專利名稱：谷物加工方法和其中有用的轉(zhuǎn)基因植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及尤其是在玉米濕磨法和大豆加工過程中提高蛋白質(zhì)和淀粉回收量的谷物加工的改進(jìn)方法，以及在此類過程中有用的新轉(zhuǎn)基因植物。
硫氧還蛋白(TRX)和硫氧還蛋白還原酶(TR)是通過NADPH來還原蛋白質(zhì)中二硫鍵的酶。蛋白質(zhì)二硫鍵在谷物加工效率和谷物加工之后回收產(chǎn)物的質(zhì)量上起了很重要的作用。消除或者減少谷物中蛋白質(zhì)二硫鍵程度的有效方法的開發(fā)能夠提高加工效率。此外，分子間或分子內(nèi)的二硫鍵也可影響谷物或源于谷物的產(chǎn)物在牲畜飼料中的表現(xiàn)。通過減少二硫鍵的程度可增加谷物的可消化性、營養(yǎng)物的可利用性和抗?fàn)I養(yǎng)因子(例如蛋白酶和淀粉酶抑制劑等)的中和(見WO 00/36126，1999年12月15日申請)。
在玉米和大豆中表達(dá)轉(zhuǎn)基因硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶以及在谷物加工中(例如濕磨法)使用硫氧還蛋白是一種在工業(yè)加工過程中或之前減少種子蛋白質(zhì)中二硫鍵的新的替代方法。因此本發(fā)明提供了經(jīng)過改良的儲(chǔ)存蛋白質(zhì)質(zhì)量的谷物，以及在工業(yè)加工或動(dòng)物消化過程(兩者隨后均稱為“加工”)中與正常谷物在質(zhì)量上表現(xiàn)不同的谷物。
本方法通過傳送硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶消除了開發(fā)在加工過程中額外加入外源硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶的來源的必要。通過谷物供應(yīng)硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶的第二個(gè)好處在于對種子完整性的物理破壞不必再讓酶在加工之前與種子中的儲(chǔ)藏蛋白或基質(zhì)蛋白接觸，或作為額外加工步驟。
三種在谷物加工過程中使用硫氧還蛋白的方法如下1.在種子發(fā)育時(shí)通過表達(dá)該蛋白質(zhì)，并使其發(fā)生作用，來改變收獲谷物的組成和質(zhì)量；
2.在種子發(fā)育時(shí)通過表達(dá)該蛋白質(zhì)(但無活性)來改變產(chǎn)物在加工時(shí)的質(zhì)量；3.在谷物中生產(chǎn)硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶，通過在加工過程中添加該谷物來改變其他谷物產(chǎn)物的質(zhì)量。
在此描述的本發(fā)明對于任何谷物都適用，尤其是玉米、大豆、小麥和大麥，特別是玉米和大豆，最特別是玉米。在谷物中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶是一種具有以下作用的方法改變需要經(jīng)過谷物加工的材料(種子)質(zhì)量、改變從谷物加工而來的材料質(zhì)量、在加工過程中使特別的種子成分的產(chǎn)率最大化(提高效率)、改變加工方法和為從研磨物流而來的種子組分或成分創(chuàng)造新用途。
因此本發(fā)明提供了一種表達(dá)硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶(如在植物體內(nèi)非天然表達(dá)的硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶)的植物，例如，含有編碼硫氧還蛋白的異源DNA序列的植物，該異源DNA序列穩(wěn)定地整合入植物的核DNA或質(zhì)體DNA，優(yōu)選在一個(gè)可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子控制下(如化學(xué)試劑誘導(dǎo)的啟動(dòng)子)，例如有效連接在可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子上或受反式激活蛋白調(diào)控的啟動(dòng)子控制，其中相應(yīng)的反式激活蛋白受可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的控制或在另一種植物體內(nèi)表達(dá)，以致通過與另一種植物雜交可激活該啟動(dòng)子；其中硫氧還蛋白或硫氧還蛋白還原酶優(yōu)選地為熱穩(wěn)定的或真核還原酶；因此該植物也可包括經(jīng)任選地處理(例如接觸過抗原的(primed)或包被的)和/或包裝的種子(例如連同使用說明書一起包裝在一個(gè)袋內(nèi))，以及從那里收獲的種子，例如用于以上曾提過的研磨加工過程。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可選擇地進(jìn)一步包含提高硫氧還蛋白還原酶和/或NADPH產(chǎn)量的基因。
更進(jìn)一步地本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)硫氧還蛋白的方法，包括培育如上所述的表達(dá)硫氧還蛋白的植物；提供了一種生產(chǎn)淀粉和/或蛋白質(zhì)的方法，包括從如上所述的植物收獲的種子中提取淀粉或蛋白質(zhì)；還提供了一種濕磨法，包括浸泡來自如上所述的表達(dá)硫氧還蛋白的植物體的種子以及從其中提取淀粉和/或蛋白質(zhì)。
更進(jìn)一步地本發(fā)明提供了一種在植物中可表達(dá)的表達(dá)盒，包括硫氧還蛋白或硫氧還蛋白還原酶的編碼區(qū)，優(yōu)選地為來自一個(gè)嗜熱生物的硫氧還蛋白，例如來自古細(xì)菌，如詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)或閃爍古生球菌(Archaeglobus fulgidus)，如下所述，其中編碼區(qū)優(yōu)選地優(yōu)化為含有植物的偏愛密碼子，并且將在植物中起作用的啟動(dòng)子和終止子序列有效地與所述編碼區(qū)連接，其中啟動(dòng)子優(yōu)選地為種子特異啟動(dòng)子或可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，如一個(gè)化學(xué)試劑誘導(dǎo)的啟動(dòng)子或反式激活蛋白調(diào)控的啟動(dòng)子；例如，一個(gè)在質(zhì)體或核中可表達(dá)的表達(dá)盒，包括一個(gè)啟動(dòng)子，如受核反式激活蛋白調(diào)節(jié)的反式激活蛋白介導(dǎo)的啟動(dòng)子(例如當(dāng)反式激活蛋白為T7RNA聚合酶時(shí)，該啟動(dòng)子可以是T7啟動(dòng)子，并且T7RNA聚合酶的表達(dá)可以選擇性地受可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的控制)。
更進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了包含此類在植物中可表達(dá)的表達(dá)盒的載體。
更進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了用此類載體轉(zhuǎn)化的植物或在其基因組中(如核或質(zhì)體基因組)含有此類在植物中可表達(dá)的表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明也包括了一種生產(chǎn)含有高含量的硫氧還蛋白或硫氧還蛋白還原酶的谷物的方法，該方法包括用含有異源表達(dá)盒的第二種植物的花粉給含有異源表達(dá)盒的第一種植物授粉，并從如此授粉的植物中回收谷物，其中第一種植物的異源表達(dá)盒含有受反式激活蛋白介導(dǎo)的啟動(dòng)子調(diào)控的，并且與之有效地連接的編碼硫氧還蛋白或硫氧還蛋白還原酶的DNA序列，而且第一種植物優(yōu)選是去雄的或雄性不育的，第二種植物的異源表達(dá)盒含有有效連接在DNA序列上的啟動(dòng)子，其中上述DNA序列編碼能調(diào)控上述反式激活蛋白介導(dǎo)的啟動(dòng)子的反式激活蛋白。
本發(fā)明也提供了一個(gè)核酸分子，包含編碼真核擬南芥(Arabidopsis)NADPH+依賴性的硫氧還蛋白還原酶(NTR)的核苷酸序列，其中該核苷酸序列優(yōu)化為在單子葉植物中表達(dá)，優(yōu)選地優(yōu)化為在玉米中表達(dá)。該核苷酸序列優(yōu)選為SEQ ID NO24的核苷酸序列，優(yōu)選編碼SEQ ID NO25的氨基酸序列。
本發(fā)明也提供了分離的核酸分子，包含編碼真核水稻NADPH+依賴性的硫氧還蛋白還原酶(NTR)的核苷酸序列。該核苷酸序列優(yōu)選地編碼SEQ ID NO27的氨基酸序列。該核苷酸序列優(yōu)選地為SEQ ID NO25的核苷酸序列。
序列表的簡要描述SEQ ID NO1-來自詹氏甲烷球菌的硫氧還蛋白的蛋白質(zhì)序列(gil 1591029)。
SEQ ID NO2-來自閃爍古生球菌的硫氧還蛋白的蛋白質(zhì)序列(gil 2649903)(trx-1)。
SEQ ID NO3-來自閃爍古生球菌的硫氧還蛋白的蛋白質(zhì)序列(gil 2649838)(trx-2)。
SEQ ID NO4-來自閃爍古生球菌的硫氧還蛋白的蛋白質(zhì)序列(gil 2649295)(trx-3)。
SEQ ID NO5-來自閃爍古生球菌的硫氧還蛋白的蛋白質(zhì)序列(gil 2648389)(trx-4)。
SEQ ID NO6-來自詹氏甲烷球菌的硫氧還蛋白還原酶(trxB)的蛋白質(zhì)序列(gil 1592167)。
SEQ ID NO7-來自閃爍古生球菌的硫氧還蛋白還原酶的蛋白質(zhì)序列(gil 2649006)(trxB)。
SEQ ID NO8-引物NMD 109。
SEQ ID NO9-引物NMD 110。
SEQ ID NO10-引物NMD 102。
SEQ ID NO11-引物NMD 103。
SEQ ID NO12-引物NMD 124A。
SEQ ID NO13-引物NMD 125A。
SEQ ID NO14-引物NMD 126。
SEQ ID NO15-引物NMD 127。
SEQ ID NO16-引物NMD 128。
SEQ ID NO17-引物NMD 129。
SEQ ID NO18-引物STRF 1A。
SEQ ID NO19-引物STRF 1B。
SEQ ID NO20-引物STRF 2A。
SEQ ID NO21-引物STRF 2B。
SEQ ID NO22-引物STR 3A。
SEQ ID NO23-引物STR 3B。
SEQ ID NO24-玉米中優(yōu)化的編碼擬南芥NADPH依賴性的硫氧還蛋白還原酶的序列。
SEQ ID NO25-由SEQ ID NO24編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO26-編碼水稻NADPH依賴性的硫氧還蛋白還原酶(NTR)的序列。
SEQ ID NO27-由SEQ ID NO26編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO28-引物P9。
SEQ ID NO29-引物P10。
SEQ ID NO30-引物P4。
SEQ ID NO31-引物P1。
SEQ ID NO32-引物P2。
SEQ ID NO33-引物P5。
SEQ ID NO34-引物P12。
SEQ ID NO35-引物P11。
SEQ ID NO36-引物P27。
SEQ ID NO37-引物P28。
SEQ ID NO38-引物P29。
SEQ ID NO39-引物P26。
SEQ ID NO40-引物P31。
SEQ ID NO41-引物Thiorodoxubi 1603SEQ ID NO42-引物Thiorodox 2364
“聯(lián)結(jié)/有效連接”指兩段物理或功能相關(guān)的核酸序列。例如，如果有效連接或定位以致于調(diào)節(jié)DNA序列能夠影響編碼或結(jié)構(gòu)DNA序列表達(dá)的水平，啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)DNA序列被認(rèn)為與編碼RNA或蛋白質(zhì)的DNA序列是“聯(lián)結(jié)”的。
“嵌合基因”為重組核酸序列，其中啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)核酸序列與編碼mRNA或表達(dá)為蛋白質(zhì)的核酸序列有效連接或聯(lián)結(jié)，以至于該調(diào)節(jié)核酸序列能夠調(diào)節(jié)所聯(lián)結(jié)核酸序列的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)。在自然界中，嵌合基因的調(diào)節(jié)核酸序列通常不是與它所聯(lián)結(jié)的核酸序列有效連接的。
“編碼序列”是可轉(zhuǎn)錄為RNA，如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、有義RNA或反義RNA的核酸序列。優(yōu)選地該RNA在生物體內(nèi)可隨后被翻譯為蛋白質(zhì)。
互補(bǔ)“互補(bǔ)”指兩條核苷酸序列(包含兩條反向平行的核苷酸序列)可在反向平行的核苷酸序列的互補(bǔ)堿基對之間通過形成氫鍵來進(jìn)行配對。
DNA改組DNA改組是一種快速、簡單且有效的方法，以向DNA分子優(yōu)選隨機(jī)地引入突變或重排，或在兩個(gè)或更多DNA分子之間優(yōu)選隨機(jī)地產(chǎn)生DNA序列交換。DNA改組所產(chǎn)生的DNA分子為改組DNA分子，它是非自然出現(xiàn)的DNA分子，并且從至少一個(gè)模板DNA分子衍生而來。與模板DNA編碼的酶相比，該改組DNA編碼經(jīng)修飾了的酶，優(yōu)選地為具有改變了的生物學(xué)活性的酶。
酶/蛋白質(zhì)活性在此指酶(或蛋白質(zhì))將底物催化轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的能力。酶的底物包括天然酶底物，也包括天然底物的類似物，酶可將該類似物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物或產(chǎn)物的類似物。酶活性可用諸如一定時(shí)間之后在反應(yīng)中檢測產(chǎn)物的量，或一定時(shí)間之后檢測剩余底物的量的方法來測得。酶活性也可通過一定時(shí)間之后測定反應(yīng)混合物中剩余未消耗的輔助因子的量或一定時(shí)間之后測定反應(yīng)混合物中消耗的輔助因子的量來測得。酶活性還可以通過一定時(shí)間之后測定反應(yīng)混合物中自由能供體或高能分子(例如ATP、磷酸烯醇丙酮酸、乙酰磷酸或磷酸肌酸)的剩余量或一定時(shí)間之后測定反應(yīng)混合物中消耗的自由能供體或高能分子(例如ADP、丙酮酸、乙酸或肌酸)的量來測得。
表達(dá)盒在此使用的“表達(dá)盒”表示可在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中指導(dǎo)一段特定核苷酸序列表達(dá)的DNA序列，包含與目標(biāo)核苷酸序列有效連接的啟動(dòng)子，該目標(biāo)核苷酸序列又和終止信號有效連接。通常它也包含該核苷酸序列適當(dāng)翻譯所需的序列。編碼區(qū)通常編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)，但也可編碼一段功能RNA，例如有義或反義方向上的反義RNA或非翻譯的RNA。包括目標(biāo)核苷酸序列的表達(dá)盒可以是嵌合的，即它組分中的至少一個(gè)相對于其它組分中的至少一個(gè)是異源的。表達(dá)盒也可以是天然出現(xiàn)的，但是以用于異源表達(dá)的重組形式獲得。然而，與宿主相比，表達(dá)盒一般為異源的，即該表達(dá)盒的特定DNA序列并非宿主細(xì)胞自然產(chǎn)生的，而是需要通過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞的祖先。表達(dá)盒中核苷酸序列的表達(dá)可受組成型啟動(dòng)子或可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的控制，對于可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子而言，只有當(dāng)宿主細(xì)胞暴露于特定的外界刺激時(shí)，該啟動(dòng)子才開始轉(zhuǎn)錄。在諸如昆蟲之類的多細(xì)胞生物中，啟動(dòng)子可以是特定組織、器官或發(fā)育階段特異的。
基因術(shù)語 “基因”廣泛使用以指與生物學(xué)功能相關(guān)的任何DNA片段。因此，基因包括編碼序列和/或它們表達(dá)所需的調(diào)控序列。基因也可包括不表達(dá)的DNA片段，例如其他蛋白質(zhì)的識別序列。可從多種來源得到基因，包括從目標(biāo)來源克隆或從已知或預(yù)測的序列信息合成，也可以包括為得到所需參數(shù)而設(shè)計(jì)的序列。
異源DNA序列在此使用的“異源DNA序列”、“外源DNA片段”或“異源核酸”均指由外源(相對于特定宿主細(xì)胞)產(chǎn)生的序列，或者如果是從相同來源產(chǎn)生的，那就是對它產(chǎn)生時(shí)的形式進(jìn)行了修飾。因此，在宿主細(xì)胞中的異源基因包括特定宿主細(xì)胞中的內(nèi)源但已被修飾過的基因，例如用DNA改組。該術(shù)語還包括自然出現(xiàn)的DNA片段的非自然出現(xiàn)的多拷貝。因此，該術(shù)語指對于細(xì)胞來說是外源或異源的DNA片段，或者該片段雖然與細(xì)胞同源，但卻在宿主細(xì)胞的核酸中處于特殊的位置，通常情況下，在該位置是不會(huì)發(fā)現(xiàn)該片段的。表達(dá)外源DNA片段以產(chǎn)生外源多肽。
同源DNA序列與宿主細(xì)胞天然相關(guān)的DNA序列。
“同質(zhì)體的”指在植物、植物組織或者植物細(xì)胞中所有的質(zhì)體在遺傳上是相同的。這是植物體的正常狀態(tài)，當(dāng)質(zhì)體還未被轉(zhuǎn)化、突變或遺傳上被改變的時(shí)候。在不同組織或不同的發(fā)育階段，質(zhì)體可以有不同的形式，如葉綠體、前質(zhì)體、白色體、造粉體、有色體等等。
分離的在本發(fā)明的上下文中，分離的DNA分子或分離的酶指通過人工方法從原天然環(huán)境中分離出來的DNA分子或蛋白質(zhì)，因而不是天然產(chǎn)物。分離的DNA分子或蛋白質(zhì)可以純化的形式存在，或者存在于非天然環(huán)境中，例如在轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中。
成熟蛋白質(zhì)正常定向于細(xì)胞器并且已被切除轉(zhuǎn)運(yùn)肽的蛋白質(zhì)。
最小啟動(dòng)子不具有活性或啟動(dòng)子活性大大降低的啟動(dòng)子元件(尤其為TATA元件)，并且沒有上游激活序列。當(dāng)存在合適的轉(zhuǎn)錄因子時(shí)，最小啟動(dòng)子可行使功能以允許轉(zhuǎn)錄。
修飾的酶活性與在昆蟲體內(nèi)自然出現(xiàn)的酶活性(即，在對此類活性缺乏人工直接或間接操縱的情況下，自然出現(xiàn)的酶活性)不同的酶活性，它對能抑制自然出現(xiàn)的酶活性的抑制劑具有耐受性。
天然的指在未經(jīng)轉(zhuǎn)化的昆蟲細(xì)胞基因組中存在的基因。
自然出現(xiàn)的“自然出現(xiàn)的”用來描述與人工生產(chǎn)不同的并且能在自然界找到的物體。例如，在生物體中(包括病毒)存在的、可從自然來源分離出來并且還未在實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過人為修飾的蛋白質(zhì)或核苷酸序列，是自然出現(xiàn)的。
核酸“核酸”指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其單鏈或雙鏈形式的多聚體。除非特別限定，該術(shù)語包括含有已知天然核苷酸類似物的核酸，它們與上面所述的核酸具有相似的結(jié)合性質(zhì)，并且與自然出現(xiàn)的核苷酸以相似的方式代謝。除非特別說明，特定的核酸序列也包含其保守性修飾的變體(例如簡并密碼子的取代)、互補(bǔ)序列以及清楚說明的序列。特別的，簡并密碼子的取代可通過將一個(gè)或多個(gè)選定的(或全部)密碼子的第三位用混和堿基或脫氧次黃苷殘基取代而完成(Batzer等，Nucleic Acid Res.195081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.2602605-2608(1985)；Rossolini等，Mol.Cell.Probes891-98(1994))。術(shù)語“核酸”或“核酸序列”也可與基因、cDNA和由基因編碼的mRNA互換使用。
“植物”指在任何發(fā)育階段的任何植物，尤其為種子植物。
“植物細(xì)胞”為植物的結(jié)構(gòu)和生理單元，包括原生質(zhì)體和細(xì)胞壁。植物細(xì)胞可為分離的單細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞的形式，也可為更高級組織單位的一部分，例如植物組織、植物器官或整個(gè)植物體。
“植物細(xì)胞培養(yǎng)”指植物單元的培養(yǎng)，例如原生質(zhì)體、細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞、植物組織中的細(xì)胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、受精卵以及處于各個(gè)發(fā)育階段的胚。
“植物材料”指葉、莖、根、花或花的部分、果實(shí)、花粉、卵細(xì)胞、受精卵、種子、插條、細(xì)胞或組織培養(yǎng)或植物的任何其他部分或產(chǎn)物。
“植物器官”指植物體明顯的、具有可見結(jié)構(gòu)和分化的部分，例如根、莖、葉、花蕾或胚。
“植物組織”在此指組織成一個(gè)結(jié)構(gòu)和功能單元的一群植物細(xì)胞。包括植物活體或培養(yǎng)體系中的任何組織。該術(shù)語包括，但并不限于整個(gè)植物體、植物器官、植物種子、組織培養(yǎng)體系和任何組織成結(jié)構(gòu)或功能單元的植物細(xì)胞群。該術(shù)語連同或不連同如上所列出或被該定義所涵蓋的任何特定植物組織類型的使用，并不旨在排除其他任何類型的植物組織。
“啟動(dòng)子”為編碼區(qū)上游的非翻譯DNA序列，含有RNA聚合酶II的結(jié)合位點(diǎn)，并可啟動(dòng)DNA轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子區(qū)域也可包含對基因表達(dá)起調(diào)控作用的其他元件。
“原生質(zhì)體”為沒有細(xì)胞壁或僅有部分細(xì)胞壁的經(jīng)分離的植物細(xì)胞。
“純化的”.當(dāng)用來指核酸或蛋白質(zhì)時(shí)，“純化的”意味著核酸或蛋白質(zhì)基本上不含天然狀態(tài)下與其相連的其他細(xì)胞成分。盡管它可以是干燥或水溶液的狀態(tài)，但它優(yōu)選地以同質(zhì)狀態(tài)存在?？赏ㄟ^分析化學(xué)技術(shù)，例如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜，來確定純度和同質(zhì)性。在制備物中以主要成分存在的蛋白質(zhì)可以認(rèn)為是基本上純化的。術(shù)語“純化的”表示核酸或蛋白質(zhì)在電泳膠中基本上呈現(xiàn)一條條帶。特別的，它意味著核酸或蛋白質(zhì)純度為至少50％，更優(yōu)選的為至少85％，最優(yōu)選的為至少99％。
“調(diào)控元件”指涉及控制核苷酸序列表達(dá)的序列。調(diào)控元件包括與目標(biāo)核苷酸序列有效相連的啟動(dòng)子和終止信號。它們一般也包括核苷酸序列正確翻譯所需的序列。
“顯著增加”.酶活性的增加大于測量技術(shù)的固有誤差極限，優(yōu)選地在抑制劑存在時(shí)比野生型酶活性增加約2倍或更多，更優(yōu)選地增加大約5倍或更多，最優(yōu)選地增加大約10倍或更多。
當(dāng)用于兩條或更多的核酸或蛋白質(zhì)序列時(shí)，“相同”或百分比“一致性”指當(dāng)在最大對應(yīng)時(shí)互相比較和比對，兩條或更多的序列或子序列為相同的或含有特定百分比相同的氨基酸殘基或核苷酸，可通過以下的比較算法或目視檢查得出。
基本上相同兩條核酸或蛋白質(zhì)序列“基本上相同”，指在最大對應(yīng)時(shí)互相比較和比對，兩條或更多的序列或子序列具有至少60％，優(yōu)選的80％，更優(yōu)選的90-95％，最優(yōu)選的99％的核苷酸或氨基酸殘基的一致性，可通過以下的比較算法中的一種或目視檢查得出。優(yōu)選地，基本上一致性存在于長度至少為50個(gè)殘基的序列區(qū)域，更優(yōu)選地為至少100個(gè)殘基的區(qū)域，最優(yōu)選地為在150個(gè)殘基的區(qū)域內(nèi)都存在基本上一致性。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，在編碼區(qū)的全長內(nèi)都存在基本上一致性。此外，基本上一致的核酸或蛋白質(zhì)序列行使基本上一致的功能。
在序列比較中，通常將一條序列作為參照序列，待測序列與其進(jìn)行比較。使用序列比較算法時(shí)，將待測和參照序列輸入電腦(必要時(shí)標(biāo)明子序列座標(biāo))，指定序列算法程序的參數(shù)。然后基于指定的程序參數(shù)，序列比較算法計(jì)算出待測序列相對于參照序列的序列一致性百分比。
可通過以下方法來進(jìn)行序列比較的最佳比對Smith & Waterman在Adv.Appl.Math 2482(1981)中提出的局部同源性算法，Needleman和Wunsch在J.Mol.Biol.48443(1970)中提出的同源比對算法，Pearson和Lipman在Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 852444(1988)中提出的相似性尋找方法，這些算法的計(jì)算機(jī)化執(zhí)行[Wisconsin遺傳軟件包(Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA]，或目視檢查(可一般性參閱Ausubel等，見下文)。
適用于序列一致性百分比和序列相似性測定的工具的例子為BLAST算法，在Altschul等的J.Mol.Biol.215403-410(1990)中有描述。在國家生物信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)可得到公開的BLAST分析軟件。該算法首先通過確定在查詢序列中長度為W的短字串來確定高分值序列對(HSPs)，當(dāng)與序列數(shù)據(jù)庫中具有相同長度的字串進(jìn)行比對時(shí)，該高分值序列滿足某個(gè)正的閾值T或者與T匹配。T指相鄰字串閾值(Altschul等，1990)。這些起始的相鄰字串作為種子開始尋找含有這些字串的更長的HSPs。接著，這些字串沿著每條鏈向兩個(gè)方向延伸直至累積比對分值增加。對于核苷酸序列，累積分值是通過參數(shù)M(給一對配對殘基的獎(jiǎng)勵(lì)分值，總為＞0)和N(對錯(cuò)配殘基的懲罰分值，總為＜0)來計(jì)算的。對于氨基酸序列，使用分值矩陣來計(jì)算累積分值。當(dāng)累積比對分值從它的最大值下降X時(shí)，或者當(dāng)累積分值降至0或更低(由于一個(gè)或更多的負(fù)分值殘基比對)時(shí)，或者當(dāng)任何一條序列到達(dá)了盡頭時(shí)，字串在每個(gè)方向的延伸就停止。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定了比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(對于核苷酸序列)使用默認(rèn)值字串長(W)為11，期望值(E)為10，截止為100，M＝5，N＝-4，兩條鏈的比較。對于氨基酸序列，BLASTP程序使用默認(rèn)值字串長(W)為3，期望值(E)為10和BLOSUM62分值矩陣(見Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915(1989))。
除了計(jì)算序列一致性百分比，BLAST算法也可用于兩條序列之間相似性的統(tǒng)計(jì)分析(如見Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA905873-5787(1993))。由BLAST算法提供的一種相似性測量為最小概率之和(P(N))，它提供了在兩條核苷酸或氨基酸序列之間隨機(jī)匹配的概率。例如，如果待測核酸序列與參照核酸序列對比的最小概率之和小于0.1，優(yōu)選地為小于0.01，最優(yōu)選地為小于0.001，則待測核酸序列可認(rèn)為類似于參照序列。
兩條核酸序列為基本上一致的另一個(gè)標(biāo)志是在嚴(yán)格條件下兩個(gè)分子可互相雜交?！疤禺愋缘仉s交”指在嚴(yán)格條件下一個(gè)分子只和存在于DNA或RNA的復(fù)雜混合物中(例如總細(xì)胞)的特定的核酸序列結(jié)合、配對或雜交，。“基本上結(jié)合”指探針核酸和目標(biāo)核酸的互補(bǔ)雜交，包括較小的錯(cuò)配，該錯(cuò)配可以通過降低雜交介質(zhì)的嚴(yán)緊性來彌補(bǔ)，以達(dá)到對目標(biāo)核酸序列的檢測。
“嚴(yán)格雜交條件”和“嚴(yán)格雜交洗脫條件”在核酸雜交實(shí)驗(yàn)例如Southern和Northern雜交中的上下文均為序列依賴性的，且在不同環(huán)境參數(shù)下而不同。長序列特異雜交需要在較高的溫度下進(jìn)行。在Tijssen(1993)的《生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-核酸探針雜交》(Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes)第I部分第2章“雜交原理概述和核酸探針試驗(yàn)策略”(Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid probe assay)(Elsevier，紐約)中有關(guān)于核酸雜交的大量指導(dǎo)?？偟膩碚f，對于特定序列，在一定的離子強(qiáng)度和pH值下，高度嚴(yán)格的雜交和洗脫條件為低于熱解鏈溫度(Tm)約5℃。通常，在“嚴(yán)格的條件”下，一個(gè)探針會(huì)同其目標(biāo)序列雜交，而不同其它序列雜交。
Tm為50％的目標(biāo)序列與完全匹配的探針雜交時(shí)的溫度(在一定的離子強(qiáng)度和pH值下)。對于一個(gè)特定的探針，選擇非常嚴(yán)格的條件以與Tm相當(dāng)。在Southern和Northern印跡中，兩條具有100個(gè)以上互補(bǔ)殘基的互補(bǔ)核酸在膜上雜交的嚴(yán)格條件的一個(gè)例子是50％甲酰胺和1mg的肝素，于42℃雜交反應(yīng)過夜。高度嚴(yán)格的洗脫條件的一例為在0.15M的NaCl中于72℃洗脫15分鐘。嚴(yán)格的洗脫條件的一例為在0.2×SSC中于65℃洗脫15分鐘(見Sambrook，見下文中關(guān)于SSC緩沖液的描述)。通常地，在高度嚴(yán)格的洗脫前使用低嚴(yán)格性的洗脫去除背景的探針信號。中度嚴(yán)格的洗脫的一例為將具有例如100個(gè)以上堿基的雙螺旋鏈在1×SSC中于45℃洗脫15分鐘。低嚴(yán)格性的洗脫的一例為將具有例如100個(gè)以上堿基的雙螺旋鏈在4-6×SSC中于40℃洗脫15分鐘。對于短的探針(例如約10-50個(gè)核苷酸)，嚴(yán)格的洗脫條件通常涉及低于1.0M的Na離子濃度，通常約為0.01-1.0M的Na離子濃度(或者其他的鹽)，pH為7.0至8.3，溫度通常為至少約30℃。嚴(yán)格條件也可通過添加諸如甲酰胺之類的去穩(wěn)定劑而達(dá)到?？傊囟s交試驗(yàn)中的信噪比比所觀察到的無關(guān)探針的信噪比高2倍(或更高)，即表明檢測到了雜交。在嚴(yán)格條件下互不雜交的核酸如果它們編碼的蛋白質(zhì)是基本相同的，那么這兩條核酸仍是基本上相同的。例如在遺傳密碼允許的前提下，使用最大密碼子簡并性來產(chǎn)生核酸的拷貝時(shí)，這種情況會(huì)發(fā)生。
如下為雜交/洗脫條件組合的例子，可用于克隆與本發(fā)明中的參照序列基本上相同的同源核苷酸序列優(yōu)選地，參照核苷酸序列與參照核苷酸序列的雜交條件為7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，0.5M NaPO4，1mMEDTA，反應(yīng)溫度50℃，洗脫條件為于50℃在2×SSC和0.1％SDS中；更理想的為7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，0.5M NaPO4，1mM EDTA，反應(yīng)溫度50℃，洗脫條件為于50℃在1×SSC和0.1％SDS中；更理想的雜交條件仍為7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，0.5M NaPO4，1mM EDTA，反應(yīng)溫度50℃，洗脫條件為于50℃在0.5×SSC和0.1％SDS中；優(yōu)選的雜交條件為7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，0.5M NaPO4，1mM EDTA，反應(yīng)溫度50℃，洗脫條件為于50℃在0.1×SSC和0.1％SDS中；更優(yōu)選的雜交條件為7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，0.5M NaPO4，1mM EDTA，反應(yīng)溫度50℃，洗脫條件為于65℃在0.1×SSC和0.1％SDS中。
兩條核苷酸序列或蛋白質(zhì)為基本上相同的另一個(gè)標(biāo)志是由第一個(gè)核酸編碼的蛋白質(zhì)能夠與第二個(gè)核酸編碼的蛋白質(zhì)發(fā)生免疫交叉反應(yīng)或者特異性結(jié)合。因此，一個(gè)蛋白質(zhì)通常與另一個(gè)蛋白質(zhì)是基本上相同的，(例如)如果它們僅僅由于保守取代而不同。
當(dāng)指蛋白質(zhì)或者肽時(shí)，短語“與抗體特異性(或選擇性)結(jié)合”或“與……發(fā)生特異性(或選擇性)的免疫反應(yīng)”，指一個(gè)結(jié)合反應(yīng)，它能夠確定當(dāng)異源蛋白質(zhì)或其他生物制劑存在時(shí)蛋白質(zhì)的存在與否。因此，在指定的免疫測定條件下，特定的抗體只和特定的蛋白質(zhì)結(jié)合，而不與樣品中存在的其他蛋白質(zhì)發(fā)生顯著量的結(jié)合。在這樣的條件下，與一個(gè)抗體發(fā)生特異性結(jié)合可能需要選擇一個(gè)對特定蛋白質(zhì)具有特異性的抗體。例如，針對具有本發(fā)明中任何核酸序列編碼的氨基酸序列的蛋白質(zhì)制備的抗體可以被選擇，從而得到與該蛋白質(zhì)而不與其它蛋白質(zhì)發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗體(多態(tài)變體除外)。
一系列的免疫測定方式可用于選擇對一個(gè)特定蛋白質(zhì)具有特異免疫反應(yīng)的抗體。例如，固相ELISA免疫測定、Western印跡或免疫組織化學(xué)都是常規(guī)用于選擇對一個(gè)特定蛋白質(zhì)具有特異免疫反應(yīng)的單克隆抗體的方法。見Harlow和Lane(1988)《抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊》(Antibodies，A Laboratory Manual)，冷泉港出版社，紐約“Harlow和Lane”)，其中有關(guān)于測定特定免疫反應(yīng)性的免疫測定方式和條件的描述。通常，一個(gè)特異性或選擇性的反應(yīng)會(huì)比背景信號或噪聲高出至少兩倍，更通常地比背景高出10至100倍。
特定核酸序列的“保守性修飾變異”是指編碼相同或基本上相同的氨基酸序列的核酸序列，或者當(dāng)核酸序列不編碼氨基酸序列時(shí)，指基本相同的序列。由于遺傳密碼的簡并性，大量功能相同的核酸都可編碼任何一個(gè)給定的多肽。例如，密碼子CGT、CGC、CGA、CGG、AGA和AGG都編碼精氨酸。因此，在每個(gè)編碼精氨酸的密碼子位置，可按照如上描述的相應(yīng)的密碼子將其替換而不會(huì)改變所編碼的蛋白質(zhì)。這一類的核酸突變稱為“沉默突變”，為一種“保守性修飾變異”。除非特別標(biāo)明，在此描述的每一種編碼蛋白質(zhì)的核酸序列都可能為沉默突變。技術(shù)人員知道核酸中的每個(gè)密碼子(除了ATG，它是甲硫氨酸的唯一密碼子)都可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)經(jīng)修飾后產(chǎn)生另一個(gè)功能相同的分子。因此，在每個(gè)描述的序列中都隱含有編碼蛋白質(zhì)的核酸序列的“沉默突變”。
此外，技術(shù)人員也知道在編碼序列中，導(dǎo)致單個(gè)氨基酸或很小百分比(通常為小于5％，更通常地為小于1％)的氨基酸改變、增加或缺失的個(gè)別的取代、缺失或增加都可被稱為“保守性修飾變異”，其中這些改變導(dǎo)致一個(gè)氨基酸被其在化學(xué)上相似的氨基酸取代。提供功能相似的氨基酸的保守取代表在本領(lǐng)域中是熟知的。如下五組中每組都包括可互相保守性取代的氨基酸脂肪族甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)；芳香族苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫氨基酸甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；堿性氨基酸精氨酸(R)、賴氨酸(K)、組氨酸(H)；酸性氨基酸天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)。也可見Creighton(1984)的《蛋白質(zhì)》(Proteins)，W.H.Freeman and Company。此外，可導(dǎo)致編碼序列中一個(gè)氨基酸或很小百分比的氨基酸的改變、增加或缺失的單個(gè)的取代、缺失或增加也稱為“保守性修飾變異”。
“子序列”指分別含有較大核酸序列或氨基酸序列(如蛋白質(zhì))的一部分的核酸序列或氨基酸序列。
當(dāng)另外的核苷酸(或者其他類似分子)整合入核酸時(shí)，核酸“延伸”。最普遍的是通過聚合酶(如DNA聚合酶)來實(shí)現(xiàn)的，例如在核酸3’末端添加序列的聚合酶。
當(dāng)分別來自兩條核酸的序列組合為子核酸時(shí)，這兩條核酸為“重組的”。當(dāng)兩條核酸都為重組底物時(shí)，這兩條序列是“直接”重組的。當(dāng)兩條核酸通過中間物例如交換寡核苷酸來進(jìn)行重組時(shí)，這兩條序列稱為“間接”重組的。在間接重組時(shí)，至多一條序列為重組的實(shí)際底物，在一些情況下，兩條序列都不是重組的底物。
“合成的”指具有在天然序列中不存在的結(jié)構(gòu)特征的核苷酸序列。例如，一段與雙子葉和/或單子葉基因的G+C含量非常接近，并且具有其正常的密碼子分布的人工合成的序列稱為“合成的”。
“反式激活蛋白”是能使編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)(獨(dú)自或結(jié)合一個(gè)或多個(gè)其它蛋白質(zhì))，其中該編碼區(qū)受相應(yīng)的反式激活蛋白介導(dǎo)的啟動(dòng)子的控制。反式激活蛋白系統(tǒng)的例子包括“噬菌體T7基因10啟動(dòng)子，其轉(zhuǎn)錄激活依賴于特定的RNA聚合酶，例如噬菌體T7 RNA聚合酶。反式激活蛋白通常為能與特定啟動(dòng)子相互作用以啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶或DNA結(jié)合蛋白，它以直接激活啟動(dòng)子或使抑制基因失活的方式(例如抑制阻遏蛋白的表達(dá)或積累)行使上述功能。DNA結(jié)合蛋白可以是一個(gè)含有與合適的轉(zhuǎn)錄激活因子區(qū)域相連的結(jié)合區(qū)(如GAL4結(jié)合區(qū))的嵌合蛋白。一些反式激活蛋白系統(tǒng)可有多個(gè)反式激活蛋白，例如一些不僅需要聚合酶，也需要一個(gè)特定亞基(σ因子)來識別啟動(dòng)子、結(jié)合DNA或激活轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。反式激活蛋白相對于植物體優(yōu)選是異源的。
轉(zhuǎn)化將異源DNA引入細(xì)胞、組織或昆蟲的方法。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織和昆蟲應(yīng)該理解成不僅包含轉(zhuǎn)化方法的終產(chǎn)物，也包含其轉(zhuǎn)基因后代。
“轉(zhuǎn)化的”、“轉(zhuǎn)基因的”和“重組”指引入異源核酸分子的宿主生物，例如細(xì)菌或植物。核酸分子可以穩(wěn)定地整合入宿主基因組，或者該核酸分子也可以染色體外分子的形式存在。這樣一個(gè)染色體外分子可以是自主復(fù)制性的。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織和昆蟲應(yīng)該理解成不僅包含轉(zhuǎn)化方法的終產(chǎn)物，也包含其轉(zhuǎn)基因后代。“未轉(zhuǎn)化的”、“非轉(zhuǎn)基因的”或“非重組的”宿主指不含有異源核酸分子的野生型生物，例如細(xì)菌和植物。
按照如下標(biāo)準(zhǔn)縮寫用堿基來表示核苷酸腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和鳥嘌呤(G)。按照如下標(biāo)準(zhǔn)縮寫來表示氨基酸、丙氨酸(Ala，A)、精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸(Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、谷氨酰胺(Gln，Q)、谷氨酸(Glu，E)、甘氨酸(Gly，G)、組氨酸(His，H)、異亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、賴氨酸(Lys，K)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F(xiàn))、脯氨酸(Pro，P)、絲氨酸(Ser，S)、蘇氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)和纈氨酸(Val，V)。此外，(Xaa，X)代表任何氨基酸。
濕磨法濕磨法是一種分離谷物中，尤其為谷類(如玉米)中淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪組分的方法。在此它和干磨法是有區(qū)別的，干磨法只是簡單地粉碎谷物。玉米濕磨法包括浸泡、磨碎谷粒和分離谷粒組分幾個(gè)步驟。濕磨法的第一個(gè)步驟通常為浸泡，其中將谷物在小心控制的條件下浸泡于水中，來達(dá)到軟化谷粒利于分離各組分的目的。通常將谷粒浸泡于盛有120°F回流水的浸泡缸中，其中含有約0.2％(重量)的二氧化硫。谷粒在浸泡缸中浸泡24至48個(gè)小時(shí)。而后將其去水，放入幾組磨碎機(jī)。第一組磨碎機(jī)將谷粒破裂并從谷粒的剩余部分釋放出胚芽和玉米油。通過離心將胚芽從剩余的谷物中分離出來。帶油的胚漂浮在水溶液的表面并被除去。其次，經(jīng)過水化和去水、研磨、篩選、離心和洗滌，可從蛋白質(zhì)中分離出淀粉并純化。去除胚后，剩余的谷物組分(包括淀粉、谷殼、纖維和谷蛋白)均被放入另一組磨碎機(jī)，經(jīng)過一系列的洗滌篩，將纖維和淀粉、谷蛋白分離開來。淀粉和谷蛋白均能通過篩，而纖維不能。用離心或第三次研磨之后離心的方法將淀粉和蛋白質(zhì)分開。離心產(chǎn)生含有淀粉顆粒的漿液，它經(jīng)過去水、用新鮮水洗滌并干燥至約12％濕度。用這種方法就可從玉米谷粒中回收得到基本上純的淀粉組分。
關(guān)鍵的難點(diǎn)在于從復(fù)雜的蛋白質(zhì)基質(zhì)和組成谷物胚乳的細(xì)胞壁物質(zhì)中釋放出淀粉顆粒。造成困難的一個(gè)原因是分子間或分子內(nèi)二硫鍵的存在，使得蛋白質(zhì)基質(zhì)不易溶且對蛋白水解酶不敏感，并抑制了從谷物蛋白質(zhì)基質(zhì)中釋放出淀粉?！，F(xiàn)在減少這些二硫鍵的主要方法是在二氧化硫存在的情況下浸泡谷物，然而這樣操作是很昂貴、不環(huán)保的，并且效率也不是最優(yōu)的。因?yàn)榻菟泻卸趸?，因此該水被認(rèn)為是有毒廢棄物，所以將產(chǎn)生的水量降到最低程度是有利的。選擇性地，可以不需要二氧化硫。降低胚乳基質(zhì)中二硫鍵含量的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是在研磨之前減少谷物處理所需的浸泡時(shí)間。一些突變對玉米谷粒胚乳(粉狀的和不透明的)中的蛋白質(zhì)基質(zhì)有較有利的影響，但是破壞了谷物的完整性。轉(zhuǎn)基因硫氧還蛋白的表達(dá)提供了上述的幾個(gè)有利條件而并不產(chǎn)生一些與突變相關(guān)的谷粒完整性問題。
收割后或加工依賴性的硫氧還蛋白的活性有相同的有利影響。例如，在一個(gè)實(shí)施例中，硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶被定位和累積于細(xì)胞小室中。在種子物理破壞之后蛋白質(zhì)還原。在另一個(gè)實(shí)施例中，通過浸泡，處于休眠中的硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶被激活。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種能夠表達(dá)熱穩(wěn)定硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶(例如來自一個(gè)嗜熱生物的硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶)的轉(zhuǎn)基因植物，從而使得硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶除了在高溫下均沒有顯著活性(例如高于50℃)。在一個(gè)實(shí)施例中，熱穩(wěn)定的硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶通過胚乳中其他熱穩(wěn)定酶的表達(dá)可增強(qiáng)糖化作用。
飼料上的應(yīng)用在谷物中表達(dá)轉(zhuǎn)基因硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶也可用于改良與可消化性相關(guān)的谷物特征，尤其在動(dòng)物飼料中。飼料蛋白質(zhì)對蛋白酶的敏感性是時(shí)間和蛋白質(zhì)構(gòu)象的函數(shù)。在飼料配方中經(jīng)常使用谷物破裂和蒸汽剝落(Steam flaking)。這兩種方法都用來增加谷粒的可消化性。在動(dòng)物的胃中其完整性更易被破壞的較軟的顆粒是優(yōu)選的。對蛋白酶敏感性的主要決定因素為構(gòu)象限制和蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)。通過增加硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶的表達(dá)而修飾這些鍵，從而有助于消化。
玉米干磨法/濕潤粉糊蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量是磨粉生產(chǎn)和濕潤粉糊生產(chǎn)的重要決定因素。二硫鍵的減少改變了玉米粉的性質(zhì)，從而使得它適用作小麥的替代物，尤其是來自高蛋白質(zhì)含量的白玉米變種的粉末。
大豆壓榨美國的大豆作物中有一半為壓榨或研磨處理的，產(chǎn)生的低脂肪豆粉或脫脂豆粉(或大豆粉)中的蛋白質(zhì)質(zhì)量對于以后的加工是很重要的。由大豆加工物流得到的蛋白質(zhì)產(chǎn)量和質(zhì)量在經(jīng)濟(jì)上是重要的，并且在很大程度上依賴于蛋白質(zhì)構(gòu)象。通過表達(dá)轉(zhuǎn)基因硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶來提高硫氧還蛋白的活性可提高蛋白質(zhì)的可溶性，進(jìn)而提高水溶性蛋白質(zhì)組分的產(chǎn)率。在堿性條件下通過在水溶液中提取脫脂大豆粉可提高回收量。通過表達(dá)轉(zhuǎn)基因硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶提高了硫氧還蛋白的活性，同時(shí)也降低了有效提取所需的pH值，因此減少了加入的氫氧化鈣或氫氧化鈉的量，同時(shí)減少了隨后酸沉降所需加入酸的量，使不經(jīng)過堿的破壞就可有效回收蛋白質(zhì)，進(jìn)而減少水的消耗和加工植物產(chǎn)生的廢水(其包含大量生化耗氧負(fù)荷)。蛋白質(zhì)氧化還原狀態(tài)影響了大豆蛋白質(zhì)的重要功能特性，例如可溶性、吸水性、粘性、內(nèi)聚力/粘附力、凝膠化和彈性。通過在此描述的提高硫氧還蛋白活性還可促進(jìn)大豆蛋白質(zhì)濃縮生產(chǎn)期間和蛋白酶對大豆蛋白質(zhì)分離物的水解過程期間的纖維的去除。類似的，如同上述對玉米描述的一樣，通過表達(dá)轉(zhuǎn)基因硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶提高硫氧還蛋白的活性也增加了具有酶活性的豆粉的功能，以及在動(dòng)物飼料中大豆粉組分和蒸汽剝落組分的可消化性。提供了在種子發(fā)育過程中或加工過程中對蛋白質(zhì)質(zhì)量的修飾，盡管優(yōu)選的為如上所述的轉(zhuǎn)基因硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶定向至細(xì)胞小室且為熱穩(wěn)定的，以避免種子發(fā)育過程中由于硫氧還蛋白的活性所導(dǎo)致的對儲(chǔ)存蛋白質(zhì)累積的可能遇到的顯著負(fù)面效應(yīng)。可選擇地，硫氧還蛋白可作為加工酶添加，因?yàn)橹钡焦任锏耐暾员黄茐?壓碎和油提取)后才有必要破壞二硫鍵(與玉米濕磨法相反)。
用于異源表達(dá)的硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶的選擇硫氧還蛋白、硫氧還蛋白還原酶和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)基因存在于真核生物，包括植物、真細(xì)菌以及古細(xì)菌，其中包括如詹氏甲烷球菌和閃爍古生球菌等嗜高溫生物。對一個(gè)特定基因的選擇部分依賴于所需的應(yīng)用。對于本發(fā)明的方法，優(yōu)選的硫氧還蛋白具有如下的特征1.熱穩(wěn)定性-來自嗜高溫細(xì)菌的硫氧還蛋白和相關(guān)蛋白在高溫下(＞50℃)均具有增加的熱穩(wěn)定性，而在環(huán)境溫度下具有相對低的活性。在種子發(fā)育過程中優(yōu)選表達(dá)來自嗜高溫細(xì)菌的硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶，例如來自詹氏甲烷球菌和閃爍古生球菌或其他嗜高溫細(xì)菌，這樣除非谷物浸泡或在高溫下加工，硫氧還蛋白的活性不會(huì)有顯著增加。大部分谷物加工過程包括或者可兼容高溫的步驟。因此熱穩(wěn)定的硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶為優(yōu)選的。熱穩(wěn)定是指酶在高溫時(shí)具有較高的活性，例如在高于40℃的溫度下，最優(yōu)選的溫度為高于50℃，如濕磨法為45-60℃，甚至更高，45-95℃。
2.底物特異性-通過選擇某一硫氧還蛋白，有可能降低對種子發(fā)育的不需要的作用，其中該硫氧還蛋白優(yōu)先作用于某一蛋白質(zhì)(如基質(zhì)中的結(jié)構(gòu)蛋白)，但對基本代謝酶具有低的活性。多種硫氧還蛋白顯示了與在氧化還原條件控制下的酶作用的不同活性。因此選擇能主要作用于目標(biāo)的硫氧還蛋白是可能的，這樣可使過量表達(dá)產(chǎn)生的不需要的負(fù)面效應(yīng)降至最低。
適當(dāng)?shù)牧蜓踹€蛋白和硫氧還蛋白還原酶包括如下幾種●來自詹氏甲烷球菌的硫氧還蛋白氨基酸序列(gil 1591029)MSKVKIELFTSPMCPHCPAAKRVVEEVANEMPDAVEVEYINVMENPQKAMEYGIMAVPTIVINGDVEFIGAPTKEALVEAIKKRL(SEQ ID NO1)；●來自閃爍古生球菌的硫氧還蛋白氨基酸序列(gil 2649903)(trx-1)MPMVRKAAFYAIAVISGVLAAVVGNALYHNFNSDLGAQAKIYFFYSDSCPHCREVKPYVEEFAKTHNLTWCNVAEMDANCSKIAQEFGIKYVPTLVIMDEEAHVFVGSDEVRTAIEGMK(SEQ ID NO2)；
●來自閃爍古生球菌的硫氧還蛋白氨基酸序列(gil 2649838)(trx-2)MVFTSKYCPYCRAFEKVVERLMGELNGTVEFEVVDVDEKRELAEKYEVLMLPTLVLADGDEVLGGFMGFADYKTAREAILEQISAFLKPDYKN(SEQ ID NO3)；●來自閃爍古生球菌的硫氧還蛋白氨基酸序列(gil 2649295)(trx-3)MDELELIRQKKLKEMMQKMSGEEKARKVLDSPVKLNSSNFDETLKNNENVVVDFWAEWCMPCKMIAPVIEELAKEYAGKVVFGKLNTDENPTIAARYGISAIPTLIFFKKGKPVDQLVGAMPKSELKRWVQRNL(SEQ ID NO4)；●來自閃爍古生球菌的硫氧還蛋白氨基酸序列(gil 2648389)(trx-4)MERLNSERFREVIQSDKLVVVDFYADWCMPCRYISPILEKLSKEYNGEVEFYKLNVDENQDVAFEYGIASIPTVLFFRNGKVVGGFIGAMPESAVRAEIEKALGA(SEQ IDNO5)；●來自詹氏甲烷球菌的硫氧還蛋白還原酶(trx B)氨基酸序列(gil 1592167)MIHDTIIIGAGPGGLTAGIYAMRGKLNALCIEKENAGGRIAEAGIVENYPGFEEIRGYELAEKFKNHAEKFKLPIIYDEVIKIETKERPFKVITKNSEYLTKTIVIATGTKPKKLGLNEDKFIGRGISYCTMCDAFFYLNKEVIVIGRDTPAIMSAINLKDIAKKVIVITDKSELKAAESIMLDKLKEANNVEIIYNAKPLEIVGEERAEGVKISVNGKEEIIKADGIFISLGHVPNTEFLKDSGIELDKKGFIKTDENCRTNIDGIYAVGDVRGGVMQVAKAVGDGCVAMANIIKYLQKL(SEQ ID NO6)；以及●來自閃爍古生球菌的硫氧還蛋白還原酶氨基酸序列(gil2649006)(trxB)MYDVAIIGGGPAGLTAALYSARYGLKTVFFETVDPVSQLSLAAKIENYPGFEGSGMELLEKMKEQAVKAGAEWKLEKVERVERNGETFTVIAEGGEYEAKAIIVATGGKHKEAGIEGESAFIGRGVSYCATCDGNFFRGKKVIVYGSGKEAIEDAIYLHDIGCEVTIVSRTPSFRAEKALVEEVEKRGIPVHYSTTIRKIIGSGKVEKVVAYNREKKEEFEIEADGIFVAIGMRPATDVVAELGVERDSMGYIKVDKEQRTNVEGVFAAGDCCDNPLKQVVTACGDGAVAAYSAYKYLTS(SEQ ID NO7)。
使用植物偏愛密碼子通過反向翻譯(back-translation)來設(shè)計(jì)編碼用于本發(fā)明的這些蛋白質(zhì)的基因，提高G-C的含量并去除有害序列，更詳細(xì)的見如下的敘述?？赏ㄟ^DNA改組或其他方法來提高蛋白質(zhì)的活性，如下所述。因此本發(fā)明包括從這些蛋白質(zhì)衍生而來的蛋白質(zhì)，尤其為具有硫氧還蛋白或硫氧還蛋白還原酶活性并且基本相似的蛋白質(zhì)。
為了在谷物發(fā)育過程中在種子中表達(dá)具活性的硫氧還蛋白，優(yōu)選的是能指導(dǎo)硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶種子特異性表達(dá)的啟動(dòng)子，由于目標(biāo)是儲(chǔ)藏，從而使得酶對儲(chǔ)藏蛋白具有需要的作用，這在一些應(yīng)用中是可取的。然而在本發(fā)明中，更普遍可取的為在種子中表達(dá)硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶，它們在谷物發(fā)育過程中累積并且無活性。很多策略可用于生產(chǎn)表達(dá)轉(zhuǎn)基因硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶的種子，并且對正常種子發(fā)育過程不會(huì)產(chǎn)生很大的影響，例如(i)將具有活性的硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶隔離，使其不能與目標(biāo)蛋白質(zhì)發(fā)生顯著相互作用，例如通過定位于或表達(dá)于造粉體中。質(zhì)體定向序列可用于引導(dǎo)在造粉體中的累積?？蛇x擇地，通過分泌信號可將硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶定位于細(xì)胞壁的細(xì)胞外空間?；蛘咴趩巫尤~植物中，在種子發(fā)育過程中在糊粉細(xì)胞等細(xì)胞類型中的表達(dá)，可將硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶與胚乳中其他儲(chǔ)存成分分離開來。
(ii)通過遺傳工程改造來自嗜熱生物的硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶的表達(dá)。在環(huán)境溫度中(在本領(lǐng)域中高至38-39℃)幾乎沒有活性的酶在發(fā)育過程中不太可能產(chǎn)生問題。因此優(yōu)選地，酶主要在高溫下具有活性，例如高于40℃的溫度，對于濕磨法最優(yōu)選的為45-60℃，甚至更高，如45-95℃。
(iii)將硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶置于一個(gè)可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子控制下，例如化學(xué)試劑誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，創(chuàng)傷誘導(dǎo)的啟動(dòng)子或者反式激活蛋白介導(dǎo)的啟動(dòng)子(它通過被表達(dá)該反式激活蛋白的植物花粉傳粉而激活)。
(iv)使用對特定硫氧還蛋白還原酶具有特定要求的硫氧還蛋白，從而使得硫氧還蛋白或硫氧還蛋白還原酶的活性可分別通過合適的硫氧還蛋白還原酶或硫氧還蛋白的獲得來調(diào)節(jié)。例如在不同植物中表達(dá)硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶，從而只有通過表達(dá)互補(bǔ)酶的植物傳粉，種子中才可發(fā)生有活性的結(jié)合?？蛇x擇地，硫氧還蛋白或硫氧還蛋白還原酶在細(xì)胞中被隔離于如上所述的質(zhì)體、液泡或質(zhì)外體中，從而直到谷物加工時(shí)它才能相遇而具有活性。
谷物加工的方法因此本發(fā)明提供了一種通過硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶促進(jìn)淀粉從蛋白質(zhì)基質(zhì)中分離的新方法。在第一個(gè)實(shí)施例中，在多個(gè)種子加工應(yīng)用中，硫氧還蛋白的活性均有用途，包括濕磨法、干磨法、油料種子加工、大豆加工、小麥加工和面粉/面團(tuán)品質(zhì)，尤其是谷物(特別是玉米)的濕磨法。因此本發(fā)明提供了一種提高研磨效率或提高研磨產(chǎn)量，提高分離淀粉和蛋白質(zhì)的效率，增大了谷物淀粉和可溶性蛋白質(zhì)的產(chǎn)量，或者提高蛋白質(zhì)在水溶液或其它溶劑中的溶解度的方法，包括在補(bǔ)充的硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶存在時(shí)浸泡谷物，以及分離谷物中的淀粉和蛋白質(zhì)組分。通常，在研磨之前浸泡，但也可在研磨之后浸泡，在加工提取過程中可有多次的研磨或浸泡步驟，在浸泡時(shí)或浸泡后種子的蛋白質(zhì)產(chǎn)量會(huì)增加。優(yōu)選地，補(bǔ)充的硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶可通過收獲谷物的植物中轉(zhuǎn)基因的表達(dá)來提供。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了在某一方法中硫氧還蛋白或硫氧還蛋白還原酶提高研磨的效率或增大淀粉和蛋白質(zhì)的研磨產(chǎn)量的用途，例如在如上所述的任何一種方法中，含有一定量的硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶的浸泡水，這一數(shù)量可促進(jìn)谷物中淀粉和蛋白質(zhì)的分離；用能促進(jìn)淀粉從蛋白質(zhì)中分離的有效量硫氧還蛋白處理的谷物；用如上所述的方法生產(chǎn)的淀粉或者蛋白質(zhì)。在如上方法中的硫氧還蛋白的活性可通過補(bǔ)充含有硫氧還蛋白還原酶和/或NADPH的浸泡水來提高。濕磨法的浸泡水中正常存在的其它組分也可存在，例如生產(chǎn)乳酸的細(xì)菌。優(yōu)選地，浸泡溫度為52℃左右，時(shí)間為22-50小時(shí)，因此就需要硫氧還蛋白在這些條件下是穩(wěn)定的。
谷物可為雙子葉植物的種子，例如油料種子，如大豆、向日葵或油菜籽，優(yōu)選的為大豆；或者也可為單子葉植物的種子，例如谷類的種子，如玉米、小麥、燕麥、大麥、黑麥或水稻，優(yōu)選的為玉米。
硫氧還蛋白可為任何含硫醇基的蛋白質(zhì)，它可被可逆氧化形成二硫鍵，并且在硫氧還蛋白還原酶的存在下，可被NADPH還原。優(yōu)選的硫氧還蛋白來自如上所述的嗜熱生物。在本發(fā)明中使用的硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶是通過基因工程微生物適當(dāng)生產(chǎn)的，例如酵母或者曲霉，或者如受控于在發(fā)芽期間活化的啟動(dòng)子，如高pI的α-淀粉酶啟動(dòng)子或其它依賴于赤霉素的啟動(dòng)子，在具有高表達(dá)能力的基因工程植物(例如在大麥中)中產(chǎn)生。將硫氧還蛋白(以分泌或提取的形式或者與制造者生物或其部分相結(jié)合的形式)加入浸泡水中。
作為一種將硫氧還蛋白加入浸泡水中的可供選擇的辦法或補(bǔ)充方法，可在用于研磨的種子中直接表達(dá)該酶。優(yōu)選地，在谷物成熟過程或條件加工過程中表達(dá)該酶。
因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在轉(zhuǎn)基因生物中以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)硫氧還蛋白的方法，例如在植物或微生物中，植物的例子是諸如大麥或玉米的谷類，微生物的例子是酵母或曲霉，例如，包含培養(yǎng)具有表達(dá)硫氧還蛋白的嵌合基因之轉(zhuǎn)基因生物，并且可選擇性地分離或提取硫氧還蛋白的步驟的方法。
使用轉(zhuǎn)基因植物的方法，該植物在種子成熟或發(fā)芽時(shí)能夠產(chǎn)生增加量的硫氧還蛋白，從而使得種子中蛋白質(zhì)的質(zhì)量在種子發(fā)育過程中或者浸泡過程中受內(nèi)源合成的硫氧還蛋白的影響，從而消除或減少了在研磨之前用外源化合物或酶處理的必要；生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法，該植物在種子成熟或發(fā)芽時(shí)能夠產(chǎn)生增加量的硫氧還蛋白，從而使得種子中蛋白質(zhì)的質(zhì)量在種子發(fā)育過程中或者浸泡過程中受硫氧還蛋白的影響，從而消除或減少了在研磨之前用外源化合物或酶處理的必要；使用含有硫氧還蛋白的轉(zhuǎn)基因種子研磨谷物的方法，可導(dǎo)致更高的淀粉和可溶性蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。
本發(fā)明進(jìn)一步包括一個(gè)在其基因組中含有嵌合表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因生物，其中該嵌合表達(dá)盒包含編碼熱穩(wěn)定或真核硫氧還蛋白或硫氧還蛋白還原酶的編碼區(qū)，該編碼區(qū)受啟動(dòng)子的有效控制。
優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因生物為以該種植物中天然不出現(xiàn)的形式表達(dá)硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶的植物，或者是其中硫氧還蛋白的表達(dá)量要高于該種植物自然表達(dá)量的植物。優(yōu)選地，硫氧還蛋白表達(dá)于處于發(fā)育過程的種子中，因此優(yōu)選地受控于種子特異性的啟動(dòng)子?？蛇x擇地，硫氧還蛋白的表達(dá)受控于可誘導(dǎo)或反式激活蛋白調(diào)控的啟動(dòng)子，從而使得在需要時(shí)可通過化學(xué)誘導(dǎo)或與反式激活蛋白雜交激活表達(dá)。通過與液泡定位序列發(fā)生融合，將硫氧還蛋白適當(dāng)定位于植物液泡中。在本發(fā)明中，編碼硫氧還蛋白的序列是與植物中具有活性的啟動(dòng)子相連的，它們轉(zhuǎn)化入核基因組或質(zhì)體基因組。啟動(dòng)子優(yōu)選地為諸如γ-玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子之類的種子特異性的啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子也可為化學(xué)試劑誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，例如煙草PR-1a啟動(dòng)子；或者為化學(xué)試劑誘導(dǎo)的反式激活蛋白調(diào)控的啟動(dòng)子，其中反式激活蛋白受控于一個(gè)化學(xué)試劑誘導(dǎo)的啟動(dòng)子；然而在一定條件下，可使用組成型啟動(dòng)子，例如CaMV35S或Gelvin啟動(dòng)子。在化學(xué)試劑誘導(dǎo)的啟動(dòng)子控制下，轉(zhuǎn)化入植物的硫氧還蛋白基因的表達(dá)可通過葉子上化學(xué)誘導(dǎo)劑的應(yīng)用在適當(dāng)時(shí)機(jī)激活。
可選擇地，硫氧還蛋白的編碼序列可以受控于反式激活蛋白調(diào)控的啟動(dòng)子，通過將轉(zhuǎn)化了該序列的植物和另一種表達(dá)反式激活蛋白的植物雜交可激活表達(dá)。在這種方法的優(yōu)選形式中，含有硫氧還蛋白編碼序列的第一種植物為種子親本，且為雄性不育，而表達(dá)反式激活蛋白的第二種植物為傳粉者。在種子中表達(dá)硫氧還蛋白是通過間作第一種和第二種植物實(shí)現(xiàn)的，例如第一種植物被第二種植物授粉，通過第二種植物反式激活蛋白基因表達(dá)的反式激活蛋白激活第一種植物中反式激活蛋白調(diào)控的啟動(dòng)子，可使硫氧還蛋白在第一種植物種子中表達(dá)。
在本申請中所描述的核酸序列可通過傳統(tǒng)DNA重組技術(shù)整合入植物細(xì)胞。通常，該過程包括將本發(fā)明的編碼序列插入對該編碼序列來說是異源(即在正常情況下不存在的)的表達(dá)系統(tǒng)，使用的為本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)克隆方法。載體含有插入的編碼蛋白質(zhì)序列轉(zhuǎn)錄和翻譯必需的元件?？墒褂枚喾N本領(lǐng)域熟知的載體系統(tǒng)，例如質(zhì)粒、噬菌體病毒或其它修飾了的病毒。適當(dāng)?shù)妮d體包括，但并不限于，病毒載體，例如λ載體系統(tǒng)λgt11、λgt10和Charon4；質(zhì)粒載體，如pBI121、pBR322、pACYC177、pACYC184、pAR系列、pKK223-3、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pRK290、pKC37、pKC101、pCDNAII；以及其它類似的系統(tǒng)。表達(dá)系統(tǒng)的組分也可經(jīng)修飾來增加表達(dá)。例如，可使用截短的序列、核苷酸取代或其它的修飾。在此所描述的表達(dá)系統(tǒng)可在適當(dāng)條件下轉(zhuǎn)化任何作物植物細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可再生為完整的植株，從而使得本發(fā)明的核苷酸序列可在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)。
編碼序列和相鄰序列的修飾來自微生物源的基因在植物中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)可能需要對這些基因進(jìn)行修飾來達(dá)到和優(yōu)化它們在植物中的表達(dá)。特別地，編碼分離酶但在天然微生物中被相同的轉(zhuǎn)錄本所編碼的細(xì)菌ORF在植物中分離的轉(zhuǎn)錄本上可被最佳表達(dá)。要達(dá)到此目的，每個(gè)細(xì)菌的ORF都被單獨(dú)分離出來并克隆入盒中，該組件提供了ORF5’端的植物啟動(dòng)子序列和ORF3’端的植物轉(zhuǎn)錄終止子。分離出的ORF序列優(yōu)選地包括起始的ATG密碼子和終端STOP密碼子，但還可在起始ATG和STOP密碼子外含有其它序列。此外，ORF可被截短，但仍具有其所需活性；對于特別長的ORF，具有活性的截短ORFs對于在轉(zhuǎn)基因生物中的表達(dá)是優(yōu)選的?！爸参飭?dòng)子”和“植物轉(zhuǎn)錄終止子”指在植物細(xì)胞中操作的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子。這包括來自非植物源例如來自病毒(如花椰菜花葉病毒)的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子。
在一些情況下，不需要對ORF編碼區(qū)及其相鄰序列進(jìn)行修飾。分離出含有目的ORF的片段并將其插入植物啟動(dòng)子下游就足夠了。例如，Gaffney等(Science261754-756(1993))已經(jīng)在CaMV 35S啟動(dòng)子和CaMV tml終止子控制下在轉(zhuǎn)基因植物中成功地表達(dá)了Pseudomonas nahG基因，其編碼區(qū)未經(jīng)修飾，并且Pseudomonas基因ATG上游x bp和STOP密碼子下游y bp仍連接于nahG ORF上。ATG上游和STOP密碼子下游相連的微生物序列最好不要留下。實(shí)際上，此類構(gòu)建依賴于限制性酶切位點(diǎn)的可獲得性。
在其它情況下，表達(dá)來自微生物源的基因可能導(dǎo)致表達(dá)中的問題。這些問題在本領(lǐng)域已經(jīng)得到了很好的表征，尤其常見的為表達(dá)來自諸如芽孢桿菌屬(Bacillus)之類的基因。這些問題可在本發(fā)明中的核苷酸序列中出現(xiàn)，可通過現(xiàn)在本領(lǐng)域熟知的技術(shù)來對這些基因進(jìn)行修飾?？捎龅饺缦碌膯栴}1.密碼子利用植物中的偏愛密碼子利用與一些微生物的偏愛密碼子利用不同。對比目標(biāo)克隆的微生物ORF中密碼子的利用和植物基因中密碼子的利用(尤其為來自目標(biāo)植物的基因)能夠辨別ORF中應(yīng)該改變的密碼子。通常對于單子葉植物來說，植物進(jìn)化趨向于在第三個(gè)堿基位置對核苷酸C和G的強(qiáng)烈偏好，而在雙子葉植物中，在這個(gè)位置經(jīng)常使用核苷酸A或T。通過修飾基因，使其整合特定目標(biāo)轉(zhuǎn)基因物種的偏愛密碼子，很多如下描述的GC/AT含量和錯(cuò)誤剪接之類的問題都可克服。
2.GC/AT含量植物基因通常具有35％以上的GC含量。富含A和T核苷酸的ORF序列在植物中會(huì)產(chǎn)生一些問題。第一，ATTTA基序會(huì)產(chǎn)生信息的不穩(wěn)定，并且經(jīng)常在許多短命mRNA的3’末端發(fā)現(xiàn)。第二，信息中在正確位置出現(xiàn)諸如AATAAA之類的聚腺苷酸化信號被認(rèn)為會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的早熟性截短。此外，單子葉植物可將富含AT的序列識別為剪接位點(diǎn)(如下)。
3.與起始甲硫氨酸相鄰的序列植物區(qū)別于微生物的一點(diǎn)在于它們的信息不具有一個(gè)固定的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。據(jù)信，核糖體與信息的5’末端結(jié)合，搜尋第一個(gè)可用的ATG來起始翻譯。然而，據(jù)信對于與ATG相鄰的某些核苷酸具有偏愛性，并且微生物基因可通過在ATG包含真核的共同翻譯起始子來增強(qiáng)表達(dá)。Clontech(1993/1994目錄，第210頁)已經(jīng)建議將一段序列作為大腸桿菌(E.coli)uidA基因在植物中翻譯的共有翻譯起始子。此外，Joshi(NAR156643-6653(1987))比較了許多與ATG相鄰的植物序列，并提出了另一個(gè)共同序列。當(dāng)微生物ORF在植物中表達(dá)遇到困難時(shí)，在起始ATG處加入一個(gè)這樣的共同序列可能會(huì)改善翻譯。在這些情況下，共同序列的最后三個(gè)核苷酸可能不適合包括于該修飾的序列，因?yàn)樗鼈儗Φ诙€(gè)氨基酸殘基的修飾。與起始甲硫氨酸相鄰的優(yōu)選序列在不同植物種類中各不相同。對GenBank數(shù)據(jù)庫中14個(gè)玉米基因的分析提供了如下的結(jié)果在14個(gè)玉米基因中位于起始ATG之前位置-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1C3846256010 7T3034321110A2314323723G6360654615該分析可適用于要整合核苷酸序列的合意的植物種類，也適用于與ATG相鄰的并經(jīng)過修飾以整合優(yōu)選核苷酸的序列。
4.錯(cuò)誤剪接位點(diǎn)的去除由非植物源克隆并且在植物中沒有經(jīng)過表達(dá)優(yōu)化的基因可能含有被植物識別為5’或3’剪接位點(diǎn)的基序，從而被剪切產(chǎn)生截短或刪除的信息?？赏ㄟ^本領(lǐng)域熟知的技術(shù)將這些位點(diǎn)去除。
修飾編碼區(qū)及其相鄰序列的技術(shù)為本領(lǐng)域熟知的。當(dāng)微生物ORF的起始表達(dá)很低并且認(rèn)為對上述的序列作修改是合適的，那么可通過本領(lǐng)域熟知的方法構(gòu)建合成基因。例如，在已發(fā)表的專利公開內(nèi)容EP0 385 962(授于Monsanto)、EP 0 359 472(授于Lubrizol)和WO93/07278(授于Ciba-Geigy)中所述的。在大部分情況下，優(yōu)選的是在轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)基因植物之前，通過瞬時(shí)分析方法(本領(lǐng)域熟知的)分析基因構(gòu)建體的表達(dá)。
植物表達(dá)盒的構(gòu)建用于在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的編碼序列首先組裝入表達(dá)盒，并且位于可在植物中表達(dá)的合適的啟動(dòng)子下。該表達(dá)盒可更進(jìn)一步包括轉(zhuǎn)基因表達(dá)所需或所造的任何序列。這樣的序列包括，但并不限于轉(zhuǎn)錄終止子、增強(qiáng)表達(dá)的外源序列如內(nèi)含子、vital序列以及用來將基因產(chǎn)物定位于特定細(xì)胞器和細(xì)胞小室的序列。這些表達(dá)盒能很容易地轉(zhuǎn)入下面描述的植物轉(zhuǎn)化載體。以下為典型表達(dá)盒各種組分的描述。
1.啟動(dòng)子對在表達(dá)盒中使用的啟動(dòng)子的選擇將決定轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)基因植物中的時(shí)間和空間表達(dá)模式。選擇的啟動(dòng)子能夠在特定的細(xì)胞類型中(例如葉表皮細(xì)胞、葉肉細(xì)胞、根皮層細(xì)胞)，或在特定的組織或器官中(例如根、葉或花)表達(dá)轉(zhuǎn)基因，且該選擇反映了基因產(chǎn)物的合意的累積位置?？蛇x擇的，選擇的啟動(dòng)子可在不同的誘導(dǎo)條件下啟動(dòng)基因的表達(dá)。啟動(dòng)子在強(qiáng)度上，即驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的能力上有區(qū)別。依賴于所使用的宿主細(xì)胞系統(tǒng)，任何適合的啟動(dòng)子都可使用，包括該基因的天然啟動(dòng)子。以下為可在表達(dá)盒中使用的啟動(dòng)子的非限制性例子。
a.組成型表達(dá)，泛素啟動(dòng)子泛素是一個(gè)在許多細(xì)胞類型中都累積的基因產(chǎn)物，它的啟動(dòng)子已從許多種類中克隆出來用于轉(zhuǎn)基因植物(例如向日葵-Binet等，Plant Science7987-94(1991)；玉米-Christensen等，Plant Mol.Biol.12619-632(1989)；擬南芥-Norrij等，Plant Mol.Biol.21895-906(1993))。玉米的泛素啟動(dòng)子已可用于轉(zhuǎn)基因單子葉系統(tǒng)中，為單子葉轉(zhuǎn)化所構(gòu)建的序列和載體公開于公布的專利EP 0 342 926(授于Lubrizol)。Taylor等(Plant Cell Rep.12491-495(1993))描述了載體(pAHC25)，其包含玉米泛素啟動(dòng)子和第一個(gè)內(nèi)含子，也描述了通過微粒轟擊引入各種單子葉植物時(shí)該載體在細(xì)胞懸浮液中具有高活性。
擬南芥泛素啟動(dòng)子與本發(fā)明中核苷酸序列一同使用是理想的。該泛素啟動(dòng)子適合用于轉(zhuǎn)基因植物中的基因表達(dá)，包括單子葉植物和雙子葉植物。適當(dāng)?shù)妮d體為pAHC25的衍生物或任何在本申請中提及的轉(zhuǎn)化載體，并通過引入適當(dāng)泛素啟動(dòng)子和/或內(nèi)含子序列進(jìn)行修飾。
b.組成型表達(dá)，CaMV 35S啟動(dòng)子質(zhì)粒pCGN1761的構(gòu)建在公布的專利申請EP 0 392 225(實(shí)施例23)有描述。pCGN1761含有“雙”CaMV 35S啟動(dòng)子和tml轉(zhuǎn)錄終止子，在啟動(dòng)子和終止子之間有一個(gè)EcoRI的單一酶切位點(diǎn)，pCGN1761具有pUC型的主鏈。構(gòu)建了一個(gè)pCGN1761的衍生物，其含有包含NotI和XhoI位點(diǎn)以及已存在的EcoRI位點(diǎn)的多位點(diǎn)接頭。該衍生物記為pCGN1761ENX。pCGN1761ENX對于在它的多位點(diǎn)接頭內(nèi)克隆cDNA序列或編碼序列(包括微生物ORF序列)是很有用的，這樣作是為了在轉(zhuǎn)基因植物中讓這些序列的表達(dá)受控于35S啟動(dòng)子。這樣一個(gè)構(gòu)建體中完整的35S啟動(dòng)子-編碼區(qū)-tml終止子序列組件，可在啟動(dòng)子的5’端被HindIII、SphI、SalI和XbaI切割，在終止子的3’端被XbaI、BamHI和BglI切割，以便于轉(zhuǎn)移到如下所述的轉(zhuǎn)化載體中去。此外，雙35S啟動(dòng)子片段可在5’末端用HindIII、SphI、SalI、XbaI或Pstl切割，在3’末端可對任何一個(gè)多位點(diǎn)接頭的限制性位點(diǎn)(EcoRI、NotI或XhoI)切割，而后用另一個(gè)啟動(dòng)子代替。需要的話，在克隆位點(diǎn)周圍的修飾可通過引入能夠提高翻譯的序列來實(shí)現(xiàn)。當(dāng)需要過量表達(dá)時(shí)，這種方法尤其有用。例如，pCGN1761ENX可通過優(yōu)化翻譯起始位點(diǎn)來修飾，如美國專利號5,639,949中實(shí)施例37所描述的。
c.組成型表達(dá)，肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子多種同種型肌動(dòng)蛋白在大部分細(xì)胞類型中均有表達(dá)，因此肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子的一個(gè)好的選擇。特別地，來自水稻ActI基因的啟動(dòng)子已被克隆并表征(McElroy等，Plant Cell2163-171(1990))。該啟動(dòng)子中一個(gè)1.3kb片段含有在水稻原生質(zhì)體表達(dá)所需的所有調(diào)節(jié)元件。此外，基于ActI啟動(dòng)子構(gòu)建了許多表達(dá)載體以特別用于單子葉植物(McElroy等，Mol.Gen.Genet.231150-160(1991))。它們整合了ActI-內(nèi)含子1、AdhI側(cè)翼序列和AdhI-內(nèi)含子1(來自玉米醇脫氫酶基因)以及CaMV35S啟動(dòng)子。高表達(dá)的載體為35S和ActI內(nèi)含子或ActI5’側(cè)翼序列和ActI內(nèi)含子的融合。將起始ATG附近序列(在GUS報(bào)告基因中)優(yōu)化后也可提高表達(dá)。McElroy等(Mol.Gen.Genet.，231150-160(1991))描述的啟動(dòng)子表達(dá)盒能很容易地修飾以用于基因表達(dá)，并且尤其適用于單子葉宿主。例如含有啟動(dòng)子的片段被從McElroy構(gòu)建體中刪除，用于代替pCGN1761ENX中的雙35S啟動(dòng)子，而后可將特定基因序列插入該pCGN1761ENX。如此構(gòu)建的融合基因可以轉(zhuǎn)移至適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化載體中。在另一篇獨(dú)立的報(bào)道中，水稻ActI啟動(dòng)子連同它的第一個(gè)內(nèi)含子也可以在培養(yǎng)的大麥細(xì)胞中指導(dǎo)表達(dá)(Chibbar等，Plant Cell Rep.12506-509(1993))。
d.可誘導(dǎo)的表達(dá)，PR-1啟動(dòng)子pCGN1761ENX中的雙35S啟動(dòng)子可用任何能夠?qū)е逻m當(dāng)高表達(dá)水平的啟動(dòng)子來代替。例如，一個(gè)在美國專利號5,614,395中所描述的化學(xué)試劑調(diào)控的啟動(dòng)子可代替雙35S啟動(dòng)子。優(yōu)選地，該啟動(dòng)子可通過限制性內(nèi)切酶從其原先位置上切除，但也可通過具有適當(dāng)末端限制性酶切位點(diǎn)的引物經(jīng)PCR擴(kuò)增而得。如果用PCR擴(kuò)增，在目標(biāo)載體上克隆該擴(kuò)增的啟動(dòng)子之后，該啟動(dòng)子應(yīng)重新測序來檢查擴(kuò)增錯(cuò)誤。將化學(xué)試劑/病原體調(diào)節(jié)的煙草PR-1a啟動(dòng)子從質(zhì)粒pCIB1004上切除(用于構(gòu)建，見EP 0 332 104中的實(shí)施例21)，并轉(zhuǎn)移至質(zhì)粒pCGN1761ENX中(Uknes等，1992)。用NcoI切割pCIB1004后，用T4DNA聚合酶處理產(chǎn)生的線性片段的3’突出端為平末端。用HindIII切割該片段，用膠純化產(chǎn)物中含有PR-1a啟動(dòng)子的片段，并將其克隆至pCGN1761ENX(其中雙35S啟動(dòng)子已被切除)。這通過以下步驟來完成用XholI切割再用T4聚合酶補(bǔ)平，之后再用HindIII切割，將較大的含有載體-終止子的片段分離出來，其中在該片段中克隆了pCIB1004啟動(dòng)子片段。這樣產(chǎn)生了一個(gè)pCGN1761ENX衍生物，含有PR-1a啟動(dòng)子和tml終止子，以及具有單一EcoRI和NotI位點(diǎn)的間插多位點(diǎn)接頭。選擇的編碼區(qū)可插入該載體，融合產(chǎn)物(即啟動(dòng)子-基因-終止子)隨后可轉(zhuǎn)移至任何選定的轉(zhuǎn)化載體，包括如下所述的載體。各種化學(xué)調(diào)控劑可用來誘導(dǎo)本發(fā)明中的轉(zhuǎn)化植物中選定的編碼序列，包括公開于美國專利號5,523,311和5,614,395中的苯并噻唑、異煙酸和水楊酸化合物。
e.可誘導(dǎo)的表達(dá)，乙醇誘導(dǎo)的啟動(dòng)子可被諸如乙醇之類的醇或酮誘導(dǎo)的啟動(dòng)子也可用于提供本發(fā)明中編碼序列的可誘導(dǎo)表達(dá)。這樣的啟動(dòng)子的一個(gè)例子是來自構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)的alcA基因啟動(dòng)子(Caddick等(1998)Nat.Biotechnol.16177-180)。在構(gòu)巢曲霉中，alcA基因編碼醇脫氫酶I，它的表達(dá)在化學(xué)誘導(dǎo)劑存在時(shí)受AlcR轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。為達(dá)到本發(fā)明的目的，包含與最小35S啟動(dòng)子融合的alcA基因啟動(dòng)子序列的質(zhì)粒palcACAT的CAT編碼序列(Caddick等(1998)Nat.Biotechnol.16177-180)被本發(fā)明中的編碼序列取代，形成一個(gè)具有受控于alcA基因啟動(dòng)子的編碼序列的表達(dá)盒。這通過本領(lǐng)域熟知的方法來實(shí)現(xiàn)。
f.可誘導(dǎo)的表達(dá)，糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的啟動(dòng)子也提供了用基于類固醇激素的系統(tǒng)來誘導(dǎo)本發(fā)明中核酸的表達(dá)。例如使用了糖皮質(zhì)激素介導(dǎo)的誘導(dǎo)系統(tǒng)(Aoyama和Chua(1997)ThePlant Journal 11605-612)，通過使用糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)了基因表達(dá)，例如合成的糖皮質(zhì)激素，優(yōu)選地為地塞米松，優(yōu)選的濃度為0.1mM至1mM，更優(yōu)選的為10mM至100mM。為達(dá)到本發(fā)明的目的，可用本發(fā)明中的核酸序列代替熒光素酶基因，形成一個(gè)表達(dá)盒，該表達(dá)盒具有本發(fā)明的核酸序列，該核酸序列受控于與35S啟動(dòng)子相連的六拷貝的GAL4上游激活序列。這通過本領(lǐng)域熟知的方法來實(shí)現(xiàn)。反式作用因子包括GAL4 DNA結(jié)合區(qū)(Keegan等(1986)Science，231699-704)，該GAL4 DNA結(jié)合區(qū)與皰疹病毒蛋白VP16的反式激活區(qū)融合(Triezenberg等(1988)Genes Devel.2718-729)，后者又與大鼠糖皮質(zhì)激素受體的激素結(jié)合區(qū)融合(Picard等(1988)，Cell 541073-1080)。融合蛋白的表達(dá)受控于任何在本領(lǐng)域熟知或在此描述的適于植物表達(dá)的啟動(dòng)子。含有與6×GAL4/最小啟動(dòng)子融合的本發(fā)明的一段核酸序列的表達(dá)盒也可包含于植物中。因而得到了融合蛋白的組織或器官特異性，進(jìn)而導(dǎo)致殺蟲毒素誘導(dǎo)的組織或器官特異性。
g.根特異表達(dá)另一種基因表達(dá)的模式為根的表達(dá)。de Framond(FEBS290103-106(1991))和已公布的專利申請EP 0 452 269中描述了一個(gè)合適的根啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子轉(zhuǎn)移至一個(gè)適當(dāng)?shù)妮d體例如pCGN1761ENX，將一個(gè)選定的基因插入，隨后將完整的啟動(dòng)子-基因-終止子序列組件轉(zhuǎn)移至目標(biāo)轉(zhuǎn)化載體中。
h.創(chuàng)傷誘導(dǎo)的啟動(dòng)子創(chuàng)傷誘導(dǎo)的啟動(dòng)子也可適用于基因表達(dá)。有大量這樣啟動(dòng)子的描述(例如，Xu等，Plant Molec.Biol.22573-588(1993)，Logemann等，Plant Cell1151-158(1989)，Rohrmeier和Lehle，PlantMolec.Biol.22783-792(1993)，F(xiàn)irek等，Plant Molec.Biol.22129-142(1993)，Warner等，Plant J.3191-201(1993))，它們均適用于本發(fā)明。Logemann等描述了雙子葉植物馬鈴薯wunI基因的5’上游序列。Xu等提出來自雙子葉植物馬鈴薯的創(chuàng)傷誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(pin2)在單子葉植物水稻中也具有活性。此外，Rohrmeier和Lehle描述了玉米WipI cDNA的克隆，該cDNA為創(chuàng)傷誘導(dǎo)的，并可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用來分離關(guān)連啟動(dòng)子。類似地，F(xiàn)irek等和Warner等描述了從單子葉植物可刁柏(Asparagus officinalis)中而來的創(chuàng)傷誘導(dǎo)的基因，它在創(chuàng)傷和病原體侵入的位置表達(dá)。使用本領(lǐng)域熟知的克隆技術(shù)可將這些啟動(dòng)子轉(zhuǎn)移至適當(dāng)?shù)妮d體上，與屬于本發(fā)明的基因融合，并用來在植物的創(chuàng)傷部位表達(dá)這些基因。
i.髓優(yōu)選的表達(dá)專利申請WO 93/07278中描述了玉米trpA基因的分離，它優(yōu)選在髓細(xì)胞中表達(dá)。提供基因序列和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之前-1726bp的啟動(dòng)子。通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)可將該啟動(dòng)子或其部分轉(zhuǎn)移至例如pCGN1761的載體，它代替了其中的35S啟動(dòng)子，并用于驅(qū)動(dòng)外源基因以髓優(yōu)選的方式表達(dá)。實(shí)際上，含有髓優(yōu)選的啟動(dòng)子或其部分片段可轉(zhuǎn)移入任何載體并被修飾以用于轉(zhuǎn)基因植物。
j.葉特異性表達(dá)Hudspeth和Grula提供了一個(gè)編碼磷酸烯醇羧化酶(PEPC)的玉米基因(Plant Molec.Biol.12579-589(1989))。通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)可將該基因的啟動(dòng)子用于驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因植物中的任何基因以葉特異性方式表達(dá)。
k.花粉特異性表達(dá)WO 93/07278描述了在花粉細(xì)胞中表達(dá)的玉米鈣依賴性蛋白激酶(CDPK)基因的分離。該基因序列和啟動(dòng)子從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)延伸至1400bp。通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，該啟動(dòng)子或其部分可轉(zhuǎn)移至例如pCGN1761的載體上，其中它可代替35S啟動(dòng)子并用于驅(qū)動(dòng)本發(fā)明的核酸序列以花粉特異性的方式表達(dá)。
2.轉(zhuǎn)錄終止子有多種轉(zhuǎn)錄終止子可用于表達(dá)盒。它們負(fù)責(zé)超出轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄終止以及轉(zhuǎn)基因的正確聚腺苷酸化。適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止子是那些在植物中起作用的，包括CaMV 35S終止子、tml終止子、胭脂堿合酶終止子和豌豆rbcS E9終止子。這些均可用于單子葉植物和雙子葉植物。此外，可使用基因的天然轉(zhuǎn)錄終止子。
3.提高或調(diào)節(jié)表達(dá)的序列已發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄單元中有大量的序列能夠增強(qiáng)基因表達(dá)，并且這些序列能與本發(fā)明中的基因相連來促進(jìn)它們在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)。
許多內(nèi)含子序列能夠增強(qiáng)表達(dá)，尤其在單子葉植物細(xì)胞中。例如，已發(fā)現(xiàn)玉米AdhI基因的內(nèi)含子能顯著增強(qiáng)位于其關(guān)連啟動(dòng)子下的野生型基因的表達(dá)，當(dāng)該野生型基因?qū)胗衩准?xì)胞時(shí)。在氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的融合構(gòu)建體中內(nèi)含子I特別有效并且促進(jìn)了表達(dá)(Callis等，Gene Develop.11183-1200(1987))。在相同的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中來自玉米bronzeI基因的內(nèi)含子在增強(qiáng)表達(dá)上具有類似的效果。內(nèi)含子序列常常整合于植物轉(zhuǎn)化載體，通常位于非翻譯的前導(dǎo)區(qū)。
已知大量來自病毒的非翻譯的前導(dǎo)區(qū)序列能增強(qiáng)表達(dá)，在雙子葉植物細(xì)胞中尤其有效。特別地，來自煙草花葉病毒(TMV，“W序列”)、玉米褪綠斑駁病毒(MCMV)和苜蓿花葉病毒(AMV)的前導(dǎo)序列在增強(qiáng)表達(dá)上均很有效(例如，Gallie等，Nucl.Acids Res.158693-8711(1987)；Skuzeski等，Plant Molec.Biol.1565-79(1990))。
4.基因產(chǎn)物在細(xì)胞中的定位已知各種定位基因產(chǎn)物的機(jī)制存在于植物中，控制這些機(jī)制行使功能的序列已經(jīng)在某種程度上表征。例如，將基因產(chǎn)物定位于葉綠體是受控于各種蛋白質(zhì)氨基端的信號序列，進(jìn)入葉綠體時(shí)該信號序列被切除，產(chǎn)生成熟的蛋白質(zhì)(例如Comai等，J.Biol.Chem.26315104-15109(1988))。這些信號序列可融合于異源基因產(chǎn)物來影響異源產(chǎn)物運(yùn)輸進(jìn)入葉綠體(van den Broeck等，Nature313358-363(1985))。編碼適當(dāng)信號序列的DNA可由編碼RUBISCO蛋白、CAB蛋白、EPSP合酶、GS2蛋白以及其他定位于葉綠體的蛋白質(zhì)的cDNA的5’端分離而得。也可見美國專利號5,639,949實(shí)施例37中題為“葉綠體定向表達(dá)”的部分。
其他基因產(chǎn)物定位于其他細(xì)胞器例如線粒體和過氧化物酶體(例如Unger等，Plant Molec.Biol.13411-418(1989))。也可操縱編碼這些產(chǎn)物的cDNA來影響異源基因產(chǎn)物定向于這些細(xì)胞器。此類序列的例子為核基因編碼的ATPase和線粒體中特定天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶同工酶。Rogers等提供了定向細(xì)胞蛋白質(zhì)體(Proc.Natl.Acad.Sci.USA826512-6516(1985))。
此外，導(dǎo)致基因產(chǎn)物定位于其它細(xì)胞器的序列已被表征。氨基端序列負(fù)責(zé)定位于ER、質(zhì)外體和從糊粉細(xì)胞的胞外分泌(Koehler和Ho，Plant Cell2769-783(1990))。此外，與羧基端序列相連的氨基端序列負(fù)責(zé)基因產(chǎn)物的液泡定位(Shinshi等，Plant Molec.Biol.14357-368(1990))。
通過將目的轉(zhuǎn)基因序列與如上所述的適當(dāng)定位序列融合，有可能將轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物引導(dǎo)進(jìn)入任何細(xì)胞器或細(xì)胞小室。例如，對于葉綠體定位而言，來自RUBISCO基因、CAB基因、EPSP合酶基因或GS2基因的葉綠體信號序列與轉(zhuǎn)基因氨基端的ATG發(fā)生融合。選擇的信號序列應(yīng)包括已知的切割位點(diǎn)，并且構(gòu)建的融合體應(yīng)考慮切割所需的切割位點(diǎn)以后的任何氨基酸。在一些情況下，這個(gè)要求可通過在切割位點(diǎn)和轉(zhuǎn)基因ATG之間添加少量氨基酸，或者將轉(zhuǎn)基因序列中一些氨基酸替換掉來滿足。
為葉綠體輸入而構(gòu)建的融合體可以檢測葉綠體吸收效率，方法是使體外構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄體在體外翻譯，而后在體外測定葉綠體吸收，該方法由Bartlett在《葉綠體分子生物學(xué)方法》(Eldelmann等(Eds))，Elsevier出版社1081-1091(1981)和Wasmann在Mol.Gen.Genet.205446-453(1986)中描述。這些構(gòu)建技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，并且對于線粒體和過氧化物酶體同樣適用。
以上描述的細(xì)胞定位機(jī)制不僅適用于與關(guān)聯(lián)啟動(dòng)子相連，也適用于與異源啟動(dòng)子相連，從而在一個(gè)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下影響特定細(xì)胞定位目標(biāo)，而該啟動(dòng)子與定位信號序列的來源啟動(dòng)子具有不同的表達(dá)模式。
植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建大量可用于植物轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化載體對植物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是熟知的，并且與本發(fā)明相關(guān)的基因可以與任何這樣的載體相連使用。載體的選擇依賴于優(yōu)選的轉(zhuǎn)化技術(shù)和轉(zhuǎn)化的目標(biāo)物種。對于一些目標(biāo)物種而言，不同的抗生素或除草劑選擇標(biāo)記是優(yōu)選的。常用的轉(zhuǎn)化選擇標(biāo)記包括nptII基因，它具有對卡那霉素及其相關(guān)抗生素的抗性(Messing和Vierra，Gene19259-268(1982)；Bevan等，Nature304184-187(1983))；bar基因，它具有對除草劑膦絲菌素的抗性(White等，Nucl.Acids Res.181062(1990)，Spencer等，Theor.Appl.Genet.79625-631(1990))；hph基因，它具有對抗生素潮霉素的抗性(Blochinger和Diggelmann，Mol Cell Biol42929-2931)；dhfr基因，它具有對methatrexate的抗性(Bourouis等，EMBO J.2(7)1099-1104(1983))；EPSPS基因，它具有對草甘磷的抗性(美國專利號4,940,935和5,188,642)；甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因，它提供了代謝甘露糖的能力(美國專利號5,767,378和5,944,629)。
1.適用于農(nóng)桿菌(Agrobacterium)轉(zhuǎn)化的載體很多載體均可適用于根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)轉(zhuǎn)化。它們通常都帶有至少一個(gè)T-DNA邊緣序列，并包括例如pBIN19(Bevan，Nucl.Acids Res.(1984))和pXYZ之類的載體。如下描述了兩種適用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的典型載體。
a.pCIB200和pCIB2001二元載體pCIB200和pCIB2001用于農(nóng)桿菌重組載體的構(gòu)建，并按照如下順序構(gòu)建。pTJS75kan用以下方法產(chǎn)生用NarI消化pTJS75(Schmidhauser和Helinski，J.Bacteriol.164446-455(1985))，以切除四環(huán)素抗性基因，而后插入具有NPTII的來自pUC4K的AccI片段(Messing和Vierra，Gene19259-268(1982)；Bevan等，Nature304184-187(1983)；NcBride等，Plant Molecular Biology14266-276(1990))。XhoI接頭與PCIB7的EcoRV片段相連，該片段含有T-DNA的左右邊緣序列、一個(gè)植物可選擇的nos/nptII嵌合基因以及pUC多位點(diǎn)接頭(Rothstein等，Gene 53153-161(1987))，并且將該Xhol消化片段克隆至SalI消化的pTJS75kan中去，形成pCIB200(也可見EP 0 332 104，實(shí)施例19)。pCIB200含有如下單一的多位點(diǎn)接頭限制性位點(diǎn)EcoRI、SstI、KpnI、BglII、XbalI和SalI。pCIB2001為pCIB200的衍生物，通過在多位點(diǎn)接頭中插入附加的限制性位點(diǎn)而形成。pCIB2001含有如下單一的多位點(diǎn)接頭限制性位點(diǎn)EcoRI、SstI、KpnI、BglII、XbaI、SalI、MluI、BclI、AvrlI、ApaI、HpaI和StuI。pCIB2001除了含有這些單一的限制性酶切位點(diǎn)以外，還具有植物和細(xì)菌卡那霉素選擇、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化所需的T-DNA的左右邊緣序列、由RK2衍生的trfA功能(用于大腸桿菌和其他宿主之間的轉(zhuǎn)移)以及來自RK2的OriT和OriV功能。pCIB2001多位點(diǎn)接頭適用于具有自身調(diào)控信號的植物表達(dá)盒的克隆。
b.pCIB10及其潮霉素選擇性衍生物二元載體pCIB10含有用于在植物中選擇的編碼卡那霉素抗性的基因、T-DNA的左右邊緣序列以及來自廣宿主范圍的質(zhì)粒pRK252的序列，使其在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中都能夠復(fù)制。它的構(gòu)建可見Rothstein等的描述(Gene53153-161(1987))。構(gòu)建了各種pCIB10的衍生物，其整合了編碼潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因，見Gritz等的描述(Gene25179-188(1983))。這些衍生物可使轉(zhuǎn)基因植物只用潮霉素篩選(pCIB741)或者用潮霉素與四環(huán)素篩選(pCIB715和pCIB717)。
2.適用于非農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的載體不使用根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化不要求在選定的轉(zhuǎn)化載體中有T-DNA序列，因而除了以上所述的含有T-DNA序列的載體，不存在這些序列的載體也可使用。不依賴于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化技術(shù)包括通過微粒轟擊、原生質(zhì)體吸收(例如PEG和電穿孔)和微量注射的轉(zhuǎn)化。載體的選擇大部分依賴于轉(zhuǎn)化物種的優(yōu)選選擇。如下描述了適用于非農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的典型載體的構(gòu)建。
a.pCIB3064pCIB3064為一個(gè)pUC衍生的載體，它適用于直接基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，并結(jié)合除草劑basta(或膦絲菌素)的選擇。質(zhì)粒pCIB246包括與大腸桿菌GUS基因和CaMV 35S轉(zhuǎn)錄終止子有效融合的CaMV 35S啟動(dòng)子，在PCT公布的申請WO 93/07278中有描述。該載體的35S啟動(dòng)子在起始位點(diǎn)的5’端含有兩個(gè)ATG序列。這些位點(diǎn)通過標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)來產(chǎn)生突變，去除了ATG序列并產(chǎn)生了SspI和PvuI的限制性酶切位點(diǎn)。這些新的限制性位點(diǎn)分別為距單SalI位點(diǎn)96和37bp，距實(shí)際起始位點(diǎn)101和42bp。pCIB246的衍生產(chǎn)物記為pCIB3025。通過SalI和SacI的消化將GUS基因從pCIB3025上切除，將末端補(bǔ)平并連接產(chǎn)生新質(zhì)粒pCIB3060。由John Innes Centre，Norwich得到質(zhì)粒pJIT82，切除含有來自產(chǎn)綠色鏈霉菌(Streptomyces viridochromogenes)bar基因的400bp SmaI片段，并插入pCIB3060的HpaI位點(diǎn)(Thompson等，EMBO J.62519-2523(1987))。這樣產(chǎn)生了pCIB3064，它包含CaMV35S啟動(dòng)子和終止子控制下的用于除草劑選擇的bar基因、氨芐青霉素抗性基因(大腸桿菌中選擇用)和具有SphI、PstI、HindIII和BamHI單一位點(diǎn)的多位點(diǎn)接頭。該載體適用于含有自身調(diào)控信號的植物表達(dá)盒的克隆。
b. pSOG19和pSOG35pSOG35是使用大腸桿菌二氫葉酸還原酶(DFR)基因的轉(zhuǎn)化載體，二氫葉酸還原酶是一個(gè)對氨甲蝶呤具有抗性的選擇性標(biāo)記。用PCR擴(kuò)增35S啟動(dòng)子(-800bp)、來自玉米Adh1基因的內(nèi)含子6(-550bp)和來自pSOG10的GUS非翻譯前導(dǎo)序列的18bp。一個(gè)編碼大腸桿菌二氫葉酸脫氫酶II的基因的250bp片段也通過PCR擴(kuò)增，這兩段PCR片段和來自pB1221(Clontech)的SacI-PstI片段相連，該SacI-PstI片段包含pUC載體主干和胭脂堿合酶終止子。這些片段的組裝產(chǎn)生pSOG19，它含有與內(nèi)含子6序列融合的35S啟動(dòng)子、GUS前導(dǎo)區(qū)、DHFR基因和胭脂堿合酶終止子。用來自玉米褪綠斑駁病毒(MCMV)的前導(dǎo)序列代替pSOG19中GUS前導(dǎo)區(qū)產(chǎn)生載體pSOG35。pSOG19和pSOG35具有氨芐青霉素抗性的pUC基因與HindIII、SphI、PstI和EcoRI位點(diǎn)(其用于外源物質(zhì)的克隆)。
3.適用于葉綠體轉(zhuǎn)化的載體為將本發(fā)明中的核苷酸序列表達(dá)于植物質(zhì)體，使用了質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體pPH143(WO 97/32011，實(shí)施例36)。將核苷酸序列插入pPH143，從而取代了PROTOX編碼序列。然后將該載體用于質(zhì)體轉(zhuǎn)化和壯觀霉素抗性轉(zhuǎn)化體的選擇?？蛇x擇地，核苷酸序列插入pPH143使得它取代了aadH基因。在這種情況下，通過PROTOX抑制劑抗性來篩選轉(zhuǎn)化體。
轉(zhuǎn)化一旦本發(fā)明的核酸序列克隆至一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)，它就轉(zhuǎn)化入植物細(xì)胞了。植物轉(zhuǎn)化和再生方法為本領(lǐng)域所熟知。例如，使用Ti質(zhì)粒載體、DNA直接攝取、脂質(zhì)體、電穿孔、微量注射和微粒轟擊來傳送外源DNA。此外，來自農(nóng)桿菌屬的細(xì)菌可用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。如下為轉(zhuǎn)化單子葉植物和雙子葉植物的具代表性的技術(shù)以及具代表性的質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)的描述。
1.雙子葉植物的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化雙子葉植物的技術(shù)為本領(lǐng)域熟知的，包括基于農(nóng)桿菌的技術(shù)以及不需要農(nóng)桿菌的技術(shù)。非農(nóng)桿菌技術(shù)涉及原生質(zhì)體或細(xì)胞直接攝取外源遺傳物質(zhì)。這可通過PEG或電穿孔介導(dǎo)的攝取、微粒轟擊介導(dǎo)的傳送或微量注射來實(shí)現(xiàn)。這些技術(shù)的描述可見Paszkowski等，EMBOJ.32717-2722(1984)，Potrykus等，Mol.Gen.Genet.199169-177(1985)，Reich等，Biotechnology41001-1004(1986)和Klein等，Nature 32770-73(1987)。在每種情況下，通過本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生為完整的植株。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化是轉(zhuǎn)化雙子葉植物的優(yōu)選技術(shù)，因?yàn)樗母咿D(zhuǎn)化效率和對許多種類的廣泛適用性。典型的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化包括將帶有目標(biāo)外源DNA的雙重載體(例如pCIB200或pCIB2001)轉(zhuǎn)移至適當(dāng)?shù)霓r(nóng)桿菌株系，這一轉(zhuǎn)移可能依賴于vir基因的補(bǔ)充，其中vir基因是由宿主農(nóng)桿菌株系攜帶的，它或者與Ti質(zhì)粒共存或者存在于染色體上(例如，pCIB200和pCIB2001的CIB542株系)(Uknes等，Plant Cell5159-169(1993))。將重組的雙重載體轉(zhuǎn)移入農(nóng)桿菌，可通過使用帶有重組雙重載體的大腸桿菌、帶有例如pPK2013質(zhì)粒并能夠?qū)⒅亟M雙重載體轉(zhuǎn)移入目標(biāo)農(nóng)桿菌株系的輔助大腸桿菌株系的三親雜交過程來實(shí)現(xiàn)。可選擇地，可通過DNA轉(zhuǎn)化將重組的雙重載體轉(zhuǎn)移入農(nóng)桿菌(Hofgen和Willmitzer，Nucl.Acids Res169877(1988))。
用重組農(nóng)桿菌對目標(biāo)植物轉(zhuǎn)化通常包括將農(nóng)桿菌和來自該植物的外植體共培養(yǎng)，依照本領(lǐng)域熟知的方法。雙重質(zhì)粒T-DNA邊緣序列之間帶有抗生素或除草劑抗性標(biāo)記的轉(zhuǎn)化組織在選擇性培養(yǎng)基上再生。
另一種用基因轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法涉及向植物組織或細(xì)胞推進(jìn)惰性或具有生物學(xué)活性的微粒。該技術(shù)公開于美國專利號4,945,050、5,036,006和5,100,792(都是授于Sanford等人)?？偟膩碚f，該技術(shù)包括在有效穿透細(xì)胞外表面并且能夠與其內(nèi)部結(jié)合的條件下，向細(xì)胞推進(jìn)惰性或具有生物學(xué)活性的微粒。當(dāng)使用惰性微粒時(shí)，該載體可通過用含有目標(biāo)基因的載體包被微粒引入細(xì)胞。可選擇地，目標(biāo)細(xì)胞可用載體包圍，當(dāng)微粒進(jìn)入的時(shí)候載體也被帶入細(xì)胞。具有生物學(xué)活性的微粒(例如干燥的酵母細(xì)胞、干燥的細(xì)菌或噬菌體，每個(gè)都含有需要引入的DNA)也可被推進(jìn)植物細(xì)胞組織。
2.單子葉植物的轉(zhuǎn)化大部分單子葉植物的轉(zhuǎn)化都已成為常規(guī)方法。優(yōu)選的技術(shù)包括通過PEG或電穿孔技術(shù)將基因直接轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體，以及通過微粒轟擊進(jìn)入愈傷組織。轉(zhuǎn)化可使用單種DNA或多種DNA(即共轉(zhuǎn)化)，這兩種方法都適用于本發(fā)明。共轉(zhuǎn)化的優(yōu)點(diǎn)是可避免完整的載體構(gòu)建，以及產(chǎn)生將目的基因與選擇標(biāo)記分離的轉(zhuǎn)基因植物，從而如果需要的話，在后代中可去除該選擇標(biāo)記。然而，使用共轉(zhuǎn)化的一個(gè)不利因素為不同種DNA整合入基因組的頻率低于100％(Schocher等，Biotechnology41093-1096(1986))。專利申請EP 0 292 435、EP 0 392 225和WO 93/07278中描述了由玉米原種自交系制備愈傷組織和原生質(zhì)體的技術(shù)，使用PEG或電穿孔轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體的技術(shù)，以及由轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體再生為玉米植株的技術(shù)。Gordon-Kamm等(Plant Cell2603-618(1990))和Fromm等(Biotechnology8833-839(1990))發(fā)表了通過微粒轟擊轉(zhuǎn)化A188衍生的玉米系的技術(shù)。此外，WO 93/07278和Koziel等(Biotechnology 11194-200(1993))描述了通過微粒轟擊轉(zhuǎn)化玉米原種自交系的技術(shù)。該技術(shù)中使用1.5-2.5mm長的未成熟玉米胚，它來自授粉后14-15天的玉米穗，使用PDS-1000HeBiolistics設(shè)備用于轟擊。
也可通過原生質(zhì)體或微粒轟擊的直接基因轉(zhuǎn)移來實(shí)現(xiàn)水稻的轉(zhuǎn)化。對于Japonia型和Indica型的原生質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化均已有描述(Zhang等，Plan Cell Res.7379-384(1988))；Shimamoto等，Nature338274-277(1989)；Datta等，Biotechnology8736-740(1990))。兩種類型均可用微粒轟擊進(jìn)行常規(guī)轉(zhuǎn)化(Christou等，Biotechnology 9957-962(1991))。此外，WO 93/21335描述了通過電穿孔轉(zhuǎn)化水稻的技術(shù)。
專利申請EP 0 332 581中描述了Pooideae原生質(zhì)體增殖、轉(zhuǎn)化和再生的技術(shù)。這些技術(shù)允許轉(zhuǎn)化鴨茅屬(Dactylis)和小麥。此外，小麥轉(zhuǎn)化已由Vasil等描述過(Biotechnology10667-674(1992))，他使用的是微粒轟擊進(jìn)入C型可長期再生的愈傷組織細(xì)胞的方法，在Vasil等(Biotechnology111553-1558(1993)和Weeks等(PlantPhysiol.1021077-1084(1993))的描述中使用微粒轟擊進(jìn)入未成熟的胚和未成熟胚衍生的愈傷組織的方法。然而，小麥轉(zhuǎn)化的優(yōu)選技術(shù)涉及用未成熟胚的微粒轟擊來轉(zhuǎn)化小麥和在基因傳送前的高蔗糖或高麥芽糖水平的步驟。在轟擊之前，任何數(shù)量的胚(長0.75-1mm)放置于含有3％蔗糖和3mg/l 2，4-D的MS培養(yǎng)基中(Murashiga和Skoog等，Physiologia Plantarum 15473-497(1962))，用于誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，該步驟可在暗處進(jìn)行。在轟擊的當(dāng)天，將胚從誘導(dǎo)培養(yǎng)基中取出，并放于滲透劑中(即含有理想濃度的蔗糖或麥芽糖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，典型的為15％，)。將胚進(jìn)行質(zhì)壁分離處理2-3個(gè)小時(shí)而后進(jìn)行轟擊。常規(guī)的為二十個(gè)胚每個(gè)目標(biāo)平板，但這并不是十分重要的。通過標(biāo)準(zhǔn)方法將適當(dāng)?shù)臄y帶基因的質(zhì)粒(例如pCIB3064或pSG35)沉淀于微米級的金顆粒上。每個(gè)胚的平板用Dupont Biolistics氦設(shè)備轟擊，暴發(fā)壓力為～1000psi，使用標(biāo)準(zhǔn)的80目篩。轟擊后，將胚放回暗處恢復(fù)24小時(shí)左右(仍處于滲透劑中)。24小時(shí)之后，將胚從滲透劑中取出，放回誘導(dǎo)介質(zhì)，在再生之前繼續(xù)放置一個(gè)月。大約一個(gè)月以后，將帶有正在發(fā)育的胚愈傷組織的胚外植體轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基(MS+1 mg/l NAA，5mg/l GA)，進(jìn)一步含有適當(dāng)?shù)倪x擇劑(pCIB3064質(zhì)粒為10mg/l basta，pSOG35質(zhì)粒為2mg/l氨甲蝶呤)。大約一個(gè)月以后將發(fā)育出的根轉(zhuǎn)移至更大的名為“GA7s”的無菌容器中，其中含有一半離子強(qiáng)度的MS、2％蔗糖和相同濃度的選擇劑。
使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物也已有描述。見WO 94/00977和美國專利號5,591,616。
3.質(zhì)體的轉(zhuǎn)化在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的核苷酸序列直接轉(zhuǎn)化入質(zhì)體基因組。質(zhì)體轉(zhuǎn)化的主要優(yōu)勢在于質(zhì)體可在不經(jīng)大量修飾的前提下表達(dá)細(xì)菌基因，并且在一個(gè)啟動(dòng)子的控制下，質(zhì)體可表達(dá)多個(gè)開放讀碼框。在美國專利號5,451,513、5,545,817和5,545,818中，PCT申請?zhí)朩O 95/16783和McBride等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA917301-7305中均有關(guān)于質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)的大量敘述。葉綠體轉(zhuǎn)化的基本技術(shù)包括將側(cè)翼帶有選擇性標(biāo)記的克隆的質(zhì)體DNA區(qū)域和目的基因引入適當(dāng)?shù)哪繕?biāo)組織，例如，通過biolistics或原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(例如氯化鈣或PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)。1至1.5kb的側(cè)翼序列稱為定位序列，促進(jìn)了質(zhì)體基因組的同源重組，因此允許質(zhì)體基因組特定區(qū)域的替換或修飾。首先，對葉綠體16SrRNA和rps12基因進(jìn)行點(diǎn)突變，使其對壯觀霉素和/或鏈霉素具有抗性，可用于作為轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記(Svab，Z.，Hajdukiewicz，P.和Maliga，P.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA878526-8530；Straub，J.M.和Maliga，P.(1992)Plant Cell 439-45)。這導(dǎo)致了穩(wěn)定的大約每100次轟擊目標(biāo)葉子產(chǎn)生一個(gè)同質(zhì)轉(zhuǎn)化體的速率。在這些標(biāo)記之間的克隆位點(diǎn)允許構(gòu)建質(zhì)粒定位的載體以導(dǎo)入外源基因(Staub，J.M.和Maliga，P.(1993)EMBO J.12601-606)。通過將隱性rRNA或r蛋白抗生素抗性基因替換為一個(gè)顯性選擇性標(biāo)記，細(xì)菌編碼壯觀霉素解毒酶氨基糖苷-3’-腺苷轉(zhuǎn)移酶的aadA基因，可大大提高轉(zhuǎn)化頻率(Svab，Z.和Maliga，P.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90913-917)。之前，該標(biāo)記已成功用于綠藻萊菌衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)質(zhì)體基因組的高頻率轉(zhuǎn)化(Goldschmidt-Clermont，M.(1991)Nucl.Acids Res.194083-4089)。其他適用于質(zhì)體轉(zhuǎn)化的選擇性標(biāo)記為本領(lǐng)域熟知的，并包含于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。通常，轉(zhuǎn)化后需要大約15-20個(gè)細(xì)胞分裂周期達(dá)到同質(zhì)體的狀態(tài)。質(zhì)體表達(dá)(其中基因通過同源重組插入每個(gè)植物細(xì)胞中都存在的環(huán)狀質(zhì)體基因組的數(shù)千個(gè)拷貝中)的巨大的拷貝數(shù)量大大超過了核表達(dá)的基因數(shù)量，允許超過植物總可溶蛋白質(zhì)量的10％的表達(dá)水平。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將本發(fā)明的核苷酸序列插入一個(gè)質(zhì)體定位載體，并轉(zhuǎn)化至目標(biāo)植物宿主的質(zhì)體基因組中。可獲得質(zhì)體基因組同型的植物，其中含有本發(fā)明的核苷酸序列，并且該植物具有高的核苷酸表達(dá)能力。
實(shí)施例依照如下詳細(xì)的實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于舉例說明而已，除非指明，并非旨在限制本發(fā)明的應(yīng)用。在此使用的標(biāo)準(zhǔn)DNA重組和分子克隆技術(shù)為本領(lǐng)域熟知的，并描述于Ausubel(ed.)《分子生物學(xué)現(xiàn)有技術(shù)》(Current Protocols in MolecularBiology)，John Wiley和Sons.，Inc(1994)；T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約(1989)；以及T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，《基因融合實(shí)驗(yàn)》(Experiments with Gene Fusion)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約(1984)。
實(shí)施例1使用熱穩(wěn)定硫氧還蛋白轉(zhuǎn)化玉米表達(dá)來自詹氏甲烷球菌的熱穩(wěn)定硫氧還蛋白的基因(具有SEQ IDNO1的序列)是通過使用如美國專利5,625,136中所述的玉米偏愛密碼子來制備的，該基因在種子特異的γ-玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子控制下，在pGIGUP質(zhì)粒T-DNA邊緣之間整合入表達(dá)盒。
在這些實(shí)驗(yàn)中使用根癌農(nóng)桿菌株系LBA4404(pAL4404，pSB1)。pAL4404是一個(gè)卸甲輔助質(zhì)粒。pSB1是一個(gè)具有廣宿主范圍的質(zhì)粒，它含有pGIGUP的同源區(qū)和來自pTiBo542毒性區(qū)的一個(gè)15.2kb的KpnI片段(Ishida等，1996；根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米(Zea mays L.)高效轉(zhuǎn)化，Nature Biotechnology 14745-750)。通過電穿孔將質(zhì)粒pGIGUP引入LBA4404(pAL4404，pSB1)導(dǎo)致pGIGUP和pSB1共合體的產(chǎn)生。該質(zhì)粒的T-DNA包括受泛素啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因，提供了代謝甘露糖的能力，以及如上所述的硫氧還蛋白基因。
在YP培養(yǎng)基上(5g/l酵母提取物、10g/l蛋白胨、5g/l NaCl、15g/l瓊脂、pH6.8)培養(yǎng)農(nóng)桿菌3天，培養(yǎng)基上還有50mg/l壯觀霉素和10mg/l四環(huán)素。用接種環(huán)收集細(xì)菌，并懸浮于N6液體培養(yǎng)基中，密度可為109至5109細(xì)胞/毫升。也可從YP培養(yǎng)基的過夜培養(yǎng)物中收集農(nóng)桿菌細(xì)胞并在N6液體培養(yǎng)基中重新懸浮。
在大約自花授粉10至14天以后可獲得玉米的未成熟胚。在具有誘導(dǎo)和支持胚愈傷組織形成的平板培養(yǎng)基上分割未成熟的合子胚，密度為大約25個(gè)未成熟胚每平板。
將未成熟胚與含有Ti質(zhì)粒(含有選擇性標(biāo)記基因)的農(nóng)桿菌在平板或液體中共同孵育。在與農(nóng)桿菌孵育之前或之后，將未成熟胚置于含有硝酸銀(10mg/l)的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。大約每個(gè)平板上放置25個(gè)未成熟胚。在孵育16至72個(gè)小時(shí)之后，將未成熟胚轉(zhuǎn)移至含有硝酸銀和頭孢噻肟的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。按照如下步驟篩選轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在體外使用甘露糖來選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在侵染2至20天以后該選擇劑的濃度可低至1g/L并維持一共2-12周。由此獲得的胚胎愈傷組織在標(biāo)準(zhǔn)再生培養(yǎng)基上再生，存在或不存在甘露糖均可。所有植物都通過氯酚紅(CR)測驗(yàn)來檢測對甘露糖的耐受性。該分析采用pH敏感的顯色劑來顯示哪些細(xì)胞在存在甘露糖時(shí)生長?；畹募?xì)胞會(huì)在培養(yǎng)基中產(chǎn)生pH變化，從而使指示劑氯酚紅由黃色變?yōu)榧t色。在這個(gè)測試中能很容易地鑒定對甘露糖有耐受性的植物。CR測驗(yàn)為陽性的植物經(jīng)PCR分析是否存在甘露糖基因。PCR測試為陽性的植物再經(jīng)Southern印跡分析。
對再生的植物分析硫氧還蛋白的表達(dá)。植物為發(fā)育上正常的植物。來自具高表達(dá)能力的子代植物玉米經(jīng)過小規(guī)模濕磨法加工分析，與不含有硫氧還蛋白轉(zhuǎn)基因的同一基因型對比確定淀粉的可提取性。在濕磨法加工過程中，表達(dá)硫氧還蛋白基因的玉米與同一基因型非轉(zhuǎn)化玉米相比，顯示了更高的淀粉可提取性。
實(shí)施例2使用熱穩(wěn)定硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶轉(zhuǎn)化玉米通過實(shí)施例1中描述的方法，玉米用來自詹氏甲烷球菌編碼硫氧還蛋白(SEQ ID NO1)和硫氧還蛋白還原酶(SEQ ID NO6)的基因共轉(zhuǎn)化。兩個(gè)基因都處于種子特異的γ-玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子控制下。這兩個(gè)基因連接于pGIGUP質(zhì)粒的左右邊緣序列之間，可提高兩個(gè)基因作為一個(gè)單一插件整合入植物染色體的可能性。
再生的植物經(jīng)過表達(dá)硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶的分析。植物為發(fā)育上正常的植物。來自具高表達(dá)能力的子代植物玉米經(jīng)過小規(guī)模濕磨法加工分析，與不含有硫氧還蛋白/硫氧還蛋白還原酶轉(zhuǎn)基因的同一基因型對比確定淀粉的可提取性。在濕磨法加工過程中，表達(dá)硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶基因的玉米與同一基因型非轉(zhuǎn)化玉米相比，顯示了更高的淀粉可提取性。
實(shí)施例3克隆硫氧還蛋白基因并構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化載體分別從水稻和小麥發(fā)芽的種子提取總RNA，通過RT-PCR克隆水稻和小麥硫氧還蛋白-h cDNA(trx-h)。通過引物NMD109-(5’-GGA TCCACC ATG GCC GCC GAG GAG-3’)(SEQ ID NO8)和NMD110(5’-GAGCTC TTA GGC AGA AGC AGA TG-3’)(SEQ ID NO9)擴(kuò)增水稻的trxcDNA，引物NMD102-(5’-GGA TCC ACC ATG GCG GCG TCG G-3’)(SEQ ID NO10)和NMD103(5’-GAG CTC TTA CTG GGC CGC GTG T-3’)(SEQ ID NO11)擴(kuò)增小麥的trx cDNA。為將該基因克隆至植物表達(dá)載體需要插入適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖形稽c(diǎn)，即在5’端插入BamHI，在3’端插入SacI，這些通過上面的反應(yīng)也完成了。適當(dāng)大小的PCR產(chǎn)物通過膠純化并用Topo PCR 2.1克隆載體(Invitrogen)克隆。含有正確插入的菌落在限制性分析后測序。水稻trx序列與已發(fā)表于GenBankAccession no.U92541的序列匹配。小麥trx序列與來自T.aestivium(GenBank Accession no.X69915)的trx-h序列匹配?？寺ˇ?玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子由Dr.Brian Larkins提供的質(zhì)粒pGZ27.3中擴(kuò)增出673 bp的γ-玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子。該序列與不透明2號修飾基因5’區(qū)(GenBank Accession no.S78780)和(Marzabal等，1998，PlantJ.，1641-52)完全匹配。γ-玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子具有胚乳特異性(Torrent等(1997)Plant Mol.Biol.，34139-149)。
pNOV 3401玉米泛素啟動(dòng)子加上內(nèi)含子-水稻trx-h -35S終止子，位于PMI選擇的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體中將水稻trx基因克隆至含有泛素啟動(dòng)子加上內(nèi)含子和35S終止子的植物表達(dá)載體。將產(chǎn)生的構(gòu)建體pNOV 3400用限制性內(nèi)切酶HindIII和KpnI消化并亞克隆至農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化二元載體盒pNOV 2117，得到pNOV3401。
pNOV 3405位于PMI選擇的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體中的γ-玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子-水稻trx-h -35S終止子pNOV 3406位于PMI選擇的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體中的γ-玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子-小麥trx-h -35S終止子將水稻和小麥trx-h基因克隆至含有如上所述的γ-玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子和35S終止子的植物表達(dá)載體。用HindIII和KpnI消化得到的構(gòu)建體得到啟動(dòng)子、基因和終止子單元，并亞克隆至農(nóng)桿菌二元載體pNOV 2117，分別得到pNOV 3405和pNOV 3406。pNOV 2117為具有磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)基因以及內(nèi)含子和NOS終止子的二元載體，磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因的表達(dá)受玉米泛素啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)。
pNOV 3408位于PMI選擇的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體中的γ-玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子-γ-玉米醇溶蛋白信號序列-水稻trx-h -γ-玉米醇溶蛋白3’端-35S終止子
為了將水稻硫氧還蛋白定位于細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)，使用了γ-玉米醇溶蛋白基因的N末端和C末端的信號序列(Torrent等(1994)Planta，192515-518)。插入Eco47AIII限制性酶切位點(diǎn)于水稻硫氧還蛋白基因第一個(gè)ATG之后的5’端，通過誘變引物NMD124A(5’-GAGCTCTTAGGCGCTAGCAG ATG-3’)(SEQ ID NO12)和NMD125A(5’-GGATCCACCAGCGCTGCCGA-3’)(SEQ ID NO13)經(jīng)PCR誘變將NheI限制性酶切位點(diǎn)插入其3’端。所有突變均為沉默突變。將基因克隆至topo PCR2.1載體并測序。通過限制性內(nèi)切酶Eco47AIII和NheI消化得到trx片段。四段寡核苷酸用來編碼γ-玉米醇溶蛋白信號序列和C端序列NMD126(5’-GATCCACCAT GAGGGTGTTG CTCGTTGCCC TCGCTCTCCT GGCTCTCGCTGCGAGCGCCA CCAGC-3’)(SEQ ID NO14)；NMD127(5’-GCTGGTGGCGCTCGCAGCGA GAGCCAGGAG AGCGAGGGCA ACGAGCAACA CCCTCATGGT G-3’)(SEQ ID NO15)；NMD128(5’CTAGCGCTCT GCAGCAGCCG ACTCCATGCCCCTACGCTGC TGCCGGCGGT GTCCCCCACT GAGAGCT-3’)(SEQ ID NO16)；和NMD 129(5’-CTCAGTGGGG GACACCGCCG GCAGCAGCGT AGGGGCATGGAGTCGGCTGC TGCAGAGCG-3’)(SEQ ID NO17)。使用標(biāo)準(zhǔn)方法用T4多核苷酸激酶將寡核苷酸對NMD126和127以及NMD128和129雜交并磷酸化。這兩對雜交并磷酸化的寡核苷酸對與如上所述的用Eco47AIII和NheI消化的trx片段和一個(gè)含有γ-玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子和35S終止子的植物表達(dá)載體盒以四向方式連接。用HindIII和KpnI消化產(chǎn)生的構(gòu)建體得到啟動(dòng)子、基因和終止子單元，并亞克隆至農(nóng)桿菌二元載體pNOV 2117，得到pNOV 3408，其中pNOV 2117含有受玉米泛素啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)基因作為選擇標(biāo)記。
將pNOV 3401、pNOV 3405、pNOV 3406和pNOV 3408轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌株系LBA4404(pSB1)并用于穩(wěn)定的玉米轉(zhuǎn)化。
在體外還原水稻硫氧還蛋白時(shí)擬南芥的硫氧還蛋白還原酶具有活性。因此構(gòu)建一個(gè)玉米優(yōu)化的NTR基因。
實(shí)施例4構(gòu)建玉米優(yōu)化的擬南芥依賴于NADPH的硫氧還蛋白還原酶基因擬南芥NADPH依賴的硫氧還蛋白還原酶基因(NTR)是一個(gè)35kD的蛋白質(zhì)。設(shè)計(jì)該合成基因需要將該從NTR基因(GenBank Accession#Z23109)推理所得的多肽序列進(jìn)行反向翻譯，通過Wisconsin大學(xué)GCG課題組建立的“反向翻譯”程序，使用玉米偏愛密碼子表(Murray等(1989)Nucl.Acids Res.，17477-498)。“玉米最優(yōu)化”序列進(jìn)一步經(jīng)修飾插入單一位點(diǎn)來促進(jìn)克隆。將該基因分為三部分克隆。每個(gè)片段都通過8-10對長為60-75個(gè)核苷酸的寡聚物(其代表基因的雙鏈)的雜交來構(gòu)建。在順序寡核苷酸對之間設(shè)計(jì)一個(gè)15個(gè)核苷酸的重疊，用于正確的定向和組裝。寡核苷酸是通過Genosys Inc.(Texas)來合成的?；虻钠?(對應(yīng)于核苷酸1-305)是通過擴(kuò)增305bp片段來構(gòu)建的，利用PCR技術(shù)通過Taq聚合酶以及由提供者推薦的標(biāo)準(zhǔn)條件，以8寡聚物的等摩爾混合物為模板，STRF1A(5’-ggATCCACCATgAACggCCT ggAg-3’)(SEQ ID NO18)和STRF1B(5’-CTCgAgAAgTCCACCTTggT CAC-3’)(SEQ ID NO19)為引物?；虻钠?是通過擴(kuò)增346bp片段來構(gòu)建的(對應(yīng)于核苷酸299-645)，利用PCR技術(shù)，以10寡聚物的等摩爾混合物為模板，STRF2A(5’-CTCgAgCAAGCCgTTCAA-3’)(SEQ ID NO20)和STRF2B(5’-gACgTCgATCTTCgggTTgg A-3’)(SEQ ID NO21)為引物?；虻钠?是通過擴(kuò)增382bp片段來構(gòu)建的(對應(yīng)于核苷酸639-1021)，利用PCR技術(shù)，以10寡聚物的等摩爾混合物為模板，STRF3A(5’-CgACgTCATCTggAACTCCT-3’)(SEQ ID NO22)和STRF3B(5’-gAgCTCAgATCTAgTCggAC TTg-3’)(SEQ ID NO23)為引物。將每個(gè)片段的擴(kuò)增DNA克隆至topo PCR2.1 T-載體(Invitrogen)。具有正確序列的基因片段通過重疊限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)XhoI和AatII連接。玉米優(yōu)化的擬南芥NADPH依賴性的硫氧還蛋白還原酶編碼序列為SEQ ID NO24，它編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO25。構(gòu)建完整的基因并測序，再亞克隆至含有γ-玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子和35S終止子的植物表達(dá)載體盒。啟動(dòng)子、基因、終止子單元再單獨(dú)亞克隆至一個(gè)農(nóng)桿菌玉米轉(zhuǎn)化載體，并與水稻和小麥的硫氧還蛋白基因相連。
實(shí)施例5水稻NADPH依賴性的硫氧還蛋白還原酶(NTR)基因水稻NADPH依賴性的硫氧還蛋白還原酶(NTR)編碼序列為SEQ IDNO26，相應(yīng)的氨基酸序列為SEQ ID NO27。
實(shí)施例6擬南芥NTR和如上所述的水稻序列的比對比對的序列參照分子arab trPG(SEQ ID NO25)，1-1002(334個(gè)氨基酸)序列2TRCONAA.TXT(SEQ ID NO27)，1-310(310個(gè)氨基酸)同源性70％排列類型球狀蛋白質(zhì)參數(shù)錯(cuò)配2；開放缺口4；延伸缺口1；保守Narab trPG(1) mnglethn--trlcivgsgpaahtaaiyaaraelkpllfegwmandiapgTRCONAA.TXT (1) .e.sagaplr....i....s...............v.....l.....a.
arab trPG(145) gqlttttdvenfpgfpegilgveltdkfrkqserfgttiftetvtkvdfsTRCONAA.TXT (51) .....................g..m.rc.a..l....s.is....a....
arab trPG(295) skpfklftdskailadavilaigavakwlsfvgsgevlgglwnrgisacaTRCONAA.TXT (101) ar..rvas..ttv.....vv.t....rr.h.a..----day.........
arab trPG(445) vcdgaapifrnkplavigggdsameeanfltkygskvyiidrrdafraskTRCONAA.TXT (147) .............i............s........h....h..nt.....
arab trpG(595) imqqralsnpkidviwnssvveaygdgerdvlgglkvknvvtgdvsdlkvTRCONAA.TXT (197) ...a........q.f.d.e......gegggp.a.v....l...ki...q.
arab trPG(745) sglffaighepatkfldggveldsdgyvvtkpgttqtsvpgvfaagdvqdTRCONAA.TXT (247) ................g.ql...a....a....s.h...k..........
arab trpG(895) kkyrqaitaagtgcmaaldaehylqeigsqqgksd*TRCONAA.TXT (297) ...........----------------------.gl
實(shí)施例7植物轉(zhuǎn)化載體PNOV4100-PTX5’-At PPO-35ST’和Ubq3(At)-內(nèi)含子-NOS載體用EcoRI消化PBH28(擬南芥Ubq3int-NOS)，分離出4756bp的條帶，用Klenow補(bǔ)平，連接至pCTK2(PTX5’-At PPO-35ST)，用HindIII消化，分離出2386bp的條帶，用Klenow補(bǔ)平。pNOV4100含有PTX5’、At PPO、35ST’、amp、Ubq3(At)內(nèi)含子NOS。將連接產(chǎn)物測序。
PNOV4101-在PPO載體pNOV4100中的β總大豆球蛋白(conglycinin)α’亞基啟動(dòng)子-大豆硫氧還蛋白-NOS用HindIII消化pNOV4100。通過PCR克隆β總大豆球蛋白α’亞基啟動(dòng)子(GenBank accession #M13759)，使用大豆葉基因組DNA和寡核苷酸P9(5’-gac taa gct tac aat tat tat atc aaa atg gc-3’(SEQ ID NO28))和P10(5’-gct ttt ccc aat acg caa tgc-3’(SEQ ID NO29))(Sylvain等(1992)Plant Mol.Biol.19937-949)。將該P(yáng)CR產(chǎn)物克隆至PCR2.1 TOPO載體并測序。該構(gòu)建體在PCR中用作模板，引物為寡核苷酸P4(5’-gac tag cgc tga cag aaa ctg atgcta gga a-3’(SEQ ID NO30))和P9(5’-gac taa gct tac aattat tat atc aaa atg gc-3’(SEQ ID NO28))。用HindIII和Eco47AIII消化。從大豆發(fā)芽的種子提取總RNA，通過RT-PCR克隆大豆硫氧還蛋白，使用P1(5’-cgt agg atc cac cat ggc tga aga aga ggg tca ggttgt c-3’(SEQ ID NO31))和P2(5’-cgt aga gct ctc aag aagaag cag cag cag cag at-3’(SEQ ID NO32))。將該P(yáng)CR產(chǎn)物克隆至PCR2.1 TOPO載體并測序。該構(gòu)建體在PCR中用作模板，引物為寡核苷酸P2(5’-cgt aga gct ctc aag aag aag cag cag cag cag at-3’(SEQ ID NO32))和P5(5’-gac tag cgc tga aga ggg tca ggt tgtcg-3’(SEQ ID NO33))。用Eco47III和SacI消化。將以上三個(gè)片段進(jìn)行三向連接，序列經(jīng)鑒定。
PNOV4102-在PPO載體pNOV4100中的β總大豆球蛋白α’亞基啟動(dòng)子-大豆硫氧還蛋白-煙草殼多糖酶液泡信號序列-NOS。用HindIII和SacI消化pNOV4100。通過PCR克隆β總大豆球蛋白α’亞基啟動(dòng)子，使用大豆葉基因組DNA和寡聚核苷酸P9(5’-gac taa gct tac aattat tat atc aaa atg gc-3’(SEQ ID NO28))和P10(5’-gct tttccc aat acg caa tgc-3’(SEQ ID NO29))。將該P(yáng)CR產(chǎn)物克隆至PCR2.1 TOPO載體并測序。該構(gòu)建體在PCR中用作模板，引物為寡核苷酸P4(5’-gac tag cgc tga cag aaa ctg atg cta gga a-3’(SEQID NO30))和P9(5’-gac taa gct tac aat tat tat atc aaa atggc-3’(SEQ ID NO28))。用HindIII和Eco47AIII消化。從大豆發(fā)芽的種子提取總RNA，通過RT-PCR克隆大豆硫氧還蛋白(GenBankaccession#AI441505)，使用P1(5’-cgt agg atc cac cat ggc tgaaga aga ggg tca ggt tgt c-3’(SEQ ID NO31))和P2(5’-cgtaga gct ctc aag aag aag cag cag cag cag at-3’(SEQ ID NO32))。將該P(yáng)CR產(chǎn)物克隆至PCR2.1 TOPO載體并測序。該構(gòu)建體在PCR中用作模板，引物為寡核苷酸P2(5’-cgt aga gct ctc aag aag aagcag cag cag cag at-3’(SEQ ID NO32))和P5(5’-gac tag cgctga aga ggg tca ggt tgt cg-3’(SEQ ID NO33))。用Eco47III和SacI消化。將以上三個(gè)片段進(jìn)行三向連接，序列經(jīng)鑒定。
PNOV4103-在PPO載體pNOV4100中的β總大豆球蛋白α’亞基啟動(dòng)子加上β總大豆球蛋白的前肽部分-大豆硫氧還蛋白-NOS。通過PCR克隆β總大豆球蛋白α’亞基啟動(dòng)子加上β總大豆球蛋白的前肽部分，使用大豆葉基因組DNA和寡核苷酸P9(5’-gac taa gct tac aattat tat atc aaa atg gc-3’(SEQ ID NO28))和P12(5’-cag taggct taa gga aat tgc aac gag-3’(SEQ ID NO34))。將該片段克隆至pCR 2.1 TOPO。用StuI和SacI消化該構(gòu)建體，并將大豆硫氧還蛋白克隆至該載體。經(jīng)PCR修飾大豆硫氧還蛋白的限制性酶切位點(diǎn)。寡核苷酸P2(SacI)(5’-cgt aga gct ctc aag aag aag cag cag cagcag at-3’(SEQ ID NO32))和P11(PvuII)(5’-cag tca gct gaagag ggt cag gtt gtc-3’(SEQ ID NO35))。在pCR 2.1 TOPO中產(chǎn)生β總大豆球蛋白啟動(dòng)子加上前肽部分+硫氧還蛋白，其稱為A-6。用HindIII和SacI消化A-6和pNOV4100。來自A-6的1459bp的片段與pNOV4100連接。
PNOV4104-在PPO載體pNOV4100中的β總大豆球蛋白α’亞基啟動(dòng)子加上β總大豆球蛋白的前肽部分-大豆硫氧還蛋白-煙草殼多糖酶液泡信號序列-NOS。用StuI和SacI消化pCR 2.1 TOPO中的β總大豆球蛋白α’亞基啟動(dòng)子加上β總大豆球蛋白的前肽部分。用P11(5’-cag tca gct gaa gag ggt cag gtt gtc-3’(SEQ ID NO35))和P27(5’-cta gga gct cta cat ggt gtc cac cag cag-3’(SEQ IDNO36))為引物，以BTC4為模板(含有大豆硫氧還蛋白和煙草殼多糖酶液泡信號序列的pBluescript)得到PCR片段。用PVuII和SacI消化該片段，與StuI-SacI片段連接。產(chǎn)生A3-10(即帶有β總大豆球蛋白啟動(dòng)子的pCR 2.1 TOPO+前肽-大豆硫氧還蛋白-煙草殼多糖酶液泡信號序列)。用HindIII和SacI消化A3-10和pNOV4100并連接。
PNOV4105-Ubq3(At)-內(nèi)含子-煙草殼多糖酶ER信號序列-NOS和PTX5’-At PPO-35ST’。用BamHI和PstI消化PNOV4100，并連接至pCIB8418的煙草殼多糖酶ER信號序列再用BamHI和PstI消化得到PNOV4105。該載體含有Ubq3啟動(dòng)子和內(nèi)含子與煙草殼多糖酶ER信號序列。
PNOV4106-在PPO載體pNOV4105中的Ubq3(At)-內(nèi)含子-煙草殼多糖酶ER信號序列-大豆硫氧還蛋白-煙草殼多糖酶液泡信號序列-NOS。用Eco47III和SacI消化pNOV4105和pNOV4102。來自pNOV4102的387bp的條帶連接至消化過的pNOV4105。
PNOV4107-在PPO載體pNOV4105中的Ubq3(At)-內(nèi)含子-煙草殼多糖酶ER信號序列-大豆硫氧還蛋白-NOS。用Eco47III和SacI消化pNOV4105和pNOV4101。來自pNOV4101的360bp的條帶連接至消化過的pNOV4105。
PNOV4108-在二元載體pCIB200中的β總大豆球蛋白α’亞基啟動(dòng)子-大豆硫氧還蛋白-煙草殼多糖酶液泡信號序列-NOS。用XbaI消化pCIB200，并用Klenow補(bǔ)平。用HindIII和SacI消化pNOV4101，用T4 DNA聚合酶將末端補(bǔ)平，并將1626bp條帶與消化過的pCIB200連接。
PNOV4109-在二元載體pCIB200中的β總大豆球蛋白α’亞基啟動(dòng)子加上β總大豆球蛋白的前肽部分-大豆硫氧還蛋白-NOS。用XbaI消化pCIB200，并用Klenow補(bǔ)平。用HindIII和KpnI消化pNOV4103，用T4 DNA聚合酶將末端補(bǔ)平，并將1748bp條帶與消化過的pCIB200連接。
PNOV4110-β總大豆球蛋白α’亞基啟動(dòng)子-大豆硫氧還蛋白-NOS。用XbaI消化pCIB200，并用Klenow補(bǔ)平。用PvuII和KpnI消化pNOV4102，用T4 DNA聚合酶將末端補(bǔ)平，并將1843bp條帶與消化過的pCIB200連接。
PNOV4111-在二元載體pCIB200中的β總大豆球蛋白α’亞基啟動(dòng)子加上β總大豆球蛋白的前肽部分-大豆硫氧還蛋白-煙草殼多糖酶液泡信號序列-NOS。用XbaI消化pCIB200，并用Klenow補(bǔ)平。用PvuII和KpnI消化pNOV4104，用T4 DNA聚合酶將末端補(bǔ)平，并將1969bp的條帶與消化過的pCIB200連接。
PNOV4112-大腸桿菌蛋白質(zhì)表達(dá)載體pET29a中的大豆硫氧還蛋白。從大豆發(fā)芽的種子提取總RNA，通過RT-PCR克隆大豆硫氧還蛋白，使用P1(5’-cgt agg atc cac cat ggc tga aga aga ggg tca ggt tgtc-3’(SEQ ID NO31))和P2(5’-cgt aga gct ctc aag aag aagcag cag cag cag at-3’(SEQ ID NO32))。用BamHI和SacI消化該P(yáng)CR產(chǎn)物，并克隆至用BamHI和SacI消化的pET29a中去。該序列已經(jīng)鑒定。
PNOV4113-大腸桿菌蛋白質(zhì)表達(dá)載體pET29a中的水稻硫氧還蛋白。用BamHI和SacI消化pNOV3400，將水稻硫氧還蛋白(378bp)克隆至用BamHI和SacI消化的pET29a中去。該序列已經(jīng)鑒定。
PNOV4114-大腸桿菌蛋白質(zhì)表達(dá)載體pET29a中的小麥硫氧還蛋白。用BamHI和SacI消化pNOV3406，將小麥硫氧還蛋白(387bp)克隆至用BamHI和SacI消化的pET29a中去。該序列已經(jīng)鑒定。
PNOV4115-大腸桿菌蛋白質(zhì)表達(dá)載體pET29a中的擬南芥NADPH硫氧還蛋白還原酶.通過RT-PCR克隆擬南芥NADPH硫氧還蛋白還原酶(GenBank Accession # Z23109)。用Trizol(GibcoBRL，Gaithersburg，MD)依照生產(chǎn)者提供的實(shí)驗(yàn)方法，從擬南芥的葉子中提取出總RNA。在Superscript One Step RT-PCR系統(tǒng)(GibcoBRL，Gaithersburg，MD)中使用一微克總RNA，來一步產(chǎn)生cDNA和PCR產(chǎn)物。在該反應(yīng)中使用引物P28(5’-gca cgg ctt ggt ggt gaa tcc-3’(SEQ ID NO37))和P29(5’-ctc att ctg gtc cat caa tgt c-3’(SEQ ID NO38))。依照生產(chǎn)者提供的實(shí)驗(yàn)方法。將PCR產(chǎn)物以1∶10稀釋，嵌套式PCR反應(yīng)中使用1微升該產(chǎn)物，與引物P26(5’-gactgt cga ctc aat cac tct tac ctt gct gag-3’(SEQ ID NO39))和P31(5’-gac tgg atc caa tgg tct cga aac tca caa c-3’(SEQID NO40))進(jìn)行反應(yīng)。該嵌套式PCR反應(yīng)產(chǎn)物(998bp)經(jīng)膠純化，用BamHI和SacI消化后克隆至用BamHI和SacI消化的pET29a中去。該序列已經(jīng)鑒定。PNOV4109-用XbaI消化pCIB200，并用Klenow補(bǔ)平。用HindIII和KpnI消化pNOV4103，用T4 DNA聚合酶將末端補(bǔ)平，并將1748bp條帶與消化過的pCIB200連接。該構(gòu)建可用于大豆中的瞬時(shí)表達(dá)分析，也可與硫氧還蛋白連接用于擬南芥和其它雙子葉植物的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。
PNOV4101、PNOV4102、PNOV4103、PNOV4104、PNOV4106、PNOV4107用于大豆子葉中的瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。
通過Western印跡分析了硫氧還蛋白的表達(dá)PNOV4108、PNOV4109、PNOV4110、PNOV4111用于擬南芥的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。通過Western印跡分析了硫氧還蛋白的表達(dá)。檢測了硫氧還蛋白對表達(dá)的作用和種子特異性蛋白質(zhì)的活性。
PNOV4112、PNOV4113、PNOV4114分別為大腸桿菌蛋白質(zhì)表達(dá)載體pET29a(Novagen)中的含有大豆、水稻和小麥trx-h基因的構(gòu)建體。這些構(gòu)建體是用于制備適用于抗體生產(chǎn)和純化的硫氧還蛋白，該硫氧還蛋白也可在硫氧還蛋白的酶試驗(yàn)中充當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)蛋白。
實(shí)施例8蛋白質(zhì)表達(dá)和純化如下構(gòu)建體用于大腸桿菌中的蛋白質(zhì)表達(dá)PNOV4112(pET29a中的大豆硫氧還蛋白)、PNOV4113(pET29a中的水稻硫氧還蛋白)、PNOV4114(pET29a中的小麥硫氧還蛋白)和PNOV4115(pET29a中的擬南芥硫氧還蛋白還原酶)。將大腸桿菌株系BL21(DE3)pLysS用每個(gè)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化。在含有來自甘油原液的等分試樣、50mg/ml的卡那霉素、34mg/ml的氯霉素的LB培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)直至在600nm的光密度達(dá)到0.6。培養(yǎng)體系在4℃中保存至第二天。將培養(yǎng)體系離心后在新鮮LB中重懸細(xì)胞。用每25ml大規(guī)模培養(yǎng)液使用1ml小規(guī)模培養(yǎng)液的方式來進(jìn)行大批培養(yǎng)。細(xì)胞在含有50mg/ml的卡那霉素、34mg/ml的氯霉素的LB培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)直至在600nm的光密度達(dá)到0.6。加入IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)使其終濃度為0.4mM，用于誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。繼續(xù)在37℃培養(yǎng)3個(gè)小時(shí)。取出培養(yǎng)液1/25體積的量，在3000g離心10分鐘，并將細(xì)胞在BugBuster中重新懸浮(Novagen，Madison，WI)。在每毫升BugBuster中加入5單位DNase。細(xì)胞在-20℃放置過夜。細(xì)胞融化后在室溫旋轉(zhuǎn)孵育30分鐘。通過在4℃以14,000g離心20min去除細(xì)胞碎片。
表達(dá)的蛋白為具有S-標(biāo)記(15個(gè)氨基酸)和5’端凝血酶切割位點(diǎn)(6個(gè)氨基酸)的融合蛋白。通過cDNA的5’端克隆位點(diǎn)的BamHI位點(diǎn)，將另外的31個(gè)氨基酸加入目標(biāo)蛋白的5’端。
用親和色譜純化該融合蛋白。將蛋白質(zhì)提取物加入S-蛋白瓊脂糖漿液(Novagen，Madison，WI)。由于融合蛋白的表達(dá)量不同，每個(gè)實(shí)驗(yàn)的S-蛋白瓊脂糖所需量也不同。產(chǎn)率為0.5mg純化的蛋白質(zhì)/ml樹脂。依照生產(chǎn)者提供的實(shí)驗(yàn)方法。要去除S-標(biāo)記，依照生產(chǎn)者提供的實(shí)驗(yàn)方法使用S-標(biāo)記凝血酶純化試劑盒(Novagen，Madison，WI)。
實(shí)施例9抗體的生產(chǎn)大豆硫氧還蛋白抗體的生產(chǎn)經(jīng)過親和色譜純化大豆硫氧還蛋白，使用S-蛋白瓊脂糖和如上所述的方法去除S-標(biāo)記。在這種制備物中存在污染蛋白，因此將該蛋白在4-20％的Tris-甘氨酸膠(Novex，SanDiego)上電泳，并將大豆硫氧還蛋白的條帶從電泳膠上切除。將切下的膠條提供給Duncroft Inc.(Lovettsville，VA)，用于在山羊中生產(chǎn)抗體，使用如下標(biāo)準(zhǔn)操作過程CG1“兔、綿羊和山羊的多克隆抗體制備”。
水稻硫氧還蛋白特異性抗體的純化依照生產(chǎn)者提供的實(shí)驗(yàn)方法用S-蛋白瓊脂糖親和色譜純化水稻硫氧還蛋白(Novagen，Madison，WI)。不去除S-標(biāo)記。
Affi-Gel-10柱的制備在與Bio-rad Affi-Gel-10柱偶聯(lián)之前，將純化的水稻硫氧還蛋白置于2L含0.1M NaHCO3、pH為8.3的溶液中透析5小時(shí)，依照生產(chǎn)者提供的實(shí)驗(yàn)方法操作。簡要地說，將大約2ml的Affi-Gel-10漿液轉(zhuǎn)移至與真空相連的玻璃過濾器，去除溶劑，并用冰預(yù)冷的dH2O(至少3倍體積)將膠洗滌兩次。然后將潮濕的膠轉(zhuǎn)移至含有透析過的水稻硫氧還蛋白的試管中，在4℃搖床上過夜。為了確保封閉所有未被占用的活性位點(diǎn)，向膠中加入0.1ml的1M乙醇胺HCl(pH7.0)，在4℃搖一個(gè)小時(shí)。再將膠轉(zhuǎn)移至柱中，經(jīng)PBS洗滌，用0.1M甘氨酸-HCl(pH2.5，0.4ml)預(yù)洗脫，再用PBS平衡。最終的柱體積為0.8ml。不使用時(shí)，將柱在含有0.2％疊氮化鈉的PBS中保存于4℃。
水稻硫氧還蛋白特異性抗體的純化通過水稻硫氧還蛋白Affi-Gel-10柱將大豆硫氧還蛋白山羊抗血清進(jìn)行免疫親和純化。對于每輪反應(yīng)，借助重力將2ml血清加入柱中，用PBS洗滌柱直至A280值＜0.015，然后用0.1M甘氨酸-HCl(pH2.5)洗脫。收集組分(1ml)并用50μl 0.5M的Tris(pH8.5)中和。將A280為0.05或更大值的組分收集。
實(shí)施例10硫氧還蛋白分析胰島素還原分析(Arne Holmgren(1979)J.Biol.Chem.2549627-9632)。在該分析中，DTT(二硫蘇糖醇)還原硫氧還蛋白。還原了的硫氧還蛋白進(jìn)而將胰島素中的二硫鍵還原，產(chǎn)生白色沉淀物。在650nm波長下記錄沉降速率。新鮮制備的胰島素溶液(1mg/ml，在0.1M的磷酸鉀溶液中，pH6.5)、2mM EDTA(乙二胺四乙酸)和100mM DTT在冰上預(yù)冷。在比色杯中制備分析混合物。每個(gè)比色杯中含有750微升1mg/ml胰島素、3.3微升DTT并用水加至終體積為1ml。空白對照不含有硫氧還蛋白，樣品中含有不同含量的硫氧還蛋白(適用于分析的最低量為10微摩爾)。在650nm讀出光密度之前，樣品必須在室溫制備和培養(yǎng)至少20分鐘。
DTNB[5，5’-二硫-雙-(2-硝基苯甲酸)]分析-(Oblong等(1993)Biochemistry 327271-7277)。在本分析中硫氧還蛋白還原酶和NADPH(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)用于還原硫氧還蛋白，而還原的硫氧還蛋白進(jìn)一步還原DTNB。在412nm處監(jiān)控光密度變化4分鐘。需要新鮮制備的DTNB溶液(100mM，于DMSO二甲基亞砜中)、NADPH(20mM于H2O中)和含有100mM Tris(pH8.0)的緩沖液、0.1mg/mlBSA。在比色杯中制備分析混合物。每個(gè)比色杯中含有10微升DTNB、10微升NADPH、5微克硫氧還蛋白、2微克擬南芥或大腸桿菌硫氧還蛋白還原酶并用緩沖液加至終體積為1ml。一旦加入硫氧還蛋白，立即顛倒混勻，并立即開始測定412nm處的光密度。這是一個(gè)慢反應(yīng)。Y軸設(shè)置為0至0.5A?？瞻讓φ詹缓蜓踹€蛋白。
實(shí)施例11農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化質(zhì)粒和選擇標(biāo)記將用于轉(zhuǎn)化的基因克隆至適于玉米轉(zhuǎn)化的載體上。使用了含有磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)基因的載體，以允許用甘露糖來篩選轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
根癌農(nóng)桿菌的制備含有植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的農(nóng)桿菌株系LBA4404(pSB1)在YEPC固體培養(yǎng)基上生長(酵母提取物(5g/L)、蛋白胨(10g/L)、NaCl(5g/L)、CaCl2·2H2O(1.029g/L))，其中含有適當(dāng)?shù)目股?壯觀霉素(100mg/L)、四環(huán)素(10mg/L))，在28℃培養(yǎng)2-4天。將大約0.75×108的農(nóng)桿菌懸浮于LS修飾的液體感染培養(yǎng)基，其中含有100μM乙酰丁香酮(acetosyringone)(Negrotto等(2000)Plant Cell Rep.，印刷中用0.1×磷酸修改)。在使用前在該培養(yǎng)基中將細(xì)菌預(yù)誘導(dǎo)0.5-2個(gè)小時(shí)。于660nm檢測細(xì)菌濃度，并將其光密度調(diào)整至大約0.75。
孵育將來自A188、Hi-II或A188×Hi-II的8-9天的未成熟胚切割，直接放入含有LS修飾的液體感染培養(yǎng)基的1.5ml離心管中，其中含有100μM乙酰丁香酮?？偳懈顣r(shí)間為30分鐘。將胚旋渦振蕩5秒，使其沉降下來，并去除感染培養(yǎng)基。加入新鮮的感染培養(yǎng)基。將離心管置于45℃水浴中5分鐘，使胚熱休克。去除感染培養(yǎng)基，代替為農(nóng)桿菌溶液。將胚旋渦振蕩30秒，使其與細(xì)菌結(jié)合5分鐘。將細(xì)菌/胚溶液倒入固化的LS修飾的感染培養(yǎng)基，其中含有500μM乙酰丁香酮(Negrotto等，ibid用0.1×磷酸修改)。小心地將菌液吸走，并將胚轉(zhuǎn)移至平板的干凈部位。將胚盾片朝上放置，于22℃共培養(yǎng)2-3天。
轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇和轉(zhuǎn)化植物的再生在共培養(yǎng)之后，將胚置于JMS培養(yǎng)基之上[Suttie等(1991)第三次國際植物生長和發(fā)育的分子生物學(xué)大會(huì)海報(bào)#905(3rDInternational Congress Molecular Biologyof Plant Growth and Development Poster#905)]，其中含有AgNO3和200mg/l替卡西林用于誘導(dǎo)愈傷組織。在所有隨后的培養(yǎng)基中均含有替卡西林。于28℃在暗處培養(yǎng)10天之后，已誘導(dǎo)出胚發(fā)生的愈傷組織。將愈傷組織轉(zhuǎn)移至不含有銀卻含有用于選擇的10g/L甘露糖和5g/L蔗糖的JMS培養(yǎng)基。在2-3周以后，將仍存活的愈傷組織轉(zhuǎn)移至新鮮的選擇培養(yǎng)基。再過2-3周，將仍存活的愈傷組織轉(zhuǎn)移至MSAK+PO4培養(yǎng)基(Murashige和Skoog(1962)Physiol.Plant.15473-439附加有20g/L蔗糖、5g/L/甘露糖、ancimidol(0.25mg/L)、細(xì)胞分裂素(0.5mg/L)和KH2PO4(170mg/L))用于再生(28℃，暗處，10-14天)。將愈傷組織轉(zhuǎn)移至新鮮的MSAK+PO4培養(yǎng)基，并轉(zhuǎn)移至光下培養(yǎng)(16小時(shí)光/8小時(shí)黑暗)。在1周以后，將再生的苗轉(zhuǎn)移至不含激素的MS培養(yǎng)基，其中附加有20g/L蔗糖和5g/L/甘露糖。將長出根的苗轉(zhuǎn)移至MagentaTMGA-7試劑盒中，其中含有0.75離子強(qiáng)度的MS培養(yǎng)基，并添加有10ml/L的Plant Preservative MixtureTM和10g/L蔗糖用于進(jìn)一步的生長?？蓪χ苯觼碜訥A-7試劑盒的植物或轉(zhuǎn)移至土壤中的植物進(jìn)行分析。
實(shí)施例12大豆子葉瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)S3911 Novartis育種系中滅菌的種子在MS固體培養(yǎng)基上萌發(fā)6天，5個(gè)/平板，條件為16/8光周期、25℃。將子葉外植并切成1-2mm的小條。將來自一對子葉的小條放置成直徑為1-2cm的圓圈，其處于含MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿的中央，該MS培養(yǎng)基中含有1mg/l BAP和0.5mg/l NAA。用PDS-100 Helium槍轟擊該組織，依照DuPont手冊。每個(gè)平板均通過1550psi裂口盤轟擊兩次。依據(jù)手冊制備帶有DNA的金微載體。每個(gè)大載體上帶有0.6μg選定的質(zhì)粒DNA。將一個(gè)不銹鋼屏幕作為轟擊波的擋板。在轟擊后，將平板置回16/8光周期，25℃的條件下。第一次取材為48小時(shí)。
實(shí)施例13用pNOV 3401轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物分析A.PCR從GA-7盒中的轉(zhuǎn)基因植物中選取材料。在96孔板用Gentra DNA提取試劑盒，依照廠家的說明書來提取DNA。使用Jumpstart RedtaqReadymix(Sigma)和引物Thiorodoxubi 1603(5’-GCGGTCGTTCATTCGTTCTA-3’(SEQ ID NO41))和引物Thiorodox 2364(5’-ACGTGCTTCA CGATGGTGTT-3’(SEQ ID NO42))，其終濃度均為2.5μM，來進(jìn)行PCR反應(yīng)。經(jīng)PCR鑒定含有硫氧還蛋白基因的轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)移至溫室中。
B.通過Northern印跡分析來自轉(zhuǎn)基因植物的硫氧還蛋白RNA通過Lagrimini等((1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，847542-7546)描述的方法，從轉(zhuǎn)基因植物的葉和種子組織中提取總RNA。探針是由完整的水稻trx-h基因制備而來的。用BamHI-SacI消化質(zhì)粒pNOV 3401得到一個(gè)327bp的片段，再經(jīng)膠純化并通過LifeTechnologies Inc.的隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒用32P α-CTP標(biāo)記。
來自代表性轉(zhuǎn)基因植物的葉和種子RNA的Northern印跡結(jié)果顯示硫氧還蛋白mRNA在葉和種子組織中的表達(dá)。
C.來自轉(zhuǎn)基因植物的硫氧還蛋白蛋白質(zhì)的分析玉米葉的蛋白質(zhì)提取和western分析從每片葉子材料上打孔取下一個(gè)eppendorf蓋大的小圓。將該組織放入eppendorf管中并用干冰冷凍。用一個(gè)小杵在eppendorf管中研磨組織。向研碎的組織加入400微升100mM Tris(pH8.0)，樣品在室溫下離心30分鐘，取上清。所有樣品均使用3000MW截止的Centriconsi濃縮。每個(gè)樣品上樣12.5微升于16％Tris-甘氨酸(Novex，San Diego CA)微型膠，以Tris-甘氨酸-SDS(24mM Tris、52mM甘氨酸、1％十二烷基硫酸鈉)為電泳緩沖液，而后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF上。雜交膜用TBS-2％Tween(TBS-150mM NaCl、30mM Tris、pH10.2)在室溫封閉15分鐘后，與水稻硫氧還蛋白抗體(從山羊抗大豆硫氧還蛋白血清中經(jīng)親和純化)溫育，濃度為1微克抗體/1微升TBS-0.5％Tween，在4℃反應(yīng)過夜。將雜交膜用TBS-0.05％Tween洗三次，每次5分鐘，而后與HRP(辣根過氧化物酶)兔抗羊IgG(50納克抗體每微升TBS-0.05％Tween)，在室溫反應(yīng)1小時(shí)，再用TBS-0.05％Tween洗，最后與supersignalwest femto化學(xué)發(fā)光底物(Pierce，Rockford，IL)在室溫反應(yīng)5分鐘。再將雜交膜與底片放置，一起曝光30秒。
玉米種子的蛋白質(zhì)提取和western分析將來自每個(gè)樣品的每個(gè)種子切成兩半，取一半在干冰中冷凍，并用研缽和杵將其研磨，加入1.5微升Tris(pH8.0)，在室溫旋轉(zhuǎn)孵育30分鐘。將樣品離心，并用10,000MW截止的Centricons將蛋白質(zhì)提取物濃縮。每個(gè)樣品上樣12.5微升于16％Tris-甘氨酸(與葉子樣品的條件相同)。膠轉(zhuǎn)移至硝化纖維素上，TBS-2％Tween封閉15分鐘，與水稻硫氧還蛋白抗體(1微克抗體每微升TBS-0.5％Tween)在室溫孵育1.5小時(shí)，洗凈后與HRP兔抗羊IgG孵育，步驟如上所述。最后將雜交膜與supersignal westpico化學(xué)發(fā)光底物(Pierce，Rockford，IL)在室溫反應(yīng)5分鐘。再將雜交膜與底片放置，一起曝光5分鐘。Western雜交結(jié)果顯示水稻硫氧還蛋白在葉和種子組織中的表達(dá)。Western印跡結(jié)果也顯示，與同上樣于膠上的對照水稻硫氧還蛋白相比，在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的水稻硫氧還蛋白具有預(yù)期的大小。
實(shí)施例14大腸桿菌中表達(dá)的重組硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶的酶活性大腸桿菌中表達(dá)的重組大豆硫氧還蛋白通過使用S-蛋白瓊脂糖的親和色譜來純化，并用凝血酶切割S-標(biāo)記。在上述的胰島素還原分析中檢測該蛋白質(zhì)。檢測4、20、40和80微克的親和純化的硫氧還蛋白(存在一種污染蛋白)。在31分鐘之后，在650nm下測量到了光密度的變化。
硫氧還蛋白(μg)650nm的OD值(31沉降速率(Δ分鐘之后)A650/min)0.0000.0000001.0010.0000322.0077.000253.0084.000274.0117.00038在NADPH硫氧還蛋白還原酶DTNB分析中測定了以下重組蛋白質(zhì)具有S-標(biāo)記的大豆硫氧還蛋白、不具有S-標(biāo)記的大豆硫氧還蛋白、具有S-標(biāo)記的水稻硫氧還蛋白、具有S-標(biāo)記的小麥硫氧還蛋白和不具有S-標(biāo)記的擬南芥硫氧還蛋白還原酶。在此分析中也使用大腸桿菌硫氧還蛋白還原酶(T-7915，Sigma，St.Louis，MO)。在4分鐘之內(nèi)監(jiān)控412nm處的光密度變化。
硫氧還蛋白硫氧還蛋白還原酶ΔA4120μl 1.5μl(≈0.5μg)0.06擬南芥30μl(≈12μg)大豆2.3μg大腸桿菌 0.33330μl(≈12μg)大豆1.5μl(≈0.5μg)0.42擬南芥30μl(≈6μg)大豆 2.3μg大腸桿菌 0.2030μl(≈15μg)水稻1.5μl(≈0.5μg)0.66擬南芥30μl(≈15μg)水稻2.3μg大腸桿菌 0.3030μl(≈0.6μg)小麥 2.3μg大腸桿菌 0.3030μl(≈0.6μg)小麥 1.5μl(≈0.5μg)0.08擬南芥30μl(≈1.2μg)小麥 1.5μl(≈0.5μg)0.08擬南芥擬南芥的硫氧還蛋白還原酶和大腸桿菌的硫氧還蛋白還原酶可還原具有或不具有S-標(biāo)記的大豆硫氧還蛋白。擬南芥和大腸桿菌的硫氧還蛋白還原酶也可還原水稻硫氧還蛋白。小麥硫氧還蛋白可被大腸桿菌的硫氧還蛋白還原酶還原，而不能被擬南芥的硫氧還蛋白還原酶還原。
序列表序列表<110>Syngenta Participations AG<120>谷物加工方法和其中有用的轉(zhuǎn)基因植物<130>A-31383A<140>
<141>
<150>US 09/598747<151>2000-06-21<160>42<170>PatentIn Ver.2.2<210>1<211>85<212>PRT<213>詹氏甲烷球菌<400>1Met Ser Lys Val Lys Ile Glu Leu Phe Thr Ser Pro Met Cys Pro His1 5 10 15Cys Pro Ala Ala Lys Arg Val Val Glu Glu Val Ala Asn Glu Met Pro20 25 30Asp Ala Val Glu Val Glu Tyr Ile Asn Val Met Glu Asn Pro Gln Lys35 40 45Ala Met Glu Tyr Gly Ile Met Ala Val Pro Thr Ile Val Ile Asn Gly50 55 60Asp Val Glu Phe Ile Gly Ala Pro Thr Lys Glu Ala Leu Val Glu Ala65 70 75 80Ile Lys Lys Arg Leu85<210>2<211>119
<212>PRT<213>閃爍古生球菌<400>2Met Pro Met Val Arg Lys Ala Ala Phe Tyr Ala Ile Ala Val Ile Ser1 5 10 15Gly Val Leu Ala Ala Val Val Gly Asn Ala Leu Tyr His Asn Phe Asn20 25 30Ser Asp Leu Gly Ala Gln Ala Lys Ile Tyr Phe Phe Tyr Ser Asp Ser35 40 45Cys Pro His Cys Arg Glu Val Lys Pro Tyr Val Glu Glu Phe Ala Lys50 55 60Thr His Asn Leu Thr Trp Cys Asn Val Ala Glu Met Asp Ala Asn Cys65 70 75 80Ser Lys Ile Ala Gln Glu Phe Gly Ile Lys Tyr Val Pro Thr Leu Val85 90 95Ile Met Asp Glu Glu Ala His Val Phe Val Gly Ser Asp Glu Val Arg100 105 110Thr Ala Ile Glu Gly Met Lys115<210>3<211>93<212>PRT<213>閃爍古生球菌<400>3Met Val Phe Thr Ser Lys Tyr Cys Pro Tyr Cys Arg Ala Phe Glu Lys1 5 10 15Val Val Glu Arg Leu Met Gly Glu Leu Asn Gly Thr Val Glu Phe Glu20 25 30Val Val Asp Val Asp Glu Lys Arg Glu Leu Ala Glu Lys Tyr Glu Val35 40 45Leu Met Leu Pro Thr Leu Val Leu Ala Asp Gly Asp Glu Val Leu Gly
50 55 60Gly Phe Met Gly Phe Ala Asp Tyr Lys Thr Ala Arg Glu Ala Ile Leu65 70 75 80Glu Gln Ile Ser Ala Phe Leu Lys Pro Asp Tyr Lys Asn85 90<210>4<211>134<212>PRT<213>閃爍古生球菌<400>4Met Asp Glu Leu Glu Leu Ile Arg Gln Lys Lys Leu Lys Glu Met Met1 5 10 15Gln Lys Met Ser Gly Glu Glu Lys Ala Arg Lys Val Leu Asp Ser Pro20 25 30Val Lys Leu Asn Ser Ser Asn Phe Asp Glu Thr Leu Lys Asn Asn Glu35 40 45Asn Val Val Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp Cys Met Pro Cys Lys Met50 55 60Ile Ala Pro Val Ile Glu Glu Leu Ala Lys Glu Tyr Ala Gly Lys Val65 70 75 80Val Phe Gly Lys Leu Asn Thr Asp Glu Asn Pro Thr Ile Ala Ala Arg85 90 95Tyr Gly Ile Ser Ala Ile Pro Thr Leu Ile Phe Phe Lys Lys Gly Lys100 105 110Pro Val Asp Gln Leu Val Gly Ala Met Pro Lys Ser Glu Leu Lys Arg115 120 125Trp Val Gln Arg Asn Leu130<210>5<211>105
<212>PRT<213>閃爍古生球菌<400>5Met Glu Arg Leu Asn Ser Glu Arg Phe Arg Glu Val Ile Gln Ser Asp1 5 10 15Lys Leu Val Val Val Asp Phe Tyr Ala Asp Trp Cys Met Pro Cys Arg20 25 30Tyr Ile Ser Pro Ile Leu Glu Lys Leu Ser Lys Glu Tyr Asn Gly Glu35 40 45Val Glu Phe Tyr Lys Leu Asn Val Asp Glu Asn Gln Asp Val Ala Phe50 55 60Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Pro Thr Val Leu Phe Phe Arg Asn Gly65 70 75 80Lys Val Val Gly Gly Phe Ile Gly Ala Met Pro Glu Ser Ala Val Arg85 90 95Ala Glu Ile Glu Lys Ala Leu Gly Ala100 105<210>6<211>301<212>PRT<213>詹氏甲烷球菌<400>6Met Ile His Asp Thr Ile Ile Ile Gly Ala Gly Pro Gly Gly Leu Thr1 5 10 15Ala Gly Ile Tyr Ala Met Arg Gly Lys Leu Asn Ala Leu Cys Ile Glu20 25 30Lys Glu Asn Ala Gly Gly Arg Ile Ala Glu Ala Gly Ile Val Glu Asn35 40 45Tyr Pro Gly Phe Glu Glu Ile Arg Gly Tyr Glu Leu Ala Glu Lys Phe50 55 60Lys Asn His Ala Glu Lys Phe Lys Leu Pro Ile Ile Tyr Asp Glu Val
65 70 75 80Ile Lys Ile Glu Thr Lys Glu Arg Pro Phe Lys Val Ile Thr Lys Asn85 90 95Ser Glu Tyr Leu Thr Lys Thr Ile Val Ile Ala Thr Gly Thr Lys Pro100 105 110Lys Lys Leu Gly Leu Asn Glu Asp Lys Phe Ile Gly Arg Gly Ile Ser115 120 125Tyr Cys Thr Met Cys Asp Ala Phe Phe Tyr Leu Asn Lys Glu Val Ile130 135 140Val Ile Gly Arg Asp Thr Pro Ala Ile Met Ser Ala Ile Asn Leu Lys145 150 155 160Asp Ile Ala Lys Lys Val Ile Val Ile Thr Asp Lys Ser Glu Leu Lys165 170 175Ala Ala Glu Ser Ile Met Leu Asp Lys Leu Lys Glu Ala Asn Asn Val180 185 190Glu Ile Ile Tyr Asn Ala Lys Pro Leu Glu Ile Val Gly Glu Glu Arg195 200 205Ala Glu Gly Val Lys Ile Ser Val Asn Gly Lys Glu Glu Ile Ile Lys210 215 220Ala Asp Gly Ile Phe Ile Ser Leu Gly His Val Pro Asn Thr Glu Phe225 230 235 240Leu Lys Asp Ser Gly Ile Glu Leu Asp Lys Lys Gly Phe Ile Lys Thr245 250 255Asp Glu Asn Cys Arg Thr Asn Ile Asp Gly Ile Tyr Ala Val Gly Asp260 265 270Val Arg Gly Gly Val Met Gln Val Ala Lys Ala Val Gly Asp Gly Cys275 280 285Val Ala Met Ala Asn Ile Ile Lys Tyr Leu Gln Lys Leu290 295 300
<210>7<211>300<212>PRT<213>閃爍古生球菌<400>7Met Tyr Asp Val Ala Ile Ile Gly Gly Gly Pro Ala Gly Leu Thr Ala1 5 10 15Ala Leu Tyr Ser Ala Arg Tyr Gly Leu Lys Thr Val Phe Phe Glu Thr20 25 30Val Asp Pro Val Ser Gln Leu Ser Leu Ala Ala Lys Ile Glu Asn Tyr35 40 45Pro Gly Phe Glu Gly Ser Gly Met Glu Leu Leu Glu Lys Met Lys Glu50 55 60Gln Ala Val Lys Ala Gly Ala Glu Trp Lys Leu Glu Lys Val Glu Arg65 70 75 80Val Glu Arg Asn Gly Glu Thr Phe Thr Val Ile Ala Glu Gly Gly Glu85 90 95Tyr Glu Ala Lys Ala Ile Ile Val Ala Thr Gly Gly Lys His Lys Glu100 105 110Ala Gly Ile Glu Gly Glu Ser Ala Phe Ile Gly Arg Gly Val Ser Tyr115 120 125Cys Ala Thr Cys Asp Gly Asn Phe Phe Arg Gly Lys Lys Val Ile Val130 135 140Tyr Gly Ser Gly Lys Glu Ala Ile Glu Asp Ala Ile Tyr Leu His Asp145 150 155 160Ile Gly Cys Glu Val Thr Ile Val Ser Arg Thr Pro Ser Phe Arg Ala165 170 175Glu Lys Ala Leu Val Glu Glu Val Glu Lys Arg Gly Ile Pro Val His180 185 190Tyr Ser Thr Thr Ile Arg Lys Ile Ile Gly Ser Gly Lys Val Glu Lys195 200 205
Val Val Ala Tyr Asn Arg Glu Lys Lys Glu Glu Phe Glu Ile Glu Ala210 215 220Asp Gly Ile Phe Val Ala Ile Gly Met Arg Pro Ala Thr Asp Val Val225 230 235 240Ala Glu Leu Gly Val Glu Arg Asp Ser Met Gly Tyr Ile Lys Val Asp245 250 255Lys Glu Gln Arg Thr Asn Val Glu Gly Val Phe Ala Ala Gly Asp Cys260 265 270Cys Asp Asn Pro Leu Lys Gln Val Val Thr Ala Cys Gly Asp Gly Ala275 280 285Val Ala Ala Tyr Ser Ala Tyr Lys Tyr Leu Thr Ser290 295 300<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物NMD109)<400>8ggatccacca tggccgccga ggag24<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物NMD110)<400>9gagctcttag gcagaagcag atg 23<210>10<211>22
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物NMD102)<400>10ggatccacca tggcggcgtc gg 22<210>11<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物NMD103)<400>11gagctcttac tgggccgcgt gt 22<210>12<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物NMD124A)<400>12gagctcttag gcgctagcag atg 23<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物NMD125A)<400>13ggatccacca gcgctgccga 20
<210>14<211>65<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物NMD126)<400>14gatccaccat gagggtgttg ctcgttgccc tcgctctcct ggctctcgct gcgagcgcca 60ccagc 65<210>15<211>61<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物NMD127)<400>15gctggtggcg ctcgcagcga gagccaggag agcgagggca acgagcaaca ccctcatggt 60g 61<210>16<211>67<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物NMD128)<400>16ctagcgctct gcagcagccg actccatgcc cctacgctgc tgccggcggt gtcccccact 60gagagct 67<210>17<211>59<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物NMD129)<400>17ctcagtgggg gacaccgccg gcagcagcgt aggggcatgg agtcggctgc tgcagagcg 59<210>18<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物STRF1A)<400>18ggatccacca tgaacggcct ggag 24<210>19<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物STRF1B)<400>19ctcgagaagt ccaccttggt cac 23<210>20<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物STRF2A)<400>20ctcgagcaag ccgttcaa 18<210>21<211>21
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物STRF2B)<400>21gacgtcgatc ttcgggttgg a 21<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物STR3A)<400>22cgacgtcatc tggaactcct 20<210>23<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物STR3B)<400>23gagctcagat ctagtcggac ttg 23<210>24<211>1021<212>DNA<213>鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)<400>24ggatccacca tgaacggcct ggagactcac aacacccgcc tctgcatcgt tggctccggc 60ccggctgccc acaccgccgc catctacgcc gcccgcgccg agctgaagcc gctcctcttc 120gagggctgga tggccaacga catcgccccg ggcggccagc tcaccaccac caccgacgtg 180gagaacttcc ccggcttccc ggagggcatc ctcggcgtgg agctgaccga caagttccgc 240aagcagagcg agcgcttcgg caccaccatc ttcaccgaga ccgtgaccaa ggtggacttc 300
tcgagcaagc cgttcaagct cttcaccgac tccaaggcca tcctcgccga cgccgtgatc 360ctcgccatcg gcgccgtggc caagtggctc tccttcgtgg gctccggcga ggtgctcggc 420ggcctctgga accgcggcat ctccgcctgc gctgtgtgcg acggcgccgc cccgatcttc 480cgcaacaagc cgctcgctgt gatcggtggc ggagacagcg cgatggagga ggccaacttc 540ctcaccaagt acggctccaa ggtgtacatc atcgaccgcc gcgacgcctt ccgcgcctcc 600aagatcatgc agcagcgcgc cctctccaac ccgaagatcg acgtcatctg gaactcctcc 660gtggtggagg cctacggcga cggcgagcgc gacgtgctcg gcggcctcaa ggtgaagaac 720gtggtgaccg gcgacgtgtc cgacctcaag gtgtccggcc tcttcttcgc catcggccac 780gagccggcca ccaagttcct cgacggcggc gtggagctgg actccgacgg ctacgtggtg 840accaagccgg gcaccaccca gacctccgtg cctggcgtgt tcgccgccgg cgacgtgcag 900gacaagaagt accgccaggc catcaccgcc gccggcaccg gctgcatggc cgccctcgac 960gccgagcact acctccagga gatcggctcc cagcagggca agtccgacta gatctgagct 1020c 1021<210>25<211>333<212>PRT<213>鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)<400>25Met Asn Gly Leu Glu Thr His Asn Thr Arg Leu Cys Ile Val Gly Ser1 5 10 15Gly Pro Ala Ala His Thr Ala Ala Ile Tyr Ala Ala Arg Ala Glu Leu20 25 30Lys Pro Leu Leu Phe Glu Gly Trp Met Ala Asn Asp Ile Ala Pro Gly35 40 45Gly Gln Leu Thr Thr Thr Thr Asp Val Glu Asn Phe Pro Gly Phe Pro50 55 60Glu Gly Ile Leu Gly Val Glu Leu Thr Asp Lys Phe Arg Lys Gln Ser65 70 75 80Glu Arg Phe Gly Thr Thr Ile Phe Thr Glu Thr Val Thr Lys Val Asp85 90 95Phe Ser Ser Lys Pro Phe Lys Leu Phe Thr Asp Ser Lys Ala Ile Leu100 105 110Ala Asp Ala Val Ile Leu Ala Ile Gly Ala Val Ala Lys Trp Leu Ser115 120 125
Phe Val Gly Ser Gly Glu Val Leu Gly Gly Leu Trp Asn Arg Gly Ile130 135 140Ser Ala Cys Ala Val Cys Asp Gly Ala Ala Pro Ile Phe Arg Asn Lys145 150 155 160Pro Leu Ala Val Ile Gly Gly Gly Asp Ser Ala Met Glu Glu Ala Asn165 170 175Phe Leu Thr Lys Tyr Gly Ser Lys Val Tyr Ile Ile Asp Arg Arg Asp180 185 190Ala Phe Arg Ala Ser Lys Ile Met Gln Gln Arg Ala Leu Ser Asn Pro195 200 205Lys Ile Asp Val Ile Trp Asn Ser Ser Val Val Glu Ala Tyr Gly Asp210 215 220Gly Glu Arg Asp Val Leu Gly Gly Leu Lys Val Lys Asn Val Val Thr225 230 235 240Gly Asp Val Ser Asp Leu Lys Val Ser Gly Leu Phe Phe Ala Ile Gly245 250 255His Glu Pro Ala Thr Lys Phe Leu Asp Gly Gly Val Glu Leu Asp Ser260 265 270Asp Gly Tyr Val Val Thr Lys Pro Gly Thr Thr Gln Thr Ser Val Pro275 280 285Gly Val Phe Ala Ala Gly Asp Val Gln Asp Lys Lys Tyr Arg Gln Ala290 295 300Ile Thr Ala Ala Gly Thr Gly Cys Met Ala Ala Leu Asp Ala Glu His305 310 315 320Tyr Leu Gln Glu Ile Gly Ser Gln Gln Gly Lys Ser Asp325 330<210>26<211>1560<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)
<400>26aytcagatat gttatccaga ttctaaatgt gctatagggg wtaaatgtgt gttcatatgg 60gagatatatc agtttcagtt tttttggaag gtgtttatag gagttmggcg cgttttaaar 120ktgtggtatg catcgtgttg tgarttgttk gtgtgttycy ttaaaaaaaa awttgccatt 180tgtcaattat tgtggaattt ctgcaacttg ttgtccmaag kaaaaggaaa atagtttcgg 240tcaacaactc aacatccatc tgggggtatg accgaccgag cgcggtggcc gttgattggc 300tcgtcgcctc ctcccttctc ggtctgacgg tctgaccagt gccgggtagg aagcgtaatt 360ttgaggagag actccgaccc gcgccgccgc cgccgcagcc aagccatgga gggatccgcc 420ggggcgccgc tccgcacgcg cctgtgcatc atcgggagcg ggccgtcggc gcacacggcg 480gcgatctacg ccgcccgcgc ggagctcaag cccgtgctct tcgagggctg gctcgccaac 540gacatcgcgg cggggggcca gctcaccacc accaccgacg tcgagaactt cccggggttc 600cccgagggga tcctcggcgg cgagctcatg gatcggtgcc gcgcccagtc cctccggttc 660ggcaccagca tcatctccga gaccgtcacc gcggtcgact tctccgcccg ccccttccgc 720gtcgcctccg actccaccac cgtgctcgcc gacgccgtcg tcgtcgccac cggcgccgtc 780gcccggcgac tccacttcgc cggctccgac gcctactgga accgcggcat ctcagcctgc 840gccgtctgcg acggggccgc cccaatcttc aggaacaaac ccatcgccgt catcggcggc 900ggcgactccg ccatggagga gtccaacttc ctcaccaagt acggctccca tgtgtacatc 960atccaccgcc gcaacacctt ccgcgcctcc aagatcatgc aggccagggc gttgtcaaac 1020cccaagatcc aggttttctg ggactctgag gtcgtcgagg cctacggcgg cgagggtgga 1080ggtccattgg ctggtgtcaa ggtgaagaac ttggttactg ggaagatctc cgaccttcag 1140gtgtccggtc tcttcttcgc catcggacat gaaccggcga cgaagtttct cggcgggcag 1200cttgagctcg atgctgatgg gtatgtggcc accaagccag gctccacgca caccagtgtg 1260aagggggtct ttgctgctgg ggatgtgcag gacaagaagt atcgccaggc tattactgcc 1320gctggatcag gtttgtgaat tgatgatttt tcaggttacc tgtgattaat ttttttctgc 1380actttcttag agatcagtcg cttcatgggt tgctatttgc tagtgcgaat tgcaatagaa 1440attgttcagg gcttgagtat gtagtgagcg aatgatgatg gtcaaaatta gaaccttttt 1500aagctatcat agagttaacg tgtttgagtt tctgaaataa gtgctttcat tatgtatcta 1560<210>27<211>310<212>PRT<213>稻(Oryza satiya)<400>27Met Glu Gly Ser Ala Gly Ala Pro Leu Arg Thr Arg Leu Cys Ile Ile1 5 10 15Gly Ser Gly Pro Ser Ala His Thr Ala Ala Ile Tyr Ala Ala Arg Ala20 25 30Glu Leu Lys Pro Val Leu Phe Glu Gly Trp Leu Ala Asn Asp Ile Ala35 40 45Ala Gly Gly Gln Leu Thr Thr Thr Thr Asp Val Glu Asn Phe Pro Gly
50 55 60Phe Pro Glu Gly Ile Leu Gly Gly Glu Leu Met Asp Arg Cys Arg Ala65 70 75 80Gln Ser Leu Arg Phe Gly Thr Ser Ile Ile Ser Glu Thr Val Thr Ala85 90 95Val Asp Phe Ser Ala Arg Pro Phe Arg Val Ala Ser Asp Ser Thr Thr100 105 110Val Leu Ala Asp Ala Val Val Val Ala Thr Gly Ala Val Ala Arg Arg115 120 125Leu His Phe Ala Gly Ser Asp Ala Tyr Trp Asn Arg Gly Ile Ser Ala130 135 140Cys Ala Val Cys Asp Gly Ala Ala Pro Ile Phe Arg Asn Lys Pro Ile145 150 155 160Ala Val Ile Gly Gly Gly Asp Ser Ala Met Glu Glu Ser Asn Phe Leu165 170 175Thr Lys Tyr Gly Ser His Val Tyr Ile Ile His Arg Arg Asn Thr Phe180 185 190Arg Ala Ser Lys Ile Met Gln Ala Arg Ala Leu Ser Asn Pro Lys Ile195 200 205Gln Val Phe Trp Asp Ser Glu Val Val Glu Ala Tyr Gly Gly Glu Gly210 215 220Gly Gly Pro Leu Ala Gly Val Lys Val Lys Asn Leu Val Thr Gly Lys225 230 235 240Ile Ser Asp Leu Gln Val Ser Gly Leu Phe Phe Ala Ile Gly His Glu245 250 255Pro Ala Thr Lys Phe Leu Gly Gly Gln Leu Glu Leu Asp Ala Asp Gly260 265 270Tyr Val Ala Thr Lys Pro Gly Ser Thr His Thr Ser Val Lys Gly Val275 280 285Phe Ala Ala Gly Asp Val Gln Asp Lys Lys Tyr Arg Gln Ala Ile Thr
290 295 300Ala Ala Gly Ser Gly Leu305 310<210>28<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(oligo P9)<400>28gactaagctt acaattatta tatcaaaatg gc 32<210>29<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(oligo P10)<400>29gcttttccca atacgcaatg c 21<210>30<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(oligo P4)<400>30gactagcgct gacagaaact gatgctagga a 31<210>31<211>40<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(oligo P1)<400>31cgtaggatcc accatggctg aagaagaggg tcaggttgtc 40<210>32<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(oligo P2)<400>32cgtagagctc tcaagaagaa gcagcagcag cagat 35<210>33<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(oligo P5)<400>33gactagcgct gaagagggtc aggttgtcg 29<210>34<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(oligo P12)<400>34cagtaggctt aaggaggttg caacgag 27
<210>35<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(oligo P11)<400>35cagtcagctg aagagggtca ggttgtc 27<210>36<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(oligo P27)<400>36ctaggagctc tacatggtgt ccaccagcag30<210>37<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物P28)<400>37gcacggcttg gtggtgaatc c 21<210>38<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物P29)<400>38
ctcattctgg tccatcaatg tc22<210>39<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物P26)<400>39gactgtcgac tcaatcactc ttaccttgct gag33<210>40<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物P31)<400>40gactggatcc aatggtctcg aaactcacaa c 31<210>41<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物thiorodoxubi 1603)<400>41gcggtcgttc attcgttcta 20<210>42<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物thiorodox 2364)<400>42acgtgcttca cgatggtgtt 20
權(quán)利要求
1.在研磨加工法中分離谷物淀粉和蛋白質(zhì)組分的方法，包括(a)在高溫下，在添加的硫氧還蛋白還原酶存在的情況下，浸泡谷物；和(b)分離谷物中的淀粉和蛋白質(zhì)組分，其中硫氧還蛋白還原酶為真核硫氧還蛋白還原酶。
2.權(quán)利要求1的方法，其中谷物包括從表達(dá)硫氧還蛋白還原酶的轉(zhuǎn)基因植物而來的谷物。
3.權(quán)利要求2的方法，其中植物是玉米。
4.含有編碼真核硫氧還蛋白還原酶的異源DNA的轉(zhuǎn)基因植物，其中該異源DNA穩(wěn)定地整合入上述轉(zhuǎn)基因植物的核或質(zhì)體基因組。
5.權(quán)利要求4的植物，其中該植物是玉米或大豆。
6.權(quán)利要求4的植物，其中硫氧還蛋白還原酶包含SEQ ID NO25或SEQ ID NO27。
7.含有真核硫氧還蛋白還原酶的編碼區(qū)的嵌合表達(dá)盒，其中上述編碼區(qū)與能在植物中行使功能的啟動(dòng)子和終止序列有效連接。
8.權(quán)利要求7的嵌合表達(dá)盒，其中硫氧還蛋白還原酶包含SEQID NO25或SEQ ID NO27。
9.一種生產(chǎn)能表達(dá)增加的真核硫氧還蛋白還原酶表達(dá)量的谷物的方法，包括用權(quán)利要求7的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化植物。
10.一種生產(chǎn)能表達(dá)增加的真核硫氧還蛋白還原酶表達(dá)量的谷物的方法，包括用權(quán)利要求8的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化植物。
11.一種生產(chǎn)能表達(dá)增加的硫氧還蛋白還原酶表達(dá)量的谷物的方法，包括用含有異源表達(dá)盒的第二種植物的花粉給含有異源表達(dá)盒的第一種植物授粉，并從如此授粉的植物中回收谷物，其中第一種植物含有的異源表達(dá)盒包含有效連接于編碼真核硫氧還蛋白還原酶的DNA序列上的反式激活蛋白介導(dǎo)的啟動(dòng)子，第二種植物含有的異源表達(dá)盒包含有效連接于編碼反式激活蛋白的DNA序列上的啟動(dòng)子，該反式激活蛋白能調(diào)控上述反式激活蛋白介導(dǎo)的啟動(dòng)子。
12.一種包含SEQ ID NO24或SEQ ID NO26的分離的核酸分子。
13.一種包含在植物中具有活性的啟動(dòng)子的嵌合基因，并且該啟動(dòng)子有效連接于權(quán)利要求12的核酸分子上。
14.含有權(quán)利要求13的嵌合基因的重組載體。
15.含有權(quán)利要求13的嵌合基因的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞，其為轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。
17.含有權(quán)利要求16的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物。
18.權(quán)利要求17的轉(zhuǎn)基因植物，其為玉米或大豆。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的轉(zhuǎn)基因植物的種子，含有權(quán)利要求13中的嵌合基因。
全文摘要
本發(fā)明提供了加工谷物(例如玉米和大豆)的新方法，通過使用硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶來提高淀粉和蛋白質(zhì)的可提取性和回收量。本發(fā)明進(jìn)一步提供了表達(dá)熱穩(wěn)定硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶的新的轉(zhuǎn)基因植物。
文檔編號C12N15/53GK1606627SQ01811532
公開日2005年4月13日 申請日期2001年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月21日
發(fā)明者M·B·拉納翰, N·M·德賽, P·Y·伽斯達(dá)斯卡 申請人:辛根塔參與股份公司