)胞或生物在分析方法中的用途。
36.權(quán)利要求35在基因表達譜分析中的用途。
37.權(quán)利要求35在蛋白質(zhì)組分析中的用途。
38.權(quán)利要求35-37中任一項的用途，其中對外源靶核酸編碼的靶蛋白的變體或突變形式進行分析。
39.權(quán)利要求38在鑒定靶蛋白功能域中的用途。
40.權(quán)利要求35-39中任一項的用途，其中對至少兩種細(xì)胞或生物進行比較，它們選自(i)一種對照細(xì)胞或?qū)φ丈?，沒有靶基因抑制，(ii)一種細(xì)胞或生物，具有靶基因抑制，和(iii)一種細(xì)胞或生物，具有靶基因抑制加外源靶核酸對靶基因的互補。
41.權(quán)利要求35-40中任一項的用途，其中的分析包括功能和/或表型分析。
42.權(quán)利要求30-34中任一項的細(xì)胞在制備方法中的用途。
43.權(quán)利要求41的用途，用于從真核細(xì)胞中分離蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物。
44.權(quán)利要求43的用途，用于分離任選地含有核酸的高分子量蛋白質(zhì)復(fù)合物。
45.權(quán)利要求35-44中任一項在鑒定和/或表征藥理試劑中的用途。
46.一種系統(tǒng)，用于鑒定和/或表征作用于至少一種靶蛋白的藥理試劑，其包括(a)一種真核細(xì)胞或真核非人類生物，它能表達至少一種編碼所述至少一種靶蛋白的內(nèi)源靶基因，(b)至少一種雙鏈RNA分子，它能抑制所述至少一種內(nèi)源靶基因的表達，和(c)一種待測物質(zhì)或一組待測物質(zhì)，其中將要鑒定和/或表征這種待測物質(zhì)或組合的藥理學(xué)性質(zhì)。
47.權(quán)利要求46的系統(tǒng)，其進一步包括(d)編碼靶蛋白或靶蛋白變體或突變形式的至少一種外源靶核酸，其中外源靶核酸在核酸水平上不同于內(nèi)源靶基因，因此與內(nèi)源靶基因的表達相比，外源靶核酸的表達受雙鏈RNA分子的抑制大大減少。
全文摘要
雙鏈RNA(dsRNA)在多種生物中通過一種被稱作RNA干涉(RNAi)的過程誘導(dǎo)序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。利用果蠅體外系統(tǒng)，我們證明了19－23 nt短RNA片段是RNAi的序列特異性介體。短干涉RNA(siRNA)通過長dsRNA的RNase III樣加工反應(yīng)產(chǎn)生。化學(xué)合成的具有突出3’端的siRNA雙鏈體在裂解液中介導(dǎo)高效的靶RNA切割，切割位點位于指導(dǎo)siRNA所覆蓋的區(qū)域的中心附近。此外，我們還證明了dsRNA的加工方向決定是有義還是反義靶RNA能被產(chǎn)生的siRNP復(fù)合物切割。
文檔編號C12N15/113GK1568373SQ01820900
公開日2005年1月19日 申請日期2001年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月1日
發(fā)明者T·圖舍爾, S·埃爾巴沙, W·蘭德科爾, M·威爾姆, R·呂爾曼 申請人:馬普科技促進協(xié)會, 歐洲生物分子學(xué)實驗室