專利名稱：一個鋅指蛋白家族的人類新基因znf328的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鋅指蛋白家族的一個人類新基因ZNF328及其克隆，它在人體各組織和胚胎不同發(fā)育階段的表達，它的遺傳學(xué)定位以及該基因在不同物種間同源基因的同源程度分析，以探索利用該基因進行人類疾病的診斷及治療。
背景技術(shù)：
鋅指蛋白家族一般具有該家族的特征性結(jié)構(gòu)----鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域，是最先在果蠅被確立的、為中樞神經(jīng)系統(tǒng)和肌肉等組織分化所必需的調(diào)控因子(POSTIGO AA，SHEPPARD A M，MUCENSKI M L，et al.EuropeanMolecular Biology Organization ofJournal，1997，16(13)3924-3834)。已知zfh-1基因在早期果蠅胚胎的中胚層以及晚期胚胎的多種中胚層衍生結(jié)構(gòu)中表達，其中包括背側(cè)內(nèi)臟、性腺支持細胞和成肌細胞等；此外還主要在發(fā)育時的中樞神經(jīng)系統(tǒng)運動神經(jīng)元中表達。研究表明，Zfh-1蛋白是果蠅中調(diào)節(jié)肌細胞和性腺細胞分化的轉(zhuǎn)錄抑制因子；zfh-1基因參與調(diào)節(jié)果蠅的尾部中胚層(CVM)的早期分化；參與調(diào)節(jié)eve基因的表達，控制心臟前體細胞(EPC)的形成；還與tinman基因一同調(diào)節(jié)包括性腺中胚層在內(nèi)的外側(cè)中胚層的進一步分化(LAI Z C，F(xiàn)ORTONI M E，RUBIN C M et al，Mechanism of Development，1991，34(1-2)123-124；POSTIGO AA，DEAN D C.Proceeding National AcademicScience USA.2000，1997(12)6391-6396；KUSCH T，REUTER R.Development，1999，126(18)3991-4003；SU M T，F(xiàn)UJIOKA M，GOTO T，et al，Development，1999，126(14)3241-3251)。
脊椎動物中的zfh同源基因也有相似的功能。如ZEB基因的表達產(chǎn)物ZEB-1和ZEB-2蛋白，在包括肌肉、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、T淋巴細胞等組織中均有表達，而最近發(fā)現(xiàn)ZEB蛋白包含兩個獨立的區(qū)域，分別調(diào)節(jié)哺乳動物肌細胞和淋巴細胞的分化(POSTIGO AA，DEAN D C Development，1999，19(12)7961-7971)。小鼠的zfp-35基因則是精子發(fā)生中粗線期精母細胞發(fā)育的上游調(diào)節(jié)基因(CUNLIFFE V，KOOPMAN P，MCLAREN A et al，EuropeanMolecular Biology Organization of Joural，1990，9(1)197-205)。而人類鋅指基因ZNF家族已被發(fā)現(xiàn)參與調(diào)節(jié)某些腫瘤的形成(OGURI T，KATOHO，TAKAHASHI T et al，Gene，1998，222(1)61-67.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用果蠅zfh-1的cDNA序列，檢索基因組序列數(shù)據(jù)庫而得到該cDNA的各種人類同源序列所編碼的氨基酸序列，在其中發(fā)現(xiàn)了一個新的蛋白質(zhì)，得到ZNF328基因的部分cDNA序列，并以該序列克隆ZNF328全長cDNA。
本發(fā)明以胎盤組織的cDNA為模板，利用部分cDNA序列設(shè)計引物，PCR擴增得到該基因開放閱讀框序列，經(jīng)T載體克隆并測序，測序結(jié)果證明其與計算機檢索獲得的部分cDNA序列完全吻合。以從T載體酶切下的開放閱讀框片段為探針，進行Northern雜交，結(jié)果表明該基因全長mRNA約為2.4kb，且在腦組織中有較強的表達。利用獲得的開放閱讀框序列設(shè)計引物，采用TakaRa公司的5’端RACE試劑盒，以腦組織mRNA為模板，做5’端RACE獲得該基因5’端序列。以胎盤組織cDNA為模板，利用獲得的5’端序列設(shè)計5’端引物，利用數(shù)據(jù)庫檢索得到的3’端同源EST序列設(shè)計3’端引物，PCR擴增得到ZNF328全長cDNA，T載體克隆并測序。(

圖1)。該基因cDNA全長2467bp，其中5’端非翻譯區(qū)為430bp，編碼區(qū)為789bp，編碼262個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，3’端非翻譯區(qū)為1248bp(圖2)；其近5’端有一個起始密碼子ATG，近3’端有一個終止密碼子TGA以及末端的加尾信號ATAAA。
進行18周，19周，21周，25周，26周的人體胚胎各種組織總RNA膜的Northern雜交分析，結(jié)果表明該基因在人體不同發(fā)育時期均有廣泛表達(圖3)。其中在18周時，大腦中表達最強，肝，腎上腺，肺次之，在小腦，肌肉，胃，脾也有一定表達，而在腸，心臟和舌中則幾乎沒有表達。在19周，大腦，小腦中有較強表達，肝中次之，在腎，肺，肌肉中也有一定表達，而在腸和心臟中則幾乎沒有表達。在21周，在大腦，小腦，肺，胃組織中表達較強，肝，腎上腺，腎，肌肉次之，在腸和心臟則幾乎沒有表達。在25周時，大腦，小腦，腎，腎上腺，腸中表達較強，肝，肌肉中次之，在心，舌，胃則幾乎沒有表達。在26周時，在大腦，肺，肌肉，腎，腸中表達較強，胃，舌，心臟次之，而在腎上腺和肝中則幾乎沒有表達。綜合各時期的表達情況可見該基因在不同發(fā)育時期的腦組織中均有表達，且表達較強；在肝組織中表達也一直較強，但在26周無表達；在肺，腸，肌肉和舌中，隨著胚胎發(fā)育時期的增長，其表達是不斷增強的；在腎及胃中，表達較為特殊，呈波浪性表達。用免疫系統(tǒng)的6種組織的mRNA膜進行Northern雜交分析，結(jié)果表明該基因在胎兒肝及脾有強烈表達，在胸腺，骨髓中都有較強表達，而在外周血細胞和淋巴結(jié)中表達則相對較弱(圖4)。
用該基因編碼的蛋白質(zhì)檢索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)其與人類ZNF135，狗bc3，大鼠pMLZ-4，小鼠rKr1及果蠅crol基因均有較高的同源性，其同源度分別為62％，61％，61％，60％，40％(圖5)。已知人類鋅指蛋白是參與正常和異常的細胞增殖與分化的(OGURI T，KATOHO，TAKAHASHI T etal，Gene，1998，222(1)61-67.)，已有一部分人類鋅指蛋白家族的基因被確定為侯選疾病基因，它們是ZNF132，ZNF133，ZNF134，ZNF135，ZNF137，ZNF138，ZNF139，ZNF143，ZNF148，ZNF151，ZNF154和ZNF155。而其中ZNF135為甲狀腺瘤疾病候選基因(Tommerup N，Vissing H，Genomics 1995 May20；27(2)259-264.)。依據(jù)ZNF328為鋅指蛋白家族成員及基因的同源同功原理，并結(jié)合其在人體中的表達情況，顯示該基因亦為人類疾病候選基因。
以該基因全長cDNA檢索核酸數(shù)據(jù)庫nr及htgs，將該基因定位于BACCTD-2368P22上，該BAC位于染色體19q13區(qū)段，故該基因定位在染色體19q13區(qū)段。進一步檢索，將該基因定位于遺傳學(xué)圖標(biāo)記SG50955/SG45544位點上。已知在甲狀腺瘤病人中，染色體19q13區(qū)段的微缺失是極為常見的(Tommerup N，Vissing H，Genomics 1995 May 20；27(2)259-264.)，從而提示ZNF328可能也是該病的致病基因。
本發(fā)明的優(yōu)點1、提供了一個人類新基因ZNF328基因的全長cDNA序列，并描述了其編碼的蛋白產(chǎn)物在不同物種間同源基因結(jié)構(gòu)域的同源程度，證明了該基因是鋅指蛋白基因家族成員之一。
2、該基因編碼的蛋白產(chǎn)物為鋅指蛋白，是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，有可能成為基因工程的產(chǎn)物。
3、該基因在不同時期的人組織中廣泛表達，顯示該基因在細胞中具有重要的功能，而其在免疫系統(tǒng)的強烈表達，則提示其與人類免疫反應(yīng)密切相關(guān)。
4、該基因位于人類染色體的19q13區(qū)段，而19q13的微缺失是甲狀腺瘤普遍的致病原因，提示該基因可能是甲狀腺瘤的致病基因。
本發(fā)明通過以下附圖和實施例作進一步闡述，但并不限制本發(fā)明的范圍。
圖1.ZNF328的cDNA序列圖2.ZNF328的編碼蛋白圖3.在人體胚胎不同發(fā)育階段的Northem雜交圖3a 18周胚胎圖中1肝 2腸 3腎上腺 4心臟 5肺6舌 7大腦8小腦 9腎 10肌肉 11胃 12脾圖3b 19周胚胎圖中1肌肉 2大腦 3腸 4小腦 5腎 6肝 7心臟 8肺圖3c 21周胚胎圖中1肝 2腸 3腎上腺 4心臟 5肺 6大腦7小腦 8腎 9肌肉 10胃圖3d 25周胚胎圖中1肝 2腸 3腎上腺 4心臟 5肺 6舌7大腦 8小腦 9腎 10肌肉 11胃圖3e 26周胚胎圖中1胃 2肌肉 3腎 4大腦 5舌 6肺 7心臟8腎上腺 9腸 10肝圖4.在人體免疫系統(tǒng)組織的Northern雜交1脾 2淋巴結(jié) 3胸腺 4外周血 5骨髓 6胎兒肝圖5.ZNF328編碼的蛋白在不同物種間的同源性比較實施例1 ZNF328全長cDNA的克隆和測序1、ZNF328開放閱讀框的克隆以胎盤組織的cDNA為模板，利用部分cDNA序列設(shè)計引物，PCR擴增得到該基因開放閱讀框序列，經(jīng)T載體克隆并測序。
引物序列W1S5-CAT ATG AGA ATG CAT ACT GGA GA-3W1AS5-TTC AAT TCA GTT TCT CTT CAC TGT-32、利用TakaRa公司的5’端RACE試劑盒做ZNF328基因的5’端RACE，以開放閱讀框序列設(shè)計RACE引物5’端磷酸化RT primer5-XCTC CGA TGA GCA ACA AGG-3primer A15-CAG ATG GCT CAC CTT G-3primer S15-GTT TAG TGA GGG CTG A-3primer A25-CCT TGT TGC TCA TCG G-3primer S25-TGC TTT GCC ACA TTC C-3上述引物均由上海生工公司合成。
利用TakaRa公司的5’端RACE試劑盒做5’端RACE的具體操作按該公司protocol進行。本實驗中取大腦組織mRNA 5ug為模板。
將RACE產(chǎn)物克隆入Topo ta cloning載體(由Invitroten公司提供)并測序獲得ZNF3285’端序列。
3、ZNF328全長cDNA的克隆以胎盤組織的cDNA為模板，利用5’端RACE獲得的5’端序列設(shè)計5’引物，利用數(shù)據(jù)庫檢索得到的3’端同源EST序列設(shè)計3’端引物，PCR擴增得到ZNF328全長cDNA，T載體克隆并測序(圖1)。該基因cDNA全長2467bp，其中5’端非翻譯區(qū)為430bp，編碼區(qū)為789bp，編碼262個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，3’端非翻譯區(qū)為1248bp(圖2)，其近5’端有一個起始密碼子ATG，近3’端有一個終止密碼子TGA以及末端的加尾信號ATAAA。
引物序列5’端引物(W2S)5-TAC TCA ACA TAC AAG CAC TTA CAC-33’端引物(W2AS)5-GAC AGA GAA ACC AGG TAA CT-3實施例2 Northern雜交1組織總RNA的提取(按王雁云等，一種快速的總RNA提取方法，生命科學(xué)研究，5(1)88-90(2001)進行)。
2總RNA的電泳及轉(zhuǎn)膜，均按《現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗技術(shù)》介紹的方法進行(盧圣棟主編，第二版)。
3Northern雜交將固定有人各種組織的總RNA的尼龍膜，放在雜交袋中，加入變性10ml68℃預(yù)熱的快速雜交液(Clontech公司)，68℃預(yù)雜交的30分鐘，加入變性的同位素標(biāo)記的ZNF328的開放閱讀框789bp的片段，42℃雜交過夜。2XSSC，0.05％SDS洗膜，42℃洗兩次，15分鐘/次。0.1XSSC，0.1％SDS 42℃洗兩次，15分鐘/次。
4.-80℃曝光12小時，洗出X光片即得圖3.4。
權(quán)利要求
1.一個鋅指蛋白家族的人類新基因ZNF328，其特征在于該人類新基因ZNF328的cDNA核苷酸序列與氨基酸序列如下＞znf328cDNA1T2 ACT CAA CAT ACA AGC ACT TAC ACT GCA GAG AAA CCC TAT GAC TAC 4647 AAT GAA TGT GGG ACG TCT TTC ATC TGG AGC TCT TAC CTT ATT CAA 9192 CAT AAG AAA ACT CAT ACT GGA GAA AAA CCC TAT GAA TGT GAT AAA 136137TGT GGA AAA GTT TTT AGG AAT CGC TCA GCC CTT ACG AAA CAT GAA 181182CGG ACT CAC ACT GGA ATA AAA CCC TAT GAA TGT AAT AAA TGT GGA 226227AAA GCC TTC AGC TGG AAT TCT CAT CTT ATT GTA CAT AAG AGA ATT 271272CAT ACA GGA GAA AAA CCT TAT GTT TGT AAT GAG TGT GGG AAA TCT 316317TTC AAC TGG AAC TCT CAT CTT ATT GGA CAT CAG AGG ACT CAT ACA 361362GGA GAG AAA CCT TTT GAA TGT ACT GAA TGT GGG AAA TCA TTC AGC 406407TGG AGC TCC CAT CTT ATT GCC CAT ATG AGA ATG CAT ACT GGA GAG 451452AAA CCC TTT AAA TGT GAT GAA TGT GAA AAA GCT TTT AGG GAC TAC 496497TCA GCC CTT AGT AAA CAT GAA AGA ACT CAT TCT GGA GCA AAA CCA 541542TAT AAA TGT ACT GAA TGT GGA AAA TCC TTC AGC TGG AGC TCC CAT 586587CTT ATT GCC CAT CAG AGA ACT CAC ACG GGA GAG AAA CCA TAT AAC 631632TGT CAG GAA TGT GGC AAA GCA TTC AGA GAA CGC TCA GCC CTC ACT 676677AAA CAT GAG ATA ATT CAT TCT GGA ATT AAG CCC TAT GAA TGT AAT 721722AAA TGT GGA AAA TCC TGT AGC CAG ATG GCT CAC CTT GTT AGA CAT 766續(xù)后767CAA AGG ACT CAT ACT GGA GAA AAA CCC TAT GAA TGC AAT AAA TGT811812GGA AAA TCC TTC AGT CAG AGC TGT CAC CTT GTT GCT CAT CGG AGA856857ATT CAC ACT GGT GAG AAA CCC TAT AAA TGT AAT CAG TGT GAA AGA901902TCC TTT AAC TGT AGT TCT CAC CTC ATT GCA CAC CGG AGA ACT CAT946947ACT GGA GAG AAA CCA TAC AGG TGT AAT GAA TGT GGG AAA GCA TTT991992AAT GAG AGT TCA TCC CTT ATT GTA CAC CTA AGA AAC CAT ACT GGA10361037 GAA AAG CCC TAC AAA TGT AAT CAT TGT GAA AAA GCA TTT TGT AAG10811082 AAT TCT TCC CTT ATT ATT CAT CAG AGA ATG CAT AGT GGA GAG AAA11261127 CGC TTT ATA TGC AGT GAA TGT GGA AAA GCC TTT AGT GGT CAC TCA11711172 GCC CTA CTT CAA CAC CAG AGA AAT CAC AGT GAA GAG AAA CTG AAT12161217 TGA ATT TAT GCG AGT TTT TCG TTT CTT GTA CAT TTG ACA ACA CAT12611262 TGA GGA AAA CCC TAT AAA CAT AAT CAA GAG GGG ACA TTT TTC ATT13061307 AAG AGT TCA GTA AGA CTT CTC CCA CAT TAT TTA CTA GAA AAT ATC13511352 ATC TTA GAA GAA ACC CCA TGA AGG AAA AGA ATA GGG AAA AGC TTT13961397 CAG CAG TTA TTT AGC CCT TAC TCA AAA TCA GAT AAT TAA CAA TGA14411442 AGG AAA CTC TAA ACT CCC CTT ATG GTC TAC CAG TAA TTC ATA CTT14861487 GAG GAC CAT GAC TGC GGG GAA TGA GGC ATC TTT TAG CAA GAG CTC15311532 TCA CCA ATT GTA GAT TGG TGT GAA TTG CTA AGG GAA AAA CCT TAT15761577 GCA GAG AAA AGT TTT TGA CTG GAA ATA CAC TGT TTT GCA TCA AGC16211622 TGG AGT ACT GGA TGG AAA ACT CTA CAA TAA CAT TTT GTG CAT AAT16661667 TGT AGA AAT ACA GAT TTT GTT GTT ATA AGG GGA GGG TCT GGG TGC17111712 CCA GGA GTA GAA TAT GAA GTG CTA AAT CTG AAT GTA AGA AAA ATA17561757 ATA GTA TTG AAT GGG GTA TTT ACT GTT GAT TAA CCT CCT TAG AGA1801續(xù)后1802 AAA TTA ATG AAT GAG ATG ACT AAC GGT AGA AAA GTT ATT GCC TAG 18461847 GAG TGT GAG ACT GAT GTT GCT GGA CAG AAA GTG ATC CTT AGC CCA 18911892 GTG TGT CAG CGT CCA TTG TTA CTC ATC ACT GCA TTG TTG GGC AAT 19361937 TAG TTT GTA ATT TGT TTT AGG CAA TCA CTA TAA ATT ATA ATT ATG 19811982 GAC ACT GCA TCA GTA TAC ATA ACA TGA AGG AAT AAA AAG GAT ACA 20262027 GAA TTG TAT ATA CAT ACT TAC TGT AAC ACA TCT AAA AAA ATG TAT 20712072 ATG GGT AAG GAC CTG AAA GAT CCA TGG AAA AGT TAA CCC AGT TGA 21162117 GAT TTT TAA AAA GTT TTA CAA ATA CAT ATA ACA CTT ATG TGC TGG 21612162 GCT TTC TTT TAA ATG CTT TCC AAG TGT TAA CTT GTT TAG TCC CCT 22062207 TTA CTC TGA GAT AGG TAC TGT TAC CCC AGT TTT ACA AAT GGC TAA 22512252 GCT GAA GCA GAG ATG TTG AAG GAT CCT ACC TAA GGG GCA CAA CTA 22962297 GTA AGG GAG TAG AGC TGA GAT TGG CTC CAG AGT TCT TGT TTT CAG 23412342 CCA CCA TTT TAT GCT GCC TCT CCA GTG ATT TTT TTT CCC ATT TTC 23862387 TTC AGT GTT TCT ATA GCA GAG ATT TGA TAA TAA AAA GAA AAT CCT 24312432 AAA CAA TGA GAA ATA AAG TTA CCT GGT TTC TCT GTC 2467ZNF328編碼的蛋白質(zhì)1 MRMHTGEKPF KCDECEKAFR DYSALSKHER THSGAKPYKC TECGKSFSWS51 SHLIAHQRTH TGEKPYNCQE CGKAFRERSA LTKHEIIHSG IKPYECNKCG101 KSCSQMAHLV RHQRTHTGEK PYECNKCGKS FSQSCHLVAH RRIHTGEKPY151 KCNQCERSFN CSSHLIAHRR THTGEKPYRC NECGKAFNES SSLIVHLRNH201 TGEKPYKCNH CEKAFCKNSS LIIHQRMHSG EKRFICSECG KAFSGHSALL251 QHQRNHSEEK LN
全文摘要
本發(fā)明涉及鋅指蛋白家族人類基因。本發(fā)明的一個鋅指蛋白家族的人類新基因ZNF328,它的cDNA全長2467bp,編碼262個氨基酸的蛋白質(zhì)。該基因在人體不同發(fā)育時期均有廣泛表達,該基因定位在染色體19q13區(qū)段。
文檔編號C12N15/12GK1341716SQ0112868
公開日2002年3月27日 申請日期2001年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月17日
發(fā)明者吳秀山, 袁婺洲, 汪神球, 朱傳炳, 王躍群, 李永清, 戴琦, 曾偉奇, 羅開梅 申請人:湖南師范大學(xué)