專利名稱：有涂層的含酶催化劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶催化劑，尤其是顆粒形狀的酶催化劑，其中顆粒具有含酶的涂層。
包含具有酶活性的固定化的細(xì)胞的組合物是已知的，例如歐洲專利No.0089165公開了一種組合物，其中在惰性載體上具有包含通過交聯(lián)聚合物固定的大腸桿菌的涂層。用這種組合物來制備左旋-天冬氨酸。歐洲專利申請No.0297912還公開了一種包含涂層顆粒的生物活性材料，其中該涂層包含生物材料和交聯(lián)聚合物。
我們發(fā)現(xiàn)相對于施用涂層的顆粒內(nèi)核具有特定厚度涂層的帶涂層顆粒酶材料比已知的酶催化劑材料具有出人意料的優(yōu)勢。
因此，本發(fā)明提供了在水中不可分散的顆粒形式的酶催化劑，所述的催化劑包含帶涂層的內(nèi)核，該涂層包含酶材料，其中涂層的厚度為30-400微米，且核心尺寸與涂層厚度的比例為2-20。
本發(fā)明的酶催化劑提供了優(yōu)于已有技術(shù)的優(yōu)勢，即控制涂層的厚度，從而使得到的顆粒催化劑顯示了更高的催化活性。
本發(fā)明涉及顆粒形式的酶催化劑，本文以后稱其為顆粒酶催化劑。這種催化劑必須在水中是不可分散的，優(yōu)選是難溶于水的。由內(nèi)核提供這種在水中不可分散且優(yōu)選難溶于水的特性。用于內(nèi)核的適當(dāng)材料包括氧化鋁、氧化硅、沸石、樹脂、脂肪材料如硬脂酸、玻璃珠和塑料珠。核心優(yōu)選氧化鋁。
核心可是任何適合形狀，如規(guī)則或不規(guī)則球體、橢圓形等，但優(yōu)選的形狀為平均直徑為0.1-5毫米的規(guī)則球體，較佳地為0.4-2.5毫米。核心可以是大孔、中孔或微孔的。較佳地，核心不是大孔的，從而可避免酶材料進(jìn)入核心。
核心涂層的厚度為約30到400微米，優(yōu)選100到250微米。核心尺寸與涂層厚度的比例為2-20，優(yōu)選3-15。在本發(fā)明中，核心尺寸的定義為最大內(nèi)徑，即核心外緣壁上兩個外點(diǎn)的最大距離。
顆粒催化劑的涂層包含酶材料。酶材料可以是可溶的或結(jié)合細(xì)胞的酶、微生物(完整或被破壞的細(xì)胞、活的或非活的)、抗體和輔酶以及它們的混合物。特別優(yōu)選的酶材料包括葡糖異構(gòu)酶、青霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(aceylase)、腈水合酶、腈水解酶、酰胺酶(amidease)、脂肪酶、蛋白酶和酯酶。優(yōu)選的酶材料是腈水解酶。
除了酶材料外，涂層還優(yōu)選包含聚合物和交聯(lián)劑。這些化合物的存在可以讓酶材料嵌合入聚合物的交聯(lián)網(wǎng)中。這種網(wǎng)結(jié)構(gòu)克服了固定化中存在的主要問題，即從固定材料漏損所需的酶。因此，制備不滲透高分子量材料的限制屏障是很有用的。適合的聚合物包括聚吖丁啶聚合物；聚胺聚合物，如聚乙烯亞胺；聚酰胺聚合物，如蛋白質(zhì)；異氰酸酯聚合物；或它們的混合物。優(yōu)選的聚合物是聚吖丁啶聚合物，因?yàn)樗芟蛲繉犹峁┝己玫臋C(jī)械強(qiáng)度?？捎玫木圻苟∴ぞ酆衔锏膶?shí)例為可購得的聚合物如Polycup 2002、Kymene 617和Kymene 450(都是Hercules Inc.，USA的商標(biāo))。適合的交聯(lián)劑包括胺，如己二胺；醛，如戊二醛或丙烯醛；酸，如己二酸；異氰酸酯，如二異氰酸己二酯。優(yōu)選的交聯(lián)劑是戊二醛。用于本發(fā)明特別優(yōu)選的涂層是腈水解酶、聚吖丁啶聚合物和戊二醛的混合物。
對催化劑涂層中的酶材料、聚合物和交聯(lián)劑的量而言，干涂層中各成分的量適宜為50-80％，較佳地為40-60％酶材料；適宜的為5-20％，較佳地為10-15％聚合物材料；和適宜的為1-5％，較佳地為2-3％交聯(lián)劑。在涂層中還可存在其它成分，如多元醇，例如葡萄糖、蔗糖、海藻糖、麥芽糖醇、山梨糖醇和甘油，和/或鹽，如磷酸鹽。它們的存在量可以為0-35％。涂層還可包含有限量的水。水的合適存在量為涂層的0-30％。
可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適合的固定化方法制備本發(fā)明的酶催化劑，例如通過凝膠截留或吸收。歐洲專利申請0297912、0206687和0502035公開了一種方法，通過吸收讓含有酶材料的水性化合物沉積到顆粒上，然后干燥這些顆粒。EP089165公開了另一種沉積涂層的方法，包括形成含有酶材料的糊劑，將這種糊劑施用于顆粒，然后干燥得到的顆粒。
我們發(fā)現(xiàn)還可用涂層材料混合物噴灑核心制備涂層的顆粒狀酶催化劑，因此本發(fā)明的另一方面提供了制備如上所述的酶催化劑的方法，包括形成酶材料、聚合物和交聯(lián)劑的懸浮水溶液，用所述的懸浮液噴灑核心，從而給核心涂層。
用噴灑方法(通常稱為“噴灑涂層”)制備帶涂層的酶催化劑，比已知的固定方法更好，因?yàn)榭梢钥刂仆繉荧@得所需的厚度，而這對本發(fā)明的酶催化劑而言是一重要特征。
為了用噴灑涂層方法制備帶涂層的顆粒酶催化劑，使用酶材料、聚合物和交聯(lián)劑的懸浮水溶液。在本發(fā)明的制備過程中，可以直接使用酶材料或在使用前純化酶材料?？梢酝ㄟ^離心、過濾、沉淀或絮凝來回收?？梢杂盟蚝宣}(如氯化鈉、磷酸鹽、EDTA或鎂鹽)的水溶液沖洗酶材料。優(yōu)選的起始材料是通過過濾或離心培養(yǎng)物，從發(fā)酵罐回收的具有酶活性的細(xì)胞漿液?？梢跃腿绱耸褂眠@種細(xì)胞漿液，或者在使用前沖洗。通過透析或重懸浮和離心沖洗這些細(xì)胞。
懸浮液可包含5-25％酶材料、1-12％聚合物和0.2-4％交聯(lián)劑，以懸浮水溶液的重量計(jì)。懸浮液中水的含量并不是關(guān)鍵因素，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)噴灑用的材料調(diào)整。較佳地，使用固體含量為10-30％的懸浮液(以重量/體積為計(jì))。懸浮液還可包含少量的材料，如多元醇，例如葡萄糖、蔗糖、海藻糖、麥芽糖醇、山梨糖醇和甘油，和鹽，如氯化鈉。
懸浮液的pH值宜為(但并非必須)pH5-9.5之間，更佳地為pH7.5和8.5之間。由此，可添加緩沖劑。適合的緩沖劑可以是磷酸鹽，如磷酸鉀或磷酸二鉀，或磷酸鈉或磷酸二鈉，或碳酸鹽。優(yōu)選的緩沖劑是磷酸鹽緩沖劑。當(dāng)懸浮液中存在緩沖劑時，相對于干的酶材料添加15-50％重量緩沖劑。
可以用任何方法制備懸浮液。較佳地，最初在水或緩沖液中形成酶材料的懸浮液，來制備這種懸浮液。然后在酶材料的懸浮液中添加交聯(lián)劑。在添加聚合物之前，讓交聯(lián)劑與酶材料接觸一段足以讓交聯(lián)劑與酶材料的胺、羥基或羧基反應(yīng)的時間。在進(jìn)行噴灑步驟之前，可以在懸浮液中添加任選的試劑，如多元醇、緩沖劑和氯化鈉。
宜在0-50℃之間，較佳地為10-35℃之間的溫度制備懸浮液。
然后，在噴灑之前，存儲如此制備的懸浮液若干天，而無需任何特別的預(yù)防。存儲溫度宜為0℃-環(huán)境溫度之間。
可以用任何噴灑-涂層裝置，較佳地用流化床，將懸浮液沉積到內(nèi)核上。適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)氣流速度從而使固態(tài)支持物很好地流動。適宜將進(jìn)氣口的溫度調(diào)節(jié)在30-90℃之間，調(diào)節(jié)懸浮水溶液的噴灑速度，從而使流動床的溫度為10-60℃之間，較佳地為20-40℃之間(操作過程中)。制備的核心上涂層的厚度為30-400微米之間。
用上述方法制備的酶催化劑，使用前可以在水或緩沖介質(zhì)中或以干燥的形式存儲幾個月。
可以將本發(fā)明的顆粒狀酶催化劑用于任何適合的酶反應(yīng)。具體說，可用本發(fā)明的酶催化劑，將2-羥基-4-甲硫基丁腈(HMTBN)轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的銨鹽，即2-羥基-4-甲硫基丁酸銨(HMTBS)。這種催化劑還可用于水解尼龍66寡聚物。本發(fā)明催化劑的特定優(yōu)勢是其比其它已知的催化劑半衰期長。具體說，這種顆粒狀涂層的酶催化劑的半衰期至少為30小時，較佳地為至少70小時。
現(xiàn)參考以下實(shí)施例說明本發(fā)明在以下的實(shí)施例中，使用如下縮寫HMTBN-2-羥基-4-甲硫基丁腈HMTBS-2-羥基-4-甲硫基丁酸銨實(shí)施例1酶催化劑的制備構(gòu)建大腸桿菌BIOCAT 714菌株用限制內(nèi)切酶EcoRI和XbaI從質(zhì)粒pRPA6BCAT6(專利申請WO 98/18941)提取1.27kb片段，該片段包含Ptrp啟動子、噬菌體cll基因的核糖核蛋白結(jié)合位點(diǎn)(RBScII)和糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenges faecalis)ATCC8750的腈水解酶基因(nitB)，然后將該片段克隆入用相同限制內(nèi)切酶開口的載體pXL642(美國專利No.5,629,190描述的)中。用StuI和BsmI酶打開如此得到的質(zhì)粒pRPA-BCAT15，并將4.3kb片段與純化的pRPABCAT4(專利申請WO 98/18941)的136bp STul-BsmI片段相連，得到質(zhì)粒pRPA-BCAT19。pRPA-BCAT19的部分測序表明腈水解酶的Asp279殘基的密碼子被Asn279殘基的密碼子替代。然后將pRPA-BCAT19(包含Ptrp∷RBScII∷nitB融合)的1.2kb EcoRI-XbaI片段克隆入用相同酶開口的載體pRPA-BCAT28中，制得6.2kb質(zhì)粒pRPA-BCAT29。通過將pXL642(CIP申請No.08/194,588)的3.9kb SspI-ScaI片段與pHP45 Tc(Fellay等人，1987，Gene 52147-154)的2.1kb SmaI片段相連，從而任用四環(huán)素抗性標(biāo)記替代氨芐青霉素抗性標(biāo)記，制得載體pRPA-BCAT28。用部分NdeI消化和大腸桿菌聚合酶I(克列諾片段)的作用，破壞質(zhì)粒pRPA-BCAT29復(fù)制起點(diǎn)附近的Ndel位點(diǎn)，制得質(zhì)粒pRPA-BCAT41。
用標(biāo)準(zhǔn)電穿孔，將質(zhì)粒pRPA-BCAT41和pXL2035(Levy-Schill等人，1995，Gene 16115-20)引入大腸桿菌菌株W(ATCC 9637)。將獲得的克隆命名為BIOCAT714。
菌株的培養(yǎng)在100升含有80升培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)含有糞產(chǎn)堿菌的腈水解酶的大腸桿菌W菌株，表1列出了培養(yǎng)基的配方表1
添加氨水將pH維持在7.0。以1v/v(培養(yǎng)基/分鐘)的速度通入氧氣并攪拌將氧飽和度維持于20％。最初引入濃度為2g/l的葡萄糖。然后，用700g/l葡萄糖和19.6g/lMgSO4·7H2O的原液來連續(xù)補(bǔ)加其它葡萄糖。添加的速度為2.2g葡萄糖/h.l培養(yǎng)基。發(fā)酵24小時后，離心收集細(xì)胞。將固體含量為26％的漿液直接用于固定。
在571.5g lmol/升的磷酸鹽緩沖液中稀釋含有26.0％重量干細(xì)胞的950g細(xì)胞漿液。室溫，在配備有三-槳螺旋攪拌器的反應(yīng)器中進(jìn)行稀釋。稀釋后pH為8.0。
將165.5g K2HP4和6.8g KH2PO4溶解于1升去離子水中，制得1mol/升磷酸鹽緩沖液。該溶液最初的pH為9.0。
以6％重量的速率將164.6g戊二醛水溶液緩慢添加到細(xì)胞懸浮液中。在以12.5％重量添加395.2g聚吖丁啶(Kymene 617)水溶液之前，室溫?cái)嚢柚频玫幕旌衔镏辽?小時。如此制得細(xì)胞懸浮液，表2列出了該組合物的成分表2
將1800g這種細(xì)胞懸浮液噴灑到350g氧化鋁珠(直徑為2.0mm)上，這些小珠在熱空氣流中流化(進(jìn)氣口溫度為53℃)。調(diào)節(jié)噴灑速度以保持小珠的溫度為35℃。噴灑170分鐘后，獲得841g生物催化劑，其含有25.5％重量干細(xì)胞和16.6％殘留水。涂層的厚度為330微米。涂層后顆粒的直徑為2.6mm。顆粒尺寸與涂層厚度的比例為7。
1.2將HMTBN催化轉(zhuǎn)化成HMTBS25℃，pH6.6，存在0.1mol/lHMTBN時，測得的該催化劑的活性為每小時每千克催化劑將0.56kg HMTBN轉(zhuǎn)化成2-羥基-3-甲硫基丁酸銨(HMTBS)。
用100g催化劑填充內(nèi)徑為3cm和高度為45cm的恒溫柱。通過循環(huán)回路用泵裝配該柱。反應(yīng)器的總體積為430ml。用25％的HMTBN銨鹽溶液填充該回路。將溶液從頂部注入該柱，以每小時20升流到底部。水在該柱上環(huán)繞的雙夾套內(nèi)循環(huán)，從而將溫度維持于35℃。以40克/小時的速度將礦質(zhì)水引入回路。除去柱底部過量的液體，將反應(yīng)器的體積維持在恒定水平。獲得以95％腈轉(zhuǎn)化的連續(xù)流。反應(yīng)器流出的HMTBS的濃度為25％。在0.2mol/l HMTBN存在下35℃時的半衰期為30小時。
實(shí)施例22.1酶催化劑的制備在13.2kg含有9g/l氯化鈉的水溶液中稀釋1100g包含26％重量干細(xì)胞的如實(shí)施例1所述制備的細(xì)胞漿液。室溫，在攪拌式反應(yīng)器中攪拌該懸浮液30分鐘。離心收集細(xì)胞。
如上所述處理950g含有26％重量干細(xì)胞的沖洗后的細(xì)胞漿液，得到1800g處理過的懸浮液。噴灑170分鐘后，獲得850g催化劑，其包含25.5％重量干細(xì)胞和17％殘留水。涂層的厚度為190微米。核心的直徑為2.2mm。核心尺寸與涂層厚度的比例為11.6。
2.2將HMTBN催化轉(zhuǎn)化成HMTBS如實(shí)施例1所述，在35℃，pH6.6，0.1mol/l HMTBN存在下，測定催化劑的活性和半衰期。其活性為每小時每千克催化劑將0.5kg HMTBN轉(zhuǎn)化成2-羥基-3-甲硫基丁酸銨(HMTBS)。其半衰期為70小時。
實(shí)施例33.1酶催化劑的制備重復(fù)實(shí)施例1的步驟，但使用由23％聚乙烯亞胺和77％聚吖丁啶構(gòu)成的聚合物基質(zhì)。下表列出了這種細(xì)胞懸浮液的最終成分。
在與實(shí)施例2相同的操作條件下，將1300g細(xì)胞懸浮液噴灑到400g氧化鋁珠上。噴灑130分鐘后，獲得533g催化劑，其包含17.6％重量干細(xì)胞和7.5％殘留水。涂層的厚度為210微米。核心的直徑為2.2mm。核心尺寸與涂層厚度的比例為10。
制得的催化劑用于將HMTBN轉(zhuǎn)化成HMTBS，得到上述其它催化劑類似的結(jié)果。
實(shí)施例44.1具有聚酰胺酶活性的酶催化劑的制備如法國專利申請No.9508916(本文將其納入作為參考)所述制備的134g具有聚酰胺酶活性的重組大腸桿菌的細(xì)胞漿液，在230g磷酸鹽緩沖劑(0.2M，pH8.0)中稀釋。重復(fù)實(shí)施例3所述的流程，并在與實(shí)施例1所述相同的條件下將540g細(xì)胞懸浮液噴灑到400g氧化鋁珠上。
4.2催化水解尼龍66按FR95098016的流程測定酶活性。在30℃、pH7，5g/l尼龍6，6寡聚物存在下測定的催化劑活性為每小時每千克催化劑將140g尼龍66寡聚物轉(zhuǎn)化成己二酸。其半衰期超過790小時。
對比例AA.1酶催化劑的制備將100g如實(shí)施例1所述制備的細(xì)胞懸浮液噴灑到350g直徑為2.0mm的氧化鋁珠上，這些小珠在熱空氣流中流化(進(jìn)氣口溫度53℃)。調(diào)節(jié)噴灑速度以確保小珠的溫度為35℃。噴灑170分鐘后，獲得385g催化劑，其包含3％重量干細(xì)胞。涂層的厚度為20微米。核心的直徑為2mm。核心尺寸與涂層厚度的比例為100。
A.2將HMTBN催化轉(zhuǎn)化成HMTBS如實(shí)施例1所述，在25℃、pH6.6，0.1mol/l HMTBN存在下，測定這種生物催化劑的活性和半衰期。其活性為每小時每千克催化劑將0.06kg HMTBN轉(zhuǎn)化成2-羥基-4-甲硫基丁酸銨。其半衰期為11小時。
權(quán)利要求
1.一種酶催化劑，其特征在于，這種酶催化劑是顆粒形狀的，在水中是不分散的，所述的催化劑包括帶涂層的內(nèi)核，所述的涂層包含酶材料，其中涂層的厚度為30-400微米，且內(nèi)核尺寸與涂層厚度的比例為2-20。
2.如權(quán)利要求1所述的酶催化劑，其特征在于，所述的酶催化劑不溶于水。
3.如權(quán)利要求1或2所述的酶催化劑，其特征在于，所述的涂層的厚度為100-250微米。
4.如權(quán)利要求1-3任一所述的酶催化劑，其特征在于，所述的涂層厚度與內(nèi)核尺寸的比例為3-15。
5.如權(quán)利要求1-4任一所述的酶催化劑，其特征在于，所述的內(nèi)核的平均直徑為0.1-5毫米。
6.如權(quán)利要求1-5任一所述的酶催化劑，其特征在于，所述的內(nèi)核是中孔或微孔的。
7.如權(quán)利要求1-6任一所述的酶催化劑，其特征在于，所述的內(nèi)核選自氧化鋁、氧化硅、沸石、樹脂、脂肪材料、玻璃珠和塑料珠。
8.如權(quán)利要求1-7任一所述的酶催化劑，其特征在于，所述的酶材料選自葡糖異構(gòu)酶、青霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶、腈水合酶、腈水解酶、酰胺酶、脂肪酶、蛋白酶和酯酶。
9.如權(quán)利要求8所述的酶催化劑，其特征在于，所述的酶是腈水解酶。
10.如權(quán)利要求1-9任一所述的酶催化劑，其特征在于，所述的涂層還包含聚合物和交聯(lián)劑。
11.如權(quán)利要求10所述的酶催化劑，其特征在于，所述的聚合物選自聚吖丁啶聚合物、聚胺聚合物、聚酰胺聚合物和異氰酸酯聚合物；所述的交聯(lián)劑選自胺、醛、酸和異氰酸酯。
12.如權(quán)利要求1-11任一所述的酶催化劑，其特征在于，所述的涂層包含腈水解酶、聚吖丁啶聚合物和戊二醛。
13.如權(quán)利要求1-12任一所述的酶催化劑，其特征在于，所述的涂層包含0-30％水。
14.如權(quán)利要求1-13任一所述的酶催化劑，其特征在于，所述的酶催化劑的半衰期至少為30小時，較佳地為至少70小時。
15.一種制備如權(quán)利要求1-14任一所述的顆粒狀酶催化劑的方法，其特征在于，所述的方法包括制備酶材料、聚合物和交聯(lián)劑的懸浮液；將所述的懸浮液噴灑到核心上，從而涂覆所述的核心。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述的酶材料是具有酶活性的細(xì)胞漿液，在制備所述的懸浮液之前所述的漿液已洗滌過。
17.權(quán)利要求1-14任一所述的酶催化劑在酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)中的用途。
18.如權(quán)利要求17所述的用途，其特征在于，用于將2-羥基-4-甲硫基丁腈轉(zhuǎn)化成2-羥基-4-甲硫基丁酸銨。
19.如權(quán)利要求17所述的用途，其特征在于，用于水解尼龍66。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種顆粒形狀的在水中不可分散的酶催化劑，這種酶催化劑包含帶涂層的內(nèi)核，其中涂層包含酶材料，其中涂層的厚度為30－400微米，且核心的尺寸與涂層厚度的比例為2－20。本發(fā)明還提供了一種制備催化劑的方法，和這種催化劑在將2－羥基－4－甲硫基丁腈轉(zhuǎn)化成2－羥基－4－甲硫基丁酸銨中的用途。
文檔編號C12N9/14GK1440457SQ01812041
公開日2003年9月3日 申請日期2001年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月30日
發(fā)明者O·法威一布勒, J－C·勒蒂斯 申請人:阿方蒂動物營養(yǎng)素股份有限公司