專利名稱：加工甲殼綱動(dòng)物物料的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶法加工甲殼綱動(dòng)物以便由此提供有用產(chǎn)物的方法。
背景技術(shù)：
在食品和飼料添加劑領(lǐng)域，特別在水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類方面，作為著色劑和/或抗氧化劑的類胡蘿卜素色料如蝦青素的用途正在不斷增大。水生動(dòng)物例如陸棲動(dòng)物通常不能合成蝦青素或其他類胡蘿卜素，但這類動(dòng)物中的一些，包括甲殼綱動(dòng)物，能積累存在于其飲食中的蝦青素。甲殼綱動(dòng)物具有將胡蘿卜素轉(zhuǎn)變?yōu)槲r青素的能力。鮭魚和紅海鯉魚能積累食物中的蝦青素，但這些魚不能將其他胡蘿卜素轉(zhuǎn)變?yōu)槲r青素。因此，存在于鮭魚中的蝦青素必須由食物這一來源取得。
近來，合成的蝦青素被用作飼養(yǎng)魚的供染色的飼料添加劑，以生成它所需的特征微紅色。然而，消費(fèi)者的關(guān)心已導(dǎo)致提供天然蝦青素以取代合成蝦青素這一不斷增長(zhǎng)的要求?？紤]到近來對(duì)天然產(chǎn)物的廣泛青睞，這應(yīng)該是不言自明的。
甲殼綱動(dòng)物加工工業(yè)的發(fā)展伴隨著產(chǎn)生大量含蝦青素的甲殼綱動(dòng)物廢棄物。蝦的加工包括除去蝦頭和硬殼，它們的數(shù)量高達(dá)整蝦的70％。雖然用甲殼綱動(dòng)物廢棄物喂養(yǎng)魚能夠?qū)︳~肉進(jìn)行染色，但這一辦法有若干缺點(diǎn)。這些缺點(diǎn)包括染色水平不恒定，原始的甲殼綱廢棄物易于迅速腐敗。它們的體積龐大、運(yùn)輸費(fèi)用高及甲殼質(zhì)含量高。對(duì)它被大量用作魚飼料來說，與其中所不希望的高含量甲殼質(zhì)和高含量鈣相比，甲殼綱動(dòng)物廢棄物中的類胡蘿卜素色料含量是太低了。
萃取色料的各種化學(xué)方法例如從甲殼綱動(dòng)物廢棄物萃取，以及將它們加到魚飼料中，這些均已有所描述。Chen等人在《食品科學(xué)雜志》(Journal ofFood Science)vol 47/3，892-900，1982中描述了單獨(dú)用豆油或與蛋白酶一起從甲殼綱動(dòng)物中萃取蝦青素。也描述用有機(jī)溶劑萃取蝦青素。
若干參考文獻(xiàn)公開了包括從甲殼綱動(dòng)物中萃取蝦青素的蛋白酶處理方法，這可以參考例如，Simpson及Haard，《應(yīng)用生物化學(xué)雜志》(Joumal of AppliedBiochemistry)7，212-222，1985；Chen及Meyers，《食品科學(xué)雜志》(Joumal ofFood Science)vol 47，892-900，1982加拿大專利CA1,313,935也公開了用蛋白酶處理甲殼綱動(dòng)物廢棄物。在《美國化學(xué)會(huì)論文摘要》(Abstract of Papers，American Chemical Society)vol.231 p7-IEC，1997中公開了用胰蛋白酶從甲殼綱動(dòng)物廢棄物中萃取胡蘿卜素蛋白質(zhì)。
JP 60-35057A公開了用溶劑從磷蝦中萃取橙色染料，萃取后往萃取液中加入脂肪酶或堿以分解脂肪酸，以及在超臨界態(tài)用一種液體從萃取液中分離出此染料。
JP 62-001 79A公開了從磷蝦中萃取和分離有色物，其中使用蛋白酶，在超臨界態(tài)用二氧化碳從磷蝦中萃取蛋白質(zhì)。
JP 62-190090A公開了使用酶例如淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶從蔬菜物料例如胡蘿卜、南瓜中萃取色料。
總的來說，近來在市場(chǎng)上要求取代合成法生產(chǎn)的蝦青素，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)天然的有色色料如蝦青素的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，用具有磷脂酶活性的脂解酶對(duì)甲殼綱動(dòng)物物料進(jìn)行的酶處理促進(jìn)了從甲殼綱動(dòng)物物料萃取帶色色料。該處理法對(duì)萃取甲殼綱動(dòng)物物料中的其他有用組分也是有利的。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種從甲殼綱運(yùn)動(dòng)物料回收帶色色料例如蝦青素和/或甲殼質(zhì)或脫乙酰殼多糖和/或溶血卵磷脂的方法。
本發(fā)明涉及加工甲殼綱動(dòng)物的方法，包括用脂解酶例如脂肪酶或磷脂酶處理甲殼綱動(dòng)物物料。可以將脂解酶處理后的甲殼綱動(dòng)物物料可進(jìn)行另外的加工步驟。本發(fā)明的方法生成若干種適用的產(chǎn)物和這些產(chǎn)物的若干用途。因此，本發(fā)明也涉及用這里所述的方法所獲得的產(chǎn)物，并涉及這些產(chǎn)物的用途，如喂養(yǎng)動(dòng)物。
本發(fā)明的詳細(xì)說明本發(fā)明人已開發(fā)一種生產(chǎn)天然色料的有效方法。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種從甲殼綱動(dòng)物物料回收有色色料例如蝦青素的方法。因此，本發(fā)明涉及一種加工甲殼綱動(dòng)物的方法，包括用脂解酶處理甲殼綱動(dòng)物物料的步驟(i)。
甲殼綱動(dòng)物物料在本發(fā)明的方法中，此甲殼綱動(dòng)物物料可以是包括完整的甲殼綱動(dòng)物或其一部分的任何物料。此甲殼綱動(dòng)物可以是任何來源的；因此此甲殼綱動(dòng)物可以得自海水源或淡水源。這類甲殼綱動(dòng)物包括但不限地生物體例如磷蝦、蝦(包括對(duì)蝦)、蟹、龍蝦(包括挪威龍蝦)及?？?。因此，在本發(fā)明方法中加工的甲殼綱動(dòng)物物料可以得自選自這一組的生物體。得自不同種甲殼綱動(dòng)物的混合物的甲殼綱動(dòng)物物料也被包括在內(nèi)，例如這里所提及的這些生物體的任何兩種或多種的混合物。就實(shí)現(xiàn)步驟(i)的酶處理的目的來說，此甲殼綱動(dòng)物物料可以是任何含微紅色/橙色色料的甲殼綱動(dòng)物有機(jī)體或其一部分。甲殼綱動(dòng)物物料優(yōu)選是含所需色料的固體甲殼綱動(dòng)物物料。因此應(yīng)該明白，在本發(fā)明方法的步驟(i)中被處理的甲殼綱動(dòng)物物料含有色料，特別是類胡蘿卜素。因而在步驟(i)之前這些化合物尚未被從甲殼綱動(dòng)物物料中萃取出來。然而人們期待，在步驟(i)中甲殼綱動(dòng)物物料的脂解酶處理除了促進(jìn)從該甲殼綱動(dòng)物物料萃取色料外，還具有其他優(yōu)點(diǎn)。因而對(duì)本發(fā)明的某些實(shí)施方案來說，在甲殼綱動(dòng)物物料中存在微紅色/橙色色料不是必不可少的標(biāo)準(zhǔn)，這取決于這種酶處理的目的。人們注意到在本發(fā)明的上下文中，蝦和磷蝦是特別令人感興趣的甲殼綱動(dòng)物生物體。
如已指出的，此甲殼綱動(dòng)物物料可以由完整的甲殼綱動(dòng)物(例如完整的蝦)或其一部分(例如殼)組成。此甲殼綱動(dòng)物物料也可含有來自例如蝦加工工業(yè)的甲殼綱動(dòng)物(如蝦)的廢殼、卵和頭，或由這些廢殼、卵和頭組成。因此，在某些實(shí)施方案中，此甲殼綱動(dòng)物物料可以基本上由蝦殼組成。所以此甲殼綱動(dòng)物物料可含有“完整的”甲殼綱動(dòng)物生物體(即例如是甲殼綱動(dòng)物殼和甲殼綱動(dòng)物“肉”)或它們的一部分(即例如僅是殼)，或由它們組成。形成或構(gòu)成甲殼綱動(dòng)物物料的“完整的”甲殼綱動(dòng)物有機(jī)體或甲殼綱動(dòng)物有機(jī)體的“一部分”，在進(jìn)行酶處理之前或之中可以被分割為更細(xì)的部分，例如是但不限于研碎的殼片，或者它可以是完整的，例如是但不限于整磷蝦或整蝦。
人們了解，在步驟(i)中的被脂解酶處理的甲殼綱動(dòng)物物料不是這里所定義的甲殼綱動(dòng)物萃取液。
酶處理除了用脂解酶進(jìn)行的甲殼綱動(dòng)物物料的處理外，根據(jù)本發(fā)明的方法可以包括用一種或多種非脂解酶進(jìn)行的甲殼綱動(dòng)物物料的處理。這種甲殼綱動(dòng)物物料用一種或多種非脂解酶進(jìn)行的處理可以在脂解酶活性處理之前、之中或之后進(jìn)行。
一種優(yōu)選實(shí)施方案中，此甲殼綱動(dòng)物物料用一種蛋白酶進(jìn)行處理。也注意到在其他實(shí)施方案中此甲殼綱動(dòng)物物料不用蛋白酶處理。這種蛋白酶處理可以與磷脂酶處理同時(shí)進(jìn)行。在另一些實(shí)施方案中，甲殼綱動(dòng)物物料首先在水溶液中用蛋白酶處理，隨后將從液相中分離而得的固相用一種或多種脂解酶進(jìn)行處理。
用于本發(fā)明方法的酶可以是單組份酶制劑(例如僅存在一種蛋白酶)，或者它可以是混合酶制劑(例如若干種酶的混合物和/或若干種不同酶的混合物，例如脂解酶(如脂肪酶和磷脂酶)的混合物)。
本發(fā)明的方法還可還包括滅活和/或除去所加酶的步驟，以獲得基本上不含該酶活性的產(chǎn)品。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明方法包括使脂解酶失活和/或除去脂解酶以獲得基本上不含該脂解活性的產(chǎn)品。
在廣泛方面，本發(fā)明涉及從甲殼綱動(dòng)物物料中萃取出有色色料的方法，包括用能促進(jìn)這種萃取的脂解酶處理甲殼綱動(dòng)物物料的步驟。
在另一方面，本發(fā)明涉及從含類胡蘿卜素物質(zhì)(例如甲殼綱動(dòng)物或植物)中萃取出類胡蘿卜素的方法，包括用能促進(jìn)這種萃取的脂解酶處理含類胡蘿卜素的物質(zhì)。
本發(fā)明特別感興趣的脂解酶是這里所述的能促進(jìn)從甲殼綱動(dòng)物物料萃取出類胡蘿卜素的脂解酶，或者能促進(jìn)從任何別的物質(zhì)分離出類胡蘿卜素的脂解酶。
這種類胡蘿卜素是任何存在于用這里所述的脂解酶處理的物質(zhì)之中的類胡蘿卜素。這種類胡蘿卜素可以是例如蝦青素或蝦青素衍生物如蝦青素酯，β-胡蘿卜素、斑蝥黃(cantaxanthin)和玉米黃質(zhì)、葉黃素、tunaxanthin、巖藻黃質(zhì)及halocynthiaxanthin，或者前述各物質(zhì)的混合物。在本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，在步驟(i)用脂解處理法從甲殼綱動(dòng)物物料中將蝦青素萃取出來。另一種描述酶處理效果的方法關(guān)于是從甲殼綱動(dòng)物物料萃取出的色料的顏色，即關(guān)于萃取液的顏色。本發(fā)明的方法提供了一種加工甲殼綱動(dòng)物的方法，其中，與不用這種脂解酶處理的方法相比，在步驟(i)中，用脂解酶處理，從該甲殼綱動(dòng)物物料中萃取出更多微紅色和/或橙色色料(例如蝦青素)。在一些本發(fā)明方法的實(shí)施方案中，與不用這種脂解酶處理的相似方法相比，步驟(i)中用酶處理，至少多于1/2倍、至少多于2倍或至少多于10倍的類胡蘿卜素，例如蝦青素被從該甲殼綱動(dòng)物物料中萃取出來。
用于本發(fā)明方法中的脂解酶可以是任何脂解酶。
脂解酶是將羧酸酯鍵水解的酶。取決于底物的特性，即于所選擇的底物中在所選擇酯鍵上的活性，此活性可進(jìn)行分類，例如脂肪酶、溶血磷脂酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2或二半乳糖基二甘油脂(DGDG)水解酶。
底物特性因此，脂解酶是將羧酸酯鍵水解的酶。這些酶可具有下列活性中的一種或多種，每一種以在底物中的某一酯鍵上的作用來定義。圓括號(hào)內(nèi)的數(shù)字是根據(jù)酶的酶活性類型，由國際生物化學(xué)聯(lián)盟酶委員會(huì)指定的系統(tǒng)數(shù)。
■脂肪酶(三?；视椭久?，EC 3.1.1.3)，對(duì)三酸甘油酯特別是長(zhǎng)鏈(C16-C20)的三酸甘油酯中的脂肪?；鹱饔?。
■磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)，對(duì)完整磷脂例如卵磷脂1-位的脂肪?；鹱饔谩?br> ■磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)，對(duì)完整磷脂例如卵磷脂2-位的脂肪?；鹱饔?。
■溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)，對(duì)溶血磷脂例如溶血卵磷脂的脂肪?；鹱饔?。
每一種活性均可以或者用國際單位(IU)或者用在WO 00/32758中所給出的或在本說明書中給出的檢驗(yàn)方法進(jìn)行定量。
因此，本發(fā)明提供了一種加工甲殼綱動(dòng)物物料的方法，包括將脂解酶例如磷脂酶加到甲殼綱動(dòng)物物料之中。一種實(shí)施方案涉及一種加工甲殼綱動(dòng)物物料的方法，包括將至少兩種具有不同底物特性例如磷脂酶活性和脂肪酶活性的脂解酶(例如兩種脂解酶)加到甲殼綱動(dòng)物物料之中。
脂肪酶活性(LU)使用阿拉伯膠作乳化劑，通過使三丁精(三丁酸甘油酯)乳化而制備脂肪酶用的底物。三丁精在pH7之下于30℃水解后接著進(jìn)行pH滴定實(shí)驗(yàn)。脂肪酶活性1單位(1LU)等于在標(biāo)準(zhǔn)條件下可釋放出1微摩爾丁酸/分鐘的酶的數(shù)量。
磷脂酶活性(PHLU)磷脂酶活性(PHLU)以從卵磷脂釋放出的游離脂肪酸測(cè)定。往50微升4％L-α-磷脂酰膽堿(由Avanti得到的植物卵磷脂)，4％Triton X-100，在50毫摩爾HEPES中的5毫摩爾CaCl2，pH7中，加入在50毫摩爾HEPES中的已稀釋到合適濃度的50微升酶溶液，pH7。此樣品在30℃下培養(yǎng)10分鐘，在離心(7000rpm下5分鐘)之前于95℃下停止反應(yīng)5分鐘。用購自Wako Chemicals GmbH的NEFA C試劑盒測(cè)定游離的脂肪酸；25微升反應(yīng)混合物中加入250微升試劑A，并在37℃下培養(yǎng)10分鐘。然后加500微升試劑B，又在37℃將樣品在37℃下再培養(yǎng)10分鐘。用HP8452A二極管陣列分光光度計(jì)在550nm處測(cè)定其吸收。樣品試驗(yàn)至少兩次。底物與酶掩蔽物(已預(yù)熱的酶樣品(在95℃下10分鐘)+底物)也被包括在內(nèi)。油酸被用作脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)。1PHLU等于在這些條件下可釋放出1微摩爾游離脂肪酸/分鐘的酶的數(shù)量。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，脂解酶是具有磷脂酶活性的脂解酶，例如脂肪酶和/或磷脂酶，或它們的混合物。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，此脂解酶是磷脂酶。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，此酶是脂肪酶。
磷脂類，例如卵磷脂，由被兩個(gè)脂肪酸酯化的甘油組成，在甘油的外部(sn-1)及中間(sn-2)這兩個(gè)位置被酯化，在第三個(gè)位置則被磷酸酯化；此磷酸本身則又被氨基醇酯化。磷脂酶是參與磷脂的水解的酶?？梢詤^(qū)分若干類型的磷脂酶，包括磷脂酶A1和A2，它們水解1個(gè)脂肪?；?分別在sn-1和sn-2位置)，形成溶血磷脂；而溶血磷脂酶(或磷脂酶B)，它能將溶血磷脂中殘留的脂肪?；?。因此，在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及有能力把在磷脂中的一個(gè)和/或兩個(gè)脂肪?；獾拿傅挠猛?。
磷脂酶活性可由也具有其他活性的酶例如具有磷脂酶活性的脂肪酶來提供。磷脂酶活性可以例如來自具有磷脂酶次活性的脂肪酶。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，磷脂酶活性由基本上僅具有磷脂酶活性的酶來提供，其中磷脂酶酶活性不是次活性。在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，磷脂酶不是具有如WO 98/26057所定義的磷脂酶次活性的脂肪酶。
此磷脂酶可以是具有一種多種下列活性的酶磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)，磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)，磷脂酶B，溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)。
在一種更優(yōu)選實(shí)施方案中，脂解酶是磷脂酶A1或磷脂酶A2。在一種實(shí)施方案中，在步驟(i)中的甲殼綱動(dòng)物物料用1種或多種選自磷脂酶A1和A2的磷脂酶進(jìn)行培養(yǎng)。
在一種實(shí)施方案中，磷脂酶在磷脂酶處理?xiàng)l件下不具有或僅具有低的甘油三酯脂肪酶活性(EC 3.1.1.3)。脂肪酶與磷脂酶的合適比例可以低于0.001LU/LEU或低于0.005(特別是低于0.001)PHLU/KLU(其單位如上所定義)。
為了處理甲殼綱動(dòng)物物料，甲殼綱動(dòng)物物料如這里所公開的用有效量的酶進(jìn)行培養(yǎng)。術(shù)語“有效量”在這里被定義為它足以在至少一種與加工甲殼綱動(dòng)物(特別是萃取色料，例如從甲殼綱動(dòng)物物料提取蝦青素)有關(guān)的性能方面產(chǎn)生適當(dāng)作用的酶數(shù)量。
磷脂酶的使用劑量，以干固體的重量計(jì)，典型地為0.001-0.05％酶蛋白質(zhì)。市場(chǎng)供應(yīng)的活性為10,000LEU/g的磷脂酶產(chǎn)品的使用劑量，以干固體的重量計(jì)為20-500ppm。
用于本發(fā)明的酶在適于加工甲殼綱動(dòng)物的pH和溫度范圍內(nèi)優(yōu)選具有合適的酶活性。在一種實(shí)施方案中，在寬廣的pH和溫度范圍內(nèi)，這些酶具有活性。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，用于本發(fā)明方法的酶，包括這里所述的脂解酶，其最佳pH在約3～10的范圍內(nèi)。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些酶，包括在這里所述的脂解酶，其最佳pH在約4.5～8.5的范圍內(nèi)。
在別的實(shí)施方案中，這些酶，包括這里所述的脂解酶，其最佳溫度在約5℃～100℃的范圍內(nèi)。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些酶，包括這里所述的脂解酶，其最佳溫度在約25℃～75℃的范圍內(nèi)。
用于本發(fā)明方法的這些酶，特別是脂解酶可以由任何來源例如植物、微生物體或動(dòng)物獲得。這些酶包括脂解酶，可以是真核生物的，例如來自霉菌源或動(dòng)物源的。得自動(dòng)物源的脂解酶的例子是得自蜂毒液或蛇毒液，或者得自哺乳動(dòng)物胰腺例如豬胰腺的磷脂酶。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，這些酶優(yōu)選得自微生物源例如細(xì)菌或霉菌，如細(xì)絲霉菌或酵母。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，脂解酶是原核酶，具體是細(xì)菌酶，例如來自假單胞菌屬(Pseudmonas)或芽孢桿菌屬(Bacillus)的。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，這些酶來自細(xì)菌源。例如，這些酶可來自醋桿菌屬(Acetobacter)，不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)，土壤桿菌屬(Agrobacterium)，產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)，節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)，固氮桿菌屬(Azotobacter)，芽孢桿菌屬(Bacillus)，叢毛單孢菌屬(Comamonas)，梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)，葡糖桿菌屬(Gluconobacter)，鹽桿菌屬(Halobacterium)，分枝桿菌屬(Mycobacterium)，根瘤菌屬(Rhizobium)，沙門氏菌屬(Salmonella)，沙雷氏菌屬(Serratia)，鏈霉菌屬(Streptomyces)，大腸桿菌屬(E.coli)，假單胞菌屬(Pseudomonas)，沃林氏菌屬(Wolinella)，或甲基營(yíng)養(yǎng)生物的細(xì)菌菌株。
在更優(yōu)選實(shí)施方案中，這些酶來自醋酸化醋桿菌(Acetobacter aceti)，糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes faecalis)，氧化節(jié)桿菌(Arthrobacter oxidans)，棕色固氮桿菌(Azotobacter vinelandii)，嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alkalophilus)，解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)，anitratum芽孢桿菌(Bacillus anitratum)，短芽孢桿菌(Bacillus brevis)，環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)，凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)，燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)，緩慢芽孢桿菌(Bacilluslentus)，地衣形芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)，巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)，嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，蘇六金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)，睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)，絡(luò)丁酸梭狀芽孢桿菌(Clostridiumtyrobutyricum)，dioxyaceticus葡糖桿菌(Gluconobacter dioxyaceticus)，液化葡糖桿菌(Gluconobacter liqueifaciens)，弱氧化葡糖桿菌(Gluconobactersuboxydans)，紅皮鹽桿菌(Halobacterium cutirubrum)，旋卷分枝桿菌(Mycobacterium convolutum)，苜蓿根瘤菌(Rhizobium melioti)，鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)，粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)，變青鏈霉菌(Streptomyces lividans)，鼠灰鏈霉菌(Streptomyces murinus)，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)，惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)，或產(chǎn)琥珀酸沃林氏菌(Wolinella succinogenes)菌株。
在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，這些酶來自霉菌源。例如，這些酶可以來自酵母菌株，如假絲酵母屬(Candida)，克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)，畢赤氏酵母屬(Pichia)，糖酵母屬(Saccharomyces)，裂殖糖酵母屬(Schizosaccharomyces)，或Yarrowia菌株；或來自細(xì)絲霉菌菌株如支頂孢屬(Acremonium)，曲霉屬(Aspergillus)，短柄霉屬(Aureobasidium)，金孢子菌屬(Chrysosporium)，隱球酵母屬(Cryptococcus)，F(xiàn)ilibasidium，鐮孢屬(Fusarium)，腐質(zhì)霉屬(Humicola)，Magnaporthe，念珠霉屬(Monilia)，毛霉屬(Mucor)，毀絲霉屬(Myceliophthora)，Neocallimastix，鏈孢解霉屬(Neurospora)，擬青霉屬(Paecilomyces)，青霉屬(Penicillium)，Phanerochaete，Piromyces，裂褶菌科(Schizophyllum)，小核菌屬(Sclerotium)，孢子絲菌屬(Sporotrichum)，踝節(jié)菌屬(Talaromyces)，熱子囊菌屬(Thermoascus)，草根霉屬(Thielavia)，Tolypocladium，或木霉屬(Trichoderma)菌株。
在另一更優(yōu)選實(shí)施方案中，這些酶來自卡爾斯伯糖酵母(Saccharomycescarlsbergensis)，啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)，糖化糖酵母(Saccharomyces diastaticus)，douglasii糖酵母(Saccharomyces douglasii)，kluyveri糖酵母(Saccharomyces kluyveri)，norbensis糖酵母(Saccharomycesnorbensis)，或卵形糖酵母(Saccharomyces oviformis)菌株。
在另一更優(yōu)選實(shí)施方案中，這些酶來自棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)，泡盛曲霉(Aspergillus awamori)，臭曲霉(Aspergillus foetidus)，日本曲霉(Aspergillus japonicus)，構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)，黑色曲霉(Aspergillus niger)，米曲霉(Aspergillus oryzae)，lignorum金孢子菌(Chrysosporium lignorum)，桿孢狀鐮孢(Fusarium bactridioides)，cerealis鐮孢(Fusarium cerealis)，crookwellense鐮孢(Fusarium crookwellense)，大刀鐮孢(Fusarium culmorum)，禾谷鐮孢(Fusarium graminearum)，禾赤鐮孢(Fusariumgraminum)，異孢鐮孢(Fusarium heterosporum)，合歡木鐮孢(Fusariumnegundi)，尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum)，多枝鐮孢(Fusarium reticulatum)，玖瑰色鐮孢(Fusarium roseum)，接骨木鐮孢(Fusarium sambucinum)，膚色鐮孢(Fusarium sarcochroum)，硫色鐮孢(Fusarium sulphureum)，toruloseum鐮孢(Fusarium toruloseum)，trichothecioides鐮孢(Fusarium trichothecioides)，venenatum鐮孢(Fusarium venenatum)，insolens腐質(zhì)霉(Humicola insolens)，lanuginose腐質(zhì)霉(Humicola lanuginosa)，好食念珠霉(Monilia sitophila)，米赫毛霉菌(Mucor miehei)，thermophila毀絲霉(Myceliophthora thermophila)，粗糙鏈孢鏈孢霉(Neurospora crassa)，產(chǎn)青青霉(Penicillium purpurogenum)，(Phanerochaete chrysporum)，pinsitus多孔菌(Polyporus pinsitus)，變色多孔菌(Polyporus versicolour)，整齊小核菌(Sclerotium rolfsii)，thermophile孢子絲菌Sporotrichum thermophile，citrinoviride木霉(Trichoderrna citrinoviride)，hamatum木霉(Trichoderma hamatum)，harzianum木霉(Trichodermaharzianum)，康寧氏木霉(Trichoderma koning)，longibrachiatum木霉(Trichoderma longibrachiatum)，polysporum木霉(Trichoderma ploysporum)，reesei木霉(Trichoderma reesei)，saturnisporum木霉(Trichodermasatumisporum)，或者綠色木霉(Trichoderma viride)菌株。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，霉菌脂解酶來自下列的屬或種腐質(zhì)霉屬(Humicola)(異名Thermomyces)，lanuginosa腐質(zhì)霉素(H.lanuginosa)(異名T.lanuginosus)，insolens腐質(zhì)霉素(H.insolens)，鐮孢屬(Fusarium)，尖孢鐮孢(F.oxysporum)，茄病鐮孢(F.solani)，異孢鐮孢(F.heterosporum)，曲霉屬(Aspergillus)，塔賓曲霉(A.tubigensis)，黑色曲霉(A.niger)，米曲霉(A.oryzae)，Rhizomucor，假絲酵母屬(Candida)，antarctica假絲酵母(C.antarctica)，青霉屬(Penicillium)，沙門氏柏干酪青霉(P.camembertii)，根霉屬(Rhizopus)，米根霉(Rhizopus oryzae)，或梨頭霉屬(Absidia)。
脂解酶的一些具體例子如下·得自豬胰腺的磷脂酶A2，Novozymes A/S以商品名LECITASETM出售的。
·得自H.lanuginose的脂肪酶，在EP 305216有描述，其氨基酸序列表示在US 5869438的SEQ ID No.2的位置1-269(以后稱作Hll或H.lanuginosa脂肪酶)。
·得自在WO 98/26057中描述的尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum)，具有脂肪酶和磷脂酶A1活性的酶(以后稱作FoL或尖孢鐮孢(F.oxysporum)脂肪酶/磷脂酶)。其分子量為30±2KDa，等電點(diǎn)為5.8-6.8，大于pH9具有最佳磷脂酶活性。
·在WO 01/27251中描述的酶。
或者，此脂解酶可以是通過改變?nèi)缟厦嫠龅奶烊淮嬖诿傅陌被嵝蛄卸玫降淖儺愺w。脂解酶變異體的例子描述在WO 00/32758。
在一種實(shí)施方案中，磷脂酶A1得自鐮孢屬菌株，具體是尖孢鐮孢，例如得自在WO 98/26057中描述的菌株DSM 2627，具體描述在權(quán)利要求36中和其中的SEQ ID No.2。
用于本發(fā)明方法中的這些酶，包括脂解酶(例如磷脂酶)可以是這樣一種酶，其氨基酸序列相同于天然酶，或者它可以具有改進(jìn)的氨基酸序列，例如具有一個(gè)或多個(gè)缺失的、插入的和/或取代的氨基酸，即一種重組生成的或合成生成的酶，它是天然氨基酸序列的突變型和/或片段。天然變異體包括在天然酶的含義內(nèi)。
用于本發(fā)明方法的酶可以采用任何適用方法獲得。例如，通過合適微生物的發(fā)酵及隨后用本技術(shù)領(lǐng)域公知方法從所得已發(fā)酵的發(fā)酵液或微生物中分離出磷脂酶制劑，而獲得磷脂酶制劑。因此，這些酶可以用任何適用技術(shù)，特別是使用本領(lǐng)域公知的重組DNA技術(shù)(見Sambrook，J.等人，1989，《分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，Cold SpringHarbor Press，Cold Spring Harbor，NY，USA)，從所述有機(jī)體獲得。重組DNA技術(shù)的采用通常包括在允許酶表達(dá)以及從培養(yǎng)物回收酶的條件下，在培養(yǎng)介質(zhì)中，將用重組DNA載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，而這種宿主細(xì)胞由在合適啟動(dòng)子與終止子之間插入的人們所關(guān)切的產(chǎn)品基因組成。此DNA序列可以是基因組的cDNA或合成的起點(diǎn)，或者是它們的任何混合物，而且它可以按照本技術(shù)領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行分離或合成。如上所述，這種酶也可以從它的天然存在源例如植物或有機(jī)物，或從它的有關(guān)部分獲得。這些酶也可以由商業(yè)供應(yīng)商例如丹麥的Novozymes A/S獲得。
因此，用于本發(fā)明方法的酶可以是任何適于所述使用的形態(tài)，例如干粉形態(tài)、聚集粉形態(tài)或粒狀形態(tài)(具體是非撒粉粒)、液體(具體是已穩(wěn)定的液體)、或者是已保護(hù)的酶。此酶制劑優(yōu)選是液體形態(tài)。
用于本發(fā)明中的術(shù)語“蛋白酶”在這里定義為催化肽鏈的水解的酶。應(yīng)該明白，術(shù)語“蛋白酶”包括肽鏈內(nèi)切酶和肽鏈端解酶(氨基肽酶和羧基肽酶)。加工步驟、所得產(chǎn)物及其用途本發(fā)明提供一種加工甲殼綱動(dòng)物的方法，它包括用一種或多種脂解酶處理甲殼綱動(dòng)物物料的步驟(i)。
對(duì)本發(fā)明的方法來說，在步驟(i)中用脂解酶處理甲殼綱動(dòng)物物料優(yōu)選在水成液中進(jìn)行。因此，甲殼綱動(dòng)物物料在步驟(i)之前或之中可以懸浮在水成液之中。
在酶處理之前，此懸浮的甲殼綱動(dòng)物物料可被加熱，或者可省去熱處理。
在步驟(i)中，酶處理可以在適于這種酶的任何溫度、pH及培養(yǎng)時(shí)間下進(jìn)行。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，在用酶處理之前調(diào)整pH。在另一實(shí)施方案中，在用酶處理之前pH不調(diào)整。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，pH值在約3～12的范圍。在另一實(shí)施方案中，pH在約4.5～8.5的范圍。
酶處理優(yōu)選在最佳于該酶的溫度下進(jìn)行。在某些實(shí)施方案中，酶處理在約5～100℃的溫度范圍下進(jìn)行。在其他實(shí)施方案中，此溫度在約10～90℃的范圍內(nèi)。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，此溫度在約20～75℃的范圍內(nèi)。
酶處理在任何適合時(shí)間內(nèi)進(jìn)行，這取決于存在的酶活性。酶處理可以進(jìn)行例如約10分鐘～約10時(shí)內(nèi)，如約30分鐘～約6小時(shí)。
在一實(shí)施方案中，由得自胰腺的磷脂酶A2在30-70℃、pH3-12(特別優(yōu)選4.5～8.5)下使用。在另一實(shí)施方案中，使用得自尖孢鐮孢(Fusariumoxysporum)的磷脂酶A1，溫度為20-50℃，pH3-12(特別優(yōu)選4.5～8.5)。
在某些實(shí)施方案中，甲殼綱動(dòng)物物料也與下列化合物中的一種或多種相接觸抗氧化劑(例如化學(xué)抗氧化劑如BHA＝丁基化羧基茴香醚和HT＝丁基化羥基甲苯)，物理抗氧化劑(例如氮氧層)，氧清除劑，例如酶清除劑，如漆酶，檸檬酸，EDTA，表面活性劑，凝膠化合物，調(diào)整pH的酸/堿，通常還有提高本發(fā)明方法可用的酶活性的化合物。
在低氧含量下進(jìn)行蝦青素的萃取可能是優(yōu)選的。在一實(shí)施方案中，如WO 96/31133所述，用漆酶處理來進(jìn)行萃取。在本發(fā)明中所用的術(shù)語“漆酶”在這里定義為苯二酚氧化還原酶，它在分子氧存在下將4個(gè)苯二酚催化轉(zhuǎn)化為4個(gè)苯并半醌和2個(gè)水。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，有一些方法，其中脂解酶處理過的甲殼綱動(dòng)物物料被進(jìn)一步加工成為消耗產(chǎn)物，包括例如飼料或食品(食品中包括飲料)，還包括飼料添加劑和食品添加劑。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，還有一些方法，其中脂解酶處理過的甲殼綱動(dòng)物物料被再加工成為化妝品或保健食品或功能食品或藥物。
本發(fā)明的方法，在步驟(i)之后或之中，還可包括從固體甲殼綱動(dòng)物物料中分離出液相(或稱作“甲殼綱動(dòng)物萃取液”或僅稱“萃取液”)。這一分離可采用任一合適工藝進(jìn)行，例如用離心法、篩分法或傾析法進(jìn)行。
在其他實(shí)施方案中，既不在步驟(i)之后也不在其過程中將液相從固體甲殼綱動(dòng)物物料中分離出。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，有一些方法，其中步驟(ii)的固體甲殼綱動(dòng)物物料被進(jìn)一步加工成為消耗產(chǎn)品，包括例如飼料或食品(食品中包括飲料)，還包括飼料添加劑和食品添加劑。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，還有一些方法，其中步驟(ii)的甲殼綱動(dòng)物固體被進(jìn)一步加工成為化妝品或保健食品或功能食品或藥物。
在一種實(shí)施方案中，固體甲殼綱動(dòng)物物料被進(jìn)一步加工，以便由它回收甲殼質(zhì)或脫乙酰殼多糖。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，還有一些方法，其中步驟(ii)的甲殼綱動(dòng)物萃取液被進(jìn)一步加工為消耗產(chǎn)品，包括例如飼料或食品(食品中包括飲料)，還包括飼料添加劑或食品添加劑。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，還有一些方法，其中步驟(ii)的甲殼綱動(dòng)物萃取液被再加工成為化妝品、保健品或功能食品或藥物。
可將萃取液濃縮?？捎萌魏芜m用工藝?yán)缯舭l(fā)、膜過濾和干燥進(jìn)行濃縮。在一種實(shí)施方案中，此方法包括一個(gè)步驟，其中萃取液被制成基本上是干的，即水份低例如約為5％，例如在約3％～10％的范圍。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，本方法還包括從液相提純已萃取的類胡蘿卜素化合物，以獲得富含類胡蘿卜素化合物的制劑。此回收的類胡蘿卜素制劑可以例如為含至少100ppm類胡蘿卜素的形式。在另一實(shí)施方案中，類胡蘿卜素化合物被從已水解的脂肪化合物如溶血卵磷脂中分離出來。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，不將類胡蘿卜素化合物從已水解的脂肪化合物例如溶血卵磷脂中分離出來。分離方法可以是膜過濾或其他的過濾步驟，和/或離子交換。
優(yōu)選的是，在步驟(i)之前甲殼綱動(dòng)物物料還未用有機(jī)溶劑處理。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，在步驟(i)之前，甲殼綱動(dòng)物物料還未用一種或多種有機(jī)溶劑處理，這些有機(jī)溶劑選自丙酮、正己烷和乙酸乙酯。
本發(fā)明還涉及萃取含在磷蝦中的有色色料的方法，此方法包括用蛋白酶分解磷蝦以除去蛋白質(zhì)，以及用脂解酶處理殘留的磷蝦。
在一個(gè)方面，用本發(fā)明方法的步驟(i)，從該甲殼綱動(dòng)物物料中萃取有色色料。
在一個(gè)方面，用本發(fā)明方法的步驟(i)，從該甲殼綱動(dòng)物物料中萃取微紅色和/或橙色色料。
在一個(gè)方面，用本發(fā)明方法的步驟(i)，從該甲殼綱動(dòng)物物料中萃取類胡蘿卜素。
在一個(gè)方面，用本發(fā)明方法的步驟(i)，從該甲殼綱動(dòng)物物料中萃取一種或多種類胡蘿卜素，這些類胡蘿卜素選自蝦青素，蝦青素衍生物例如蝦青素酯類，β-胡蘿卜素，斑蝥黃和玉米黃質(zhì)，葉黃素，tunaxanthin，巖藻黃質(zhì)和halocynthiaxanthin。
在一個(gè)方面，用本發(fā)明方法的步驟(i)，從該甲殼綱動(dòng)物物料中萃取蝦青素。
在一個(gè)方面，在本發(fā)明方法的步驟(i)，其中脂解酶是磷脂酶(例如磷脂酶A1和/或A2)，用磷脂酶酶處理法形成溶血卵磷脂，此產(chǎn)物被加至消耗產(chǎn)品例如飼料或食品中，消耗產(chǎn)品還包括飼料添加劑或食品添加劑。
優(yōu)選實(shí)施方案涉及生產(chǎn)有色色料的方法，包括下列步驟(i)在適于保證所述酶的酶活性的條件下，用含有有效量脂解酶的水成液來培養(yǎng)甲殼綱動(dòng)物物料；及(ii)從固體甲殼綱動(dòng)物物料中分離出含有已萃出的有色色料的液相。
一種更優(yōu)選的實(shí)施方案涉及生產(chǎn)蝦青素的方法，包括下列步驟(i)在適于保證所述酶的酶活性的條件下，用含有有效量脂解酶的水成液來培養(yǎng)基本上已粉碎的蝦殼；及(ii)從固體碎蝦殼中分離出含有已萃出的蝦青素的液相。
本發(fā)明還涉及用這里所公開的本發(fā)明任何方法特別是這里所公開的加工甲殼綱動(dòng)物物料的方法可獲得的或已獲得的產(chǎn)品的用途。
一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例涉及用本發(fā)明的方法能獲得的或已獲得的產(chǎn)品，其中步驟(i)中的脂解酶的磷脂酶，包括例如磷脂酶A1和/或磷脂酶A2，其中該可得到的或已得到的產(chǎn)品含有類胡蘿卜素例如蝦青素，和溶血卵磷脂。
本發(fā)明還涉及制備消耗產(chǎn)品的方法，此方法包括一個(gè)步驟，在此步驟中，由本發(fā)明任一方法(加工甲殼綱動(dòng)物物料)可獲得的或已獲得的產(chǎn)品被加至該消耗產(chǎn)品中。此消耗產(chǎn)品是例如飼料或食品，包括飼料添加劑或食品添加劑。
一種優(yōu)選實(shí)施方案涉及制備消耗產(chǎn)品的方法，包括一個(gè)步驟，其中(a)用本發(fā)明的加工甲殼綱動(dòng)物物料的方法可獲得的或已獲得的產(chǎn)品，而且在該方法的步驟(i)中的脂解酶是磷脂酶包括例如磷脂酶A1和/或磷脂酶A2，以及其中該可獲得的或已獲得的產(chǎn)品包含類胡蘿卜素例如蝦青素，和溶血卵磷脂；將這一可獲得的或已獲得的產(chǎn)品加至該消耗產(chǎn)品中。這種消耗產(chǎn)品是例如飼料或食品，包括飼料添加劑或食品添加劑。
本發(fā)明還涉及一種制備消耗產(chǎn)品的方法，這一方法包括一個(gè)步驟，其中在這里所述的加工甲殼綱動(dòng)物物料的方法步驟(ii)中所已獲得的或可獲得的甲殼綱動(dòng)物萃取液，被加到該消耗產(chǎn)品中；在步驟(ii)之后和加至消耗產(chǎn)品之前，此甲殼綱動(dòng)物萃取液可被進(jìn)一步加工。此消耗產(chǎn)品是例如飼料或食品，包括飼料添加劑或食品添加劑。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，此被加至消耗產(chǎn)品中的甲殼綱動(dòng)物萃取液是用這里所述的加工甲殼綱動(dòng)物方法已獲得的或可獲得的，其中在步驟(i)中的脂解酶是磷脂酶，包括磷脂酶A1和/或磷脂酶A2，而且該可獲得的或已獲得的產(chǎn)品含有類胡蘿卜素例如蝦青素，和溶血卵磷脂。
本發(fā)明還涉及含有蝦青素和溶血卵磷脂的組合物。
本發(fā)明還涉及消耗產(chǎn)品，例如食品或飼料，或食品添加劑或飼料添加劑，它們含有用這里公開的本發(fā)明的任何方法，特別是這里公開的加工甲殼綱動(dòng)物物料的方法可獲得或已獲得的產(chǎn)品，或由這些產(chǎn)品組成。
本發(fā)明還涉及消耗產(chǎn)品，例如飼料或食品，或者飼料添加劑或食品添加劑，它們含有用本發(fā)明的加工甲殼綱動(dòng)物物料的任何方法可獲得的或已獲得的產(chǎn)品，或由這些產(chǎn)品組成，其中步驟(i)的脂解酶是磷脂酶，包括例如磷脂酶A1和/或磷脂酶A2，而且該可獲得的或已獲得的產(chǎn)品含有類胡蘿卜素例如蝦青素，和溶血卵磷脂。
本發(fā)明在其另一方面涉及喂養(yǎng)動(dòng)物的方法，此方法包括用本發(fā)明的飼料或飼料添加劑喂養(yǎng)動(dòng)物。此動(dòng)物可例如是魚或家禽。此動(dòng)物可選自但不限于鮭科魚、海鯉魚、蝦及龍蝦。鮭科魚可以是真鱒或鮭魚。鮭魚可以是虹鱒，大西洋鮭、哥倫比亞河口鮭魚，coho鮭魚，粉紅鮭魚，魚餌鮭魚或太平詳鮭魚。此動(dòng)物也可以是甲殼綱動(dòng)物。家禽可選自但不限于產(chǎn)蛋母雞。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及喂養(yǎng)魚特別是幼魚的方法，此方法包括用包含蝦青素和溶血卵磷脂的飼料或飼料添加劑喂養(yǎng)魚(包括例如幼魚)。
用本發(fā)明方法獲得的類胡蘿卜素可用作著色劑和/或用作抗氧化劑。
本發(fā)明在另一方面涉及磷脂酶在生產(chǎn)蝦青素方面的用途。
在一種優(yōu)選實(shí)施中，本發(fā)明涉及脂解酶(例如磷脂酶如磷脂酶A1或磷脂酶A2)在從甲殼綱動(dòng)物物料萃取蝦青素方面的用途。
蝦青素也可用于加至食品例如幼魚和蛋、每日食品、蛇用食品等之中。
本發(fā)明在又一方面涉及磷脂酶在制備甲殼綱動(dòng)物食品或飼料，或者食品添加劑或飼料添加劑方面的用途。具體地說，本發(fā)明涉及磷脂酶在以甲殼綱動(dòng)物類胡蘿卜素為來源制備含類胡蘿卜素產(chǎn)品方面的用途。這也包括含有這里所公開的磷脂酶如磷脂酶A1或A2的酶制劑在以甲殼綱動(dòng)物類胡蘿卜素為來源制備含類胡蘿卜素產(chǎn)品方面的用途。
本發(fā)明的方法在下列方面優(yōu)于通常的蝦青素萃取方法本發(fā)明方法高產(chǎn)率地得到有色色料，例如蝦青素，以及其他有用組份例如甲殼質(zhì)或脫乙酰殼多糖和/或溶血卵磷脂。此外，酶萃取法被認(rèn)為是比化學(xué)萃取法更為消費(fèi)者希望的，因?yàn)榛瘜W(xué)萃取法使用有機(jī)溶劑。此外，本發(fā)明的方法提供對(duì)于合成法生產(chǎn)蝦青素來說期望的用自然資源的替代方法。
本發(fā)明用下列實(shí)施進(jìn)一步說明，這不應(yīng)被認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
酶處理時(shí)間為55℃下5小時(shí)，隨后在85℃加熱10分鐘。加熱后把樣品離心(3000rpm，10分鐘)以獲得作為上層清液的萃取液。
有色色料的測(cè)定用美能達(dá)制的套裝(coordinates)Lab測(cè)量顏色。
使用下列的酶1.來自解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的中性內(nèi)切蛋白酶制劑(NEUTRASE 0.8LTM)2.從豬胰腺萃取的胰蛋白酶(PTN 6.0STM)3.從豬胰腺萃取的具有很高磷脂酶A2活性的脂解酶制劑(LECITASE10LTM)4.源自Rhizomucor miehei的脂肪酶(PALATASE 20,000LTM)所有這些酶均得自丹麥的Novozymes A/S。
酶的劑量按表1
表1實(shí)驗(yàn)方案
結(jié)果萃取液的優(yōu)選顏色是紅色。當(dāng)單獨(dú)使用LECITASE 10LTM(磷脂酶A2)時(shí)得到的紅色強(qiáng)度最高(試樣5)。次最強(qiáng)紅色是試樣2，其中使用了LECITASE 10LTM(磷脂酶A2)和蛋白酶。因此，蛋白酶(NEUTRASETM)不增大紅色強(qiáng)度。用脂肪酶PALATASETM萃取時(shí)，與LECITASE 10L(磷脂酶A2)的試樣(5和2)相比，得到的橙色萃取液在紅色強(qiáng)度方面低很多。單獨(dú)用蛋白酶萃取的兩個(gè)試樣(分別使用中性酶(Neutrase)和胰蛋白酶，試樣1和3)僅顯示淺黃色。
酶處理時(shí)間為55℃下5小時(shí)，隨后在85℃加熱，時(shí)間為10分鐘。加熱后將樣品離心(3000rpm下離心10分鐘)以上層清液的形式得到萃取液。
如實(shí)施例1測(cè)定有色色料。
使用了下列的酶1.得自解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的中性內(nèi)切蛋白酶。(NEUTRASE 0.8LTM)2.萃取自豬胰腺的具有很高磷脂酶A2活性的脂解酶制劑(LECITASE10LTM)3.具有很高磷脂酶A1活性的尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum)脂解酶制劑(LECITASE NOVOTM)所有的酶均得自丹麥的Novozymes A/S。
酶劑量按表2。在用HCl調(diào)整至pH5.0下進(jìn)行試驗(yàn)2。
表2實(shí)驗(yàn)方案
結(jié)果具有不同磷脂酶活性(A1和A2)的兩種酶制劑均呈現(xiàn)顯著的所想要的紅色/橙色強(qiáng)度。在使用LECITASE 10L(磷脂酶A2)的試驗(yàn)1中獲得了最高的紅色強(qiáng)度。與參考實(shí)施例相比，試驗(yàn)2(磷脂酶A1)也呈現(xiàn)更顯著的顏色強(qiáng)度。
權(quán)利要求
1.一種加工甲殼綱動(dòng)物的方法，該方法包括用脂解酶處理甲殼綱動(dòng)物物料的步驟(i)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(i)用脂解酶對(duì)該甲殼綱動(dòng)物物料進(jìn)行的處理在水成液中進(jìn)行。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中脂解酶處理過的甲殼綱動(dòng)物物料被加成為飼料或食品，包括飼料添加劑或食品添加劑。
4.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，它包括在步驟(i)之后或之中，從固體甲殼綱動(dòng)物物料中分離出液相。
5.權(quán)利要求2-4中的任一項(xiàng)的方法，包括從液相中提純類胡蘿卜素化合物以獲得富含類胡蘿卜素化合物的制劑的步驟。
6.權(quán)利要求5的方法，其中在步驟(ii)之后包括加工該固體物料以回收甲殼質(zhì)或脫乙酰殼多糖的步驟。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(i)之前該甲殼綱動(dòng)物物料還未用有機(jī)溶劑處理。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，包括用一種或多種非脂解酶處理甲殼綱動(dòng)物物料。
9.權(quán)利要求8的方法，其中非脂解酶是蛋白酶。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，還包括將所加的酶滅活和/或除去，以獲得基本上沒有該酶活性的產(chǎn)品。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中甲殼綱動(dòng)物物料得自選自磷蝦、蝦(包括對(duì)蝦)、蟹、龍蝦(包括挪威龍蝦)及?？纳矬w；或者此甲殼綱動(dòng)物物料得自該生物體的任一混合物。
12.權(quán)利要求11的方法，其中此生物體是蝦和/或磷蝦。
13.權(quán)利要求12的方法，其中此甲殼綱動(dòng)物物料基本上由蝦殼、蝦頭和蝦卵組成。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(i)中微紅色和/或橙色色料被從該甲殼綱動(dòng)物物料中萃取出來。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(i)中類胡蘿卜素被從該甲殼綱動(dòng)物物料中萃取出來。
16.權(quán)利要求15的方法，其中類胡蘿卜素選自蝦青素、蝦青素衍生物、β-胡蘿卜素、斑蝥黃和玉米黃質(zhì)、葉黃素、tunaxanthin、巖藻黃質(zhì)及halocynthiaxanthin以及前述各物質(zhì)的任一混合物。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(i)中蝦青素或蝦青素被從甲殼綱動(dòng)物物料中萃取出來。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中脂解酶具有脂肪酶活性和/磷脂酶活性。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-17的任一項(xiàng)的方法，其中脂解酶具有磷脂酶活性。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-18的任一項(xiàng)的方法，其中脂解酶是脂肪酶或磷脂酶或它們的混合物。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-20的任一項(xiàng)的方法，其中脂解酶是具有磷脂酶活性的脂肪酶。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-21的任一項(xiàng)的方法，其中脂解酶是磷脂酶與具有磷脂酶活性的脂肪酶的混合物。
23.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中在步驟(i)中甲殼綱動(dòng)物物料用一種或多種選自磷脂酶A1和A2或它們的混合物的磷脂酶進(jìn)行培養(yǎng)。
24.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中脂解酶得自微生物源。
25.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，它包括把所得的產(chǎn)品加到消耗產(chǎn)品例如飼料或食品，包括飼料添加劑及食品添加劑之中的步驟。
26.一種生成類胡蘿卜素的方法，它包括下列步驟(i)在適于保證所述酶的酶活性的條件下，用含有效量脂解酶的水成液培養(yǎng)甲殼綱動(dòng)物物料；及(ii)從固體的甲殼綱動(dòng)物物料中分離出含有已萃出的類胡蘿卜素的液相。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中類胡蘿卜素是蝦青素。
28.根據(jù)權(quán)利要求26或27的方法，它包括在步驟(i)之后或之中，把液相(萃取液)從固體甲殼綱動(dòng)物物料中分離出來的步驟(ii)。
29.根據(jù)權(quán)利要求26-28中的任一項(xiàng)的方法，其中甲殼綱動(dòng)物物料也用非脂解酶例如蛋白酶進(jìn)行處理。
30.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中在脂解酶處理之中或之后，甲殼綱動(dòng)物物料不用蛋白酶進(jìn)行處理以減少存在于萃取液中的蛋白質(zhì)數(shù)量。
31.根據(jù)權(quán)利要求26-30中的任一項(xiàng)的方法，其中甲殼綱動(dòng)物物料如權(quán)利要求11-13中的任一項(xiàng)所定義。
32.根據(jù)權(quán)利要求26-31中的任一項(xiàng)的方法，它包括權(quán)利要求5-10所定義的任一步驟。
33.根據(jù)權(quán)利要求26-32中的任一項(xiàng)的方法，其中脂解酶如權(quán)利要求18-24中的任一項(xiàng)定義。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中脂解酶具有磷脂酶活性。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中溶血卵磷脂被從類胡蘿卜素中分離出來，而且此溶血卵磷脂任選加到消耗產(chǎn)品例如幼魚的飼料中。
36.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中溶血卵磷脂不從類胡蘿卜素例如蝦青素中分離出來。
37.一種生產(chǎn)蝦青素的方法，它包括下列步驟(i)在適于保證所述酶的酶活性的條件下，用含有有效量脂解酶的水成液培養(yǎng)碎蝦殼；及(ii)從固體碎蝦殼中分離出含有已萃出的蝦青素的液相。
38.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中，與不用脂解酶處理的方法相比，在步驟(i)中，用脂解酶處理從該甲殼綱動(dòng)物物料中把更多的微紅色和/或橙色色料萃取出來。
39.一種制造消耗產(chǎn)品的方法，它包括將如權(quán)利要求5或6所定義的液相加至該消耗產(chǎn)品之中的步驟。
40.一種用權(quán)利要求1-37的任一方法可獲得的或已獲得的已加工甲殼綱動(dòng)物產(chǎn)品，其中該脂解酶是磷脂酶，而且其中該可獲得的或已獲得的產(chǎn)品含有類胡蘿卜素和溶血卵磷脂。
41.一種制造消耗產(chǎn)品的方法，它包括將如權(quán)利要求40所定義的甲殼綱動(dòng)物產(chǎn)品加至該消耗產(chǎn)品之中這一步驟。
42.一種包含蝦青素及溶血卵磷脂的組合物。
43.一種含有根據(jù)權(quán)利要求40的已加工甲殼綱動(dòng)物產(chǎn)品的食品或飼料，或添加劑。
44.一種喂養(yǎng)動(dòng)物的方法，它包括給動(dòng)物喂以權(quán)利要求43的飼料或添加劑。
45.權(quán)利要求44的方法，其中動(dòng)物是魚包括幼魚。
46.權(quán)利要求44的方法，其中動(dòng)物選自鮭科魚、海鯉、蝦、磷蝦及龍蝦。
47.磷脂酶在生產(chǎn)蝦青素方面的用途。
48.磷脂酶在由甲殼綱動(dòng)物源制備含類胡蘿卜素的產(chǎn)品方面的用途。
49.根據(jù)權(quán)利要求47或48的用途，其中磷脂酶是磷脂酶A1或A2。
50.一種從固體物料萃取類胡蘿卜素的方法，該方法包括用脂解酶處理該固體物料的步驟。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中脂解酶是磷脂酶A1或A2。
52.一種生產(chǎn)有色色料的方法，它包括下列步驟(i)在適于保證所述酶的酶活性的條件下，用含有有效量脂解酶的水成液培養(yǎng)甲殼綱動(dòng)物物料；及(ii)從固體甲殼綱動(dòng)物物料中分離出含有已萃取出的有色色料的液相。
53.根據(jù)權(quán)利要求52的方法，其中有色色料包括微紅色和/或橙色色料。
54.根據(jù)權(quán)利要求51或52的方法，其中有色色料包括蝦青素。
55.根據(jù)權(quán)利要求52或52的方法，其中甲殼綱動(dòng)物物料如權(quán)利要求11～13中的任一項(xiàng)所定義。
56.根據(jù)權(quán)利要求52-55中的任一項(xiàng)的方法，它包括如權(quán)利要求2-10所定義的任一步驟。
57.根據(jù)權(quán)利要求52-56中的任一項(xiàng)的方法，其中脂解酶如權(quán)利要求18-24中的任一項(xiàng)所定義。
58.根據(jù)權(quán)利要求52-57中的任一項(xiàng)的方法，其中脂解酶具有磷脂酶活性。
59.根據(jù)權(quán)利要求52-58中的任一項(xiàng)的方法，其中脂解酶是磷脂酶或脂肪酶，或它們的混合物。
60.一種包含蝦青素與選自溶血卵磷脂、甲殼質(zhì)和脫乙酰殼多糖的化合物的組合物。
全文摘要
發(fā)明人業(yè)已發(fā)現(xiàn)，用脂解酶對(duì)甲殼綱動(dòng)物進(jìn)行的酶處理促進(jìn)了有色色料的萃取。因此，本發(fā)明涉及從甲殼綱動(dòng)物回收有色色料例如蝦青素和/或甲殼質(zhì)或脫乙酰殼多糖和/或溶血卵磷脂的方法。脂解酶可以是例如脂肪酶或磷脂酶。可以將脂解酶處理過的甲殼綱動(dòng)物物料進(jìn)行另外的加工步驟，包括用非脂解酶例如蛋白酶進(jìn)行處理。本發(fā)明的方法提供若干適用產(chǎn)物及這些產(chǎn)物的若干用途。此外，本發(fā)明還涉及由此制成的化妝品和消耗產(chǎn)品(飼料和食品(包括飲料)以及飼料添加劑和食品添加劑)。
文檔編號(hào)A23L1/275GK1466612SQ01816304
公開日2004年1月7日 申請(qǐng)日期2001年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月25日
發(fā)明者珀·M·尼爾森, 珀 M 尼爾森 申請(qǐng)人:諾維信公司