專利名稱：新型變態(tài)反應(yīng)原突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及天然變態(tài)反應(yīng)原的突變體，新型重組變態(tài)反應(yīng)原。本發(fā)明也涉及包含該新型重組變態(tài)反應(yīng)原突變體的混合物的組合物。更進(jìn)一步，本發(fā)明涉及制備這種重組變態(tài)反應(yīng)原突變體的方法以及包含該重組變態(tài)反應(yīng)原突變體的藥物組合物，包括疫苗。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在被試者中產(chǎn)生免疫反應(yīng)的方法、涉及對(duì)被試者接種疫苗或治療以及制備本發(fā)明的組合物的方法。
背景技術(shù)：
遺傳誘發(fā)的個(gè)體對(duì)源于各種環(huán)境來源的抗原以及對(duì)該個(gè)體所暴露的變態(tài)反應(yīng)原變得過敏(變態(tài)反應(yīng))。當(dāng)先前過敏的個(gè)體再次遭受同樣或同源的變態(tài)反應(yīng)原時(shí)發(fā)生變態(tài)反應(yīng)。響應(yīng)于如蜜蜂或大黃蜂刺痛或昆蟲叮咬，變態(tài)反應(yīng)的范圍為從枯草熱、rhinoconductivitis、鼻炎和氣喘到全身過敏反應(yīng)及死亡。該反應(yīng)是立即發(fā)生的，且可由各種特異反應(yīng)性的變態(tài)反應(yīng)原導(dǎo)致，如源于草、樹、野草、昆蟲、食物、藥品、化學(xué)品和香料等。
然而，當(dāng)個(gè)體初次遭受變態(tài)反應(yīng)原時(shí)不發(fā)生該反應(yīng)。初始的適應(yīng)性反應(yīng)耗費(fèi)時(shí)間且一般不導(dǎo)致任何癥狀。但當(dāng)已經(jīng)生產(chǎn)了能夠與變態(tài)反應(yīng)原反應(yīng)的抗體和T細(xì)胞時(shí)，任何隨后的暴露都可引起癥狀。因而，變態(tài)反應(yīng)證明免疫反應(yīng)本身能夠?qū)е嘛@著的病理學(xué)狀態(tài)，其可威脅生命。
涉及在特異反應(yīng)性變態(tài)反應(yīng)中的抗體主要屬于IgE類的免疫球蛋白。IgE與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合。在特異性變態(tài)反應(yīng)原與結(jié)合肥大細(xì)胞的IgE形成復(fù)合物之后，在細(xì)胞表面交聯(lián)的受體導(dǎo)致通過受體的信號(hào)傳導(dǎo)和目的細(xì)胞的生理學(xué)反應(yīng)。脫粒導(dǎo)致釋放缺席的組胺、肝素、嗜曙紅白細(xì)胞的一種趨化因子、白三烯C4、D4和E4，它們導(dǎo)致了支氣管平滑肌細(xì)胞收縮延長。所導(dǎo)致的作用可能為全身性或局部性。
抗體介導(dǎo)的過敏性反應(yīng)可分為4類，即類型I、類型II、類型III和類型IV。類型I變態(tài)反應(yīng)是在抗原暴露之后數(shù)秒或數(shù)分鐘之內(nèi)發(fā)生的典型的即時(shí)過敏反應(yīng)。這些癥狀由變態(tài)反應(yīng)原特異的IgE所介導(dǎo)。
通常觀察到的變態(tài)反應(yīng)是作為對(duì)蛋白質(zhì)變態(tài)反應(yīng)原的反應(yīng)，這些蛋白質(zhì)變態(tài)反應(yīng)原存在于如花粉、房屋塵螨、動(dòng)物毛發(fā)和頭皮屑、毒液和食物產(chǎn)品中。
為了減少或消除變態(tài)反應(yīng)，通常使用謹(jǐn)慎控制并重復(fù)給藥的變態(tài)反應(yīng)疫苗。變態(tài)反應(yīng)疫苗接種傳統(tǒng)上是以漸增的劑量在一個(gè)相當(dāng)長的時(shí)期內(nèi)通過腸胃外、鼻內(nèi)或舌下給藥方式進(jìn)行，且導(dǎo)致患者脫敏。精確的免疫學(xué)機(jī)制尚未知道，但認(rèn)為在變態(tài)反應(yīng)原特異的T細(xì)胞表型中誘導(dǎo)的差異特別重要。
變態(tài)反應(yīng)疫苗接種疫苗接種的概念基于免疫系統(tǒng)的兩個(gè)基本特征，即特異性和記憶。疫苗接種將使受者的免疫系統(tǒng)預(yù)先準(zhǔn)備好，且在重復(fù)暴露在相似的蛋白質(zhì)中時(shí)該免疫系統(tǒng)將能夠?qū)θ缥⑸锔腥井a(chǎn)生更加劇烈的反應(yīng)。疫苗是疫苗接種中用于在受者中產(chǎn)生這種保護(hù)性免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)的混合物。該保護(hù)將僅包含存在于疫苗和同源抗原中的成分。
與其他類型的疫苗接種相比較，變態(tài)反應(yīng)疫苗接種由于在變態(tài)反應(yīng)患者中存在正在進(jìn)行的免疫反應(yīng)而是復(fù)雜。該免疫反應(yīng)特征在于當(dāng)暴露于變態(tài)反應(yīng)原時(shí)存在介導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)癥狀釋放的變態(tài)反應(yīng)原特異的IgE。因而，利用來自于天然來源的變態(tài)反應(yīng)原的變態(tài)反應(yīng)疫苗接種具有固有的副作用的危險(xiǎn)，其最大的結(jié)果甚至威脅患者生命。
避免這個(gè)問題的方法可分為三類。實(shí)際上經(jīng)常組合使用超過一類的方法。第一類方法包括在延長的時(shí)間內(nèi)給藥幾種小劑量以達(dá)到相當(dāng)?shù)睦鄯e劑量。第二類方法包括通過將變態(tài)反應(yīng)原摻入到凝膠物質(zhì)如氫氧化鋁中而對(duì)變態(tài)反應(yīng)原進(jìn)行物理修飾。氫氧化鋁制備物具有減小活性變態(tài)反應(yīng)原成分的組織濃度的緩慢變態(tài)反應(yīng)原釋放的佐劑作用及貯存作用。第三類方法包括目的在于減少變態(tài)反應(yīng)性即IgE結(jié)合的變態(tài)反應(yīng)原的化學(xué)修飾。
成功的變態(tài)反應(yīng)疫苗接種的詳細(xì)機(jī)制仍有爭議。然而，一致認(rèn)為T細(xì)胞在免疫反應(yīng)的全面調(diào)節(jié)中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。根據(jù)目前的一致意見，T細(xì)胞表型的兩個(gè)極端即Th1和Th2決定了個(gè)體的變態(tài)反應(yīng)狀態(tài)。當(dāng)用變態(tài)反應(yīng)原刺激時(shí)，Th1細(xì)胞分泌以干擾素-γ為主的導(dǎo)致保護(hù)性免疫的白細(xì)胞介素，則個(gè)體是健康的。另一方面，Th2細(xì)胞主要分泌導(dǎo)致IgE合成和嗜曙紅性的白細(xì)胞介素4和5，則個(gè)體發(fā)生變態(tài)反應(yīng)。體外研究顯示通過用衍生自含有相關(guān)的T細(xì)胞抗原決定部位的肽的變態(tài)反應(yīng)原免疫激發(fā)可能改變變態(tài)反應(yīng)原特異的T細(xì)胞的反應(yīng)。因此目前對(duì)新變態(tài)反應(yīng)疫苗的研究主要是基于影響T細(xì)胞，其目的在于使T細(xì)胞沉默(誘導(dǎo)無反應(yīng)性)或?qū)h2表型的反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)門h1表型的。
結(jié)合抗體的抗原決定部位(B-細(xì)胞抗原決定部位)對(duì)Fab-抗原復(fù)合物的X-射線晶體學(xué)分析已經(jīng)增加了對(duì)抗體-結(jié)合的抗原決定部位的理解。根據(jù)該類分析抗體-結(jié)合的抗原決定部位可定義為包含來自15～25個(gè)氨基酸殘基的原子的抗原表面部分，它們處在與能直接相互作用的抗體原子的一定距離之內(nèi)。抗原-抗體相互作用的親和力不能單從由范德瓦耳斯相互作用、氫鍵或離子鍵貢獻(xiàn)的焓來預(yù)測。與水分子幾乎完全從界面排除相關(guān)的熵代表了大小相似的能量貢獻(xiàn)。這意味著相互作用分子外形之間的正確配合是抗原-抗體高親和力相互作用的主要因素。
在WO 97/30150(參考文獻(xiàn)1)中，要求保護(hù)一組蛋白質(zhì)分子，該蛋白質(zhì)分子與親代蛋白質(zhì)相比在氨基酸序列中具有特異性突變的分布。從說明書中可知，看來該發(fā)明涉及生產(chǎn)與親代蛋白質(zhì)相比被修飾的類似物，但它們以與親代蛋白質(zhì)(天然存在的變態(tài)反應(yīng)原)相似的方式被吸收、消化及呈遞給T細(xì)胞。因此，獲得了修飾的T細(xì)胞反應(yīng)。修飾的蛋白質(zhì)文庫用稱為PM(簡約原則誘變)的技術(shù)來制備。
在WO 92/02621(參考文獻(xiàn)2)中，描述了重組DNA分子，該分子包含編碼具有至少一個(gè)Fagalrs目樹木變態(tài)反應(yīng)原的抗原決定部位多肽的DNA，該變態(tài)反應(yīng)原選自Aln g 1、Cor a 1和Bet v 1。在此處描述的重組分子都具有與天然發(fā)生的變態(tài)反應(yīng)原的序列相應(yīng)的氨基酸序列或部分氨基酸序列。
WO 90/11293(參考文獻(xiàn)3)在理論上涉及分離的豚草(ragweed)花粉的變態(tài)反應(yīng)肽和修飾的豚草花粉肽。在此處公開的肽具有與天然存在的變態(tài)反應(yīng)原或其天然存在的同種型相應(yīng)的氨基酸序列。
變態(tài)反應(yīng)原的化學(xué)修飾已經(jīng)采取了幾種對(duì)變態(tài)反應(yīng)原化學(xué)修飾的方法。七十年代早期的方法包括將變態(tài)反應(yīng)原與聚合物化學(xué)偶聯(lián)和用甲醛等化學(xué)交聯(lián)變態(tài)反應(yīng)原，從而形成所謂的“類變態(tài)反應(yīng)原(allergoid)”。這些方法背后的基本原理是通過附加化學(xué)配體而造成的IgE結(jié)合的抗原決定部位的隨機(jī)破壞，因而在通過增加的復(fù)合物分子量維持免疫原性同時(shí)減少了IgE-結(jié)合?！邦愖儜B(tài)反應(yīng)原”生產(chǎn)的固有缺點(diǎn)與在控制化學(xué)交聯(lián)方法中的困難及在對(duì)結(jié)果所得的高分子量復(fù)合物的分析和標(biāo)準(zhǔn)化中的困難有關(guān)?！邦愖儜B(tài)反應(yīng)原”目前做臨床應(yīng)用，且由于IgE結(jié)合的抗原決定部位的隨機(jī)破壞，與常規(guī)疫苗相比可以應(yīng)用高劑量，但其安全和效力參數(shù)并沒有比常規(guī)疫苗的應(yīng)用有改進(jìn)。
對(duì)變態(tài)反應(yīng)原的化學(xué)修飾的更新方法目標(biāo)在于對(duì)變態(tài)反應(yīng)原三級(jí)結(jié)構(gòu)的整體破壞從而消除IgE的結(jié)合，這里假定基本的治療目標(biāo)是變態(tài)反應(yīng)原特異的T細(xì)胞。這樣的疫苗包含由變態(tài)反應(yīng)原序列，其衍生自代表最小的T細(xì)胞抗原決定部位的合成肽、代表連接的T細(xì)胞抗原決定部位的較長的肽、較長的變態(tài)反應(yīng)原序列，其衍生自代表免疫決定T細(xì)胞抗原表位區(qū)域的合成肽或被重組技術(shù)切割成兩個(gè)半分子的變態(tài)反應(yīng)原分子。另一個(gè)基于該基本原理的方法建議使用“低IgE結(jié)合”重組同種型。最近幾年中已經(jīng)明確天然的變態(tài)反應(yīng)原是異質(zhì)性的，其含有氨基酸約達(dá)25％被替換的異變態(tài)反應(yīng)原(isoallergen)和變體。已發(fā)現(xiàn)一些重組異變態(tài)反應(yīng)原可能由于不可逆的變性及因此導(dǎo)致的三級(jí)結(jié)構(gòu)的整體破壞而具有較低的IgE結(jié)合效力。
體外誘變和變態(tài)反應(yīng)疫苗接種已經(jīng)用幾種變態(tài)反應(yīng)原進(jìn)行了通過體外定點(diǎn)突變來減少變態(tài)反應(yīng)性的嘗試，包括Der f 2(Takai等人，參考文獻(xiàn)4)，Der p 2(Smith等人，參考文獻(xiàn)5)，一個(gè)39 kDa的粉塵螨(Dermatophagoides farinae)變態(tài)反應(yīng)原(Aki等人，參考文獻(xiàn)6)，蜜蜂毒液磷脂酶A2(Frster等人，參考文獻(xiàn)7)，Ara h 1(Burks等人，參考文獻(xiàn)8)，Ara h 2(Stanley等人，參考文獻(xiàn)9)，Bet v 1(Ferreira等人，參考文獻(xiàn)10和11)，樺木抑制蛋白(Wiedemann等人，參考文獻(xiàn)12)和Ory s 1(Alvarez等人，參考文獻(xiàn)13)。
這些方法背后的基本原理再次針對(duì)變態(tài)反應(yīng)原特異的T細(xì)胞而同時(shí)減少IgE介導(dǎo)的副作用危險(xiǎn)，這是通過破壞重組變態(tài)反應(yīng)原突變體的三級(jí)結(jié)構(gòu)減少或消除IgE結(jié)合。這些方法背后的基本原理不包括主要IgE結(jié)合抗原決定部位的概念且不包括起始也涉及B-細(xì)胞和抗體產(chǎn)生的新的保護(hù)性免疫反應(yīng)的概念。
Ferreira等人(參考文獻(xiàn)11)的文章描述了目的在于減少IgE結(jié)合的定點(diǎn)突變的應(yīng)用。盡管在文中提到了Bet v 1的三維結(jié)構(gòu)，但作者未用該結(jié)構(gòu)對(duì)暴露在溶劑中的氨基酸殘基做突變預(yù)測，其中一半的殘基具有低程度的溶劑暴露。相反，他們應(yīng)用了一種發(fā)展來用于在與對(duì)此處描述的基于確定保守表面區(qū)域的結(jié)構(gòu)概念不同的蛋白質(zhì)功能殘基的預(yù)測方法。盡管作者確實(shí)討論了α-碳主鏈的三級(jí)結(jié)構(gòu)的保守性，但是該概念不是治療策略的部分，而僅僅是包含在體外IgE結(jié)合的估計(jì)中。另外，出示的證據(jù)不足，因?yàn)镃D-譜的歸一化阻礙估計(jì)樣品的部分變性，這是一個(gè)普遍的問題。所述治療策略目標(biāo)在于對(duì)變態(tài)反應(yīng)原特異性T細(xì)胞誘導(dǎo)耐受性且沒有提到起始新免疫反應(yīng)。
Wiedemann等人(參考文獻(xiàn)12)的文章描述了定點(diǎn)突變的應(yīng)用和用于單克隆抗體抗原決定部位表征的肽合成。作者擁有抗原三級(jí)結(jié)構(gòu)的知識(shí)，而且他們用這些知識(shí)選擇了一個(gè)表面暴露的氨基酸進(jìn)行突變?？梢哉f所用的算法是與本發(fā)明者所描述的算法相反的，因其選擇了與同源序列有差異的氨基酸。該研究證明表面暴露的氨基酸的替換具有修飾單克隆抗體的結(jié)合特征的能力，考慮到一般的知識(shí)這并不令人驚訝。所述實(shí)驗(yàn)不是設(shè)計(jì)來估計(jì)對(duì)多克隆抗體如變態(tài)反應(yīng)患者的血清IgE結(jié)合的調(diào)制。包含的一個(gè)實(shí)驗(yàn)的確應(yīng)用了IgE，且盡管該實(shí)驗(yàn)不適于數(shù)量評(píng)估，但I(xiàn)gE的結(jié)合看來沒有受發(fā)生的突變的影響。
Smith等人(參考文獻(xiàn)5)的文章描述了用于單克隆抗體抗原決定部位的作圖和減少IgE結(jié)合的定點(diǎn)突變的應(yīng)用。作者沒有三級(jí)結(jié)構(gòu)的知識(shí)，且他沒有嘗試估價(jià)α-碳主鏈的三級(jí)結(jié)構(gòu)的保守性。所用的算法不能確保選擇用來進(jìn)行突變的氨基酸是事實(shí)上暴露于分子表面。只有一個(gè)所述突變體導(dǎo)致IgE結(jié)合真正減少。該突變體在對(duì)所有檢驗(yàn)的抗體的結(jié)合中都有缺陷，這顯示其三級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞。作者沒有定義治療策略，且沒有提到起始新免疫反應(yīng)。
Colombo等人(參考文獻(xiàn)14)的文章描述了通過應(yīng)用定點(diǎn)突變和肽合成對(duì)IgE結(jié)合抗原決定部位的研究。作者應(yīng)用基于同源蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)的三維電腦模型結(jié)構(gòu)來闡明存在于分子表面的抗原決定部位?？乖瓫Q定部位在顯示一級(jí)結(jié)構(gòu)同源的不同變態(tài)反應(yīng)原上進(jìn)一步的存在是用代表抗原決定部位的合成肽來陳述的。治療策略是基于應(yīng)用該代表單價(jià)IgE結(jié)合抗原決定部位的合成肽進(jìn)行治療。沒有提到同源變態(tài)反應(yīng)原之間保守的表面區(qū)域以及起始一種新的保護(hù)性免疫反應(yīng)的治療概念。
Spangfort等人(參考文獻(xiàn)15)的文章描述了主要樺木變態(tài)反應(yīng)原三維結(jié)構(gòu)和保守表面暴露的區(qū)塊。文章沒有提到主要IgE結(jié)合抗原決定部位，也沒有提到定點(diǎn)突變，也沒有陳述治療應(yīng)用。
上述的研究中沒有一個(gè)關(guān)于由替換表面暴露的氨基酸同時(shí)保持α-碳主鏈的三級(jí)結(jié)構(gòu)而減少IgE結(jié)合。上述方法背后的基本原理沒包括主要IgE結(jié)合抗原決定部位的概念，且它不包括起始一種新保護(hù)性免疫反應(yīng)的治療概念。
WO 99/47680公開了在維持變態(tài)反應(yīng)原的α-碳主鏈三級(jí)結(jié)構(gòu)同時(shí)，向確定的關(guān)鍵性位置引入人工氨基酸替換。具體地，WO99/47680公開了一種重組變態(tài)反應(yīng)原，它是衍生自天然存在的變態(tài)反應(yīng)原的非天然存在的突變體，其中至少一種表面暴露的B細(xì)胞抗原決定部位的保守氨基酸殘基是由另一種殘基替換的，在該天然存在的變態(tài)反應(yīng)原所源自的分類目中該殘基不存在于任何已知同源蛋白質(zhì)氨基酸序列中的相同位置上，該變態(tài)反應(yīng)原突變體具有基本與該天然存在的變態(tài)反應(yīng)原相同的α-碳主鏈三級(jí)結(jié)構(gòu)，且對(duì)突變的變態(tài)反應(yīng)原的特異的IgE結(jié)合與對(duì)該天然存在的變態(tài)反應(yīng)原的結(jié)合相比是減少的。
在WO 99/47680中公開的重組變態(tài)反應(yīng)原通過以下途徑可得到a)在天然存在的變態(tài)反應(yīng)原中確定氨基酸殘基，該變態(tài)反應(yīng)原是保守的，其在該天然存在的變態(tài)反應(yīng)原所源自的分類目中的所有已知的同源蛋白質(zhì)中以超過70％的一致性保守，b)確定至少一片區(qū)域的保守氨基酸殘基，它們?cè)谧儜B(tài)反應(yīng)原分子的三維表面上至少4002的面積上互相連接，該小片區(qū)域由具有至少20％的溶劑可接近性所定義，其中至少一個(gè)區(qū)域包含至少一個(gè)B細(xì)胞抗原決定部位，和c)在至少一個(gè)區(qū)域用另一個(gè)氨基酸殘基替換至少一個(gè)氨基酸殘基，該新殘基在該特別位置不保守，但基本保持了該變態(tài)反應(yīng)原分子的α-碳主鏈三級(jí)結(jié)構(gòu)。
附圖簡述

圖1表示用于Bet v 1突變體1號(hào)的突變體特異性寡核苷酸引物。突變的核苷酸以下劃線表示。
圖2表示兩個(gè)合成并用于所有突變體的一般可適用的引物(以“全有義的”和“全無義的”標(biāo)明)。
圖3表示天然存在的變態(tài)反應(yīng)原Bet v 1和許多Bet v 1突變體的DNA和氨基酸序列。
圖4表示通過非生物素化的Bet v 1和Bet v 1 Glu45Ser突變體抑制生物素化的重組Bet v 1與來自變態(tài)反應(yīng)患者群體的血清IgE結(jié)合。
圖5表示通過非生物素化的Bet v 1和Bet v 1突變體Asn28Thr+Lys32Gln抑制生物素化的重組Bet v 1與來自變態(tài)反應(yīng)患者群體的血清IgE結(jié)合。
圖6表示通過非生物素化的Bet v 1和Bet v 1 Pr0108Gly突變體抑制生物素化的重組Bet v 1與來自變態(tài)反應(yīng)患者群體的血清IgE結(jié)合。
圖7表示通過非生物素化的Bet v 1和Bet v 1突變體Glu60Ser抑制生物素化的重組Bet v 1與來自變態(tài)反應(yīng)患者群體的血清IgE結(jié)合。
圖8表示重組和三重區(qū)塊突變體的CD譜，以接近相等的濃度記錄。
圖9表示通過非生物素化的Bet v 1和Bet v 1三重區(qū)塊突變體抑制生物素化的重組Bet v 1與來自變態(tài)反應(yīng)患者群體的血清IgE結(jié)合。
圖10表示單獨(dú)比對(duì)的抗原5殘基和黃胡蜂屬(Vespula)抗原5序列(左面部分)的溶劑可接近性。在圖10的右圖版顯示了在黃胡蜂抗原5s中具有保守區(qū)域的抗原5的分子表面。
圖11表示相應(yīng)于由有義鏈衍生的Ves v 5氨基端的引物序列。下游引物的序列從無義鏈衍生。
圖12表示兩個(gè)合成并用于所有突變體的一般可適用的引物(以“全有義的”和“全無義的”表示)。
圖13表示天然存在的變態(tài)反應(yīng)原Ves v 5以及2個(gè)Ves v 5突變體的DNA和氨基酸序列。
圖14表示通過非生物素化的Ves v 5和Ves v 5突變體Lys72Ala抑制生物素化的重組Ves v 5與來自變態(tài)反應(yīng)患者群體的血清IgE結(jié)合。
圖15表示變態(tài)反應(yīng)原和肥大細(xì)胞之間通過IgE交聯(lián)的反應(yīng)的理論模型。
圖16表示天然存在的變態(tài)反應(yīng)原Der p 2的DNA和氨基酸序列。
圖17示意性地表示用于產(chǎn)生突變的引物。(I)表示有義和反義引物。(II)表示在顯示的位置含有突變的最終重組蛋白質(zhì)。
圖18表示對(duì)構(gòu)建Bet v 1突變體的說明和所用引物的列表。該突變體含有5到9個(gè)氨基酸。
圖19表示在Bet v 1(2628)和Bet v 1(2637)表面引入的點(diǎn)突變。在突變體Bet v 1(2628)中，在Bet v 1的一半中引入了5個(gè)初級(jí)突變而另一半沒有改變。在突變體Bet v 1(2637)中，在另一半中引入了5個(gè)初級(jí)突變和3個(gè)二級(jí)突變，而第一半沒有改變。
圖20表示以幾乎相等的濃度記錄的重組Bet v 1.2801(野生型)和Bet v 1(2637)突變體的圓二色(CD)譜。
圖21表示通過非生物素化的Bet v 1.2801和通過Bet v 1(2628)、Bet v 1(2637)及Bet v 1(2628)與Bet v 1(2637)的1∶1混合物抑制生物素化的重組Bet v 1.2801(野生型)與來自變態(tài)反應(yīng)患者群體的血清IgE結(jié)合。
圖22表示人Bet v 1.2801(野生型)、Bet v 1(2628)和Bet v1(2637)嗜堿性粒細(xì)胞中的組胺釋放。
圖23表示人Bet v 1.2801(野生型)、Bet v 1(2628)和Bet v1(2637)嗜堿性粒細(xì)胞中的組胺釋放。
圖24表示Bet v 1(2744)表面的點(diǎn)突變。
圖25表示Bet v 1(2753)表面的點(diǎn)突變。
圖26表示Bet v 1(2744)和Bet v 1(2753)表面的點(diǎn)突變。
圖27表示以幾乎相等的濃度記錄的Bet v 1.2801(野生型)和Bet v 1(2744)的圓二色(CD)譜。
圖28表示人Bet v 1.2801(野生型)和突變體Bet v 1(2744)嗜堿性粒細(xì)胞中的組胺釋放。
圖29表示人Bet v 1.2801(野生型)和突變體Bet v 1(2744)嗜堿性粒細(xì)胞中的組胺釋放。
圖30表示Bet v 1(2733)表面的點(diǎn)突變。
圖31表示用于對(duì)Der p 2進(jìn)行定點(diǎn)突變的引物。
圖32表示Der p 2與其他類群2屋塵螨變態(tài)反應(yīng)原的序列比對(duì)。
圖33從4個(gè)不同角度表示Der p 2的表面外形。
圖34從4個(gè)不同角度表示Der p 2突變體的表面外形。
圖35A和B表示Der p 1與其他類群1屋塵螨變態(tài)反應(yīng)原的序列比對(duì)。
圖36從4個(gè)不同角度表示Der p 1的表面外形。
圖37從4個(gè)不同角度表示Der p 1突變體的表面外形。
圖38A-D表示Phl p 5與其他類群5草變態(tài)反應(yīng)原的序列比對(duì)。
圖39A和B分別從4個(gè)不同角度表示Phl p 5模型A和模型B的表面外形。
圖40A和B分別從4個(gè)不同角度表示Phl p 5突變體模型A和B的表面外形。
圖41表示表達(dá)為各種Bet v 1制備物的刺激指數(shù)(StimulationIndex，SI)的外周血淋巴細(xì)胞的增殖。
圖42-44表示用各種Bet v制備物刺激的T細(xì)胞的細(xì)胞因子的概況。圖42表示具有Th0狀況的患者，圖43表示Th1狀況，圖44表示Th2狀況。
發(fā)明目的本發(fā)明背后的基本原理本發(fā)明基于獨(dú)特的基本原理。根據(jù)此基本原理，成功的變態(tài)反應(yīng)原免疫接種機(jī)制不是改造進(jìn)行中的Th2-類型免疫反應(yīng)，而是平行地起始一種新的涉及B-細(xì)胞識(shí)別三級(jí)抗原決定部位和抗體形成的免疫反應(yīng)?，F(xiàn)已相信該新的免疫反應(yīng)部分屬于Th1-類型免疫反應(yīng)。該模型由于觀察到特異IgE水平不受成功的免疫接種治療的影響而得到支持，且成功的治療經(jīng)常是伴隨變態(tài)反應(yīng)原特異的IgG4的真正增加。另外，在變態(tài)反應(yīng)原攻擊前后的鼻活組織檢查中沒有顯示具Th2-樣表型的T細(xì)胞的減少，而是觀察到Th1-樣T細(xì)胞的增加。當(dāng)將疫苗(或藥物組合物)通過除呼吸道之外的其他途徑給藥時(shí)，假定該新的免疫反應(yīng)在與正在進(jìn)行的Th2反應(yīng)物理相分隔的位置上發(fā)展，因而使得兩個(gè)反應(yīng)得以平行存在。
免疫系統(tǒng)的另一個(gè)重要方面是所謂的主要IgE結(jié)合抗原決定部位存在的確定。有人提出這些主要IgE結(jié)合抗原決定部位是由三級(jí)結(jié)構(gòu)依賴的連續(xù)表面區(qū)域構(gòu)成，該區(qū)域大小足夠大容納抗體結(jié)合，且在異變態(tài)反應(yīng)原、變體和/或來自相關(guān)物種的同源變態(tài)反應(yīng)原中保守。能夠在同源變態(tài)反應(yīng)原上結(jié)合相似抗原決定部位的交叉反應(yīng)性IgE的存在得到了臨床觀察的支持，即變態(tài)反應(yīng)患者經(jīng)常對(duì)幾種密切相關(guān)的物種反應(yīng)，如榿木、樺木和榛子，多種草本物種，或嗜皮螨屬(Dermatophagoides)的幾個(gè)物種。此外，它得到了實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)的支持，該實(shí)驗(yàn)證明了來自相關(guān)物種的同源變態(tài)反應(yīng)原之間的IgE交叉反應(yīng)性及一種變態(tài)反應(yīng)原抑制IgE結(jié)合同源變態(tài)反應(yīng)原的能力(Ipsen等人，1992，參考文獻(xiàn)16)。眾所周知，暴露和免疫反應(yīng)以劑量依賴的方式相關(guān)。結(jié)合這些觀察，可假定保守的表面區(qū)域暴露于免疫系統(tǒng)的劑量比不保守的表面區(qū)域更高，導(dǎo)致具有更高親和力的IgE抗體的產(chǎn)生，因此有了術(shù)語“主要IgE結(jié)合抗原決定部位”。
根據(jù)這個(gè)基本原理，必要的是變態(tài)反應(yīng)原具有與天然變態(tài)反應(yīng)原基本上相同的α-碳主鏈三級(jí)結(jié)構(gòu)，因而確保圍繞保守區(qū)塊的區(qū)域表面拓?fù)鋵W(xué)的保守性，這些區(qū)域代表了旨在減少IgE結(jié)合的誘變目標(biāo)。通過實(shí)現(xiàn)這些標(biāo)準(zhǔn)，變態(tài)反應(yīng)原有潛力以相對(duì)較高的劑量施用以改善其效力，即產(chǎn)生一種保護(hù)性的免疫反應(yīng)而不損害安全性。
此外，本發(fā)明基于如下發(fā)現(xiàn)，即變態(tài)反應(yīng)癥狀由IgE通過高親和力的受體FceR I在效應(yīng)細(xì)胞即肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面的2個(gè)特異的結(jié)合所導(dǎo)致的變態(tài)反應(yīng)交聯(lián)引起。為了說明，我們參考圖15，它描述了具有IgE結(jié)合抗原決定部位的變態(tài)反應(yīng)原的理論模型。誘導(dǎo)中介體從肥大細(xì)胞釋放及因此產(chǎn)生的變態(tài)反應(yīng)癥狀由變態(tài)反應(yīng)原所介導(dǎo)的結(jié)合于肥大細(xì)胞表面的IgE所致，參考圖15A。在圖15B所示的情況下，兩個(gè)抗原決定部位已經(jīng)發(fā)生突變以減少它們的IgE結(jié)合親和力，并因此防止了變態(tài)反應(yīng)原介導(dǎo)的交聯(lián)。在這種聯(lián)系中應(yīng)該注意到變態(tài)反應(yīng)原通常包含超過3個(gè)的B細(xì)胞抗原決定部位。然而，從圖15中描述的理論狀況下可假定發(fā)生的以消除或減少其IgE結(jié)合能力的抗原決定部位的突變?cè)蕉啵敲醋儜B(tài)反應(yīng)原介導(dǎo)的交聯(lián)和結(jié)果所得的變態(tài)反應(yīng)癥狀的危險(xiǎn)就越低。
然而，為了使突變的變態(tài)反應(yīng)原能夠引起新的免疫反應(yīng)，包括IgG反應(yīng)，變態(tài)反應(yīng)原必須包含至少一個(gè)未變的抗原決定部位。優(yōu)選，未變的抗原決定部位是主要的抗原決定部位，因?yàn)檫@樣的突變變態(tài)反應(yīng)原用于疫苗接種時(shí)將提供改善的保護(hù)。
總之，本發(fā)明的發(fā)明思想基于如下認(rèn)識(shí)，即具有在多重B細(xì)胞抗原決定部位中減少IgE結(jié)合的突變的變態(tài)反應(yīng)原突變體和至少一種未變的抗原決定部位將一方面減少變態(tài)反應(yīng)原介導(dǎo)的交聯(lián)，另一方面允許引起具有與IgE競爭的結(jié)合能力的IgG反應(yīng)。因而，該變態(tài)反應(yīng)原突變體組成了一種非常有利的變態(tài)反應(yīng)原，這里過敏性的反應(yīng)的危險(xiǎn)將大大減少。
本發(fā)明也基于如下認(rèn)識(shí)，即包含不同這樣的變態(tài)反應(yīng)原突變體的混合物的疫苗，其中許多或全部抗原決定部位都理想地表現(xiàn)為未變化，在其誘導(dǎo)對(duì)變態(tài)反應(yīng)癥狀的保護(hù)的能力上具有與天然存在的變態(tài)反應(yīng)原相同的效力，其中從天然的變態(tài)反應(yīng)原衍生了該變態(tài)反應(yīng)原突變體。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及向一些確定的關(guān)鍵位點(diǎn)，即IgE結(jié)合的抗原決定部位引入人工的氨基酸替換，目的在于減少每個(gè)突變的抗原決定部位的特異的IgE結(jié)合能力。
本發(fā)明提供了重組變態(tài)反應(yīng)原，其特征在于它是天然存在的變態(tài)反應(yīng)原的突變體，其中變態(tài)反應(yīng)原突變體具有至少4個(gè)初級(jí)突變，與該天然存在的變態(tài)反應(yīng)原的IgE結(jié)合能力相比，這每一個(gè)突變都減少了變態(tài)反應(yīng)原突變體的特異的IgE結(jié)合能力；其中每一個(gè)初級(jí)突變都用其他的殘基替換一個(gè)表面暴露的氨基酸殘基，在該天然存在的變態(tài)反應(yīng)原所源自的分類學(xué)物種中該新殘基不發(fā)生于任何已知同源蛋白質(zhì)氨基酸序列的相同位置上；其中每一個(gè)初級(jí)突變都與任一其他初級(jí)突變間隔至少15；且其中初級(jí)突變以這種方式分布，以使得至少一個(gè)具有8002面積的圓形表面區(qū)域不包含有突變。
如果不受理論的限制，相信B細(xì)胞抗原決定部位可分布在變態(tài)反應(yīng)原的幾乎整個(gè)表面。此外，有實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明至少一些抗原決定部位組成了包含大量交迭抗原決定部位的抗原決定部位簇的一部分。因此，本發(fā)明的理論基礎(chǔ)即為任何表面暴露的氨基酸都構(gòu)成突變的潛在位點(diǎn)，其可導(dǎo)致降低特異地結(jié)合IgE的能力。
因此，初級(jí)突變是由它們相互的定位而確定，即它們相互隔開，以確保它們是分離的抗原決定部位簇中的突變。
本發(fā)明也提供包含兩或多種根據(jù)權(quán)利要求1的重組變態(tài)反應(yīng)原突變體的組合物，其中每一個(gè)變體都是通過具有至少一個(gè)主要突變而定義，該突變?cè)谥辽僖粋€(gè)其他的變體中不存在；其中對(duì)于每一個(gè)變體而言在每一個(gè)不存在的初級(jí)突變的15的半徑之內(nèi)不存在二級(jí)突變。該組合物優(yōu)選包含2～12個(gè)，更優(yōu)選3～10個(gè)，更優(yōu)選4～8個(gè)且最優(yōu)選5～7個(gè)變體。
本發(fā)明也提供制備根據(jù)權(quán)利要求1的重組變態(tài)反應(yīng)原的方法，其特征在于a)在天然存在的變態(tài)反應(yīng)原中確定一些氨基酸殘基，它們具有至少20％的溶劑可接近性；b)以這樣的方式選擇至少4個(gè)確定的氨基酸殘基以使得每個(gè)所選氨基酸與其他所選氨基酸相互間隔至少15，且所選氨基酸是以這種方式放置，使得至少一個(gè)具有8002面積的圓形表面區(qū)域不包含選擇的氨基酸；和c)對(duì)每個(gè)所選氨基酸進(jìn)行初級(jí)突變，使得與天然存在的變態(tài)反應(yīng)原的結(jié)合能力相比變態(tài)反應(yīng)原突變體的特異性IgE結(jié)合能力減少了，其中每個(gè)初級(jí)突變都是用其他的氨基酸替換所選氨基酸殘基，前者在該天然存在的變態(tài)反應(yīng)原所源自的分類學(xué)物種中不發(fā)生于任何已知同源蛋白質(zhì)氨基酸序列的相同位置上。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及制備根據(jù)本發(fā)明的重組變態(tài)反應(yīng)原的方法，其特征在于該變態(tài)反應(yīng)原是從由編碼相應(yīng)的天然存在的變態(tài)反應(yīng)原的DNA進(jìn)行的DNA改組(DNA shuffling)(分子培育(Molecular breeding))獲得的DNA序列生產(chǎn)。
此外，本發(fā)明涉及根據(jù)權(quán)利要求1以用作藥物的重組變態(tài)反應(yīng)原。
本發(fā)明也涉及根據(jù)權(quán)利要求1的重組變態(tài)反應(yīng)原在制備預(yù)防和/或治療變態(tài)反應(yīng)的藥物中的用途。
此外，本發(fā)明涉及根據(jù)權(quán)利要求37的用作藥物的組合物。
本發(fā)明也涉及根據(jù)權(quán)利要求37的組合物以制備藥物來預(yù)防和/或治療變態(tài)反應(yīng)的用途。
更進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及藥物組合物，其特征在于它包含根據(jù)權(quán)利要求1的重組變態(tài)反應(yīng)原或根據(jù)權(quán)利要求37的組合物，可選地與藥物學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑，以及可選佐劑結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可為對(duì)抗變態(tài)反應(yīng)的疫苗的形式，該變態(tài)反應(yīng)是由天然存在的變態(tài)反應(yīng)原在遭受變態(tài)反應(yīng)的患者中引起。
本發(fā)明也涉及在被試者中產(chǎn)生免疫反應(yīng)的方法，包含向被試者施用根據(jù)權(quán)利要求1的重組變態(tài)反應(yīng)原、根據(jù)權(quán)利要求37的組合物或根據(jù)權(quán)利要求41-42或46的藥物組合物。
更進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及對(duì)被試者進(jìn)行疫苗接種或治療，包含向被試者施用根據(jù)權(quán)利要求1的重組變態(tài)反應(yīng)原、根據(jù)權(quán)利要求37的組合物或根據(jù)權(quán)利要求41-42或46的藥物組合物。
本發(fā)明也涉及制備根據(jù)權(quán)利要求41或42的藥物組合物的方法，包含將根據(jù)權(quán)利要求1的重組變態(tài)反應(yīng)原或根據(jù)權(quán)利要求37的組合物與藥物學(xué)上可接受的物質(zhì)和/或賦形劑混合。
更進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及由根據(jù)權(quán)利要求45的方法可獲得的藥物組合物。
本發(fā)明也涉及在被試者中治療、預(yù)防或減輕變態(tài)反應(yīng)的方法，包含向被試者施用根據(jù)權(quán)利要求1的重組變態(tài)反應(yīng)原、根據(jù)權(quán)利要求37的組合物或根據(jù)權(quán)利要求41-42或46的藥物組合物。
更進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及編碼根據(jù)本發(fā)明的變態(tài)反應(yīng)原的DNA序列、其衍生物、其部分序列、其簡并的序列或在嚴(yán)緊條件下與其雜交的序列，其中該衍生物、部分序列、簡并序列或雜交序列編碼具有至少一個(gè)B細(xì)胞抗原決定部位的肽。
本發(fā)明也涉及包含根據(jù)本發(fā)明的DNA的表達(dá)載體。
此外，本發(fā)明也涉及含有根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
此外，本發(fā)明涉及生產(chǎn)重組變態(tài)反應(yīng)原突變體的方法，該方法包含培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞的步驟。
最后，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明或由根據(jù)本發(fā)明的DNA序列編碼的重組變態(tài)反應(yīng)原，其包含至少一種T細(xì)胞抗原決定部位能夠刺激特異于天然存在的變態(tài)反應(yīng)原的T細(xì)胞克隆或T細(xì)胞系。
根據(jù)本發(fā)明的突變體應(yīng)該優(yōu)選地能夠以由T細(xì)胞刺激指數(shù)測量的相似方式/程度來刺激變態(tài)反應(yīng)原特異的T細(xì)胞系。
發(fā)明詳述在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，初級(jí)突變間隔20，優(yōu)選地為25，且最優(yōu)選地為30。
相信變態(tài)反應(yīng)原包含許多特異的IgE的潛在結(jié)合區(qū)，其中每個(gè)區(qū)域約具有8002的面積，每個(gè)表面區(qū)域包含大量的交迭抗原決定部位。因而，變態(tài)反應(yīng)原含有許多由8002劃分的表面區(qū)域的潛在的初級(jí)突變。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的重組變態(tài)反應(yīng)原包含5～20個(gè)，優(yōu)選6～15個(gè)，更優(yōu)選7～12個(gè)，且最優(yōu)選8～10個(gè)初級(jí)突變。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，不含有突變的表面區(qū)域具有7002的面積，優(yōu)選6002，更優(yōu)選5002且最優(yōu)選4002。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，重組變態(tài)反應(yīng)原包含許多二級(jí)突變，與該天然存在的變態(tài)反應(yīng)原的結(jié)合能力相比，它們每一個(gè)突變都減少了變態(tài)反應(yīng)原突變體的特異的IgE結(jié)合能力；其中每一個(gè)二級(jí)突變都是用其他的殘基替換一個(gè)表面暴露的氨基酸殘基，前者在該天然存在的變態(tài)反應(yīng)原所源自的分類學(xué)物種中不發(fā)生于任何已知同源蛋白質(zhì)氨基酸序列的相同位置上；其中的二級(jí)突變是處于圓形表面區(qū)域之外。
二級(jí)突變可位于靠近初級(jí)突變的位置，即二級(jí)突變也可是相同抗原決定部位的額外突變，該抗原決定部位已有了初級(jí)突變。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在天然存在的變態(tài)反應(yīng)原中至少一個(gè)要進(jìn)行替換的表面暴露的氨基酸具有超過20％的溶劑可接近性，優(yōu)選超過30％，更優(yōu)選超過40％且最優(yōu)選超過50％。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，至少一個(gè)要在天然存在的變態(tài)反應(yīng)原中進(jìn)行替換的表面暴露的氨基酸在該天然存在的變態(tài)反應(yīng)原所源自的分類目中的所有已知的同源蛋白質(zhì)中具有超過70％，優(yōu)選80％的且最優(yōu)選90％的一致性。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的重組變態(tài)反應(yīng)原基本上具有與該天然存在的變態(tài)反應(yīng)原相同的α-碳主鏈三級(jí)結(jié)構(gòu)。
當(dāng)比較突變體和天然存在的變態(tài)反應(yīng)原分子的α-碳主鏈三級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，對(duì)原子坐標(biāo)的平均根均方偏差優(yōu)選地低于2。
在本發(fā)明的重組變態(tài)反應(yīng)原的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，每一個(gè)要結(jié)合入變態(tài)反應(yīng)原突變體的氨基酸殘基在該天然存在的變態(tài)反應(yīng)原所源自的分類學(xué)屬，優(yōu)選亞科，更優(yōu)選科，更優(yōu)選總科，更優(yōu)選軍團(tuán)(legion)，更優(yōu)選亞目且最優(yōu)選目中都不發(fā)生于任何已知同源蛋白質(zhì)氨基酸序列的相同位置上。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的重組變態(tài)反應(yīng)原突變體是非天然存在的變態(tài)反應(yīng)原。
在使用來自來源特異的IgE反應(yīng)性變態(tài)反應(yīng)患者或其群體的血清進(jìn)行的免疫測定中與天然存在的異變態(tài)反應(yīng)原或相似的重組蛋白質(zhì)相比，對(duì)突變的變態(tài)反應(yīng)原的特異的IgE結(jié)合減少了至少5％，優(yōu)選至少10％。
估計(jì)減少的IgE結(jié)合和減少的介導(dǎo)突變體交聯(lián)能力的另一個(gè)途徑是突變體起始組胺釋放(HR)的能力。組胺的釋放可在幾個(gè)組胺釋放測定中被測量。突變體減少的組胺釋放來源于對(duì)結(jié)合到細(xì)胞表面的特異的IgE的親和力的減小及其減少的促進(jìn)交聯(lián)的能力。與天然存在的變態(tài)反應(yīng)原相比，本發(fā)明的突變體HR優(yōu)選減少5～100％，更優(yōu)選25～100％，更優(yōu)選50～100％且最優(yōu)選75～100％。
典型地，不含有突變且具有8002面積的圓形表面區(qū)域包含15～25個(gè)氨基酸殘基的原子。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的重組變態(tài)反應(yīng)原特征在于將表面暴露的氨基酸殘基關(guān)于溶劑可接近性分級(jí)，且將處于較高的溶劑可接近性的氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)替換。
根據(jù)本發(fā)明一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的重組變態(tài)反應(yīng)原特征在于將表面暴露的氨基酸殘基關(guān)于其在該天然存在的變態(tài)反應(yīng)原所源自的分類學(xué)種中的所有已知同源蛋白質(zhì)中的保守程度而分級(jí)，且將處于較高保守程度的氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)替換。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的重組變態(tài)反應(yīng)原對(duì)于每個(gè)初級(jí)突變包含1～4個(gè)二級(jí)突變。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案特征在于一個(gè)或多個(gè)替換由定點(diǎn)突變實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案特征在于一個(gè)或多個(gè)替換由隨機(jī)誘變實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明進(jìn)一步的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案特征在于一個(gè)或多個(gè)替換由DNA改組實(shí)現(xiàn)。
根據(jù)本發(fā)明的重組變態(tài)反應(yīng)原可適當(dāng)?shù)貫槲氲淖儜B(tài)反應(yīng)原的突變體，它理論上來源于樹、草、草本植物、真菌、屋塵螨、蟑螂和動(dòng)物毛發(fā)和皮屑。來自樹、草和草本植物的重要花粉變態(tài)反應(yīng)原是源自分類目Fagales、Oleales和Pinales的這些，理論上包括樺木(樺木屬(Betula))、榿木(榿木屬(Alnus))、榛樹(榛屬(Corvlus))、角樹(鵝耳櫪屬(Carpinus))和橄欖樹(齊墩果屬(Olea))，Poales目理論上包括黑麥草屬(Lolium)、貓尾草屬(Phleum)、早熟禾屬(Poa)、狗牙根屬(Cynodon)、鴨茅屬(Dactylis)和黑麥屬(Secale)等屬的草，Asterales和Urticales目理論上包括豚草屬(Ambrosia)和蒿屬(Artemisia)的草本植物。來自真菌的重要吸入型變態(tài)反應(yīng)原理論上為源自鏈格孢屬(Alternaria)和芽枝霉屬(Cladosporium)的這些。其他重要吸入型變態(tài)反應(yīng)原來自嗜皮螨屬的屋塵螨、來自蟑螂和來自哺乳動(dòng)物如貓、狗和馬。更進(jìn)一步地，根據(jù)本發(fā)明的重組變態(tài)反應(yīng)原可為毒液變態(tài)反應(yīng)原的突變體，包括來自刺人的或咬人的昆蟲，例如來自膜翅目，包括蜜蜂(蜜蜂總科(Apidae))，黃蜂(胡蜂總科(Vespidae))和螞蟻(蟻Formicoidae總科)。
特異的變態(tài)反應(yīng)原成分包括如Fagalrs目的Bet v 1(白樺(B.verrucosa)，樺木)、Aln g 1(膠榿木(Alnus glutinosa)，榿木)、Cor a 1(Corylus avelana，榛子)和Car b 1(樺葉鵝耳櫪(Carpinus betulus)，角樹)。其他的為Cry j 1(Pinales)、Amb a1和2、Art v 1(Asterales)、Par j 1(Urticales)、Ole e 1(Oleales)、Ave e 1、Cyn d 1、Dac g 1、Fes p 1、Hol l 1、Lol p 1和5、Pas n 1、Phl p 1和5、Poa p 1、2和5、Sec c 1和5、及Sorh 1(各種草的花粉)、Alt a 1和Cla h 1(真菌)、Der f 1和2、Derp 1和2(屋塵螨，分別為粉塵螨(D.farinae)和屋塵螨(D.pteronyssinus))、Lep d 1和2(Lepidoglyphus destructor；貯藏螨(storage mite))、Bla g 1和2、Per a 1(蟑螂，分別為德國小蠊(Blatella germanica)和美洲大蠊(Periplaneta americana)、Fel d1(貓)、Can f 1(狗)、Equ c 1、2和3(馬)、Apis m 1和2(蜜蜂)、Ves v 1、2和5、Pol a 1、2和5(全為黃蜂)和Sol i 1、2、3和4(火蟻(fire ant))。
在一個(gè)實(shí)施方案中重組變態(tài)反應(yīng)原是Bet v 1的一個(gè)突變體。潛在適合用于替換的氨基酸包含氨基酸V2、D72、E87、K-129、E-60、N-47、K-65、P-108、N-159、D-93、K-123、K-32、D-125、R-145、D-109、E-127、Q-36、E-131、L-152、E-6、E-96、D-156、P-63、H-76、E-8、K-134、E-45、T-10、V-12、K-20、S-155、H-126、P-50、N-78、K-119、V-2、L-24、E-42、N-4、A-153、I-44、E-138、G-61、A-130、R-70、N-28、P-35、S-149、K-103、Y-150、H-154、N-43、A-106、K-115、P-14、Y-5、K-137、E-141、E-87和E-73。一或多種一次和二次替換可選自V2F、V2L、V2I、V2M、Y5V、T10P、T10A、K20N、D25E、N28T、K32Q、Q36A、Q36K、E42S、E45S、N47S、K55N、K65N、D72H、D72Q、D72N、T77A、N78K、E87G、E96L、K97S、K103V、P108G、D109N、K123I、D125Y、K129N、K134E、R145E、S149R、S149T、D156H和+160N，其中+表示插入了一個(gè)額外的氨基酸。
根據(jù)本發(fā)明Bet v 1突變體的實(shí)施例如下(當(dāng)用到時(shí)，括弧表示一次和二級(jí)突變)突變體A(Asn28Thr，Lys32Gln)、(Asn78Lys，Lys103Val)、Arg145Glu、(Asp156His，+160Asn)。
突變體BTyr5Val、Glu42Ser、Glu45Ser、Asn78Lys、Lys103Val、Lys123Ile、Lys134Glu、Asp156His。
突變體2595(實(shí)施例2)N28T、K32Q、E45S、P108G突變體2628(實(shí)施例4)Tyr5Val、Glu45Ser、Lys65Asn、Lys97Ser、Lys134Glu。
突變體2637(實(shí)施例4)Ala16Pro、(Asn28Thr，Lys32Gln)、Lys103Thr、Pro108Gly、(Leu152Lys，Ala153Gly，Ser155Pro)。
突變體2724N28T、K32Q、N78K、K103V、P108G、R145E、D156H、+160N。
突變體2733(實(shí)施例4)(Tyr5Val，Lys134Glu)、(Asn28Thr，Lys32Gln)、Glu45Ser、Lys65Asn、(Asn78Lys，Lys103Val)、Lys97Ser、Pro108Gly、Arg145Glu、(Asp156His，+160Asn)。
突變體2744(Tyr5Val，Lys134Glu)、(Glu42Ser、Glu45Ser)、(Asn78Lys，Lys103Val)、Lys123Ile、(Asp156His，+160Asn)。
突變體2753(實(shí)施例4)(Asn28Thr，Lys32GIn)、Lys65Asn、(Glu96Leu，Lys97Ser)、(Pro108Gly，Asp109Asn)、(Asp125Tyr，Glu127Ser)、Arg145Glu。
突變體2744+2595Y5V、N28T、K32Q、E42S、E45S、N78K、K103V、P108G、K123I、K134E、D156H、+160N。
突變體2744+2628Y5V、E42S、E45S、K65N、N78K、K97S、K103V、K123I、K134E、D156H、+160N。
突變體2744+2595+2628Y5V、N28T、K32Q、E42S、E45S、K65N、N78K、K97S、K103V、P108G、K123I、K134E、D156H、+160N。
此外，所有上述突變體包含一種或多種下面的替換V2F、V2L、V2I、V2M、T10A、K20N、Q36A或Q36K、D72H、D72Q、D72N、E87G、K129N和S149R或S149T。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，重組變態(tài)反應(yīng)原衍生自來自分類學(xué)目胡蜂科(Vespidae)、蜜蜂科(Apidae)和蟻(Formicoidae)總科的毒液變態(tài)反應(yīng)原。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，重組變態(tài)反應(yīng)原衍生自Ves v 5。潛在適合用于替換的氨基酸包含氨基酸K-16、K-185、K-11、K-44、K-210、R-63、K-13、F-6、K-149、K-128、E-184、K-112、F-157、E-3、K-29、N-203、N-34、K-78、K-151、L-15、L-158、Y-102、W-186、K-134、D-87、K-52、T-67、T-125、K-150、Y-40、Q-48、L-65、K-81、Q-101、Q-208、K-144、N-8、N-70、H-104、Q-45、K-137、K-159、E-205、N-82、A-111、D-131、K-24、V-36、N-7、M-138、T-209、V-84、K-172、V-19、D-56、P-73、G-33、T-106、N-170、L-28、T-43、Q-114、C-10、K-60、N-31、K-47、E-5、D-145、V-38、A-127、D-156、E-204、P-71、G-26、Y-129、D-141、F-201、R-68、N-200、D-49、S-153、K-35、S-39、Y-25、V-37、G-18、W-85和I-182。一或多種一次和二次替換可選自K29A、T67A、K78A、V84S、Y102A、K112S、K144A、K202M和N203G。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，重組變態(tài)反應(yīng)原衍生自Der p 2。潛在適合用于替換的氨基酸包含氨基酸R-128、D-129、H-11、H-30、S-1、K-77、Y-75、R-31、K-82、K-6、K-96、K-48、K-55、K-89、Q-85、W-92、I-97、H-22、V-65、S-24、H-74、K-126、L-61、P-26、N-93、D-64、I-28、K-14、K-100、E-62、I-127、E-102、E-25、P-66、L-17、G-60、P-95、E-53、V-81、K-51、N-103、Q-2、N-46、E-42、T-91、D-87、N-10、M-111、C-8、H-124、I-68、P-79、K-109和R-128、D-129、H-11、H-30、S-1、K-77、Y-75、R-31、K-82、K-6、K-96、K-48、K-55、K-89、Q-85、W-92、I-97、H-22、V-65、S-24、H-74、K-126、L-61、P-26、N-93、D-64、I-28、K-14、K-100、E-62、I-127、E-102、E-25、P-66、L-17、G-60、P-95、E-53、V-81、K-51、N-103、Q-2、N-46、E-42、T-91、D-87、N-10、M-111、C-8、H-124、I-68、P-79、K-109、K-15。一或多種一次和二次替換可選自K6A、N10S、K15E、S24N、H30N、K48A、E62S、H74N、K77N、K82N、K100N和R128Q。
根據(jù)本發(fā)明Bet v 1突變體的實(shí)施例如下突變體AK6A、K15E、H30N、E62S。
突變體BK6A、K15E、H30N、E62S、H74N、K82N。
突變體CK6A、N10S、K15E、S24N、H30N、K48A、E62S、H74N、K77N、K82N、K100N和R128Q疫苗疫苗的制備為本領(lǐng)域眾所周知。疫苗一般以可注射的液體溶液或懸浮液的形式制備。這樣的疫苗也可以乳化或調(diào)配以使其能夠經(jīng)鼻及經(jīng)口給藥，包括口腔和舌下給藥。正被討論的免疫原性成分(如在此處所限定的重組變態(tài)反應(yīng)原)可適當(dāng)?shù)嘏c藥物學(xué)上可接受，且進(jìn)一步與活性成分相容的賦形劑混合。適當(dāng)?shù)馁x形劑的實(shí)例為水、鹽、右旋糖、甘油、乙醇等以及它們的組合。疫苗另外可含有其他的物質(zhì)，如潤濕劑、乳化劑、緩沖劑或增強(qiáng)疫苗效力的佐劑。
疫苗最通常通過皮下或肌內(nèi)注射以腸胃外方式給藥。適合于通過其他途徑給藥的制劑包括口服制劑和栓劑。經(jīng)口給藥的疫苗可適當(dāng)?shù)赜猛ǔＳ糜谶@種制劑的賦形劑來調(diào)配，如藥物等級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉(sodium saccharine)、纖維素、碳酸鎂等。組合物可被制備成溶液、懸浮掖、乳劑、片劑、藥丸、膠囊、緩釋制備物、氣溶膠、粉末或顆粒。
疫苗的給藥途徑應(yīng)與劑量配方相容，并且其量在藥物學(xué)上有效且具免疫原性。在疫苗中包含的活性成分的量依賴于治療對(duì)象、理論上被試者響應(yīng)于治療的免疫系統(tǒng)對(duì)治療的應(yīng)答能力、給藥途徑及被試者的年齡和體重。適當(dāng)?shù)膭┝糠秶?.0001μg～1000μg。
如上所述，通過向制備物中添加佐劑可獲得增加的作用。這樣的佐劑的實(shí)例為氫氧化鋁和磷酸緩沖鹽溶液中0.05％～0.1％的磷酸(明礬)或磷酸鈣溶液、用作0.25％溶液的糖或聚交酯乙交酯(polylactid glycolid)(PLG)的合成多聚體。也可采用與細(xì)菌細(xì)胞如小棒桿菌(C.parvum)、革蘭氏陰性細(xì)菌的內(nèi)毒素或脂多糖成分的混合物、在生理學(xué)可接受的油載體如二縮甘露醇monoaleate(Aracel A)中的乳劑或在用作阻斷替換的20％全氟烴(perfluorocarbon)(如Fluosol-DA)溶液中的乳劑。也可用到油乳劑如MF-59。也可以用到其他的佐劑如弗氏完全和不完全佐劑以及皂苷，如QuilA、Qs-21和ISCOM和RIBI。
最經(jīng)常地，疫苗的多重給藥對(duì)確保其作用是必需的。疫苗經(jīng)常以初次給藥后伴隨后續(xù)接種或其他給藥的方式來給藥。疫苗接種的數(shù)量一般為1～50次，通常不超過35次疫苗接種。疫苗接種通常雙周到雙月地進(jìn)行3個(gè)月到5年的時(shí)間。預(yù)期這將達(dá)到預(yù)防或治療效果的期望水平。
重組變態(tài)反應(yīng)原可被用作藥物制備物，在癥狀出現(xiàn)所在年的期間適合于提供某些對(duì)抗變態(tài)反應(yīng)的保護(hù)(預(yù)防)。通常，必須每年重復(fù)治療以維持保護(hù)作用。調(diào)配為鼻、口和舌下應(yīng)用的制備物特別適合于這個(gè)目的。
制備根據(jù)本發(fā)明的重組變態(tài)反應(yīng)原的方法如上所述，本發(fā)明也涉及制備本發(fā)明的重組變態(tài)反應(yīng)原突變體的方法，參考權(quán)利要求48。
依照本發(fā)明適合于替換的表面暴露的氨基酸可以其溶劑(水)可接近性的信息為基礎(chǔ)進(jìn)行確定，該信息表達(dá)了其表面暴露的程度。本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案特征在于以溶劑可接近性對(duì)其中確定的氨基酸殘基進(jìn)行分級(jí)，且在具有較大溶劑可接近性的氨基酸中替換一個(gè)或多個(gè)。
有助于確定依照本發(fā)明的適合用作替換的表面暴露的氨基酸的第二個(gè)參數(shù)是氨基酸在該天然存在的變態(tài)反應(yīng)原所源自的物種中所有已知同源蛋白質(zhì)中的保守程度?；蛘撸瑢⑵湓谠撎烊淮嬖诘淖儜B(tài)反應(yīng)原所源自的分類學(xué)屬、亞科、科、總科、軍團(tuán)(legion)、亞目或目中所有已知的同源蛋白質(zhì)中的保守程度用作這樣的第二個(gè)參數(shù)。
因此，本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案特征在于選擇確定的氨基酸殘基，其在該天然存在的變態(tài)反應(yīng)原所源自的物種中所有已知同源蛋白質(zhì)中具有超過70％，優(yōu)選超過80％的且最優(yōu)選超過90％的一致性。
此外，本發(fā)明方法的特別優(yōu)選的一個(gè)實(shí)施方案特征在于關(guān)于以在該天然存在的變態(tài)反應(yīng)原所源自的物種中所有已知同源蛋白質(zhì)中的保守程度來對(duì)其中確定的氨基酸殘基進(jìn)行分級(jí)，且在具有較大保守性的氨基酸中替換一個(gè)或多個(gè)。
本發(fā)明方法更進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案包含選擇確定的氨基酸以形成變態(tài)反應(yīng)原突變體，它具有與天然存在的變態(tài)反應(yīng)原基本上相同的α-碳主鏈三級(jí)結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明方法的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案特征在于對(duì)氨基酸殘基的替換通過定點(diǎn)突變來實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明方法的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案特征在于對(duì)氨基酸殘基的替換通過DNA改組來實(shí)現(xiàn)。
替換標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于三級(jí)結(jié)構(gòu)已經(jīng)確定的分子(例如通過X-射線晶體學(xué)或NMR電子顯微鏡方法)，帶有替換的氨基酸的突變體應(yīng)該優(yōu)選地符合如下標(biāo)準(zhǔn)1.分子的總α-碳主鏈三級(jí)結(jié)構(gòu)優(yōu)選保守。保守定義為比較結(jié)構(gòu)時(shí)原子坐標(biāo)中平均根均方偏差低于2。這由于兩個(gè)原因而重要a)可預(yù)期天然的變態(tài)反應(yīng)原的整個(gè)表面組成了潛在抗體結(jié)合抗原決定部位的一個(gè)交迭連續(xù)統(tǒng)一體。分子表面的大部分不受替換影響，并因而維持了其抗體結(jié)合誘導(dǎo)的性質(zhì)，這對(duì)于產(chǎn)生針對(duì)也存在于天然變態(tài)反應(yīng)原上的抗原決定部位的新保護(hù)性抗體特異性重要。b)考慮保存限期和注射入體液中時(shí)的穩(wěn)定性。
2.要替換的氨基酸優(yōu)選位于表面，因而可供抗體結(jié)合所接近。位于三維結(jié)構(gòu)的表面的氨基酸通常具有至少20％的溶劑(水)可接近性，適當(dāng)?shù)貫?0～80％，更適當(dāng)?shù)貫?0～80％。溶劑可接近性定義為對(duì)具有與溶劑(水，r＝1.4)分子相當(dāng)半徑的球體可接近的分子的面積。
3.每個(gè)替換的氨基酸優(yōu)選位于具有超過4002面積的保守區(qū)塊中。保守的區(qū)塊定義為表面暴露的保守氨基酸殘基和主鏈的連續(xù)相結(jié)合的區(qū)域。保守的氨基酸殘基由處于相同分類學(xué)屬、亞科、科、總科、軍團(tuán)(legion)、亞目或目中的同源蛋白質(zhì)的所有已知氨基酸序列的序列比對(duì)來界定。在超過70％的序列中具有相同氨基酸殘基的氨基酸位置被認(rèn)為保守。預(yù)期保守的區(qū)塊含有大多數(shù)患者的IgE所針對(duì)的抗原決定部位。
α-碳主鏈三級(jí)結(jié)構(gòu)的保守是由在誘變前后用X-射線晶體學(xué)或NMR獲得相同的結(jié)構(gòu)而最好地確定的。沒有描述突變體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)時(shí)，如果與由對(duì)結(jié)構(gòu)上確定的分子分析所獲得的數(shù)據(jù)相比，不能區(qū)別的CD-譜或免疫化學(xué)數(shù)據(jù)如抗體反應(yīng)性則能推知大概α-碳主鏈三級(jí)結(jié)構(gòu)的保守性。
4.在保守的區(qū)塊中，用于誘變的氨基酸應(yīng)該優(yōu)選選自優(yōu)選位于接近保守區(qū)塊中心的具有最大溶劑(水)可接近性的那些。
5.優(yōu)先地，極性氨基酸殘基由另一個(gè)極性殘基替換，而非極性氨基酸殘基由另一個(gè)非極性殘基替換。
為了基本維持變態(tài)反應(yīng)原的三維結(jié)構(gòu)，要結(jié)合進(jìn)來的氨基酸可基于同該變態(tài)反應(yīng)原的結(jié)構(gòu)類似物的蛋白質(zhì)的比較來選擇，例如一個(gè)與該變態(tài)反應(yīng)原屬于相同分類學(xué)目且與該變態(tài)反應(yīng)原不具有任何交叉反應(yīng)性的蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的DNA在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的DNA序列是編碼天然存在的變態(tài)反應(yīng)原的DNA序列的衍生物。
優(yōu)選，該DNA衍生物通過對(duì)編碼天然存在的變態(tài)反應(yīng)原的DNA進(jìn)行定點(diǎn)突變或隨機(jī)誘變而獲得。
在第一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，DNA序列是如圖3所示的序列的一個(gè)衍生物，其中的DNA序列進(jìn)行了突變以編碼具有至少4個(gè)突變的變態(tài)反應(yīng)原，這些突變選自K-129、E-60、N-47、K-65、P-108、N-159、D-93、K-123、K-32、D-125、R-145、D-109、E-127、Q-36、E-131、L-152、E-6、E-96、D-156、P-63、H-76、E-8、K-134、E-45、T-10、V-12、K-20、S-155、H-126、P-50、N-78、K-119、V-2、L-24、E-42、N-4、A-153、I-44、E-138、G-61、A-130、R-70、N-28、P-35、S-149、K-103、Y-150、H-154、N-43、A-106、K-115、P-14、Y-5、K-137、E-141、E-87、E-73。
在第二個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，DNA序列是如圖13所示的序列的一個(gè)衍生物，其中的DNA序列進(jìn)行了突變以編碼具有至少4個(gè)突變的變態(tài)反應(yīng)原，這些突變選自K-16、K-185、K-11、K-44、K-210、R-63、K-13、F-6、K-149、K-128、E-184、K-112、F-157、E-3、K-29、N-203、N-34、K-78、K-151、L-15、L-158、Y-102、W-186、K-134、D-87、K-52、T-67、T-125、K-150、Y-40、Q-48、L-65、K-81、Q-101、Q-208、K-144、N-8、N-70、H-104、Q-45、K-137、K-159、E-205、N-82、A-111、D-131、K-24、V-36、N-7、M-138、T-209、V-84、K-172、V-19、D-56、P-73、G-33、T-106、N-170、L-28、T-43、Q-114、C-20、K-60、N-31、K-47、E-5、D-145、V-38、A-127、D-156、E-204、P-71、G-26、Y-129、D-141、F-201、R-68、N-200、D-49、S-153、K-35、S-39、Y-25、V-37、G-18、W-85和I-182。
在第三個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，DNA序列是如圖16所示的序列的一個(gè)衍生物，其中的DNA序列進(jìn)行了突變以編碼具有至少4個(gè)突變的變態(tài)反應(yīng)原，這些突變選自R-128、D-129、H-11、H-30、S-1、K-77、Y-75、R-31、K-82、K-6、K-96、K-48、K-55、K-89、Q-85、W-92、I-97、H-22、V-65、S-24、H-74、K-126、L-61、P-26、N-93、D-64、I-28、K-14、K-100、E-62、I-127、E-102、E-25、P-66、L-17、G-60、P-95、E-53、V-81、K-51、N-103、Q-2、N-46、E-42、T-91、D-87、N-10、M-111、C-8、H-124、I-68、P-79、K-109和R-128、D-129、H-11、H-30、S-1、K-77、Y-75、R-31、K-82、K-6、K-96、K-48、K-55、K-89、Q-85、W-92、I-97、H-22、V-65、S-24、H-74、K-126、L-61、P-26、N-93、D-64、I-28、K-14、K-100、E-62、I-127、E-102、E-25、P-66、L-17、G-60、P-95、E-53、V-81、K-51、N-103、Q-2、N-46、E-42、T-91、D-87、N-10、M-111、C-8、H-124、I-68、P-79、K-109、K-15。
DNA改組(shuffling)
根據(jù)本發(fā)明的重組變態(tài)反應(yīng)原突變體可以用從相關(guān)天然DNA的DNA改組(分子培育)獲得的DNA來生產(chǎn)。DNA改組可根據(jù)在Punnonen等人(參考文獻(xiàn)25)的文章所公開的程序以及其中提到的文章中公開的程序來實(shí)施，這些程序在此處引用作為參考。
診斷測定此外，根據(jù)本發(fā)明的重組變態(tài)反應(yīng)原突變體具有診斷可能性和優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)前領(lǐng)域中的變態(tài)反應(yīng)疫苗基于天然存在的變態(tài)反應(yīng)原來源的提取物，因而代表了多種同種型。變態(tài)反應(yīng)個(gè)體最初針對(duì)一種或多種存在的同種型過敏并產(chǎn)生IgE。由于同源性及隨后與使個(gè)體發(fā)生變態(tài)反應(yīng)的同種型的交叉反應(yīng)性，一些同種型關(guān)于變態(tài)反應(yīng)個(gè)體的變態(tài)反應(yīng)是相關(guān)的，然而其他同種型由于不具有任何變態(tài)反應(yīng)個(gè)體對(duì)其具有特異性IgE的IgE結(jié)合抗原決定部位而不相關(guān)。由于IgE群體特征性的異質(zhì)性，一些同種型因而可安全地給藥，即它們不導(dǎo)致經(jīng)由IgE的變態(tài)反應(yīng)，然而其他的同種型可能有害地導(dǎo)致不良的副作用。
因而，打算治療性給藥的本發(fā)明的突變體和本發(fā)明的組合物也可被用作體內(nèi)或體外診斷測定以監(jiān)控使用這種突變體或組合物進(jìn)行治療的適當(dāng)性、安全性或結(jié)果。應(yīng)用的診斷樣品包括人體樣品，如血清。
因而，本發(fā)明也涉及用根據(jù)本發(fā)明的重組變態(tài)反應(yīng)原突變體或根據(jù)本發(fā)明的組合物來估計(jì)對(duì)被試者的治療的適當(dāng)性、安全性或結(jié)果的診斷測定，其中將被試者的含IgE的樣品與該突變體或該組合物混合并估計(jì)該樣品中或該突變體中IgE之間的反應(yīng)性的水平。對(duì)該樣品中或該突變體中IgE之間的反應(yīng)性的水平的估計(jì)可用任何已知的免疫測定來實(shí)施。
定義在本發(fā)明中，表達(dá)“與該天然存在的變態(tài)反應(yīng)原的IgE結(jié)合能力相比減少特異性IgE結(jié)合能力”指在至少一個(gè)免疫測定中，該減少是以統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的方式(p＜0.05)可測量的，其中的免疫測定應(yīng)用來自對(duì)天然存在的變態(tài)反應(yīng)原發(fā)生變態(tài)反應(yīng)的被試者的血清。優(yōu)選，IgE結(jié)合能力減少了至少5％，更優(yōu)選至少10％。
表達(dá)“表面暴露的氨基酸”指氨基酸殘基這樣位于三維結(jié)構(gòu)的表面當(dāng)變態(tài)反應(yīng)原在溶液中時(shí)，氨基酸殘基的至少一個(gè)原子的至少一部分可接觸周圍溶劑。優(yōu)選，在三維結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基具有至少20％的溶劑(水)可接近性，適當(dāng)?shù)貫橹辽?0％，更適當(dāng)?shù)貫橹辽?0％且最優(yōu)選地為至少50％。
表達(dá)“溶劑可接近性”定義為對(duì)具有與溶劑分子相當(dāng)半徑的球體(水，r＝1.4)是可接近的分子面積。
表達(dá)“表面暴露的”和“溶劑暴露的”可互換使用。
表達(dá)“天然存在的變態(tài)反應(yīng)原所源自的分類學(xué)物種”指分類學(xué)系統(tǒng)中的物種。
此外，表達(dá)“該變態(tài)反應(yīng)原突變體具有與該天然存在的變態(tài)反應(yīng)原基本相同的α-碳主鏈三級(jí)結(jié)構(gòu)”指當(dāng)比較結(jié)構(gòu)時(shí)，對(duì)原子坐標(biāo)的平均根均方偏差低于2。
在本發(fā)明中，表達(dá)“替換”指與天然存在的變態(tài)反應(yīng)原的氨基酸序列相比的氨基酸缺失、替換或加成。
本發(fā)明通過下面非限制性的實(shí)施例進(jìn)一步地進(jìn)行闡明。
實(shí)施例實(shí)施例1實(shí)施例1描述了具有1個(gè)或3個(gè)初級(jí)突變的重組變態(tài)反應(yīng)原突變體的制備。根據(jù)本發(fā)明的重組變態(tài)反應(yīng)原突變體，即包含至少4個(gè)初級(jí)突變的變態(tài)反應(yīng)原可用相同的程序來制備。
Fagales花粉變態(tài)反應(yīng)原中共同抗原決定部位的確定主要樺木花粉變態(tài)反應(yīng)原Bet v 1顯示與來自分類學(xué)相關(guān)的樹木花粉的主要變態(tài)反應(yīng)原有約90％的氨基酸序列一致性，即Fagales(例如榛子和角樹)和樺木花粉變態(tài)反應(yīng)患者常顯示對(duì)這些Bet v 1同源蛋白質(zhì)變態(tài)反應(yīng)交叉反應(yīng)性的臨床癥狀。
Bet v 1也顯示與在某些水果(例如蘋果和櫻桃)和蔬菜(例如芹菜和胡蘿卜)中存在的變態(tài)反應(yīng)蛋白質(zhì)有約50～60％的序列一致性，且有臨床證據(jù)顯示Bet v 1和這些食物相關(guān)的蛋白質(zhì)之間的變態(tài)反應(yīng)交叉反應(yīng)性。
另外，Bet v 1與一組稱為病原體相關(guān)的蛋白質(zhì)(PR-10)的植物蛋白質(zhì)享有顯著的序列一致性(20～40％)，然而對(duì)這些PR-10蛋白質(zhì)的變態(tài)反應(yīng)交叉反應(yīng)性沒有報(bào)道。
分子模型暗示因與Bet v 1結(jié)構(gòu)近乎相同，F(xiàn)agales和食物變態(tài)反應(yīng)原和PR-10蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)相近。
變態(tài)反應(yīng)性Bet v 1的交叉反應(yīng)性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)報(bào)道于(Gajhede等人1996，參考文獻(xiàn)17)，其中可以確定Bet v 1分子表面的3個(gè)區(qū)塊同已知的主要樹木花粉變態(tài)反應(yīng)原相同。因而，識(shí)別Bet v 1上這些區(qū)塊的任何IgE將能夠交叉反應(yīng)并結(jié)合到其他Fagales主要花粉變態(tài)反應(yīng)原上，從而引起變態(tài)反應(yīng)癥狀。對(duì)這3個(gè)共同區(qū)塊的確定是在將主要樹木花粉變態(tài)反應(yīng)原所有已知的氨基酸序列比對(duì)結(jié)合對(duì)報(bào)道于參考文獻(xiàn)17中的α-碳主鏈三級(jí)結(jié)構(gòu)所揭示的Bet v 1分子表面的分析之后進(jìn)行。另外，基于結(jié)合有抗體后被覆蓋的面積這些區(qū)塊界定為具有確定的最小尺寸(＞4002)。
用于定點(diǎn)突變的氨基酸殘基的選擇用于定點(diǎn)突變的氨基酸殘基選自存在于Bet v 1特異區(qū)域和共同區(qū)塊的殘基，因?yàn)閷?duì)這些殘基的修飾預(yù)期可影響其與來自大多數(shù)表現(xiàn)臨床樹木花粉變態(tài)反應(yīng)交叉反應(yīng)性的患者的血清IgE的結(jié)合。
各個(gè)區(qū)塊中每個(gè)氨基酸殘基溶劑暴露的相對(duì)方向和百分比基于其原子坐標(biāo)來計(jì)算。由于可能導(dǎo)致破壞結(jié)構(gòu)或缺乏抗體相互作用，而不認(rèn)為具有低程度的溶劑暴露(＜20％)的殘基與誘變相關(guān)。剩下的殘基根據(jù)其溶劑暴露的程度分級(jí)。
序列比對(duì)與所考察序列(Bet v 1 No.2801，WHO IUIS變態(tài)反應(yīng)原命名小組委員會(huì))同源的序列是通過BLAST檢索(Altschul等人，參考文獻(xiàn)18)在GenBank和EMBL序列數(shù)據(jù)庫中得來。將BLAST報(bào)告的概率小于0.1的所有序列進(jìn)行考察，且構(gòu)建含有不重復(fù)同源序列列表的列表。這些序列通過CLUSTAL W(Higgins等人，參考文獻(xiàn)19)進(jìn)行比對(duì)，且一致性百分比考慮了全部列表或單獨(dú)分類學(xué)相關(guān)的物種對(duì)序列中的每個(gè)位置進(jìn)行計(jì)算?？傆?jì)有122個(gè)序列與Bet v 1 No.2801同源，其中的57個(gè)序列源自分類學(xué)相關(guān)的物種。
編碼Bet v 1的基因的克隆通過酚抽提和LiCl沉淀從白樺(Betula verrucosa)花粉(Allergon，瑞典)制備RNA。Oligo(dT)-纖維素親和層析是在Eppendorph管中以分批方式進(jìn)行，且雙鏈的cDNA是用商品試劑盒(Amersham)合成。通過PCR擴(kuò)增編碼Bet v 1的DNA并克隆。簡單扼要地，PCR以cDNA作為模板進(jìn)行，其引物設(shè)計(jì)為分別在相應(yīng)于Bet v 1的氨基端和3’-非翻譯區(qū)的位置與cDNA的序列相配對(duì)。將引物在5’-端延長以包含限制酶切位點(diǎn)(NcoI和HindIII)以定向克隆入pKK233-2。
亞克隆入pMAL-c將編碼Bet v 1的基因隨后亞克隆入麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)融合載體pMAL-c(New England Biolabs)。將該基因通過PCR擴(kuò)增并在malE的框內(nèi)亞克隆以生成麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)(MBP)-Bet v 1蛋白質(zhì)融合操縱子，其中MBP和Bet v 1由因子Xa蛋白酶切割位點(diǎn)分隔，該位點(diǎn)被定位于當(dāng)切割后可恢復(fù)原來的Bet v 1氨基端序列的位置，如在參考文獻(xiàn)15中所描述。簡單扼要地，PCR以插入了Bet v 1的pKK233-3作為模板，且其引物分別相應(yīng)于蛋白質(zhì)的氨基-和羧基端。將接近啟動(dòng)子的引物在5’-端延長以包含在框內(nèi)編碼因子Xa蛋白酶切割位點(diǎn)的4個(gè)密碼子。將兩個(gè)引物都在5’-端延長以包含限制酶切位點(diǎn)(Kpn I)以進(jìn)行克隆。將編碼Bet v 1的基因用20個(gè)循環(huán)的PCR進(jìn)行亞克隆以減少PCR假象的頻率。
體外誘變體外誘變以插入了Bet v 1的重組pMAL-c作為模板經(jīng)過PCR進(jìn)行。每個(gè)突變體Bet v 1基因都是用4個(gè)引物由3次PCR來生成的。
合成2個(gè)包含每個(gè)突變的突變特異性寡核苷酸引物，每個(gè)DNA鏈對(duì)應(yīng)1個(gè)，參見圖1和2。用突變的核苷酸作為起始位點(diǎn)，兩個(gè)引物都在5’-端延長7個(gè)核苷酸，而在3’-端延長15個(gè)核苷酸。延長的核苷酸在序列上與實(shí)際區(qū)域的Bet v 1基因相同。
此外合成了2個(gè)通用引物(圖2標(biāo)為“全有義”和“全無義”)并用于所有突變體。這些引物長為15個(gè)核苷酸且在序列上與pMAL-c載體中Bet v 1的上游和下游約1千堿基對(duì)(kb)處區(qū)域的序列相應(yīng)。上游引物的序列衍生自有義鏈而下游引物的序列衍生自無義鏈，參見圖2。
基本根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行2個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)(Saiki等人1988，參考文獻(xiàn)20)，只進(jìn)行20次循環(huán)變溫以減少PCR假象的頻率。每個(gè)PCR反應(yīng)都使用插入了Bet v 1的pMAL-c作模板且一個(gè)突變特異的引物和一個(gè)通用引物形成有意義的組合。
在三重區(qū)塊突變體中引入4個(gè)氨基酸替換(Asn28Thr，Lys32Gln，Glu45Ser，Pro108Gly)如上所述按一步一步的方法進(jìn)行。首先，用插入了Bet v 1 No.2801、Bet v 1(Glu45Ser)、Bet v 1(Glu45Ser，Pro108Gly)的pMAL-c作為模板來分別引入Glu45Ser突變，然后是Pro108Gly突變，最后是Asn28Thr，Lys32Gln突變。
用瓊脂糖凝膠電泳和電洗脫及隨后的乙醇沉淀純化PCR產(chǎn)物。第三次PCR反應(yīng)使用來自前兩次PCR反應(yīng)產(chǎn)物的組合作為模板和兩個(gè)通?？蛇m用的引物來進(jìn)行。再次使用標(biāo)準(zhǔn)PCR的20次循環(huán)。將PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳和電洗脫及隨后的乙醇沉淀進(jìn)行純化，用限制性內(nèi)切酶(BsiW I/EcoR I)進(jìn)行切割，并定向地連接入用相同的酶限制酶切的插入了Bet v 1的pMAL-c中。
圖3表示所有9個(gè)Bet v 1突變的概述，其如下Thr10Pro、Asp25Gly、Asn28Thr+Lys32Gln、Glu45Ser、Asn47Ser、Lys55Asn、Glu60Ser(非區(qū)塊的)、Thr77Ala和Pro108Gly。也制備具有4個(gè)突變的額外的突變體(Asn28Thr、Lys32Gln、Glu45Ser、Pro108Gly)。在這些突變中，選擇5個(gè)以進(jìn)行進(jìn)一步的檢驗(yàn)Asn28Thr+Lys32Gln、Glu45Ser、Glu60Ser、Pro108Gly和三重區(qū)塊突變體Asn28Thr、Lys32Gln、Glu45Ser、Pro108Gly。
核苷酸測序?qū)et v 1編碼基因核苷酸序列的確定分別在亞克隆前后及隨后的體外誘變中進(jìn)行。
按照供應(yīng)商的建議，將來自10ml在補(bǔ)充了0.1g/l氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜至飽和的細(xì)菌培養(yǎng)物的質(zhì)粒DNA用Qiagen-tip20柱進(jìn)行純化并用測序酶(Sequenase)2.0型DNA測序試劑盒(USB)進(jìn)行測序。
重組Bet v 1和突變體的表達(dá)和純化如在參考文獻(xiàn)15中所述，將重組Bet v 1(Bet v 1 No.2801和突變體)在大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α中過量表達(dá)，融合到麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)上并純化。簡要地，使重組大腸桿菌細(xì)胞在37℃生長到436nm光密度為1.0，隨之Bet v 1融合蛋白質(zhì)的表達(dá)由添加IPTG來誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)后3小時(shí)通過離心來收集細(xì)胞，并重懸于裂解緩沖液中并用超聲斷裂。在超聲處理和額外的離心之后，通過直鏈淀粉親和層析分離重組的融合蛋白質(zhì)并隨后通過與因子Xa溫育來切割(參考文獻(xiàn)15)。在F Xa切割后，將重組Bet v 1用凝膠過濾來分離，且如果發(fā)現(xiàn)必要的話，進(jìn)行另一輪的直鏈淀粉親和層析以除去痕量的麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)。
將純化的重組Bet v 1超濾濃縮為約5mg/ml并貯存于4℃。純化的重組Bet v 1制備物的終產(chǎn)量為每升大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)物2～5mg。
純化的重組Bet v 1制備物經(jīng)銀染SDS-聚丙烯酰胺電泳后顯示單一的表現(xiàn)分子量為17.5kDa的條帶。N-末端的測序顯示預(yù)期的序列為衍生自cDNA核苷酸序列，且定量的氨基酸分析顯示預(yù)期的氨基酸組合物。
我們?cè)谇懊骘@示(參考文獻(xiàn)15)重組Bet v 1 No.2801與天然存在的Bet v 1在免疫化學(xué)上不能區(qū)別。
用兔多克隆抗體的免疫電泳以重組Bet v 1蛋白質(zhì)的形式生產(chǎn)了7個(gè)突變體Bet v 1并如上所述進(jìn)行了純化，然后檢驗(yàn)它們對(duì)多克隆兔抗體的反應(yīng)性，該抗體由對(duì)抗從樺木花粉中分離的Bet v 1而產(chǎn)生。當(dāng)在天然條件下經(jīng)免疫電泳(火箭線(rocket-line)免疫電泳)進(jìn)行分析時(shí)，兔抗體能夠沉淀所有的突變體，顯示這些突變體具有保守的α-碳主鏈三級(jí)結(jié)構(gòu)。
為了分析對(duì)人多克隆IgE反應(yīng)的作用，選擇了突變體Glu45Ser、Pro108Gly、Asn28Thr+Lys32Gln和Glu60Ser進(jìn)行進(jìn)一步的分析。
Bet v 1 Glu45Ser突變體位置45的谷氨酸顯示了高度的溶劑暴露(40％)，并定位于Fagales變態(tài)反應(yīng)原所共有的分子表面區(qū)塊(區(qū)塊I)。在一些Bet v1同源的PR-10蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)絲氨酸殘基占具位置45，這表示谷氨酸可被絲氨酸替換而不使α-碳主鏈三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變形。另外，由于沒有已知的Fagales變態(tài)反應(yīng)原序列在位置45具有絲氨酸，谷氨酸被絲氨酸替換則產(chǎn)生了一個(gè)非天然存在的Bet v 1分子。
用重組的Glu45Ser Bet v 1突變體進(jìn)行T細(xì)胞增殖測定該分析以如Spangfort等人1996a描述方法進(jìn)行。發(fā)現(xiàn)重組Betv 1 Glu45Ser突變體能夠誘導(dǎo)來自3種不同的樺木花粉變態(tài)反應(yīng)患者中的T細(xì)胞系的增殖，其刺激指數(shù)與重組體的和天然存在的情況相似。
重組的Glu45Ser Bet v 1的結(jié)晶和結(jié)構(gòu)確定重組G1u45Ser Bet v 1的晶體于25℃由蒸氣擴(kuò)散來生長，基本如在(Spangfort等人1996b，參考文獻(xiàn)21)中所述。將濃度為5mg/ml的Glu45Ser Bet v 1與相同體積的2.0M的硫酸銨、0.1M的檸檬酸鈉、1％(v/v)的二氧六環(huán)，pH6.0的溶液混合，并對(duì)100x體積的2.0M的硫酸銨、0.1M的檸檬酸鈉、1％(v/v)的二氧六環(huán)，pH6.0的溶液進(jìn)行平衡。平衡24小時(shí)之后，通過采用在參考文獻(xiàn)21中所描述的加晶種技術(shù)來誘導(dǎo)晶體生長，這里用重組的野生型Bet v 1作為晶種來源。
2個(gè)月后，收獲晶體并用如參考文獻(xiàn)21所述從Rigaku旋轉(zhuǎn)陽極生成的X-射線進(jìn)行分析，且該結(jié)構(gòu)用分子置換(molecularreplacement)來解決。
Bet v 1 Glu45Ser突變體的結(jié)構(gòu)突變的結(jié)構(gòu)作用通過生長三維Bet v 1 Glu45Ser蛋白質(zhì)晶體而陳述，當(dāng)用旋轉(zhuǎn)陽極生成的X-射線進(jìn)行分析時(shí)該晶體衍射為3.0的分辨率。位置45上谷氨酸到絲氨酸的替換通過Bet v 1 Glu45Ser的結(jié)構(gòu)電子密度圖象證實(shí)，該圖象也顯示總的α-碳主鏈三級(jí)結(jié)構(gòu)保守。
Bet v 1 Glu45Ser突變體的IgE結(jié)合性質(zhì)在液相IgE抑制測定中比較Bet v 1 Glu45Ser突變體與重組Betv 1的IgE結(jié)合性質(zhì)，該測定使用衍生自樺木變態(tài)反應(yīng)患者的血清IgE庫。
重組Bet v 1 no.2801以摩爾比為1∶5進(jìn)行生物素化(Bet v 1 no.2801生物素)。抑制測定進(jìn)行如下將血清樣品(25μl)與固相抗IgE溫育，洗滌，重懸并進(jìn)一步在生物素化的Bet v 1 no.2801(3.4nM)和給定的突變體(0～28.6nM)的混合物中溫育。結(jié)合到固相的生物素化的Bet v 1 no.2801的量通過在用丫啶酯(acridiniumester)標(biāo)記的鏈酶抗生物素溫育后測量RLU來估計(jì)。抑制的程度計(jì)算為用緩沖液和突變體作為抑制備物所獲得的RLU的比率。
圖4表示由非生物素化的Bet v 1和Bet v 1 Glu45Ser突變體抑制生物素化的重組Bet v 1對(duì)來自變態(tài)反應(yīng)患者庫的血清IgE的結(jié)合。
對(duì)存在于血清庫中的血清IgE的結(jié)合達(dá)到50％的抑制所必需的各種重組蛋白質(zhì)的量有明顯的差別。重組Bet v 1在約6.5ng即達(dá)到了50％的抑制，而相應(yīng)的Bet v 1 Glu45Ser突變體的濃度為約12ng。這顯示在Bet v 1 Glu45Ser突變體中引入的點(diǎn)突變以約2的系數(shù)降低了特異性血清IgE的親和力。由Bet v 1 Glu45Ser突變體達(dá)到的最高抑制水平與重組Bet v 1相比明顯較低。這可能顯示在Glu45Ser替換之后，一些存在于血清庫中的特異性IgE不能識(shí)別Bet v 1Glu45Ser突變體。
Bet v 1突變體Asn28Thr+Lys32Gln位置28和32的天冬氨酸和賴氨酸分別顯示了高度的溶劑暴露(分別為35％和50％)，并位于Fagales變態(tài)反應(yīng)原所共同的分子表面區(qū)塊(區(qū)塊II)。在結(jié)構(gòu)中，天冬氨酸28和賴氨酸32相互靠近地位于分子表面，且極可能通過氫鍵相互作用。在一些與Bet v 1同源的PR-10蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)蘇氨酸和谷氨酸殘基分別占具位置28和32，這表明天冬氨酸和賴氨酸可分別被蘇氨酸和谷氨酸替換而不使α-碳主鏈三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變形。另外，由于沒有已知的天然發(fā)生的異變態(tài)反應(yīng)原序列在位置28和32分別具有蘇氨酸和谷氨酸，則這些替換產(chǎn)生了一個(gè)非天然存在的Bet v 1分子。
Bet v 1突變體Asn28Thr+Lys32Gln的IgE結(jié)合性質(zhì)在液相IgE抑制測定中比較突變體Asn28Thr+Lys32Gln與重組Bet v 1的IgE結(jié)合性質(zhì)，該測定使用上述衍生自樺木變態(tài)反應(yīng)患者的血清IgE庫。
圖5表示由非生物素化的Bet v 1和由Bet v 1突變體Asn28Thr+Lys32Gln抑制生物素化的重組Bet v 1與來自變態(tài)反應(yīng)患者庫的血清IgE的結(jié)合。
對(duì)存在于血清庫中的血清IgE的結(jié)合達(dá)到50％的抑制所必需的各種重組蛋白質(zhì)的量有明顯的差別。重組Bet v 1在約6.5ng即達(dá)到了50％的抑制，而相應(yīng)的Bet v 1突變體Asn28Thr+Lys32Gln的濃度為約12ng。這顯示在Bet v 1突變體Asn28Thr+Lys32Gln中引入的點(diǎn)突變以約2倍的系數(shù)降低其特異性血清IgE的親和力。
由Bet v 1突變體Asn28Thr+Lys32Gln達(dá)到的最高抑制水平與重組Bet v 1相比明顯較低。這可能顯示在Asn28Thr+Lys32Gln替換之后，一些存在于血清庫中的特異性IgE不能識(shí)別Bet v 1突變體Asn28Thr+Lys32Gln。
Bet v 1突變體Pro108Gly位置108的脯氨酸顯示了高度的溶劑暴露(60％)，并位于Fagales變態(tài)反應(yīng)原所共同的分子表面區(qū)塊(區(qū)塊III)。在一些與Betv 1同源的PR-10蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)甘氨酸殘基占具位置108，這表明脯氨酸可被甘氨酸替換而不使α-碳主鏈三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變形。另外，由于沒有已知的異變態(tài)反應(yīng)原序列在位置108具有甘氨酸，脯氨酸被甘氨酸的替換則產(chǎn)生一個(gè)非天然存在的Bet v 1分子。
Bet v 1 Pro108Gly突變體的IgE結(jié)合性質(zhì)在液相IgE抑制測定中比較Bet v 1 Pro108Gly突變體與重組Betv 1的IgE結(jié)合性質(zhì)，該測定使用上述衍生自樺木變態(tài)反應(yīng)患者的血清IgE庫。
圖6表示由非生物素化的Bet v 1和由Bet v 1 Pro108Gly突變體抑制生物素化的重組Bet v 1與來自變態(tài)反應(yīng)患者庫的血清IgE的結(jié)合。
對(duì)存在于血清庫中的血清IgE的結(jié)合達(dá)到50％的抑制所必需的各個(gè)重組蛋白質(zhì)的量有明顯的差別。重組Bet v 1在約6.5ng即達(dá)到了50％的抑制，而相應(yīng)的Bet v 1 Pro108Gly突變體的濃度為約15ng。這顯示在Bet v 1 Pro108Gly突變體中引入的點(diǎn)突變以約2倍的系數(shù)降低了特異性血清IgE的親和力。
由Bet v 1 Pro108Gly突變體達(dá)到的最高抑制水平與重組Bet v 1相比明顯較低。這可能顯示在Pro108Gly替換之后，一些存在于血清庫中的特異性IgE不能識(shí)別Bet v 1 Pro108Gly突變體。
Bet v 1突變體Glu60Ser(非區(qū)塊突變體)位置60的谷氨酸顯示了高度的溶劑暴露(60％)，然而它不位于Fagales變態(tài)反應(yīng)原所共同的分子表面區(qū)塊內(nèi)。在一些與Bet v 1同源的PR-10蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)絲氨酸殘基占具位置60，這表明谷氨酸可被絲氨酸替換而不使α-碳主鏈三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變形。另外，由于沒有已知的異變態(tài)反應(yīng)原序列在位置60具有絲氨酸，谷氨酸被絲氨酸的替換則產(chǎn)生一個(gè)非天然存在的Bet v 1分子。
Bet v 1 Glu60Ser突變體的IgE結(jié)合性質(zhì)在液相IgE抑制測定中比較Bet v 1 Glu60Ser突變體與重組Betv 1的IgE結(jié)合性質(zhì)，該測定使用上述衍生自樺木變態(tài)反應(yīng)患者的血清IgE庫。
圖7表示由非生物素化的Bet v 1和由Bet v 1 Glu60Ser突變體抑制生物素化的重組Bet v 1與來自變態(tài)反應(yīng)患者庫的血清IgE的結(jié)合。與Glu45Ser、Pro108Gly和Asn28Thr+Lys32Gln突變體相反，谷氨酸60到絲氨酸的替換不顯示對(duì)IgE結(jié)合性質(zhì)有任何顯著的作用。這顯示在定義的Fagales共同區(qū)塊之外的替換對(duì)特異性血清IgE的結(jié)合僅具有少量作用，這支持了保守的變態(tài)反應(yīng)原分子表面包含主要IgE結(jié)合抗原決定部位的概念。
Bet v 1三重區(qū)塊突變體在三重區(qū)塊突變體中，將如上所述在3個(gè)不同的共同F(xiàn)agales區(qū)塊引入的點(diǎn)突變(Glu45Ser、Asn28Thr+Lys32Gln和Pro108Gly)同時(shí)引入以造成具有4個(gè)氨基酸替換的人工突變體。
Bet v 1三重區(qū)塊突變體的結(jié)構(gòu)分析純化的Bet v 1三重區(qū)塊突變體的結(jié)構(gòu)完整性用圓二色(CD)譜學(xué)分析。圖8顯示以近乎相同的濃度記錄的重組的和三重區(qū)塊突變體的CD譜。來自2個(gè)重組蛋白質(zhì)的CD譜中峰幅和位置的交迭顯示2種制備物含有等量的二級(jí)結(jié)構(gòu)，這強(qiáng)有力地暗示α-碳主鏈三級(jí)結(jié)構(gòu)沒有受到引入的氨基酸替換的影響。
Bet v 1三重區(qū)塊突變體的IgE結(jié)合性質(zhì)在液相IgE抑制測定中比較Bet v 1三重區(qū)塊突變體與重組Bet v1的IgE結(jié)合性質(zhì)，該測定使用上述衍生自樺木變態(tài)反應(yīng)患者的血清IgE庫。
圖9表示由非生物素化的Bet v 1和由Bet v 1三重區(qū)塊突變體抑制生物素化的重組Bet v 1與來自變態(tài)反應(yīng)患者庫的血清IgE的結(jié)合。與上述的單獨(dú)的突變體相反，三重區(qū)塊突變體抑制曲線相對(duì)于重組體不再平行。這顯示在三重區(qū)塊突變體中引入的替換與重組體相比改變了IgE結(jié)合性質(zhì)和抗原決定部位的外形。平行性的缺乏使得很難定量三重區(qū)塊突變體對(duì)特異性血清IgE親和力的降低。
重組Bet v 1在約6ng即達(dá)到了50％的抑制，而相應(yīng)的Bet v 1三重區(qū)塊突變體的濃度為約30ng，即親和力以系數(shù)5倍降低。然而，為了達(dá)到80％的抑制，相應(yīng)的值分別為20ng和400ng，即以系數(shù)20降低。
用重組Bet v 1三重區(qū)塊突變體進(jìn)行T細(xì)胞增殖測定該分析以如參考文獻(xiàn)15中所述方法實(shí)施。發(fā)現(xiàn)重組Bet v 1三重區(qū)塊突變體能夠誘導(dǎo)來自3個(gè)不同的樺木花粉變態(tài)反應(yīng)患者中的T細(xì)胞系的增殖，其刺激指數(shù)與重組體的和天然存在的情況相似。這暗示三重區(qū)塊突變體可以起始抗體生產(chǎn)所必需的細(xì)胞免疫反應(yīng)。
實(shí)施例2實(shí)施例2描述了具有1個(gè)初級(jí)突變的重組變態(tài)反應(yīng)原突變體的制備。根據(jù)本發(fā)明的重組變態(tài)反應(yīng)原突變體，即包含至少4個(gè)初級(jí)突變的變態(tài)反應(yīng)原可用相同的程序來制備。
Vespula Vulgaris毒液主要變態(tài)反應(yīng)原抗原5中共同抗原決定部位的確定抗原5是3個(gè)黃蜂毒液蛋白質(zhì)之一，它們是已知的人變態(tài)反應(yīng)原。黃蜂包括大黃蜂類、小黃蜂和黃蜂。另外2個(gè)已知的黃蜂毒液變態(tài)反應(yīng)原是磷脂酶A1和透明質(zhì)酸酶。來自Vespula Vulgaris(Ves v5)的抗原5已在酵母體系中被克隆及表達(dá)為重組蛋白質(zhì)(Monsalve等人1999，參考文獻(xiàn)22)。最近已經(jīng)以1.8的分辨率確定重組Vesv 5的三維晶體結(jié)構(gòu)(準(zhǔn)備中)。該結(jié)構(gòu)的主要特征由4個(gè)β-鏈和4個(gè)α-螺旋排列在3個(gè)堆積層形成“α-β-α三明治”組成。在來自不同黃胡蜂屬(Vespula)物種的抗原5同源變態(tài)反應(yīng)原之間的序列一致性為約90％，這暗示存在保守的分子表面區(qū)域和B細(xì)胞抗原決定部位。
如前文對(duì)3個(gè)花粉變態(tài)反應(yīng)原的描述，共同區(qū)塊的存在和確定在對(duì)黃胡蜂屬抗原5變態(tài)反應(yīng)原所有已知的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)結(jié)合對(duì)由Ves v 5的三維結(jié)構(gòu)揭示的抗原5的分子表面分析之后進(jìn)行。圖10顯示單獨(dú)比對(duì)的抗原5殘基的溶劑可接近性及黃胡蜂屬抗原5序列的比對(duì)(左圖版)。在圖10的右圖版顯示了黃胡蜂屬抗原5的分子表面，其中有色區(qū)域表示保守區(qū)。
用于定點(diǎn)突變的氨基酸戎基的選擇用于定點(diǎn)突變的氨基酸殘基選自存在于黃胡蜂屬共同區(qū)塊的殘基，這是因?yàn)閷?duì)這些殘基的修飾預(yù)期可影響血清IgE的結(jié)合，這些血清IgE來自大多數(shù)表現(xiàn)臨床黃胡蜂屬變態(tài)反應(yīng)交叉反應(yīng)性的患者。
各個(gè)區(qū)塊中每個(gè)氨基酸殘基溶劑暴露的相對(duì)方向和百分比基于其原子坐標(biāo)來計(jì)算。由于可能的結(jié)構(gòu)破壞或缺乏抗體相互作用，而不認(rèn)為具有低程度溶劑暴露的殘基適用于誘變。剩下的殘基根據(jù)它們?nèi)軇┍┞兜某潭葋矸旨?jí)。
編碼Ves v 5的基因的克隆總RNA以如在(Fang等人1988，參考文獻(xiàn)23)中所描述的方法從Vespula Vulgaris黃蜂的毒液酸腺中分離。
第一鏈cDNA的合成、PCR擴(kuò)增和Ves v 5基因的克隆以如(Lu等人1993，參考文獻(xiàn)24)中所述方法進(jìn)行。
亞克隆入pPICZαA將編碼Ves v 5的基因隨后亞克隆入pPICZαA載體中(Invitrogen)以得到Ves v 5在畢赤巴斯德酵母(pichia pastoris)中的分泌表達(dá)。將該基因通過PCR擴(kuò)增并以同啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α-因子分泌信號(hào)的編碼序列框相匹配地亞克隆。在該構(gòu)建體中，α-因子在蛋白質(zhì)分泌期間將由畢赤巴斯德酵母Kex2蛋白酶體系在體內(nèi)。
簡單扼要地，PCR以Ves v 5作為模板的，其引物分別相應(yīng)于蛋白質(zhì)的氨基-和羧基端。將引物在5’-端延長以分別包含用于克隆的限制酶切位點(diǎn)EcoR I和Xba I。編碼Kex2切割位點(diǎn)的核苷酸在這個(gè)構(gòu)建體中位于蛋白質(zhì)氨基端上游18個(gè)核苷酸處，導(dǎo)致Ves v 5在氨基末端具有6個(gè)額外的氨基酸Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Phe的表達(dá)。
將pPICZαA-Ves v 5插入到畢赤巴斯德酵母中插入了Ves v 5基因的pPICZαA載體經(jīng)過Sac I限制酶切而線性化并插入到畢赤巴斯德酵母基因組的AOX1座位。插入是依照Invitrogen的建議通過在畢赤巴斯德酵母KM71細(xì)胞中同源重組而進(jìn)行。
體外誘變體外誘變以插入了Ves v 5的重組pPICZαA作為模板經(jīng)過PCR進(jìn)行。每個(gè)突變體Ves v 5基因都使用4個(gè)引物由3次PCR來生成。
合成2個(gè)包含每種突變的突變特異性寡核苷酸引物，每個(gè)DNA鏈對(duì)應(yīng)1個(gè)，參見圖11和12。用突變的核苷酸作為起始位點(diǎn)，兩個(gè)引物都在5’-端延長了6-7個(gè)核苷酸，而在3’-端延長了12-13個(gè)核苷酸。延長的核苷酸在序列上與實(shí)際區(qū)域的Ves v 5基因相同。
此外合成了2個(gè)通用的引物(圖12標(biāo)為“全有義”和“全無義”)并用于所有突變體。為了確保具有原氨基末端的Ves v 5突變體的表達(dá)，相應(yīng)于蛋白質(zhì)氨基末端的一個(gè)引物在5’-端延長了一個(gè)Xho I位點(diǎn)。當(dāng)Ves v 5突變體基因插入到pPICZαA載體中時(shí)，在Ves v 5的氨基末端上游直接就再生了Kex2蛋白酶的切割位點(diǎn)。第二個(gè)引物在序列上相應(yīng)于pPICZαA載體中位于Ves v 5基因下游約300bp的區(qū)域。相應(yīng)于Ves v 5的氨基末端的引物序列衍生自有義鏈而下游引物的序列衍生自無義鏈，參見圖11。
基本根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行了2個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)(Saiki等人1988)，只是進(jìn)行20次循環(huán)變溫以減少PCR假象的頻率。每個(gè)PCR反應(yīng)都使用插入了Ves v 5的ppICZαA作為模板且一個(gè)突變特異性的引物和一個(gè)通用的引物形成有意義的組合。
將PCR產(chǎn)物用“Concert，Rapid PCR Purification System”(Life Technologies)進(jìn)行純化。第三次PCR反應(yīng)使用來自前兩次PCR產(chǎn)物的組合作為模板和兩個(gè)通?？蛇m用的引物來進(jìn)行。再次使用標(biāo)準(zhǔn)PCR的20次循環(huán)。將PCR產(chǎn)物用“Concert，Rapid PCRPurification System”(Life Technologies)進(jìn)行純化，用限制性內(nèi)切酶(XhoI/XbaI)進(jìn)行切割，并定向地連接入用相同的酶限制酶切的pPICZαA載體中。圖13表示所有Ves v 5突變的概況。
將nPICZαA-Ves v 5突變體插入到畢赤巴斯德酵母中插入了Ves v 5突變體基因的pPICZαA載體經(jīng)過Sac I限制酶切而線性化并插入到畢赤巴斯德酵母基因組的AOX1座位。插入依照Invitrogen的建議通過在畢赤巴斯德酵母KM71細(xì)胞中同源重組而進(jìn)行。
核苷酸測序Ves v 5編碼基因核苷酸序列的確定分別在亞克隆前后及隨后的體外誘變中進(jìn)行。
按照供應(yīng)商的建議，將來自10ml在補(bǔ)充了0.1g/l氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜至飽和的細(xì)菌培養(yǎng)物的質(zhì)粒DNA用Qiagen-tip20柱進(jìn)行純化并用測序酶(Sequenase)2.0型DNA測序試劑盒(USB)進(jìn)行測序。
重組Ves v 5的表達(dá)和純化畢赤巴斯德酵母菌株KM71的重組酵母細(xì)胞在30℃于定軌搖床，225rpm，在500ml的瓶中生長直到A600nm為4-6，瓶中含有100ml包含酵母氮堿、生物素、甘油和組氨酸的pH6.0的磷酸緩沖液。細(xì)胞經(jīng)離心收集，并重懸于10mL的相似的用甲醇替換了甘油的緩沖培養(yǎng)基中。于30℃繼續(xù)溫育7天，每天添加0.05ml甲醇。
細(xì)胞經(jīng)離心收獲，且收集的培養(yǎng)物流體通過超濾來濃縮。在對(duì)50mM的醋酸銨緩沖液，pH4.6透析之后，將樣品應(yīng)用于在相同緩沖液中平衡的FPLC(Pharmacia)SE-53陽離子交換柱。該柱用0-1.0M的NaCl，50mM醋酸銨線性梯度進(jìn)行洗脫。收集在約0.4M的NaCl洗脫出的重組Ves v 5峰并對(duì)0.02N的乙酸進(jìn)行透析。在濃縮到約為10mg/ml之后，將純化的Ves v 5保存于4℃。
重組Ves v 5的結(jié)晶Ves v 5的晶體于25℃用蒸氣擴(kuò)散技術(shù)來生長。為了結(jié)晶，將5μl 5mg/ml的Ves v 5與5μl含18％的PEG 6000、0.1M的檸檬酸鈉，pH6.0的溶液混合，并對(duì)1ml含18％的PEG 6000、0.1M的檸檬酸鈉，pH6.0的溶液進(jìn)行平衡。
X-射線衍射數(shù)據(jù)于100K從天然Ves v 5晶體及插入重原子衍生物之后收集，并用于解析Ves v 5的三維結(jié)構(gòu)，參見圖10(原稿在準(zhǔn)備中)。
用兔多克隆抗體的免疫電泳以重組Ves v 5蛋白質(zhì)的形式生產(chǎn)2個(gè)Ves v 5突變體并檢驗(yàn)了它們對(duì)多克隆兔抗體的反應(yīng)性，該抗體是對(duì)抗重組Ves v 5而產(chǎn)生的。當(dāng)在天然條件下經(jīng)火箭免疫電泳進(jìn)行分析時(shí)，兔抗體能夠沉淀重組Ves v 5以及兩種突變體，顯示這些突變體具有保守的α-碳主鏈三級(jí)結(jié)構(gòu)。
特異性血清IgE的抑制在液相IgE抑制測定中比較Ves v 5突變體與重組Ves v 5的IgE結(jié)合性質(zhì)，該測定使用衍生自黃蜂毒液變態(tài)反應(yīng)患者的血清IgE庫。
抑制測定如上文所述用生物素化的重組Ves v 5代替Bet v 1進(jìn)行。
Ves v 5 Lys72Ala突變體位置72的賴氨酸顯示高度的溶劑暴露(70％)，并位于黃胡蜂屬抗原5所共同的分子表面區(qū)塊。溶劑暴露的相對(duì)方向和高程度的溶劑暴露說明賴氨酸72可被丙氨酸殘基替換而不使α-碳主鏈三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變形。另外，由于沒有已知的異變態(tài)反應(yīng)原序列在位置72具有丙氨酸，賴氨酸被丙氨酸的替換則產(chǎn)生了一個(gè)非天然存在的Ves v 5分子。
Ves v 5 Lys72Ala突變體的IgE結(jié)合性質(zhì)在液相IgE抑制測定中比較Ves v 5 Lys72Ala突變體與重組Vesv 5的IgE結(jié)合性質(zhì)，該測定使用上述衍生自樺木變態(tài)反應(yīng)患者的血清IgE庫。
圖14表示由非生物素化的Ves v 5和Ves v 5 Lys72Ala突變體抑制生物素化的重組Ves v 5與來自變態(tài)反應(yīng)患者庫的血清IgE的結(jié)合。
對(duì)存在于血清庫中的血清IgE的結(jié)合達(dá)到50％的抑制所必需的各個(gè)重組蛋白質(zhì)的量有明顯的差別。重組Ves v 5在約6ng即達(dá)到了50％的抑制，而相應(yīng)的Ves v 5 Lys72Ala突變體的濃度為40ng。這顯示在Ves v 5 Lys72Ala突變體中引入的點(diǎn)突變以約6倍的系數(shù)降低了特異性血清IgE的親和力。由Ves v 5 Lys72Ala突變體達(dá)到的最高抑制水平與重組Ves v 5相比明顯較低。這可能顯示在Lys72Ala替換之后，一些存在于血清庫中的特異的IgE不能識(shí)別Ves v 5 Lys72Ala突變體。
Ves v 5 Tyr96Ala突變體位置96的酪氨酸顯示了高度的溶劑暴露(65％)，并位于黃胡蜂屬抗原5所共同的分子表面區(qū)塊。溶劑暴露的相對(duì)方向和高的溶劑暴露程度表明酪氨酸96可被丙氨酸殘基替換而不使α-碳主鏈三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變形。另外，由于沒有已知的異變態(tài)反應(yīng)原序列在位置96具有丙氨酸，酪氨酸被丙氨酸的替換則產(chǎn)生了一個(gè)非天然存在的Ves v5分子。
Ves v 5 Tyr96Ala突變體的IgE結(jié)合性質(zhì)在液相IgE抑制測定中比較Ves v 5 Tyr96Ala突變體與重組Vesv 5的IgE結(jié)合性質(zhì)，該測定使用上述衍生自樺木變態(tài)反應(yīng)患者的血清IgE庫。
圖14表示由非生物素化的Ves v 5和由Ves v 5 Tyr96Ala突變體抑制生物素化的重組Ves v 5與來自變態(tài)反應(yīng)患者庫的血清IgE的結(jié)合。
對(duì)存在于血清庫中的血清IgE的結(jié)合達(dá)到50％的抑制所必需的各個(gè)重組蛋白質(zhì)的量中有明顯的差別。重組Ves v 5在約6ng即達(dá)到了50％的抑制，而相應(yīng)的Ves v 5 Tyr96Ala突變體的濃度為40ng。
這顯示在Ves v 5 Tyr96Ala突變體中引入的點(diǎn)突變以約6倍的系數(shù)降低了特異性血清IgE的親和力。
由Ves v 5 Tyr96Ala突變體達(dá)到的最高抑制水平與重組Ves v 5相比明顯較低。這可能顯示在Tyr96Ala替換之后，一些存在于血清庫中的特異性IgE不能識(shí)別Ves v 5 Tyr96Ala突變體。
實(shí)施例3對(duì)用于替換的氨基酸的確定和選擇用溶劑可接近性和保守程度參數(shù)來確定和選擇適合于對(duì)變態(tài)反應(yīng)原Bet v 1、Der p 2和Ves v 5進(jìn)行替換的表面暴露的氨基酸。
溶劑可接近性溶劑可接近性用軟件InsightII版本97.0(MSI)和1.4的探測半徑來計(jì)算。
通過使用軟件PASS(推定的球體活性位點(diǎn))以探針充滿而從分析中排除內(nèi)部腔。隨后手動(dòng)去除表面的探針。
保守性Bet v 13-D結(jié)構(gòu)基于訪問號(hào)Z80104(1bv1.pdb)。
包括在保守殘基分析中的38個(gè)其他的Bet v 1序列包含訪問號(hào)P15494＝X15877＝Z80106、Z80101、AJ002107、Z72429、AJ002108、Z80105、Z80100、Z80103、AJ001555、Z80102、AJ002110、Z72436、P43183＝X77271、Z72430、AJ002106、P43178＝X77267、P43179＝X77268、P43177＝X77266、Z72438、P43180＝X77269、AJ001551、P43185＝X77273、AJ001557、Z72434、AJ001556、Z72433＝P43186、AJ001554、X81972、Z72431、P45431＝X77200、P43184＝X77272、P43176＝X77265、S47250、S47251、Z72435、Z72439、Z72437、S47249。
Der p 23-D結(jié)構(gòu)基于訪問號(hào)P49278(1a9v.pdb)的。
包括在保守殘基分析中的6個(gè)其他的Der p 2序列包含下列替換ALK-GV40L、T47S、M111L、D114N。
ALK-101M76V。
ALK-102V40L、T47S。
ALK-104T47S、M111I、D114N。
ALK-113T47S。
ALK-120V40L、T47S、D114N。
Ves v 53-D結(jié)構(gòu)基于訪問號(hào)Q05110(pdb坐標(biāo)尚未發(fā)表)。
在保守殘基分析中的另一個(gè)Ves v 5序列含有一個(gè)氨基酸替換M202K。
結(jié)果Bet v 1高溶劑暴露的59個(gè)氨基酸K-129、E-60、N-47、K-65、P-108、N-159、D-93、K-123、K-32、D-125、R-145、D-109、T-77、E-127、Q-36、E-131、L-152、E-6、E-96、D-156、P-63、H-76、E-8、K-134、E-45、T-10、V-12、K-20、L-62、S-155、H-126、P-50、N-78、K-119、V-2、L-24、E-42、N-4、A-153、I-44、E-138、G-61、A-130、R-70、N-28、P-35、S-149、K-103、Y-150、H-154、N-43、A-106、K-115、P-14、Y-5、K-137、E-141、E-87、E-73。
高度溶劑暴露且保守(＞70％)的57個(gè)氨基酸K-129、E-60、N-47、K-65、P-108、N-159、D-93、K-123、K-32、D-125、R-145、D-109、E-127、Q-36、E-131、L-152、E-6、E-96、D-156、P-63、H-76、E-8、K-134、E-45、T-10、V-12、K-20、S-155、H-126、P-50、N-78、K-119、V-2、L-24、E-42、N-4、A-153、I-44、E-138、G-61、A-130、R-70、N-28、P-35、S-149、K-103、Y-150、H-154、N-43、A-106、K-115、P-14、Y-5、K-137、E-141、E-87、E-73。
進(jìn)行的23個(gè)突變Y5V、T10P、D25E、N28T、K32Q、E42S、E45S、N47S、K55N、K65N、T77A、N78K、E96L、K97S、K103V、P108G、D109N、K123I、D125Y、K134E、R145E、D156H、+160N。
表1以下降順序表示Bet v 1氨基酸的溶劑暴露程度的列表。第1列列出起始于氨基末端的氨基酸號(hào)碼，第2列以單字母縮寫列出了氨基酸，第3列列出正規(guī)化的溶劑暴露指數(shù)，第4列列出了已知序列在該位置具有保守氨基酸的百分?jǐn)?shù)。
表1Bet v 1NO AA Solv_exp Cons％129K1,000 9060E 0,986 9747N 0,979 10065K 0,978 100108P0,929 100159N0,869 10093D 0,866 100123K0,855 10032K 0,855 100125D0,821 74145R0,801 90109D0,778 8277T 0,775 56
127E 0,760 10036Q0,749 95131E 0,725 100152L 0,718 976E 0,712 10096E0,696 100156D 0,693 9763P0,692 9776H0,683 908E 0,638 97134K 0,630 10045E0,623 10010T0,613 9712V0,592 10020K0,584 10062L0,575 5155S 0,568 97126H 0,551 9550P0,541 10078N0,538 100119K 0,529 1002V 0,528 10024L0,528 10042E0,519 1004N 0,517 95153A 0,513 10044I0,508 97138E 0,496 10061G0,488 100130A 0,479 9770R0,474 10028N0,469 9035P0,467 100149S 0,455 92103K 0,447 100150Y 0,438 100154H 0,436 10043N0,412 100106A 0,411 95115K 0,411 10014P0,410 975Y 0,410 100137K 0,396 100141E 0,387 9587E0,385 10073E0,384 10016A0,367 10079F0,362 1003F 0,355 100158Y 0,346 100105V 0,336 100101E 0,326 10064F0,325 10086I0,322 10039S0,314 100124G 0,310 10072D0,308 97
142T 0,2936766Y0,28910055K0,2881007T 0,2796740S0,2749525D0,27187135A 0,2679268K0,26210097K0,24710046G0,23510027D0,232971G 0,227100113I 0,2257751G0,22010092G0,21810080K0,212100110G 0,211100107T 0,2038594T0,2029241V0,2019748G0,19810091I0,1921831P0,18810075D0,1889733V0,18310049G0,17610017R0,17210099S0,1586489G0,15410053I0,154100121H 0,1531009T 0,1507274V0,14897132Q 0,1467257S0,13749148E 0,13510082N0,13341128V 0,12564117S 0,1248790P0,11767116I 0,112100122T 0,107100139M 0,1046295L0,1049754K0,096100146A 0,09510059P0,08897157A 0,088100133V 0,0774488G0,068100140G 0,0538537A0,0429581Y0,04110023I0,03695104I 0,03692
15A0,0369758F0,02910029L0,02810019F0,027100100N 0,0229722F0,0219771V0,014100111G 0,01410013I0,01410018L0,01497114L 0,01410011S0,007100151L 0,00797144L 0,0079052T0,00710084S0,00797118N 0,00797102I 0,00710021A0,0009726G0,0009730F0,0004434A0,00010038I0,0008756I0,00010067V0,0009769D0,0006283Y0,0009585V0,0007298I0,00095112S 0,00077120Y 0,00095136S 0,00067143L 0,000100147V 0,000100
Der p 2高度溶劑暴露的55個(gè)氨基酸R-128、D-129、H-11、H-30、S-1、K-77、Y-75、R-31、K-82、K-6、K-96、K-48、K-55、K-89、Q-85、W-92、I-97、H-22、V-65、S-24、H-74、K-126、L-61、P-26、N-93、D-64、I-28、K-14、K-100、E-62、I-127、E-102、E-25、P-66、D-114、L-17、G-60、P-95、E-53、V-81、K-51、N-103、Q-2、N-46、E-42、T-91、D-87、N-10、M-111、C-8、H-124、I-68、P-79、K-109、K-15。
高度溶劑暴露且保守(＞70％)的57個(gè)氨基酸R-128、D-129、H-11、H-30、S-1、K-77、Y-75、R-31、K-82、K-6、K-96、K-48、K-55、K-89、Q-85、W-92、I-97、H-22、V-65、S-24、H-74、K-126、L-61、P-26、N-93、D-64、I-28、K-14、K-100、E-62、I-127、E-102、E-25、P-66、L-17、G-60、P-95、E-53、V-81、K-51、N-103、Q-2、N-46、E-42、T-91、D-87、N-10、M-111、C-8、H-124、I-68、P-79、K-109、K-15。
進(jìn)行的6個(gè)突變K6A、K15E、H30N、E62S、H74N、K82N表2以下降順序表示Des p 2氨基酸的溶劑暴露程度的列表。第1列列出起始于氨基末端的氨基酸號(hào)碼，第2列以單字母縮寫列出氨基酸，第3列列出正規(guī)化的溶劑暴露指數(shù)，第4列列出了已知序列在該位置具有保守氨基酸的百分?jǐn)?shù)。
表2Der p 2NO AASolv_exp Cons％128R 1,000 100129D 0,965 10011H0,793 10030H0,712 1001S 0,700 10077K0,694 10075Y0,681 10031R0,677 10082K0,658 1006K 0,645 10096K0,643 100
48K0,64210055K0,64110089K0,62710085Q0,62410092W0,61010097I0,58110022H0,56810065V0,55910024S0,55710074H0,54210026K0,54210061L0,53910026P0,51610093N0,51310064D0,50910028I0,50410014K0,493100100K 0,48910062E0,454100127I 0,439100102E 0,42810025E0,42810066P0,427100114D 0,4185717L0,41210060G0,39010095P0,38810053E0,37710081V0,37710051K0,370100103N 0,3691002Q 0,36610046N0,36010042E0,35710091T0,34010087D0,33410010N0,333100111M 0,325718C 0,323100124H 0,31510068I0,31310079P0,307100109K 0,30710015K0,30210049T0,29210044N0,291100113D 0,29010063V0,286100105V 0,28010019P0,27010084Q0,26410076M0,262867D 0,251100116V 0,24410078C0,23810036Q0,23510045Q0,23310040V0,2235757S0,212100
38E 0,205 10069D 0,203 1009A 0,196 10071N 0,190 10098A 0,186 100115G0,180 10013I 0,179 100123T0,179 10034P 0,178 1004D 0,157 10020G 0,150 100107T0,143 10012E 0,137 10094V 0,137 100121I0,136 10083G 0,128 10070P 0,128 10073C 0,120 1003V 0,116 10035F 0,111 10059D 0,099 10029I 0,098 10023G 0,085 10054I 0,075 1005V 0,075 100101S0,074 10072A 0,069 10027C 0,060 10032G 0,059 10099P 0,058 10086Y 0,056 10016V 0,052 10050A 0,040 10090Y 0,039 10018V 0,035 10033K 0,033 10052I 0,029 10058I 0,029 100104V0,024 100112G0,023 10021C 0,023 10088I 0,023 100117L0,016 10056A 0,011 10041F 0,011 100120A0,006 100119C0,006 10067G 0,005 100122A0,005 10037L 0,000 10039A 0,000 10043A 0,000 10047T 0,000 2980L 0,000 100106V0,000 100108V0,000 100110V0,000 100118A0,000 100125A0,000 100
Ves v 5高度溶劑暴露的89個(gè)氨基酸K-16、K-185、K-11、K-44、K-210、R-63、K-13、F-6、K-149、K-128、E-184、K-112、K-202、F-157、E-3、K-29、N-203、N-34、K-78、K-151、L-15、L-158、Y-102、W-186、K-134、D-87、K-52、T-67、T-125、K-150、Y-40、Q-48、L-65、K-81、Q-101、Q-208、K-144、N-8、N-70、H-104、Q-45、K-137、K-159、E-205、N-82、A-111、D-131、K-24、V-36、N-7、M-138、T-209、V-84、K-172、V-19、D-56、P-73、G-33、T-106、M-170、L-28、T-43、Q-114、C-10、K-60、N-31、K-47、E-5、D-145、V-38、A-127、D-156、E-204、P-71、G-26、Y-129、D-141、F-201、R-68、N-200、D-49、S-153、K-35、S-39、Y-25、V-37、G-18、W-85、I-182。
高度溶劑暴露且保守(＞70％)的88個(gè)氨基酸K-16、K-185、K-11、K-44、K-210、R-63、K-13、F-6、K-149、K-128、E-184、K-1 12、F-157、E-3、K-29、N-203、N-34、K-78、K-151、L-15、L-158、Y-102、W-186、K-134、D-87、K-52、T-67、T-125、K-150、Y-40、Q-48、L-65、K-81、Q-101、Q-208、K-144、N-8、N-70、H-104、Q-45、K-137、K-159、E-205、N-82、A-111、D-131、K-24、V-36、N-7、M-138、T-209、V-84、K-172、V-19、D-56、P-73、G-33、T-106、M-170、L-28、T-43、Q-114、C-10、K-60、N-31、K-47、E-5、D-145、V-38、A-127、D-156、E-204、P-71、G-26、Y-129、D-141、F-201、R-68、N-200、D-49、S-153、K-35、S-39、Y-25、V-37、G-18、W-85、I-182。
進(jìn)行的9個(gè)突變K29A、T67A、K78A、V84S、Y102A、K112S、K144A、K202M、N203G表3以下降順序表示Ves v 5氨基酸的溶劑暴露程度的列表。第1列列出了起始于氨基末端的氨基酸號(hào)碼，第2列以單字母縮寫列出了氨基酸，第3列列出了正規(guī)化的溶劑暴露指數(shù)，第4列列出了已知序列在該位置具有保守氨基酸的百分?jǐn)?shù)。
表3Ves v 5NO AASolv_exp16K1,000100185K 0,98910011K0,97810044K0,978100210K 0,96210063R0,95610013K0,9511006F 0,868100149K 0,868100128K 0,857100184E 0,841100112K 0,824100202K 0,82450157F 0,8191003E 0,80210029K0,797100203N 0,79710034N0,77510078K0,775100151K 0,75310015L0,714100158L 0,714100102Y 0,687100186W 0,665100134K 0,65410087D0,62110052K0,61510067T0,610100125T 0,610100150K 0,60410040Y0,59310048Q0,59310065L0,59310081K0,588100101Q 0,577100208Q 0,566100144K 0,5601008N 0,55510070N0,549100104H 0,54910045Q0,538100137K 0,538100159K 0,533100205E 0,51110082N0,500100111A 0,500100131D 0,49510024K0,48910036V0,4891007N 0,484100138M 0,473100
209T 0,473 10084V0,462 100172K 0,451 10019V0,445 10056D0,445 10073P0,440 10033G0,429 100106T 0,429 100170N 0,429 10028L0,423 10043T0,423 100114Q 0,423 10010C0,412 10060K0,407 10031N0,396 10047K0,396 1005E 0,390 100145D 0,390 10038V0,379 100127A 0,379 100156D 0,379 100204E 0,374 10071P0,363 10026G0,352 100129Y 0,352 100141D 0,341 100201F 0,341 10068R0,335 100200N 0,308 10049D0,302 100153S 0,302 10035K0,297 10039S0,291 10025Y0,280 10037V0,280 10018G0,275 10085W0,275 100182I 0,275 10046E0,264 100126A 0,253 10088E0,247 10076P0,236 10079N0,236 100124S 0,236 10030P0,231 100123G 0,231 100162H 0,231 100183Q 0,231 10012I0,225 100197P 0,225 100130D 0,220 100148P 0,214 100180K 0,214 10023C0,209 10075P0,209 100113Y 0,209 100108R 0,203 100188K 0,203 10051L0,198 10059Q0,198 100
121L 0,198 100122T 0,198 100154G 0,192 10053E0,170 10072G0,170 10041G0,165 10086N0,165 100147N 0,165 100173E 0,165 10027S0,159 10094Q0,159 100187H 0,159 100142E 0,154 10064G0,148 10017G0,143 100133V 0,137 10042L0,121 100155N 0,121 10055N0,115 10091Y0,115 10069G0,110 100103G 0,110 100198S 0,110 100109D 0,093 100207Y 0,082 10096W0,077 100161G 0,077 100140E 0,071 100152F 0,071 10080M0,066 100117Q 0,066 1004A 0,060 10032C0,055 10090A0,055 100206L 0,055 10022A0,049 100110V 0,044 100146Y 0,044 10014C0,038 1009Y 0,033 10062A0,033 100132P 0,033 10057F0,027 10099Q0,027 100100C 0,027 100199G 0,027 10077A0,022 100105D 0,022 100119V 0,022 10020H0,016 10083L0,016 100120A 0,016 100139W 0,016 100176C 0,016 100178S 0,016 100181Y 0,016 10095V0,011 100115V 0,011 100116G 0,011 100165Q 0,011 100
169A 0,011 100189H 0,011 10066E0,005 10074Q0,005 10089L0,005 10092V0,005 10098N0,005 100118N 0,005 100168W 0,005 10021T0,000 10050I0,000 10054H0,000 10058R0,000 10061I0,000 10093A0,000 10097A0,000 100107C 0,000 100135L 0,000 100136V 0,000 100143V 0,000 100160T 0,000 100163Y 0,000 100164T 0,000 100166M 0,000 100167V 0,000 100171T 0,000 100174V 0,000 100175G 0,000 100177G 0,000 100179I 0,000 100190Y 0,000 100191L 0,000 100192V 0,000 100193C 0,000 100194N 0,000 100195Y 0,000 100196G 0,000 100
實(shí)施例4本實(shí)施例描述了制備和表征根據(jù)本發(fā)明的重組突變體Bet v 1變態(tài)反應(yīng)原，即包含至少4個(gè)初級(jí)突變且具有減小的IgE結(jié)合親和力的變態(tài)反應(yīng)原。
用于Bet v 1定點(diǎn)突變的氧基酸殘基的選擇Bet v 1的氨基酸殘基的溶劑可接近性如實(shí)施例3表1所示。氨基酸保守的比率基于用ClustalW算法以BLAST搜索在ExPaSyMolecular Biology Server(http//www.expasy.ch/)上進(jìn)行的序列比對(duì)，其中用Bet v 1.2801野生型氨基酸序列作為輸入序列。該比對(duì)包括來自Fagales目中物種(Bet v 1白樺(Betula verrucosa)；Carb 1樺葉鵝耳櫪(Carpinus betulus)；Cor a 1Corylus avellana；Aln g 1膠榿木(Alnus glutinosa))的67個(gè)變態(tài)反應(yīng)原序列(39個(gè)Bet v 1序列、11個(gè)Car b 1序列、6個(gè)Cor a 1序列和13個(gè)Aln g1序列)?？紤]到在實(shí)施例中顯示的突變重組Bet v 1變態(tài)反應(yīng)原，用于替換的目標(biāo)殘基基于≥95％的氨基酸一致性。
如在實(shí)施例1中所描述的，將來自相關(guān)物種的花粉變態(tài)反應(yīng)原之間具有高溶劑暴露程度的和高度保守性的氨基酸殘基選來用于定點(diǎn)突變。不認(rèn)為具有低溶劑暴露程度的(＜20％)殘基與誘變相關(guān)，這是由于可能的三級(jí)結(jié)構(gòu)破壞或抗體相互作用的缺乏。
引入的殘基都存在于一組稱為病理相關(guān)(PR-10)蛋白質(zhì)的植物蛋白質(zhì)同種型的相應(yīng)位置。分子模型暗示Fagales變態(tài)反應(yīng)原和PR-10蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)近乎相同。Bet v 1與PR-10蛋白質(zhì)共享顯著的序列一致性(20-40％)。然而，沒有對(duì)這些PR-10蛋白質(zhì)的變態(tài)反應(yīng)交叉反應(yīng)性的報(bào)道。因而，來自Bet v 1的高度保守和溶劑暴露的氨基酸與PR-10蛋白質(zhì)中相應(yīng)位置上的氨基酸的交換導(dǎo)致一個(gè)突變的Bet v 1蛋白質(zhì)，其α-碳主鏈三級(jí)結(jié)構(gòu)沒有改變但具有減小的IgE結(jié)合親和力。
體外誘變體外誘變用插入了Bet v 1的重組pMAL-c作為模板通過PCR來進(jìn)行。包含5～9個(gè)初級(jí)突變的重組變態(tài)反應(yīng)原突變體的制備包括兩個(gè)PCR步驟步驟I和步驟II。首先，分別用包含每個(gè)突變的有義和反義突變特異性寡核苷酸引物連同包含上游或下游臨近突變或Betv 1的N-末端/C-末端的有義和反義寡核苷酸引物，將單一的突變(或者幾個(gè)突變，如果它們?cè)贒NA序列中緊密靠在一起)引入到Bet v1.2801或Bet v 1.2801衍生物連續(xù)的DNA序列中，如在圖17中示意性闡明的(I)。其次，將來自PCR反應(yīng)I的PCR產(chǎn)物純化、混合并用作另外的PCR反應(yīng)(II)的模板，其寡核苷酸引物包含Bet v 1的N-末端和C-末端，如在圖17中示意性闡明的(II)。將PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳和PCR凝膠純化(Life Technologies)和隨后的乙醇沉淀進(jìn)行純化，用限制性內(nèi)切酶(Sac I/EcoR I)或(Sac I/Xba I)進(jìn)行切割，并定向地連接入用相同的酶限制酶切的pMAL-c中。
圖18表示合成的寡核苷酸引物和對(duì)構(gòu)建具有5～9個(gè)初級(jí)突變的Bet v 1突變體的示意性闡明。突變的氨基酸優(yōu)選地選自特征在于如實(shí)施例3所述具有高度溶劑暴露和保守性的氨基酸。Bet v 1突變體為如下在括弧中陳述的一次和二級(jí)突變突變體Bet v 1(2628)Tyr5Val、Glu45Ser、Lys65Asn、Lys97Ser、Lys134Glu。
突變體Bet v 1(2637)Ala16Pro、(Asn28Thr，Lys32Gln)、Lys103Thr、Pro108Gly、(Leu152Lys，Ala153Gly，Ser155Pro)。
突變體Bet v 1(2733)(Tyr5Val，Lys134Glu)、(Asn28Thr，Lys32Gln)、Glu45Ser、Lys65Asn、(Asn78Lys，Lys103Val)、Lys97Ser、Pro108Gly、Arg145Glu、(Asp156His，+160Asn)。
突變體Bet v 1(2744)Tyr5Val，Lys134Glu)、(Glu42Ser，Glu45Ser)、(Asn78Lys，Lys103Val)、Lys123Ile、(Asp156His，+160Asn)。
突變體Bet v 1(2753)(Asn28Thr，Lys32Gln)、Lys65Asn、(Glu96Leu，Lys97Ser)、(Pro108Gly，Asp109Asn)、(Asp125Tyr，Glu127Ser)、Arg145Glu。
核苷酸測序?qū)et v 1編碼基因核苷酸序列的確定分別在亞克隆前后及隨后的體外誘變中進(jìn)行。
按照供應(yīng)商的建議，將來自10ml在補(bǔ)充了0.1g/l氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜至飽和的細(xì)菌培養(yǎng)物的質(zhì)粒DNA用Qiagen-tip20柱進(jìn)行純化，并用均來自(Perkin Elmer)的快速反應(yīng)染料終止子循環(huán)測序試劑盒(Ready reaction dye terminator cycle sequencingkit)和熒光測序儀(Fluoresence Sequencer)AB PRISM 377進(jìn)行測序。
重組Bet v 1和突變體的表達(dá)和純化如在參考文獻(xiàn)15中所描述的，將重組Bet v 1(Bet v 1 No.2801和突變體)在大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α中過量表達(dá)，融合到麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)上并純化。簡要地，使重組的大腸桿菌細(xì)胞在37℃生長到600nm時(shí)光密度為0.8，隨之由添加IPTG來誘導(dǎo)Bet v1融合蛋白質(zhì)的表達(dá)。在誘導(dǎo)后3小時(shí)通過離心來收集細(xì)胞，重懸于裂解緩沖液中并用超聲斷裂。在超聲處理和額外的離心之后，通過直鏈淀粉親和層析分離重組的融合蛋白質(zhì)并隨后通過與因子Xa的溫育來切割(參考文獻(xiàn)15)。在F Xa切割后，將重組Bet v 1用凝膠過濾來分離，并進(jìn)行另一輪的直鏈淀粉親和層析以除去痕量的麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)。
將純化的重組Bet v 1超濾濃縮為約5mg/ml并貯存于4℃。純化的重組Bet v 1制備物的終產(chǎn)量為每升大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)物2～5mg。
純化的重組Bet v 1制備物經(jīng)銀染SDS-聚丙烯酰胺電泳后顯示單一的表現(xiàn)分子量為17.5kDa的條帶。
我們?cè)谇懊骘@示(參考文獻(xiàn)15)重組Bet v 1 No.2801與天然存在的Bet v 1在免疫化學(xué)上不能相區(qū)別。
Bet v 1(2628)和Bet v 1(2637)突變體圖19表示在Bet v 1(2628)和Bet v 1(2637)分子表面引入點(diǎn)突變。在突變體Bet v 1(2628)中，在Bet v 1的一半上引入5個(gè)初級(jí)突變而另一半沒有改變。在突變體Bet v 1(2637)中，在Bet v 1的另一半上引入5個(gè)初級(jí)和3個(gè)二級(jí)突變，而第一半不改變。通過這個(gè)途徑，在突變體Bet v 1(2628)和突變體Bet v 1(2637)中的突變分別影響B(tài)et v 1表面的不同的一半。
重組Bet v 1(2628)突變體的結(jié)晶和結(jié)構(gòu)確定重組Bet v 1(2628)的晶體于25℃蒸氣擴(kuò)散來生長，基本如在(Spangfort等人1996b，參考文獻(xiàn)21)中所描述。將濃度為5mg/ml的Bet v 1(2628)與相同體積的2.2M的硫酸銨、0.1M的檸檬酸鈉、1％(v/v)的二氧六環(huán)，pH6.3的溶液混合，并對(duì)100x體積的2.2M的硫酸銨、0.1M的檸檬酸鈉、1％(v/v)的二氧六環(huán)，pH6.3的溶液進(jìn)行平衡。平衡24小時(shí)之后，通過采用在參考文獻(xiàn)21中所描述的加晶種技術(shù)來誘導(dǎo)晶體生長，這里用重組體的野生型Betv 1作為晶種來源。
約4個(gè)月后，收獲晶體并用如參考文獻(xiàn)21所描述的從Rigaku旋轉(zhuǎn)陽極生成的X-射線進(jìn)行分析，且該結(jié)構(gòu)用分子置換(molecularreplacement)來解析。
Bet v 1(2628)突變體的結(jié)構(gòu)突變的結(jié)構(gòu)作用通過生長三維Bet v 1(2628)蛋白質(zhì)晶體而陳述，當(dāng)用旋轉(zhuǎn)陽極生成的X-射線進(jìn)行分析時(shí)該晶體衍射為2.0的分辨率。替換Tyr5Val、G1u45Ser、Lys65Asn、Lys97Ser、Lys134Glu是通過Bet v 1(2628)的結(jié)構(gòu)電子密度圖象證實(shí)的，該圖象也顯示總的α-碳主鏈三級(jí)結(jié)構(gòu)是保守的。
Bet v 1(2637)突變體的結(jié)構(gòu)分析純化的Bet v 1(2637)突變體的結(jié)構(gòu)完整性用圓二色(CD)譜分析。圖20顯示以近乎相同的濃度記錄的重組Bet v 1.2801(野生型)和Bet v 1(2637)突變體的CD譜。來自2個(gè)重組蛋白質(zhì)的CD譜中峰幅和位置的交迭顯示這2種制備物含有相同量的二級(jí)結(jié)構(gòu)，這強(qiáng)有力地暗示α-碳主鏈三級(jí)結(jié)構(gòu)沒有受到氨基酸替換引入的影響。
Bet v 1(2628)和Bet v 1(2637)突變體的IgE結(jié)合性質(zhì)在液相IgE抑制測定中比較Bet v 1(2628)和Bet v 1(2637)以及Bet v 1(2628)與Bet v 1(2637)的1∶1混合物同重組野生型Bet v 1.2801的IgE結(jié)合性質(zhì)，該測定使用衍生自樺木變態(tài)反應(yīng)患者的血清IgE庫。
如在實(shí)施例1中所描述，重組Bet v 1.2801以摩爾比為1∶5進(jìn)行生物素化(Bet v 1 no.2801生物素)。抑制測定如下進(jìn)行將血清樣品(25μ1)與固相抗IgE溫育，洗滌，重懸并進(jìn)一步同生物素化的Bet v 1.2801和給定的突變體或兩種突變體的1∶1混合物溫育。結(jié)合到固相的生物素化的Bet v 1.2801的量通過在溫育后用丫啶酯標(biāo)記的鏈酶抗生物素測量RLU來估計(jì)。抑制的程度計(jì)算為用緩沖液和突變體作抑制備物所獲得的RLU比率。
圖21表示由非生物素化的Bet v 1.2801和Bet v 1(2628)、Betv 1(2637)以及Bet v 1(2628)與Bet v 1(2637)的1∶1混合物抑制生物素化的重組Bet v 1.2801與來自變態(tài)反應(yīng)患者庫的血清IgE的結(jié)合。
對(duì)存在于血清庫中的血清IgE的結(jié)合達(dá)到50％的抑制所必需的各個(gè)重組蛋白質(zhì)的量有明顯的差別。重組Bet v 1.2801在約5ng即達(dá)到了50％的抑制，而相應(yīng)的Bet v 1(2628)突變體的濃度為約15-20ng。這顯示在Bet v 1(2628)突變體中引入的點(diǎn)突變以約3-4倍的系數(shù)降低了特異性血清IgE的親和力。
由Bet v 1(2628)突變體達(dá)到的最高抑制水平與重組Bet v1.2801相比明顯較低。這可能顯示由于點(diǎn)突變的引入，一些存在于血清庫中的特異性IgE不能識(shí)別Bet v 1(2628)突變體。
Bet v 1(2637)在約400-500ng達(dá)到50％的抑制，顯示在Bet v1(2637)突變體中引入的點(diǎn)突變使其與Bet v 1.2801相比將對(duì)特異性血清IgE的親和力降低了80～100倍。在IgE結(jié)合中的巨大差異進(jìn)一步由Bet v 1.2801的抑制曲線相比于Bet v 1(2637)突變體蛋白質(zhì)的抑制曲線所得的明顯的傾角差別的支持。提供證據(jù)表明IgE結(jié)合減少的不同的傾角歸因于與Bet v 1.2801相比突變體顯然不同的抗原決定部位的模式。
除用單獨(dú)修飾的變態(tài)反應(yīng)原的進(jìn)行抑制測定之外，對(duì)分別與Betv 1(2628)或Bet v 1(2637)的樣品具有等摩爾濃度的Bet v 1的Bet v 1(2628)和Bet v 1(2637)的1∶1混合物進(jìn)行檢驗(yàn)，它們顯示完全能抑制rBet v 1.2801對(duì)IgE的結(jié)合(100％)。完全抑制IgE結(jié)合的能力清楚表明所有存在于Bet v 1.2801上的活性抗原決定部位也存在于1∶1的變態(tài)反應(yīng)原混合物中。進(jìn)一步的證明來自Bet v1.2801和變態(tài)反應(yīng)原混合物兩抑制曲線的可相比較的傾角?；旌系淖儜B(tài)反應(yīng)原樣品減少的IgE反應(yīng)性通過當(dāng)與Bet v 1.2801相比時(shí)，為得到50％的IgE結(jié)合抑制需要高4-倍濃度的變態(tài)反應(yīng)原混合物來證明。
用突變的重組Bet v 1變態(tài)反應(yīng)原進(jìn)行T細(xì)胞增殖測定該分析以如參考文獻(xiàn)15所述方法進(jìn)行。Bet v 1(2628)和Bet v1(2637)兩者均能夠誘導(dǎo)來自樺木花粉變態(tài)反應(yīng)患者中的T細(xì)胞系的增殖，其刺激指數(shù)與重組體的和天然存在的情況相似。這暗示Betv 1(2628)和Bet v 1(2637)突變體蛋白質(zhì)均能起始抗體生產(chǎn)所必需的細(xì)胞免疫反應(yīng)。
人嗜堿性粒細(xì)胞的組胺釋放測定嗜堿白細(xì)胞組胺釋放如下進(jìn)行。從每個(gè)樺木花粉變態(tài)反應(yīng)患者取肝素化的血液(20ml)，貯存于室溫，并在24小時(shí)內(nèi)使用。將25微升肝素化的全血置于玻璃纖維覆蓋的微量滴定孔中(ReferenceLaboratory，Copenhagen，丹麥)并與25微升的變態(tài)反應(yīng)原或抗-IgE于37℃溫育1小時(shí)。其后漂洗平板并去除干擾物質(zhì)。最后，結(jié)合到微纖維上的組胺進(jìn)行熒光分光光度測量。
Bet v 1(2628)和Bet v 1(2637)突變體蛋白質(zhì)的組胺釋放性質(zhì)組胺釋放的數(shù)據(jù)在圖22和圖23中顯示。Bet v 1(2628)和Betv 1(2637)突變體蛋白質(zhì)在來自兩個(gè)樺木花粉變態(tài)反應(yīng)患者的人嗜堿性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)組胺釋放的潛能與Bet v 1.2801的釋放曲線相比明顯地右移。該移動(dòng)表明Bet v 1(2628)和Bet v 1(2637)的潛能減少了3～10倍。
突變體Bet v 1(2744)和突變體Bet v 1(2753)Bet v 1(2744)和突變體Bet v 1(2753)同樣構(gòu)建用作混合的變態(tài)反應(yīng)原疫苗。在這些突變變態(tài)反應(yīng)原中，點(diǎn)突變?nèi)鐖D24和25所示以一種全表面排列的方式分布，并再次設(shè)計(jì)為分別在兩個(gè)分子中影響不同的表面，如在圖26中所示。然而，這些修飾的變態(tài)反應(yīng)原也可單獨(dú)用作單一變態(tài)反應(yīng)原疫苗。
Bet v 1(2744)突變體蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析純化的Bet v 1(2744)突變體的結(jié)構(gòu)完整性用圓二色(CD)譜學(xué)分析。圖27顯示以近乎相同的濃度記錄的重組Bet v 1.2801(野生型)和Bet v 1(2744)突變體的CD譜。來自2個(gè)重組蛋白質(zhì)的CD譜中峰幅和位置的交迭顯示2種制備物含有相同量的二級(jí)結(jié)構(gòu)，這強(qiáng)有力地暗示α-碳主鏈三級(jí)結(jié)構(gòu)沒有受到氨基酸替換引入的影響。
Bet v 1(2744)的組胺釋放性質(zhì)從來自5種不同的花粉變態(tài)反應(yīng)患者的嗜堿白細(xì)胞的5個(gè)實(shí)驗(yàn)中得來的組胺釋放數(shù)據(jù)在圖29和圖29A-D中顯示。已檢驗(yàn)了Bet v 1(2744)突變體蛋白質(zhì)在人嗜堿性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)組胺釋放的潛能。突變的變態(tài)反應(yīng)原的釋放曲線與Bet v 1.2801的釋放曲線相比明顯地右移，這表明Bet v 1(2744)釋放組胺的潛能減少了3～5倍。
突變體Bet v 1(2733)
已構(gòu)建并重組表達(dá)了具有9個(gè)初級(jí)突變的突變體Bet v 1(2733)。突變體Bet v 1(2733)中點(diǎn)突變的分布留下了幾個(gè)組成＞4002的沒有改變的表面區(qū)域。圖30表示在Bet v 1(2733)分子表面引入的點(diǎn)突變。
實(shí)施例5本實(shí)施例描述了編碼來自屋塵螨(Dermatophagoidespteronyssinus)的Der p 2的基因的克隆和具有減少的IgE結(jié)合親和力的突變體的構(gòu)建。
從屋塵螨第一鏈cDNA合成所得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物得自Dr.Wendy-Anne Smith和Dr.Wayne Thomas(TVW Telethon Institutefor Child Health Research，100 Roberts Rd，Subiaco，WesternAustralia 6008)。在第一鏈cDNA文庫的擴(kuò)增中，Der p 2被選擇性地用Der p 2特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。隨后將PCR片段克隆入pUC19的BamH I位點(diǎn)(New England BioLabs)。Der p 2的DNA測序用載體特異性有義(5’-GGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGG-3’)和反義引物(5’-GGAAACAGCTATGACCATGATTACGCC-3’)進(jìn)行。
確定了總共7種獨(dú)特的Der p 2同種型，稱為ALK-101、ALK-102、ALK-103、ALK-104、ALK-113、ALK-114、ALK-120。將標(biāo)號(hào)為ALK-114的克隆選作起始點(diǎn)以生成低親和力的IgE突變體，這是由于其與具有數(shù)據(jù)庫訪問號(hào)1A9V的Der p 2 NMR結(jié)構(gòu)的高度序列一致性。與ALK-114相比，6個(gè)其他天然存在的同種型包含如下替換ALK-101M76V。
ALK-102V40L、T47S。
ALK-103M111L、D114N。
ALK-104T47S、M111T、D114N。
ALK-113T47S。
ALK-120V40L、T47S、D114N。
將Der p 2插入pGAPZα-A將編碼Der p 2(ALK-114)的基因隨后插入pGAPZα-A載體中(Invitrogen)以得到Der p 2在畢赤巴斯德酵母(Pichiapastoris)中的分泌表達(dá)。將該基因是用分別相應(yīng)于Der p 2多肽的氨基-和羧基端的有義引物OB27(5’-GGAATTCCTCGAGAAAAGAGATCAAGTCGATGTCAAAGATTGTGCC-3’)和反義引物OB28(5’-CGTTCTAGACTATTAATCGCGGATTTTAGCATGAGTTGC-3’)進(jìn)行擴(kuò)增。將引物在5’-端延長以分別包含限制酶切位點(diǎn)Xho I和Xba I。Xho I限制酶切位點(diǎn)使Der p 2的第一個(gè)密碼子以符合閱讀框形式與編碼pGAPZα-A的KEX2切割位點(diǎn)(LYS-ARG)的核酸序列融合。單輪的PCR反應(yīng)在100微升(μl)體積進(jìn)行的0.1mg的模板ALK-114 DNA，1X Expand聚合酶緩沖液(得自BoehringerMannheim)，各0.2毫摩爾(mM)的4種dNTPs，各0.3微摩爾(μM)的有義和反義引物和2.5單位的Expand聚合酶(得自Boehringer Mannheim)。DNA在25個(gè)循環(huán)中擴(kuò)增95℃15秒，45℃30秒，72℃1分鐘，隨后1個(gè)72℃循環(huán)7分鐘。將結(jié)果所得的475堿基對(duì)的ALK-114 PCR片段用QIAquick旋轉(zhuǎn)純化程序(得自Qiagen)進(jìn)行純化。然后將純化的DNA片段用Xho I和Xba I消化，凝膠純化并連接入以相似方式消化的pGAPZα-A中。將連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株DH5α，結(jié)果得到質(zhì)粒pCBo06。
Der p 2的核苷酸序列通過在克隆前后及隨后的體外誘變中的DNA測序來證實(shí)(見下文)。
Der p 2序列
SEQ ID NO 1相應(yīng)于Der p 2的核酸序列(ALK-114)1 gatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaaaagttttggtaccagga61tgccatggttcagaaccatgtatcattcatcgtggtaaaccattccaattggaagccgtt121 ttcgaagccaaccaaaacacaaaaaccgctaaaattgaaatcaaagcctcaatcgatggt181 ttagaagttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgccattacatgaaatgcccattg241 gttaaaggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccgaaaattgcaccaaaa301 tctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttatgggtgatgatggtgttttggcctgtgct361 attgctactcatgctaaaatccgcgattaaSEQ ID NO 2相應(yīng)于推定的Der p 2氨基酸序列(ALK-114)1 dqvdvkdcanheikkvlvpgchgsepciihrgkpfqleavfeanqntktakieikasidg61levdvpgidpnachymkcplvkgqqydikytwnvpkiapksenvvvtvkvmgddgvlaca121 iathakird將pGAPZα-A-Der p 2插入到畢赤巴斯德酵母中將載體pCBo06用AvrII限制性內(nèi)切酶線性化并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)畢赤巴斯德酵母菌株X-33中，如在Invitrogen使用手冊(cè)中所述。選擇對(duì)100微克每毫升(μg/ml)的Zeocin具抗性的重組細(xì)胞，將菌落在含有100μg/ml Zeocin的新鮮YPD平板上純化。
重組Der p 2的表達(dá)和純化將250ml含有100μg/ml Zeocin的YPD培養(yǎng)基(1％的酵母提取物、2％的蛋白胨、2％的葡萄糖)用表達(dá)Der p 2的重組酵母細(xì)胞過夜培養(yǎng)物進(jìn)行接種。使培養(yǎng)物在30℃生長72小時(shí)以獲得適當(dāng)?shù)腄er p 2表達(dá)。細(xì)胞通過離心收集，將結(jié)果所得的培養(yǎng)物上清夜用50％的硫酸銨飽和。在用3000xg離心30分鐘之后，將上清夜用80％的硫酸銨飽和。離心后，將沉淀重懸于150毫摩爾(mM)的NH4HCO3中并在用相同的緩沖液平衡的Superdex 75凝膠過濾柱上分級(jí)分離。
Der p 2作為相應(yīng)于其預(yù)期分子量的主要峰洗脫。Der p 2的洗脫通過隨后進(jìn)行銀染的SDSPAGE電泳和用Der p 2特異性多克隆抗體的免疫印跡進(jìn)行監(jiān)控。
用于定點(diǎn)突變的氨基酸殘基的選擇用于定點(diǎn)突變的氨基酸殘基的選擇基于對(duì)來自屋塵螨(Der p 2/f2和Eur m 2)和貯存螨(storage mite)(Tyr p 2、Lep d 2、Gly d2)的變態(tài)反應(yīng)原中高度溶劑暴露和高度保守性的殘基的確定。高度溶劑暴露的殘基通過Der p 2 NMR結(jié)構(gòu)(#1.9，1A9V.pdb)的分子表面的分析直觀確定。選擇了12個(gè)氨基酸殘基用于誘變K6A、N10S、K15E、S24N、H30N、K48A、E62S、H74N、K77N、K82N、K100N和R128Q。
定點(diǎn)突變具有單個(gè)初級(jí)突變和其多重組合的重組突變變態(tài)反應(yīng)原的構(gòu)建描述如下。
編碼Der p 2突變體的表達(dá)質(zhì)粒是用pCBo06作為DNA模板而生產(chǎn)的。PCR反應(yīng)用插入了特定突變的有義和反義引物進(jìn)行。用于PCR反應(yīng)以生成特定突變的引物對(duì)列在圖31中。突變以粗體標(biāo)明，且用于隨后的克隆步驟的限制酶切位點(diǎn)在圖中加下劃線。對(duì)于突變體K6A、K15E、H30N、H74N和K82N的構(gòu)建，PCR反應(yīng)基本是如在“將Der p 2克隆入pGAPZα-A”部分中所描述的那樣進(jìn)行的。將純化的PCR片段在標(biāo)明的限制性酶切位點(diǎn)(參見圖31)消化、凝膠純化、連接入用相似消化的pCBo06并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α。
突變E62S是以在實(shí)施例1中對(duì)Bet v 1突變體的生成所描述的另一種PCR誘變方法學(xué)生成。合成了兩個(gè)覆蓋特定的突變的突變特異性寡核苷酸引物(OB47和OB48，在圖31中列出)。兩個(gè)用于二次擴(kuò)增步驟的額外引物為OB27和OB28如在“將Der p 2插入pGAPZα-A”部分中所描述。
生產(chǎn)的變態(tài)反應(yīng)原突變體用如在實(shí)施例4中所描述的相同方法來描述特性，如圓二色(CD)譜、結(jié)晶、IgE結(jié)合性質(zhì)的測量、組胺釋放、T細(xì)胞增殖刺激能力等。
實(shí)施例6具有對(duì)特異性變態(tài)反應(yīng)疫苗改善的安全性的突變的重組螨變態(tài)反應(yīng)原(Der p 2)在本實(shí)施例中，當(dāng)前發(fā)明對(duì)屋塵螨變態(tài)反應(yīng)原概念的應(yīng)用由一個(gè)變態(tài)反應(yīng)原Der p 2作為例子。對(duì)其他屋塵螨變態(tài)反應(yīng)原的處理可通過相當(dāng)?shù)某绦蜻M(jìn)行。
突變的重組Der p 2分子的設(shè)計(jì)SED ID NO.3表示Der p 2-ALK-G克隆的核苷酸和推定的氨基酸序列，該克隆是野生型的同種型。
SED ID NO.3Der p 2-ALK-G的核苷酸和推定的氨基酸序列。
GAT CAA GTC GAT GTC AAA GAT TGT GCC AAT CAT GAA ATC AAA AAA 45D Q V D V K D C A N H E I K K 15GTT TTG GTA CCA GGA TGC CAT GGT TCA GAA CCA TGT ATC ATT CAT 90V L V P G C H G S E P C I I H 30CGT GGT AAA CCA TTC CAA TTG GAA GCT TTA TTC GAA GCC AAT CAA135R G K P F Q L E A L F E A N Q 45AAC TCA AAA ACA GCT AAA ATT GAA ATC AAA GCT TCA ATC GAT GGT180N S K T A K I E I K A S I D G 60TTA GAA GTT GAT GTT CCC GGT ATC GAT CCA AAT GCA TGC CAT TAT225L E V D V P G I D P N A C H Y 75
ATG AAA TGT CCA TTG GTT AAA GGA CAA CAA TAT GAT ATT AAA TAT270M K C P L V K G Q Q Y D I K Y 90ACA TGG AAT GTT CCA AAA ATT GCA CCA AAA TCT GAA AAT GTT GTC315T W N V P K I A P K S E N V V 105GTC ACT GTT AAA GTT TTG GGT GAT AAT GGT GTT TTG GCC TGT GCT360V T V K V L G D N G V L A C A 120ATT GCT ACT CAT GCT AAA ATC CGC GAT387I A T H A K I R D 129圖32表示用ClustalW算法以BLAST搜索在ExPaSy MolecularBiology Server(http//www.expasy.ch/)上進(jìn)行的序列比對(duì)，其中用表示于SED ID NO.3中的Der p 2-ALK-G的氨基酸序列作為輸入序列。該比對(duì)包括來自屋塵螨物種的序列，即Der p 2、Der f 2和Eurm 2。在圖32中，與Der p 2-ALK-G蛋白質(zhì)序列相同位置上氨基酸相同的氨基酸殘基在灰色背景上用黑體突出。不相同的氨基酸以白色背景用黑色印刷。
表面結(jié)構(gòu)圖象代表屋塵螨類群2變態(tài)反應(yīng)原的氨基酸序列具有超過85％的相似性，且一些分子表面保守(灰色帶)，參見圖33。圖33表示當(dāng)將Der p 2-ALK-G蛋白質(zhì)序列添加到發(fā)表的PDB1A9v NMR結(jié)構(gòu)上時(shí)，即10個(gè)包含在PDB文件中編號(hào)為1的結(jié)構(gòu)，從4個(gè)不同的角度觀察的表面外形。
將保守的和高度溶劑暴露的氨基酸選來用于突變，這些氨基酸在空間上在25-30范圍的距離內(nèi)分布在整個(gè)表面。在下面的部分中，給出了下述信息認(rèn)為適合用于突變的氨基酸列表(A)、設(shè)計(jì)的突變的列表(B)和代表設(shè)計(jì)的突變的DNA序列(C)。圖34表示作為例子的以1號(hào)突變體的分子外形?；疑@示保守的氨基酸殘基。黑色顯示選來用于突變的氨基酸殘基。
A.選來用于突變的氨基酸列表K15、S24、H30、R31、K48、E62、H74、K77、K82、K100、R128
B.設(shè)計(jì)的突變的列表突變體1K15E，S24N，H30G，K48A，E62S，K77N，K82N，K100N突變體2K15E，S24N，H30G，K48A，E62S，K77N，K82N，R128Q突變體3K15E，S24N，H30G，K48A，K77N，K82N，K100N，R128Q突變體4K15E，S24N，H30G，E62S，K77N，K82N，K100N，R128Q突變體5K15E，H30G，K48A，E62S，K77N，K82N，K100N，R128Q突變體6S24N，H30G，K48A，E62S，K77N，K82N，K100N，R128Q突變體7K15E，S24N，R31S，K48A，E62S，H74N，K82N，K100N突變體8K15E，S24N，R31S，K48A，E62S，H74N，K82N，R128Q突變體9K15E，S24N，R31S，K48A，H74N，K82N，K100N，R128Q突變體10K15E，S24N，R31S，E62S，H74N，K82N，K100N，R128Q突變體11K15E，R31S，K48A，E62S，H74N，K82N，K100N，R128Q突變體12S24N，R31S，K48A，E62S，H74N，K82N，K100N，R128Q
C.突變體的核苷酸序列突變體1K15E，S24N，H30G，K48A，E62S，K77N，K82N，K100NGatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtaccaggatgccatggtAACgaaccatgtatcattGGCcgtggtaaaccattccaattggaagctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttcaatcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgccattatatgAACtgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccaaaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataatggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatccgcgat突變體2K15E，S24N，H30G，K48A，E62S，K77N，K82N，R128QGatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtaccaggatgccatggtAACgaaccatgtatcattGGCcgtggtaaaccattccaattggaagctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttcaatcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgcCattatatgAACtgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccaaaaattgcaccaaaatctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataatggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat突變體3K15E，S24N，H30G，K48A，K77N，K82N，K100N，R128QGatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtaccaggatgccatggtAACgaaccatgtatcattGGCcgtggtaaaccattccaattggaagctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttcaatcgatggtttagaagttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgccattatatgAACtgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccaaaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataatggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat
突變體4K15E，S24N，H30G，E62S，K77N，K82N，K100N，R128QGatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtaccaggatgccatggtAACgaaccatgtatcattGGCcgtggtaaaccattccaattggaagctttattcgaagccaatcaaaactcaaaaacagctaaaattgaaatcaaagcttcaatcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgccattatatgAACtgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccaaaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataatggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat突變體5K15E，H30G，K48A，E62S，K77N，K82N，K100N，R128QGatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtaccaggatgccatggttcagaaccatgtatcattGGCcgtggtaaaccattccaattggaagctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttcaatcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgccattatatgAACtgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccaaaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataatggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat突變體6S24N，H30G，K48A，E62S，K77N，K82N，K100N，R128QGatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaaaagttttggtaccaggatgccatggtAACgaaccatgtatcattGGCcgtggtaaaccattccaattggaagctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttcaatcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgccattatatgAACtgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccaaaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataatggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat
突變體7K15E，S24N，R31S，K48A，E62S，H74N，K82N，K100NGatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtaccaggatgccatggtAACgaaccatgtatcattcatAGCggtaaaccattccaattggaagctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttcaatcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgcAACtatatgaaatgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccaaaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataatggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatccgcgat突變體8K15E，S24N，R31S，K48A，E62S，H74N，K82N，R128QGatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtaccaggatgccatggtAACgaaccatgtatcattcatAGCggtaaaccattccaattggaagctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttcaatcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgcAACtatatgaaatgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccaaaaattgcaccaaaatctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataatggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat突變體9K15E，S24N，R31S，K48A，H74N，K82N，K100N，R128QGatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtaccaggatgccatggtAACgaaccatgtatcattcatAGCggtaaaccattccaattggaagctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttcaatcgatggtttagaagttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgcAACtatatgaaatgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccaaaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataatggtgttttggcctgtgctattgctaCtcatgCtaaaatcCAGgat
突變體10K15E，S24N，R31S，E62S，H74N，K82N，K100N，R128QGatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtaccaggatgccatggtAACgaaccatgtatcattcatAGCggtaaaccattccaattggaagctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttcaatcgatggtttagaagttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgcAACtatatgaaatgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccaaaaattgcaccaAACtCtgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataatggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat突變體11K15E，R31S，K48A，E62S，H74N，K82N，K100N，R128QGatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtaccaggatgccatggttcagaaccatgtatcattcatAGCggtaaaccattccaattggaagctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttcaatcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgcAACtatatgaaatgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccaaaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataatggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat突變體12S24N，R31S，K48A，E62S，H74N，K82N，K100N，R128QGatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaaaagttttggtaccaggatgccatggtAACgaaccatgtatcattcatAGCggtaaaccattccaattggaagctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttcaatcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgcAACtatatgaaatgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttCCaaaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataatggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat
實(shí)施例7具有對(duì)特異性變態(tài)反應(yīng)疫苗改善的安全性的突變的重組螨變態(tài)反應(yīng)原(Der p 1)在本實(shí)施例中，當(dāng)前發(fā)明對(duì)屋塵螨變態(tài)反應(yīng)原概念的應(yīng)用由一個(gè)變態(tài)反應(yīng)原Der p 1作為例子。對(duì)其他屋塵螨變態(tài)反應(yīng)原的處理可通過相當(dāng)?shù)某绦蜻M(jìn)行。
突變的重組Der p 1分子的設(shè)計(jì)SED ID NO.4表示Der p 1-ALK克隆的核苷酸和推定的氨基酸序列，該克隆是野生型的同種型。
SED ID NO.4Der p 1-ALK的核苷酸和推定的氨基酸序列。
ACT AAC GCC TGC AGT ATC AAT GGA AAT GCT CCA GCT GAA ATC GAT 45T N A C S I N G N A P A E I D15TTG CGA CAA ATG CGA ACT GTC ACT CCC ATT CGT ATG CAA GGA GGC 90L R Q M R T V T P I R M Q G G30TGT GGT TCA TGT TGG GCT TTC TCT GGT GTT GCC GCA ACT GAA TCA135C G S C W A F S G V A A T E S45GCT TAT TTG GCT TAC CGT AAT CAA TCA TTG GAT CTT GCT GAA CAA180A Y L A Y R N Q S L D L A E Q60GAA TTA GTC GAT TGT GCT TCC CAA CAC GGT TGT CAT GGT GAT ACC225E L V D C A S Q H G C H G D T75ATT CCA CGT GGT ATT GAA TAC ATC CAA CAT AAT GGT GTC GTC CAA270I P R G T E Y I Q H N G V V Q90GAA AGC TAC TAT CGA TAC GTT GCA CGA GAA CAA TCA TGC CGA CGA315E S Y Y R Y V A R E Q S C R R 105CCA AAT GCA CAA CGT TTC GGT ATC TCA AAC TAT TGC CAA ATT TAC360R N A Q R F G I S N Y C Q I Y 120CCA CCA AAT GTA AAC AAA ATT CGT GAA GCT TTG GCT CAA ACC CAC405P P N V N K I R E A L A Q T H 135AGC GCT ATT GCC GTC ATT ATT GGC ATC AAA GAT TTA GAC GCA TTC450S A I A V I I G I K D L D A F 150CGT CAT TAT GAT GGC CGA ACA ATC ATT CAA CGC GAT AAT GGT TAC495R H Y D G R T I I Q R D N G Y 165CAA CCA AAC TAT CAC GCT GTC AAC ATT GTT GGT TAC AGT AAC GCA540Q P N Y H A V N I V G Y S N A 180CAA GGT GTC GAT TAT TGG ATC GTA CGA AAC AGT TGG GAT ACC AAT585Q G V D Y W I V R N S W D T N195
TGG GGT GAT AAT GGT TAC GGT TAT TTT GCT GCC AAC ATC GAT TTG630W G D N G Y G Y F A A N I D L 210ATG ATG ATT GAA GAA TAT CCA TAT GTT GTC ATT CTC666M M I E E Y P Y V V I L 222圖35表示用ClustalW算法以BLAST搜索在ExPaSy MolecularBiology Server(http//www.expasy.ch/)上進(jìn)行的序列比對(duì)，其中用表示于SED ID NO.4中的Der p 1-ALK的氨基酸序列作為輸入序列。該比對(duì)包括來自屋塵螨物種的序列，即Der p 1、Der f 1和Eurm 1。在圖35中，與Der p 1-ALK蛋白質(zhì)序列相同位置上氨基酸相同的氨基酸殘基在灰色背景上用黑體突出。不相同的氨基酸以白色背景用黑色印刷。
表面結(jié)構(gòu)圖象代表屋塵螨類群1變態(tài)反應(yīng)原的氨基酸序列具有某些程度的相似性，且一些分子表面是保守的(灰色帶)，參見圖36。圖36表示當(dāng)將Der p 1-ALK蛋白質(zhì)序列迭加到Der p 1分子結(jié)構(gòu)模型上時(shí)從4個(gè)不同的角度觀察的表面外形。
將保守的和高度溶劑暴露的氨基酸選來用于突變，這些氨基酸在空間上在25-30范圍的距離內(nèi)分布在整個(gè)表面。在下面的部分中，給出了下述信息認(rèn)為適合用于突變的氨基酸列表(A)、設(shè)計(jì)的突變的列表(B)和代表設(shè)計(jì)的突變的DNA序列(C)。圖37以編號(hào)為11的突變體作為例子表示分子外形?；疑@示保守的氨基酸殘基。黑色顯示選來用于突變的氨基酸殘基。
A.選擇來用于突變的氨基酸列表E13、P24、R20、Y50、S67、R78、R99、Q109、R128、R156、R161、P167、W192B.設(shè)計(jì)的突變的列表突變體1P24T、Y50V、R78E、R99Q、R156Q、R161E、P167T
突變體2P24T、Y50V、R78Q、R99E、R156E、R161Q、P167T突變體3R20E、Y50V、R78Q、R99Q、R156E、R161E、P167T突變體4R20Q、Y50V、R78E、R99E、R156Q、R161Q、P167T突變體5P24T、Y50V、S67N、R99E、R156Q、R161Q、P167T突變體6R20E、Y50V、S67N、R99E、R156Q、R161E、P167T突變體7R20Q、Y50V、S67N、R99Q、R156E、R161E、P167T突變體8E13S、P24T、Y50V、R78E、R99Q、Q109D、R128E、R156Q、R161E、P167T突變體9E13S、P24T、Y50V、R78Q、R99E、Q109D、R128Q、R156E、R161Q、P167T突變體10E13S、P24T、Y50V、R78E、R99Q、Q109D、R128E、R156Q、R161E、P167T、W192F突變體11E13S、P24T、Y50V、R78Q、R99E、Q109D、R128Q、R156E、R161Q、P167T、W192FC.突變體的核苷酸序列突變體1P24T，Y50V，R78E，R99Q，R156Q，R161E，P167TACT AAC GCC TGC AGT ATC AAT GGA AAT GCT CCA GCT GAA ATC GAT TTG CGA CAA ATG CGA 60ACT GTC ACT ACC ATT CGT ATG CAA GGA GGC TGT GGT TCA TGT TGG GCT TTC TCT GGT GTT 120GCC GCA ACT GAA TCA GCT TAT TTG GCT GTG CGT AAT CAA TCA TTG GAT CTT GCT GAA CAA 180GAA TTA GTC GAT TGT GCT TCC CAA CAC GGT TGT CAT GGT GAT ACC ATT CCA GAA GGT ATT 240GAA TAC ATC CAA CAT AAT GGT GTC GTC CAA GAA AGC TAC TAT CGA TAC GTT GCA CAG GAA 300CAA TCA TGC CGA CGA CCA AAT GCA CAA CGT 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CGT GAA GCT TTG GCT CAA ACC CAC AGC GCT ATT GCC GTC 420ATT ATT GGC ATC AAA GAT TTA GAC GCA TTC CGT CAT TAT GAT GGC GAA ACA ATC ATT CAA 480CAG GAT AAT GGT TAC CAA ACC AAC TAT CAC GCT GTC AAC ATT GTT GGT TAC AGT AAC GCA 540CAA GGT GTC GAT TAT TGG ATC GTA CGA AAC AGT TGG GAT ACC AAT TGG GGT GAT AAT GGT 600TAC GGT TAT TTT GCT GCC AAC ATC GAT TTG ATG ATG ATT GAA GAA TAT CCA TAT GTT GTC 660ATT CTC 666突變體4R20Q，Y50V，R78E，R99E，R156Q，R161Q，P167TACT AAC GCC TGC AGT ATC AAT GGA AAT GCT CCA GCT GAA ATC GAT TTG CGA CAA ATG CAG 60ACT GTC ACT CCC ATT CGT ATG CAA GGA GGC TGT GGT TCA TGT TGG GCT TTC TCT GGT GTT 120GCC GCA ACT GAA TCA GCT TAT TTG GCT GTG CGT AAT CAA TCA TTG GAT CTT GCT GAA CAA 180GAA TTA GTC GAT TGT GCT TCC CAA CAC GGT TGT CAT GGT GAT ACC ATT CCA GAA GGT ATT 240GAA TAC ATC CAA CAT AAT GGT GTC GTC CAA GAA AGC TAC TAT CGA TAC GTT GCA GAA GAA 300CAA TCA TGC CGA CGA CCA AAT GCA CAA CGT TTC GGT ATC TCA AAC TAT TGC CAA ATT TAC 360CCA CCA AAT GTA AAC AAA ATT CGT GAA GCT TTG GCT CAA ACC CAC AGC GCT ATT GCC GTC 420ATT ATT GGC ATC AAA GAT TTA GAC GCA TTC CGT CAT TAT GAT GGC CAG ACA ATC ATT CAA 480CAG GAT AAT GGT TAC CAA ACC AAC TAT CAC GCT GTC AAC ATT GTT GGT TAC AGT AAC GCA 540CAA GGT GTC GAT TAT TGG ATC GTA CGA AAC AGT TGG GAT ACC AAT TGG GGT GAT AAT GGT 600TAC GGT TAT TTT GCT GCC AAC ATC GAT TTG ATG ATG ATT GAA GAA TAT CCA TAT GTT GTC 660ATT CTC 666突變體5P24T，Y50V，S67N，R99E，R156Q，R161Q，P167TACT AAC GCC TGC AGT ATC AAT GGA AAT GCT CCA GCT GAA ATC GAT TTG CGA CAA ATG CGA 60ACT GTC ACT ACC ATT CGT ATG CAA GGA GGC TGT GGT TCA TGT TGG GCT TTC TCT GGT GTT 120GCC GCA ACT GAA TCA GCT TAT TTG GCT GTG CGT AAT CAA TCA TTG GAT CTT GCT GAA CAA 180GAA TTA GTC GAT TGT GCT AAC CAA CAC GGT TGT CAT GGT GAT ACC ATT CCA CGT GGT ATT 240GAA TAC ATC CAA CAT AAT GGT GTC GTC CAA GAA AGC TAC TAT CGA TAC GTT GCA GAA GAA 300CAA TCA TGC CGA CGA CCA AAT GCA CAA CGT TTC GGT ATC TCA AAC TAT TGC CAA ATT TAC 360CCA CCA AAT GTA AAC AAA ATT CGT GAA GCT TTG GCT CAA ACC CAC AGC GCT ATT GCC GTC 420ATT ATT GGC ATC 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R20E，Y50V，S67N，R99E，R156Q，R161E，P167TACT AAC GCC TGC AGT ATC AAT GGA AAT GCT CCA GCT GAA ATC GAT TTG CGA CAA ATG GAA 60ACT GTC ACT CCC ATT CGT ATG CAA GGA GGC TGT GGT TCA TGT TGG GCT TTC TCT GGT GTT 120GCC GCA ACT GAA TCA GCT TAT TTG GCT GTG CGT AAT CAA TCA TTG GAT CTT GCT GAA CAA 180GAA TTA GTC GAT TGT GCT AAC CAA CAC GGT TGT CAT GGT GAT ACC ATT CCA CGT GGT ATT 240GAA TAC ATC CAA CAT AAT GGT GTC GTC CAA GAA AGC TAC TAT CGA TAC GTT GCA GAA GAA 300CAA TCA TGC CGA CGA CCA AAT GCA CAA CGT TTC GGT ATC TCA AAC TAT TGC CAA ATT TAC 360CCA CCA AAT GTA AAC AAA ATT CGT GAA GCT TTG GCT CAA ACC CAC AGC GCT ATT GCC GTC 420ATT ATT GGC ATC AAA GAT TTA GAC GCA TTC CGT CAT TAT GAT GGC CAG ACA ATC ATT CAA 480GAA GAT AAT GGT TAC CAA ACC AAC TAT CAC GCT GTC AAC ATT GTT GGT TAC AGT AAC GCA 540CAA GGT GTC GAT TAT TGG ATC GTA CGA AAC AGT TGG GAT ACC AAT TGG GGT GAT AAT GGT 600TAC GGT TAT TTT GCT GCC AAC ATC GAT TTG ATG ATG ATT GAA GAA TAT CCA TAT GTT GTC 660ATT CTC 666突變體7R20Q，Y50V，S67N，R99Q，R156E，R161E，P167TACT AAC GCC TGC AGT ATC AAT GGA AAT GCT CCA GCT GAA ATC GAT TTG CGA CAA ATG CAG 60ACT GTC ACT CCC ATT CGT ATG CAA GGA GGC TGT GGT TCA TGT TGG GCT TTC TCT GGT GTT 120GCC GCA ACT GAA TCA GCT TAT TTG GCT GTG CGT AAT CAA TCA TTG GAT CTT GCT GAA CAA 180GAA TTA GTC GAT TGT GCT AAC CAA CAC GGT TGT CAT GGT GAT ACC ATT CCA CGT GGT ATT 240GAA TAC ATC CAA CAT AAT GGT GTC GTC CAA GAA AGC TAC TAT CGA TAC GTT GCA CAG GAA 300CAA TCA TGC CGA CGA CCA AAT GCA CAA CGT TTC GGT ATC TCA AAC TAT TGC CAA ATT TAC 360CCA CCA AAT GTA AAC AAA ATT CGT GAA GCT TTG GCT CAA ACC CAC AGC GCT ATT GCC GTC 420ATT ATT GGC ATC AAA GAT TTA GAC GCA TTC CGT CAT TAT GAT GGC GAA ACA ATC ATT CAA 480GAA GAT AAT GGT TAC CAA ACC AAC TAT CAC GCT GTC AAC ATT GTT GGT TAC AGT AAC GCA 540CAA GGT GTC GAT TAT TGG ATC GTA CGA AAC AGT TGG GAT ACC AAT TGG GGT GAT AAT GGT 600TAC GGT TAT TTT GCT GCC AAC ATC GAT TTG ATG ATG ATT GAA GAA TAT CCA TAT GTT GTC 660ATT CTC 666突變體8E13S，P24T，Y50V，R78E，R99Q，Q109D，R128E，R156Q，R161E，P167TACT AAC GCC TGC AGT ATC AAT GGA AAT GCT CCA GCT AGC ATC GAT TTG CGA CAA ATG CGA 60ACT GTC ACT ACC ATT CGT ATG CAA GGA GGC TGT GGT TCA TGT TGG GCT TTC TCT GGT GTT 120GCC GCA ACT GAA TCA GCT TAT TTG GCT GTG CGT AAT CAA TCA TTG GAT CTT GCT GAA CAA 180GAA TTA GTC GAT TGT GCT TCC CAA CAC GGT TGT CAT GGT GAT ACC ATT CCA GAA GGT ATT 240GAA TAC ATC CAA CAT AAT GGT GTC GTC CAA GAA AGC TAC TAT CGA TAC GTT GCA CAG GAA 300CAA TCA TGC CGA CGA CCA AAT GCA GAT CGT TTC GGT ATC TCA AAC TAT TGC CAA ATT TAC 360CCA CCA AAT GTA AAC AAA ATT GAA GAA GCT TTG GCT CAA ACC CAC AGC GCT ATT GCC GTC 420ATT ATT GGC ATC AAA GAT TTA GAC GCA TTC CGT CAT TAT GAT GGC CAG ACA ATC ATT CAA 480GAA GAT AAT GGT TAC CAA ACC AAC TAT CAC GCT GTC AAC ATT GTT GGT TAC AGT AAC GCA 540CAA GGT GTC GAT TAT TGG ATC GTA CGA AAC AGT TGG GAT ACC AAT TGG GGT GAT AAT GGT 600TAC GGT TAT TTT GCT GCC AAC ATC GAT TTG ATG ATG ATT GAA GAA TAT CCA TAT GTT GTC 660ATT CTC 666突變體9E13S，P24T，Y50V，R78Q，R99E，Q109D，R128Q，R156E，R161Q，P167TACT AAC GCC TGC AGT ATC AAT GGA AAT GCT CCA GCT AGC ATC GAT TTG CGA CAA ATG CGA 60ACT GTC ACT ACC ATT CGT ATG CAA GGA GGC TGT GGT TCA TGT TGG GCT TTC TCT GGT GTT 120GCC GCA ACT GAA TCA GCT TAT TTG GCT GTG CGT AAT CAA TCA TTG GAT CTT GCT GAA CAA 180GAA TTA GTC GAT TGT GCT TCC CAA CAC GGT TGT CAT GGT GAT ACC ATT CCA CAG GGT ATT 240GAA TAC ATC CAA CAT AAT GGT GTC GTC CAA GAA AGC TAC TAT CGA TAC GTT GCA GAA GAA 300CAA TCAT GC CGA CGA CCA AAT GCA GAT CGT TTC GGT ATC TCA AAC TAT TGC CAA ATT TAC 360CCA CCA AAT GTA AAC AAA ATT CAG GAA GCT TTG GCT CAA ACC CAC AGC GCT ATT GCC GTC 420ATT ATT GGC ATC AAA GAT TTA GAC GCA TTC CGT CAT TAT GAT GGC GAA ACA ATC ATT CAA 480CAG GAT AAT GGT TAC CAA ACC AAC TAT CAC GCT GTC AAC ATT GTT GGT TAC AGT AAC GCA 540CAA GGT GTC GAT TAT TGG ATC GTA CGA AAC AGT TGG GAT ACC AAT TGG GGT GAT AAT GGT 600TAC GGT TAT TTT GCT GCC AAC ATC GAT TTG ATG ATG ATT GAA GAA TAT CCA TAT GTT GTC 660ATT CTC 666突變體10E13S，P24T，Y50V，R78E，R99Q，Q109D，R128E，R156Q，R161E，P167T，W192FACT AAC GCC TGC AGT ATC AAT GGA AAT GCT CCA GCT AGC ATC GAT TTG CGA CAA ATG CGA 60ACT GTC ACT ACC ATT CGT ATG CAA GGA GGC TGT GGT TCA TGT TGG GCT TTC TCT GGT GTT 120GCC GCA ACT GAA TCA GCT TAT TTG GCT GTG CGT AAT CAA TCA TTG GAT CTT GCT GAA CAA 180GAA TTA GTC GAT TGT GCT TCC CAA CAC GGT TGT CAT GGT GAT ACC ATT CCA GAA GGT ATT 240GAA TAC ATC CAA CAT AAT GGT GTC GTC CAA GAA AGC TAC TAT CGA TAC GTT GCA CAG GAA 300CAA TCA TGC CGA CGA CCA AAT GCA GAT CGT TTC GGT ATC TCA AAC TAT TGC CAA ATT TAC 360CCA CCA AAT GTA AAC AAA ATT GAA GAA GCT TTG GCT CAA ACC CAC AGC GCT ATT GCC GTC 420ATT ATT GGC ATC AAA GAT TTA GAC GCA TTC CGT CAT TAT GAT GGC CAG ACA ATC ATT CAA 480GAA GAT AAT GGT TAC CAA ACC AAC TAT CAC GCT GTC AAC ATT GTT GGT TAC AGT AAC GCA 540CAA GGT GTC GAT TAT TGG ATC GTA CGA AAC AGT TTT GAT ACC AAT TGG GGT GAT AAT GGT 600TAC GGT TAT TTT GCT GCC AAC ATC GAT TTG ATG ATG ATT GAA GAA TAT CCA TAT GTT GTC 660ATT CTC 666突變體11E13S，P24T，Y50V，R78Q， R99E，Q109D，R128Q，R156E，R161Q，P167T，W192FACT AAC GCC TGC AGT ATC AAT GGA AAT GCT CCA GCT AGC ATC GAT TTG CGA CAA ATG CGA 60ACT GTC ACT ACC ATT CGT ATG CAA GGA GGC TGT GGT TCA TGT TGG GCT TTC TCT GGT GTT 120GCC GCA ACT GAA TCA GCT TAT TTG GCT GTG CGT AAT CAA TCA TTG GAT CTT GCT GAA CAA 180GAA TTA GTC GAT TGT GCT TCC CAA CAC GGT TGT CAT GGT GAT ACC ATT CCA CAG GGT ATT 240GAA TAC ATC CAA CAT AAT GGT GTC GTC CAA GAA AGC TAC TAT CGA TAC GTT GCA GAA GAA 300CAA TCA TGC CGA CGA CCA AAT GCA GAT CGT TTC GGT ATC TCA AAC TAT TGC CAA ATT TAC 360CCA CCA AAT GTA AAC AAA ATT CAG GAA GCT TTG GCT CAA ACC CAC AGC GCT ATT GCC GTC 420ATT ATT GGC ATC AAA GAT TTA GAC GCA TTC CGT CAT TAT GAT GGC GAA ACA ATC ATT CAA 480CAG GAT AAT GGT TAC CAA ACC AAC TAT CAC GCT GTC AAC ATT GTT GGT TAC AGT AAC GCA 540CAA GGT GTC GAT TAT TGG ATC GTA CGA AAC AGT TTT GAT ACC AAT TGG GGT GAT AAT GGT 600TAC GGT TAT TTT GCT GCC AAC ATC GAT TTG ATG ATG ATT GAA GAA TAT CCA TAT GTT GTC 660ATT CTC 666實(shí)施例8具有對(duì)特異性變態(tài)反應(yīng)疫苗改善的安全性的突變的重組草變態(tài)反應(yīng)原(Phl p 5)在本實(shí)施例中，當(dāng)前發(fā)明對(duì)草花粉變態(tài)反應(yīng)原概念的應(yīng)用由一個(gè)變態(tài)反應(yīng)原Phl p 5作為例子。對(duì)其他草花粉變態(tài)反應(yīng)原的處理可通過相當(dāng)?shù)某绦蜻M(jìn)行。
突變的重組Phl p 5分子的設(shè)計(jì)SED ID NO.5表示Phl p 5.0103克隆的核苷酸和推定的氨基酸序列，該克隆是野生型的同種型。
SED ID NO.5Phl p 5.0103的核苷酸和推定的氨基酸序列。
gccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60A D L G Y G P A T P A A P A A G Y T P A 20acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120T P A A P A G A E P A G K A T T E E Q K 40ctgatcgagaagatcaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg 180L I E K I N A G F K A A L A A A A G V P 60ccagcggacaagtacaggacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240P A D K Y R T F V A T F G A A S N K A F 80gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300A E G L S G E P K G A A E S S S K A A L100acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 360T S K L D A A Y K L A Y K T A E G A T P120gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcgaggcgctccgcatcatcgccggc 420E A K Y D A Y V A T V S E A L R I I A G140accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccggc 480T L E V H A V K P A A E E V K V I P A G160gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540E L Q V I E K V D A A F K V A A T A A N180gccgcccccgccaacgacaagttcaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600A A P A N D K F T V F E A A F N D A I K200gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacaagttcatccccgccctggaggccgccgtc 660A S T G G A Y E S Y K F I P A L E A A V220aagcaggcctacgccgccaccgtcgccaccgcgccggaggtcaagtacactgtctttgag 720K Q A Y A A T V A T A P E V K Y T V F E240accgcactgaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcacagaaggctgccaagcccgcc 780T A L K K A I T A M S E A Q K A A K P A260gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840A A A T A T A T A A V G A A T G A A T A280gctactggtggctacaaagtc 861A T G G Y K V
圖32表示用ClustalW算法以BLAST搜索在ExPaSy MolecularBiology Server(http∥www.expasy.ch/)上進(jìn)行的序列比對(duì)，其中用表示于SED ID NO.5中的Phl p 5.0103的氨基酸序列作為輸入序列。該比對(duì)包括來自草物種類群5變態(tài)反應(yīng)原的序列，即Phl p 5、Poa p 5、Lol p 5、Hol l 5、Pha a 5、Hor v 9和Hor v 5。在圖38中，與Phl p 5.0103蛋白質(zhì)序列相同位置上氨基酸相同的氨基酸殘基在灰色背景上用黑體突出。不相同的氨基酸以白色背景用黑色印刷。
表面結(jié)構(gòu)圖象代表草花粉類群5變態(tài)反應(yīng)原的氨基酸序列具有某些程度的相似性，且一些分子表面保守(灰色帶)，參見圖39。圖39表示當(dāng)將Phl p 5.0103蛋白質(zhì)序列迭加到Phl p 5分子結(jié)構(gòu)模型上時(shí)，從4個(gè)不同的角度觀察的表面外形。該結(jié)構(gòu)模型以兩個(gè)半部包含該分子，模型A(氨基酸34-142)在圖39A中表示，且模型B(氨基酸149-259)在圖39B中表示將高度溶劑暴露的氨基酸選來用于突變，這些氨基酸在空間上25-30范圍的距離內(nèi)分布在整個(gè)表面。在下面的部分中，給出了下述信息認(rèn)為適合用于突變的氨基酸列表(A)、設(shè)計(jì)的突變的列表(B)和代表設(shè)計(jì)的突變的DNA序列(C)。圖40A和B分別表示作為例子的1號(hào)突變體模型A和模型B分子外形?；疑@示保守的氨基酸殘基。黑色顯示選來用于突變的氨基酸殘基。
A.選來用于突變的氨基酸列表I45、R66、E133、R136、I137、D186、F188、K211、P214、Q222、P232、L243、Q254B.設(shè)計(jì)的突變的列表突變體1I45K，E133S，F(xiàn)188I，Q222K，L243E，Q254K突變體2R66N，E133S，F(xiàn)188I，Q222K，L243E，Q254K突變體3I45K，R136S，F(xiàn)188I，Q222K，L243E，Q254K突變體4I45K，I137K，F(xiàn)188I，Q222K，L243E，Q254K突變體5I45K，E133S，D186H，Q222K，L243E，Q254K突變體6I45K，E133S，Q222K，P232G，L243E，Q254K突變體7I45K，E133S，F(xiàn)188I，P214G，L243E，Q254K突變體8I45K，E133S，F(xiàn)188I，K211N，L243E，Q254K突變體9R66N，R136S，F(xiàn)188I，Q222K，L243E，Q254K突變體10
R66N，I137K，F(xiàn)188I，Q222K， L243E，Q254K突變體11I45K，E133S，D186H，P214G，L243E，Q254K突變體12I45K，E133S，D186H，K211N，L243E，Q254K突變體13I45K，E133S，P214G，P232G，L243E，Q254K突變體14I45K，E133S，K211N，P232G，L243E， Q254KC.突變體的核苷酸序列突變體1I45K，E133S，F(xiàn)188I，Q222K，L243E，Q254Kgccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120ctgatcgagaagAAAaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg 180ccagcggacaagtacaggacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 360gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcAGCgcgctccgcatcatcgccggc 420accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccggc 480gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540gccgcccccgccaacgacaagATTaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacaagttcatccccgccctggaggccgccgtc 660aagAAAgcctacgccgccaccgtcgccaccgcgccggaggtcaagtacactgtctttgag 720accgcaGAAaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 780gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840gctactggtggctacaaagtc 861突變體2R66N，E133S，F(xiàn)188I，Q222K，L243E，Q254Kgccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120ctgatcgagaagatcaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg 180ccagcggacaagtacAACacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 360gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcAGCgcgctccgcatcatcgccggc 420accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccggc 480gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540gccgcccccgccaacgacaagATTaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacaagttcatccccgccctggaggccgccgtc 660aagAAAgcctacgccgccaccgtcgccaccgcgccggaggtcaagtacactgtctttgag 720accgcaGAAaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 780gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840gctactggtggctacaaagtc 861突變體3I45K，R136S，F(xiàn)188I，Q222K，L243E，Q254Kgccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120ctgatcgagaagAAAaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg 180ccagcggacaagtacaggacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 360gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcgaggcgctcAGCatcatcgccggc 420accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccggc 480gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540gccgcccccgccaacgacaagATTaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacaagttcatccccgccctggaggccgccgtc 660aagAAAgcctacgccgccaccgtcgccaccgcgccggaggtcaagtacactgtctttgag 720accgcaGAAaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 780gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840gctactggtggctacaaagtc 861突變體4I45K，I137K，F(xiàn)188I，Q222K，L243E，Q254Kgccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120ctgatcgagaagAAAaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg 180ccagcggacaagtacaggacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 360gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcgaggcgctccgcAAAatcgccggc 420accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccggc 480gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540gccgcccccgccaacgacaagATTaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacaagttcatccccgccctggaggccgccgtc 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660aagcaggcctacgccgccaccgtcgccaccgcgccggaggtcaagtacactgtctttgag 720accgcaGAAaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 780gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840gctactggtggctacaaagtc 861突變體8
I45K，E133S，F(xiàn)188I，K211N，L243E，Q254Kgccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120ctgatcgagaagAAAaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg 180ccagcggacaagtacaggacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 360gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcAGCgcgctccgcatcatcgccggc 420accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccggc 480gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540gccgcccccgccaacgacaagATTaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacAACttcatccccgccctggaggccgccgtc 660aagcaggcctacgccgccaccgtcgccaccgcgccggaggtcaagtacactgtctttgag 720accgcaGAAaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 780gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840gctactggtggctacaaagtc 861突變體9R66N，R136S，F(xiàn)188I，Q222K，L243E，Q254Kgccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120ctgatcgagaagatcaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg 180ccagcggacaagtacAACacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240gcggagggcctct cgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 360gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcgaggcgctcAGCatcatcgccggc 420accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccggc 480gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540gccgcccccgccaacgacaagATTaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacaagttcatccccgccctggaggccgccgtc 660aagAAAgcctacgccgccaccgtcgccaccgcgccggaggtcaagtacactgtctttgag 720accgcaGAAaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 780gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840gctactggtggctacaaagtc 861突變體10R66N，I137K，F(xiàn)188I，Q222K，L243E，Q254Kgccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120ctgatcgagaagatcaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg 180ccagcggacaagtacAACacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 360gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcgaggcgctccgcAAAatcgccggc 420accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccggc 480gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540gccgcccccgccaacgacaagATTaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacaagttcatccccgccctggaggccgccgtc 660aagAAAgcctacgccgccaccgtcgccaccgcgccggaggtcaagtacactgtctttgag 720accgcaGAAaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 780gccgctgccaccgcccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840gctactggtggctacaaagtc 861突變體11I45K，E133S，D186H，P214G，L243E，Q254Kgccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120ctgatcgagaagAAAaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg 180ccagcggacaagtacaggacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 360gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcAGCgcgctccgcatcatcgccggc 420accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccggc 480gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540gccgcccccgccaacCATaagttcaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacaagttcatcGGCgccctggaggccgccgtc 660aagcaggcctacgccgccaccgtcgccaccgcgccggaggtcaagtacactgtctttgag 720accgcaGAAaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 780gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840gctactggtggctacaaagtc 861突變體12I45K，E133S，D186H，K211N，L243E，Q254Kgccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120ctgatcgagaagAAAaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg 180ccagcggacaagtacaggacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 360gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcAGCgcgctccgcatcatcgccggc 420accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccggc 480gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540gccgcccccgccaacCATaagttcaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacAACttcatccccgccctggaggccgccgtc 660aagcaggcctacgccgccaccgtcgccaccgcgccggaggtcaagtacactgtctttgag 720accgcaGAAaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 780gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840gctactggtggctacaaagtc 861突變體13I45K，E133S，P214G，P232G，L243E，Q254Kgccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120ctgatcgagaagAAAaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg 180ccagcggacaagtacaggacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 360gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcAGCgcgctccgcatcatcgccggc 420accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccggc 480gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540gccgcccccgccaacgacaagttcaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacaagttcatcGGCgccctggaggccgccgtc 660aagcaggcctacgccgccaccgtcgccaccgcgGGCgaggtcaagtacactgtctttgag 720accgcaGAAaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 780gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840突變體14I45K，E133S，K211N，P232G，L243E，Q254Kgccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120ctgatcgagaagAAAaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg 180ccagcggacaagtacaggacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 360gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcAGCgcgctccgcatcatcgccggc 420accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccggc 480gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540gccgcccccgccaacgacaagttcaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacAACttcatccccgccctggaggccgccgtc 660aagcaggcctacgccgccaccgtcgccaccgcgGGCgaggtcaagtacactgtctttgag 720accgcaGAAaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 780gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840gctactggtggctacaaagtc 861實(shí)施例9重組體和突變體Bet v 1的T-細(xì)胞反應(yīng)性目的在增殖和細(xì)胞因子生產(chǎn)方面研究對(duì)突變的變態(tài)反應(yīng)原的體外T細(xì)胞反應(yīng)。
方法來自變態(tài)反應(yīng)患者的PBL(外周血淋巴細(xì)胞)被用于下面的研究。
為了維持T-細(xì)胞所呈對(duì)的bet v 1同種型的多樣性，用具有天然純化的bet v 1的PBL建立了8個(gè)bet v 1特異性T細(xì)胞系，如以前發(fā)表的流程所述(26)。
將10個(gè)PBL和8個(gè)T-細(xì)胞系用樺木提取物(Bet v)、天然純化的bet v 1(nbet v 1)、重組Bet v 1(rBet v 1或wt；27)和rBetv 1的4種不同的突變體(在別處所述)2595、2628、2637、2744、2773來刺激。隨后發(fā)現(xiàn)2637突變體部分解折疊，將不予討論。
簡單扼要地在一個(gè)具有96圓底孔的平板上每孔加入2×105的PBL。以4份重復(fù)(quadropplicates)的3種不同的濃度加入不同的樺木樣品并使其生長6天。在第6天，將具有最高濃度的樺木的每孔半數(shù)體積(100μl)的細(xì)胞收獲以用于細(xì)胞因子的生產(chǎn)。將放射性標(biāo)記的胸苷加入到孔中。第二天(第7天)在濾器中收獲細(xì)胞。將閃爍液加入到濾器中，其放射性用閃爍計(jì)數(shù)器進(jìn)行測量。
同樣地，在一個(gè)具有96圓底孔的平板上每孔加入3×104的T-細(xì)胞，并用自身輻射的PBL(1×105細(xì)胞/孔)和3種不同濃度的不同樺木樣品來刺激。1天后，將來自各孔具有最高濃度的樺木的細(xì)胞收獲以用于細(xì)胞因子的生產(chǎn)。將放射性標(biāo)記的胸苷加入到孔中。在第2天在濾器中收獲細(xì)胞。將閃爍液加入到濾器中并以如在PBL中描述的方法計(jì)數(shù)。
收集來自4等份(quadropplicates)的上清夜，并用來自Becton Dickinson的CBA(細(xì)胞因子珠陣列(cytokine beadarray))試劑盒來測量細(xì)胞因子。
結(jié)果10個(gè)PBL培養(yǎng)物顯示對(duì)樺木的特異性刺激。通常，對(duì)不同樺木樣品的PBL增殖相似，盡管可看到變化。在3個(gè)PBL中，nBet v 1比rBet v 1和突變體更好刺激增殖。突變體樺木樣品幾乎與rBet v 1一樣刺激了PBL(圖41)。圖41表示上述Bet v 1制備物的刺激指數(shù)。刺激指數(shù)(SI)是刺激的樣品的增殖(cpm每分鐘的讀數(shù))除以培養(yǎng)基(medium)對(duì)照的增殖(cpm)來計(jì)算的。PPD指來自結(jié)核分枝桿菌(mucobacterium tuberculosis)的純化的蛋白質(zhì)衍生物，它充當(dāng)正對(duì)照。
細(xì)胞因子的生產(chǎn)是由IFN-gamma控制的且隨PBL增殖按比例增加。Th1/Th2替換的信號(hào)不明顯(圖42-44)。圖42表示具有Th0狀況的患者，圖43表示Th1狀況且圖44表示Th2狀況。細(xì)胞因子生產(chǎn)用顯示為條形圖的pg/ml測量的且IL-5/IFN-gamma之間的比率是較下面的虛線(Y-軸右邊)。用cpm測量的增殖在Y-軸右邊表示為實(shí)線。培養(yǎng)基(medium)和MBP(麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì))作為背景對(duì)照而包括。
8個(gè)T-細(xì)胞系建立在nBet v 1上，且除一個(gè)之外，其余的全部對(duì)所有樺木樣品同樣好地增殖。4個(gè)T-細(xì)胞系基于IL-5和IFN-gamma的比率(Th2＞5、5＞Th0＞0.2、0.2＞Th1)而分泌Th0樣的細(xì)胞因子。3個(gè)T-細(xì)胞系分泌Th1的細(xì)胞因子且1個(gè)T-細(xì)胞系分泌Th2細(xì)胞因子。IL-5/IFN-gamma的比率不受不同樺木樣品的影響。
結(jié)論對(duì)nBet v 1顯示特異性刺激的所有PBL培養(yǎng)物和7/8個(gè)T-細(xì)胞系也對(duì)rBet v 1和突變體起反應(yīng)。這些數(shù)據(jù)暗示對(duì)于T-細(xì)胞的刺激，Bet v 1的同種型或這4個(gè)突變體可替換在天然變態(tài)反應(yīng)原制備物中發(fā)現(xiàn)的單獨(dú)的同種型的混合物。因而，基于重組變態(tài)反應(yīng)原或這4個(gè)突變體的疫苗將針對(duì)現(xiàn)存的Bet v 1特異性T-細(xì)胞群體。
實(shí)施例10用重組和突變體Bet v 1蛋白質(zhì)在免疫接種后誘導(dǎo)Bet v 1特異性IgG抗體和阻斷抗體在本部分中，術(shù)語“阻斷抗體”定義為與IgE抗體不同的抗體，它能夠結(jié)合到抗原并阻止人IgE抗體對(duì)該抗原的結(jié)合。
重組Bet v 1 2227野生型蛋白質(zhì)(rBet v 1)和Bet v 1 2595、2628、2744及2773突變體蛋白質(zhì)誘導(dǎo)Bet v 1特異性IgG抗體和阻斷抗體的能力在小鼠中的免疫接種實(shí)驗(yàn)中檢驗(yàn)。
通過用重組Bet v 1 2227野生型蛋白質(zhì)或4個(gè)突變體蛋白質(zhì)對(duì)BALB/cA小鼠(每組8個(gè))腹膜內(nèi)注射進(jìn)行免疫接種。該小鼠以14天的劑量間隔免疫接種4次。將不同的蛋白質(zhì)綴合到1.25mg/ml的鋁膠上(氫氧化鋁凝膠，1.3％pH8.0-8.4，Superfos Biosector)。該小鼠用或者1μg的蛋白質(zhì)/劑量或者10μg的蛋白質(zhì)/劑量來免疫接種。血液樣品在第0、14、35、21、49和63天從眶放血(orbital bleed)獲取。
特異性IgG抗體水平用rBet v 1包被的微量滴定板和生物素化的兔抗小鼠IgG抗體(Jackson)作為探測抗體通過直接的ELISA來分析。用重組Bet v 1 2227野生型蛋白質(zhì)或4種突變體蛋白質(zhì)的免疫接種誘導(dǎo)了強(qiáng)的rBet v 1特異性IgG反應(yīng)。該發(fā)現(xiàn)證明4種突變的蛋白質(zhì)能夠誘導(dǎo)與Bet v 1 2227野生型蛋白質(zhì)具有高度交叉反應(yīng)性的抗體。
為了估計(jì)阻斷抗體的誘導(dǎo)，將來自樺木變態(tài)反應(yīng)患者的血清樣品與包被了單克隆小鼠抗人IgE抗體的順磁珠溫育。溫育后，將珠子洗滌并重懸于緩沖液或來自未免疫接種的小鼠(對(duì)照)或上述免疫接種的小鼠的小鼠血清的稀釋樣品(1∶100)中。然后將生物素化的rBet v 1加入到該珠和小鼠血清抗體的混合物中。溫育之后，將珠子洗滌，其結(jié)合的生物素化的rBet v 1用丫啶(acridinium)標(biāo)記的鏈酶抗生物素來探測。珠子和來自未免疫接種的小鼠的血清的溫育沒有改變r(jià)Bet v 1與珠子的結(jié)合。相反的，珠子與來自用重組Bet v 1 227野生型蛋白質(zhì)或4種突變體蛋白質(zhì)免疫接種的小鼠血清的溫育顯著地減少了Bet v 1與珠子的結(jié)合，這證明了在血清樣品中存在Bet v 1特異性阻斷抗體。因而，在第63天，來自所有高劑量(10μg/劑量)免疫接種組的一種或多種血清樣品能夠減少超過80％的Bet v 1與珠子的結(jié)合。這些發(fā)現(xiàn)證明4種突變的蛋白質(zhì)能夠誘導(dǎo)可充當(dāng)Bet v 1特異性阻斷抗體的抗體。
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權(quán)利要求
1.重組變態(tài)反應(yīng)原，其特征在于它是天然存在的變態(tài)反應(yīng)原的突變體，其中該變態(tài)反應(yīng)原突變體具有至少4個(gè)初級(jí)突變，與該天然存在的變態(tài)反應(yīng)原的IgE結(jié)合能力相比，這里的每一個(gè)突變都減少了變態(tài)反應(yīng)原突變體的特異的IgE結(jié)合能力；其中每一個(gè)初級(jí)突變都是用其他的殘基替換一個(gè)表面暴露的氨基酸殘基，在該天然存在的變態(tài)反應(yīng)原所源自的分類學(xué)物種中用作替換的殘基不發(fā)生于任何已知同源蛋白質(zhì)氨基酸序列的相同位置上；其中每一個(gè)初級(jí)突變都與任一其他的初級(jí)突變間隔至少15；且其中初級(jí)突變這樣放置，以使得至少一個(gè)具有8002面積的圓形表面區(qū)域不包含突變。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的重組變態(tài)反應(yīng)原，其中初級(jí)突變以20間隔，優(yōu)選25且最優(yōu)選30。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的重組變態(tài)反應(yīng)原，其包含許多二級(jí)突變，與該天然存在的變態(tài)反應(yīng)原的IgE結(jié)合能力相比，這其中的每一個(gè)二級(jí)突變都減少了變態(tài)反應(yīng)原突變體的特異的IgE結(jié)合能力；其中每一個(gè)二級(jí)突變都是用其他的殘基替換一個(gè)表面暴露的氨基酸殘基，在該天然存在的變態(tài)反應(yīng)原所源自的分類學(xué)物種中該用作替換的殘基不發(fā)生于任何已知同源蛋白質(zhì)氨基酸序列的相同位置上；其中的二級(jí)突變位于所述圓形表面區(qū)域之外。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)的重組變態(tài)反應(yīng)原，其中至少一個(gè)在天然存在的變態(tài)反應(yīng)原中要被替換的表面暴露的氨基酸具有超過20％的溶劑可接近性，優(yōu)選超過30％，更優(yōu)選超過40％且最優(yōu)選超過50％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)的重組變態(tài)反應(yīng)原，其中至少一個(gè)在天然存在的變態(tài)反應(yīng)原中要被替換的表面暴露的氨基酸在該天然存在的變態(tài)反應(yīng)原所源自的物種中所有已知的同源蛋白質(zhì)中具有保守性超過70％，優(yōu)選80％且最優(yōu)選為90％。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任何一項(xiàng)的重組變態(tài)反應(yīng)原，它基本上具有與該天然存在的變態(tài)反應(yīng)原相同的α-碳主鏈三級(jí)結(jié)構(gòu)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任何一項(xiàng)的重組變態(tài)反應(yīng)原，其中每一個(gè)要插入變態(tài)反應(yīng)原突變體的氨基酸殘基在該天然存在的變態(tài)反應(yīng)原所源自的分類學(xué)屬，優(yōu)選亞科，更優(yōu)選科，更優(yōu)選總科，更優(yōu)選軍團(tuán)(legion)，更優(yōu)選亞目且最優(yōu)選目中都不發(fā)生于任何已知同源蛋白質(zhì)氨基酸序列的相同位置上。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任何一項(xiàng)的重組變態(tài)反應(yīng)原，其特征在于對(duì)突變的變態(tài)反應(yīng)原的特異的IgE結(jié)合減少至少5％，優(yōu)選至少10％。
9.根據(jù)權(quán)利要求6的重組變態(tài)反應(yīng)原，其特征在于當(dāng)比較突變體和天然存在的變態(tài)反應(yīng)原分子的α-碳主鏈三級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，原子坐標(biāo)的平均根均方偏差優(yōu)選低于2。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任何一項(xiàng)的重組變態(tài)反應(yīng)原，其特征在于所述圓形表面區(qū)域包含15～25個(gè)氨基酸殘基的原子。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任何一項(xiàng)的重組變態(tài)反應(yīng)原，其特征在于將表面暴露的氨基酸殘基以溶劑可接近性分級(jí)，并將處于較高的溶劑可接近性的一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任何一項(xiàng)的重組變態(tài)反應(yīng)原，其特征在于將表面暴露的氨基酸殘基以在該天然存在的變態(tài)反應(yīng)原所源自的物種中的所有已知同源蛋白質(zhì)中的保守程度分級(jí)，將處于較高保守性的氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)替換。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任何一項(xiàng)的重組變態(tài)反應(yīng)原，其中的變態(tài)反應(yīng)原突變體是非天然存在的變態(tài)反應(yīng)原。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任何一項(xiàng)的重組變態(tài)反應(yīng)原，其包含5～20個(gè)，優(yōu)選6～15個(gè)，更優(yōu)選7～12個(gè)，且最優(yōu)選8～10個(gè)初級(jí)突變。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任何一項(xiàng)的重組變態(tài)反應(yīng)原，其特征在于該變態(tài)反應(yīng)原突變體包含1～4個(gè)二級(jí)突變對(duì)應(yīng)每個(gè)初級(jí)突變。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任何一項(xiàng)的重組變態(tài)反應(yīng)原，其特征在于一個(gè)或多個(gè)替換由定點(diǎn)突變實(shí)現(xiàn)。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任何一項(xiàng)的重組變態(tài)反應(yīng)原，其特征在于一個(gè)或多個(gè)替換由DNA改組實(shí)現(xiàn)。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-17中任何一項(xiàng)的重組變態(tài)反應(yīng)原，其特征在于它是吸入型變態(tài)反應(yīng)原的突變體。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的重組變態(tài)反應(yīng)原，其特征在于它是花粉變態(tài)反應(yīng)原的突變體。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的重組變態(tài)反應(yīng)原，其特征在于它是源自分類目Fagales、Oleales和Pinales的花粉變態(tài)反應(yīng)原的突變體。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的重組變態(tài)反應(yīng)原，其特征在于它是Bet v 1的突變體。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的重組變態(tài)反應(yīng)原，其特征在于一種或多種替換選自V2、D72、E87、K-129、E-60、N-47、K-65、P-108、N-159、D-93、K-123、K-32、D-125、R-145、D-109、E-127、Q-36、E-131、L-152、E-6、E-96、D-156、P-63、H-76、E-8、K-134、E-45、T-10、V-12、K-20、S-155、H-126、P-50、N-78、K-119、V-2、L-24、E-42、N-4、A-153、I-44、E-138、G-61、A-130、R-70、N-28、P-35、S-149、K-103、Y-150、H-154、N-43、A-106、K-115、P-14、Y-5、K-137、E-141、E-87和E-73。
23.根據(jù)權(quán)利要求19的重組變態(tài)反應(yīng)原，其特征在于它是源自分類目Poales的花粉變態(tài)反應(yīng)原的突變體。
24.根據(jù)權(quán)利要求19的重組變態(tài)反應(yīng)原，其特征在于它是源自分類目Asterales和Urticales的花粉變態(tài)反應(yīng)原的突變體。
25.根據(jù)權(quán)利要求18的重組變態(tài)反應(yīng)原，其特征在于它是屋塵螨變態(tài)反應(yīng)原的突變體。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的重組變態(tài)反應(yīng)原，其特征在于它是源自嗜皮螨屬(Dermatophagoides)的螨變態(tài)反應(yīng)原的突變體。
27.根據(jù)權(quán)利要求18的重組變態(tài)反應(yīng)原，其特征在于它是蟑螂變態(tài)反應(yīng)原的突變體。
28.根據(jù)權(quán)利要求18的重組變態(tài)反應(yīng)原，其特征在于它是動(dòng)物變態(tài)反應(yīng)原的突變體。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的重組變態(tài)反應(yīng)原，其特征在于它是源自貓、狗或馬的動(dòng)物變態(tài)反應(yīng)原的突變體。
30.根據(jù)權(quán)利要求1-17中任何一項(xiàng)的重組變態(tài)反應(yīng)原，其特征在于它是毒液變態(tài)反應(yīng)原的突變體。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的重組變態(tài)反應(yīng)原，其特征在于它是源自分類學(xué)膜翅目(Hymenoptera)的毒液變態(tài)反應(yīng)原的突變體。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的重組變態(tài)反應(yīng)原，其特征在于它是來自分類學(xué)目胡蜂(Vespidae)、蜜蜂(Apidae)和蟻(Formicoidae)的毒液變態(tài)反應(yīng)原的突變體。
33.根據(jù)權(quán)利要求30-32中任何一項(xiàng)的重組變態(tài)反應(yīng)原，其特征在于它是Ves v 5的突變體。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的重組變態(tài)反應(yīng)原，其特征在于一或多個(gè)替換選自K-16、K-185、K-11、K-44、K-210、R-63、K-13、F-6、K-149、K-128、E-184、K-112、F-157、E-3、K-29、N-203、N-34、K-78、K-151、L-15、L-158、Y-102、W-186、K-134、D-87、K-52、T-67、T-125、K-150、Y-40、Q-48、L-65、K-81、Q-101、Q-208、K-144、N-8、N-70、H-104、Q-45、K-137、K-159、E-205、N-82、A-111、D-131、K-24、V-36、N-7、M-138、T-209、V-84、K-172、V-19、D-56、P-73、G-33、T-106、N-170、L-28、T-43、Q-114、C-10、K-60、N-31、K-47、E-5、D-145、V-38、A-127、D-156、E-204、P-71、G-26、Y-129、D-141、F-201、R-68、N-200、D-49、S-153、K-35、S-39、Y-25、V-37、G-18、W-85和I-182。
35.根據(jù)權(quán)利要求1-34中任何一項(xiàng)用作藥物的重組變態(tài)反應(yīng)原。
36.根據(jù)權(quán)利要求1-34中任何一項(xiàng)的重組變態(tài)反應(yīng)原的用途，用于制備預(yù)防和/或治療變態(tài)反應(yīng)的藥物。
37.包含兩種或更多根據(jù)權(quán)利要求1-34中任何一項(xiàng)的重組變態(tài)反應(yīng)原突變體的組合物，其中每一個(gè)變體都以具有至少一個(gè)初級(jí)突變而定義，該突變?cè)谥辽僖粋€(gè)其他的變體中不存在；其中對(duì)于每一個(gè)變體，在每一個(gè)不存在的初級(jí)突變的15的半徑之內(nèi)不存在二級(jí)突變。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的組合物，包含2～12個(gè)，優(yōu)選3～10個(gè)，更優(yōu)選4～8個(gè)且最優(yōu)選5～7個(gè)變體。
39.根據(jù)權(quán)利要求37或38的用作藥物的組合物。
40.根據(jù)權(quán)利要求37或38的組合物的用途，用以制備預(yù)防和/或治療變態(tài)反應(yīng)的藥物。
41.藥物組合物，其特征在于它包含根據(jù)權(quán)利要求1-34中任何一項(xiàng)的重組變態(tài)反應(yīng)原或根據(jù)權(quán)利要求37或38的組合物，可選結(jié)合藥物學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑，以及可選結(jié)合佐劑。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的藥物組合物，其特征在于它為抗變態(tài)反應(yīng)疫苗的形式，該變態(tài)反應(yīng)由天然存在的變態(tài)反應(yīng)原在遭受變態(tài)反應(yīng)的患者中引起。
43.在被試者中產(chǎn)生免疫反應(yīng)的方法，包含向被試者施用根據(jù)權(quán)利要求1-34中任何一項(xiàng)的重組變態(tài)反應(yīng)原、根據(jù)權(quán)利要求37或38的組合物或根據(jù)權(quán)利要求41或42的藥物組合物。
44.對(duì)被試者進(jìn)行的疫苗接種或治療，包含向被試者施用根據(jù)權(quán)利要求1-34中任何一項(xiàng)的重組變態(tài)反應(yīng)原、根據(jù)權(quán)利要求37或38的組合物或根據(jù)權(quán)利要求41或42的藥物組合物。
45.制備根據(jù)權(quán)利要求41或42的藥物組合物的方法，其包含將根據(jù)權(quán)利要求1-34中任何一項(xiàng)的重組變態(tài)反應(yīng)原或根據(jù)權(quán)利要求37或38的組合物與藥物學(xué)上可接受的物質(zhì)和/或賦形劑混合。
46.由根據(jù)權(quán)利要求45的方法可獲得的藥物組合物。
47.在被試者中治療、預(yù)防或減輕變態(tài)反應(yīng)的方法，包含向被試者施用根據(jù)權(quán)利要求1-34中任何一項(xiàng)的重組變態(tài)反應(yīng)原、根據(jù)權(quán)利要求37或38的組合物或根據(jù)權(quán)利要求41或42中任何一項(xiàng)的藥物組合物。
48.制備根據(jù)權(quán)利要求1-34中任何一項(xiàng)重組變態(tài)反應(yīng)原的方法，其特征在于a)確定天然存在的變態(tài)反應(yīng)原中的一些氨基酸殘基，其具有至少20％的溶劑可接近性；b)以這樣的方式選擇至少4個(gè)確定的氨基酸殘基，以使得每個(gè)所選氨基酸與其他所選氨基酸相互間隔至少15，且所選氨基酸以這種方式分布，以使得至少一個(gè)具有8002面積的圓形表面區(qū)域不包含所選氨基酸；和c)對(duì)每個(gè)所選氨基酸進(jìn)行初級(jí)突變，使變態(tài)反應(yīng)原突變體的特異的IgE結(jié)合能力與天然存在的變態(tài)反應(yīng)原的IgE結(jié)合能力相比減少，其中每個(gè)初級(jí)突變都是用其他的氨基酸替換所選氨基酸殘基，前者在該天然存在的變態(tài)反應(yīng)原所源自的分類學(xué)物種中不發(fā)生于任何已知同源蛋白質(zhì)氨基酸序列的相同位置上。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其特征在于以溶劑可接近性對(duì)所述確定的氨基酸殘基進(jìn)行分級(jí)，且將具有較大溶劑可接近性的一或多個(gè)氨基酸替換。
50.根據(jù)權(quán)利要求48或49的方法，其特征在于選擇確定的氨基酸殘基，它們?cè)谠撎烊淮嬖诘淖儜B(tài)反應(yīng)原所源自的物種中的所有已知同源蛋白質(zhì)中以超過70％的一致性保守。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其特征在于以在該天然存在的變態(tài)反應(yīng)原所源自的物種中的所有已知同源蛋白質(zhì)中的保守程度來對(duì)其中確定的氨基酸殘基進(jìn)行分級(jí)，且將具有較大保守性的一或多個(gè)氨基酸替換。
52.根據(jù)權(quán)利要求48-51中任何一項(xiàng)的方法，包含選擇確定的氨基酸以形成變態(tài)反應(yīng)原突變體，后者具有與天然存在的變態(tài)反應(yīng)原基本上相同的α-碳主鏈三級(jí)結(jié)構(gòu)。
53.根據(jù)權(quán)利要求48-52中任何一項(xiàng)的方法，其特征在于對(duì)氨基酸殘基的替換通過定點(diǎn)突變實(shí)現(xiàn)。
54.制備根據(jù)權(quán)利要求1-34中任何一項(xiàng)的重組變態(tài)反應(yīng)原的方法，其特征在于該變態(tài)反應(yīng)原從由編碼相應(yīng)的天然存在的變態(tài)反應(yīng)原的DNA的進(jìn)行DNA改組(DNA shuffling)(分子培育)所獲得的DNA序列生產(chǎn)。
55.編碼根據(jù)權(quán)利要求1-34中任何一項(xiàng)的重組變態(tài)反應(yīng)原的DNA序列、其衍生物、其部分序列、其簡并的序列或在嚴(yán)緊條件下與其雜交的序列，其中該衍生物、部分序列、簡并序列或雜交序列編碼具有至少一個(gè)B細(xì)胞抗原決定部位的肽。
56.根據(jù)權(quán)利要求55的DNA序列，它是編碼天然存在的變態(tài)反應(yīng)原的DNA序列的衍生物。
57.根據(jù)權(quán)利要求56的DNA序列，其中的衍生物通過對(duì)編碼天然存在的變態(tài)反應(yīng)原的DNA的定點(diǎn)突變而獲得。
58.根據(jù)權(quán)利要求55-57中任何一項(xiàng)的DNA序列，其中該序列是圖3所示序列的衍生物，其中該DNA序列經(jīng)突變而編碼具有至少4個(gè)突變的變態(tài)反應(yīng)原，這些突變選自V2、D72、E87、K-129、E-60、N-47、K-65、P-108、N-159、D-93、K-123、K-32、D-125、R-145、D-109、E-127、Q-36、E-131、L-152、E-6、E-96、D-156、P-63、H-76、E-8、K-134、E-45、T-10、V-12、K-20、S-155、H-126、P-50、N-78、K-119、V-2、L-24、E-42、N-4、A-153、I-44、E-138、G-61、A-130、R-70、N-28、P-35、S-149、K-103、Y-150、H-154、N-43、A-106、K-115、P-14、Y-5、K-137、E-141、E-87和E-73。
59.根據(jù)權(quán)利要求55-57中任何一項(xiàng)的DNA序列，其中的序列是圖13所示序列的衍生物，其中該DNA序列經(jīng)突變而編碼具有至少4個(gè)突變的變態(tài)反應(yīng)原，這些突變選自K-16、K-185、K-11、K-44、K-210、R-63、K-13、F-6、K-149、K-128、E-184、K-112、F-157、E-3、K-29、N-203、N-34、K-78、K-151、L-15、L-158、Y-102、W-186、K-134、D-87、K-52、T-67、T-125、K-150、Y-40、Q-48、L-65、K-81、Q-101、Q-208、K-144、N-8、N-70、H-104、Q-45、K-137、K-159、E-205、N-82、A-111、D-131、K-24、V-36、N-7、M-138、T-209、V-84、K-172、V-19、D-56、P-73、G-33、T-106、N-170、L-28、T-43、Q-114、C-10、K-60、N-31、K-47、E-5、D-145、V-38、A-127、D-156、E-204、P-71、G-26、Y-129、D-141、F-201、R-68、N-200、D-49、S-153、K-35、S-39、Y-25、V-37、G-18、W-85和I-182。
60.根據(jù)權(quán)利要求55-57中任何一個(gè)的DNA序列，其中的序列是圖16所示序列的衍生物，其中的DNA序列經(jīng)突變而編碼具有至少4個(gè)突變的變態(tài)反應(yīng)原，這些突變選自R-128、D-129、H-11、H-30、S-1、K-77、Y-75、R-31、K-82、K-6、K-96、K-48、K-55、K-89、Q-85、W-92、I-97、H-22、V-65、S-24、H-74、K-126、L-61、P-26、N-93、D-64、I-28、K-14、K-100、E-62、I-127、E-102、E-25、P-66、L-17、G-60、P-95、E-53、V-81、K-51、N-103、Q-2、N-46、E-42、T-91、D-87、N-10、M-111、C-8、H-124、I-68、P-79、K-109和R-128、D-129、H-11、H-30、S-1、K-77、Y-75、R-31、K-82、K-6、K-96、K-48、K-55、K-89、Q-85、W-92、I-97、H-22、V-65、S-24、H-74、K-126、L-61、P-26、N-93、D-64、I-28、K-14、K-100、E-62、I-127、E-102、E-25、P-66、L-17、G-60、P-95、E-53、V-81、K-51、N-103、Q-2、N-46、E-42、T-91、D-87、N-10、M-111、C-8、H-124、I-68、P-79、K-109和K-15。
61.包含根據(jù)權(quán)利要求55-60中任何一項(xiàng)的DNA的表達(dá)載體。
62.包含權(quán)利要求61的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
63.生產(chǎn)重組變態(tài)反應(yīng)原突變體的方法，該方法包含培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求62的宿主細(xì)胞的步驟。
64.根據(jù)權(quán)利要求1-34中任何一項(xiàng)或由根據(jù)權(quán)利要求55-60中任何一項(xiàng)的DNA序列編碼的重組變態(tài)反應(yīng)原，其包含至少一種T細(xì)胞抗原決定部位，該抗原決定部位能夠刺激特異于該天然存在的變態(tài)反應(yīng)原的T細(xì)胞克隆或T細(xì)胞系。
65.用根據(jù)權(quán)利要求1-34中任何一項(xiàng)的重組變態(tài)反應(yīng)原突變體或根據(jù)權(quán)利要求37或38的組合物來估計(jì)對(duì)被試者治療的適當(dāng)性、安全性或結(jié)果的診斷測定，其中將被試者的含IgE的樣品與該突變體或該組合物混合并估計(jì)該樣品中的IgE和該突變體的反應(yīng)性水平。
全文摘要
本發(fā)明公開了具有多重突變及減小的IgE結(jié)合親和力的新型重組變態(tài)反應(yīng)原。該變態(tài)反應(yīng)原是天然變態(tài)反應(yīng)原的非天然存在的突變體。總的α－碳主鏈的三級(jí)結(jié)構(gòu)基本保守。本文也公開了制備這種重組變態(tài)反應(yīng)原的方法及其用途。
文檔編號(hào)C12N1/19GK1484699SQ01820783
公開日2004年3月24日 申請(qǐng)日期2001年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月16日
發(fā)明者J·霍爾姆, J 霍爾姆, H·伊普森, 丈, J·尼得加德拉爾森, 眉擁呂 , M·D·斯潘格福特, 斯潘格福特 申請(qǐng)人:阿爾克-阿貝洛有限公司