專利名稱：高活性纖維素酶組合物及其制備方法
技術領域：
本實用新型涉及一種酶，尤其是利用遺傳工程技術得到的纖維素酶組合物。
背景技術：
纖維素酶已大量用于紡織、釀酒、飼料、中藥提取和果汁生產等行業(yè)。Wood等在《酶學方法》(Methodsin Enzymology)，160,25,234頁(1986)中公開了完整的真菌纖維素酶系統(tǒng)包括幾個不同的酶種類，包括那些被鑒定為外切纖維二糖水解酶(EC3.2.1.91)(“CBH”)，內切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)(“EG”)和β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)(“BG”)的酶。CBH、EG和BG真菌纖維素酶分類可進一步擴展到包括每種類型之中的多重成份，已從多種真菌資源中分離到CBH和EG?，F有的生產纖維素酶的菌種多為綠色木霉菌，這些菌種通過化學與物理誘變然后篩選而得到，綠色木霉菌雖然能在大罐生產時分泌10-20克/升蛋白質，而且大部分為纖維素酶，但由于綠色木霉本身產的酶特異活性較低，一般在200,000國際單位/升(余曉斌，2000，ChinaEnzyme)。厭氧真菌是近二十年來從草食動物胃腸道分離出來的新型微生物菌種，大部分具有分泌植物細胞壁降解的酶活性，而且這些酶的特異活性特別高(Wood et al.1986)。單位重量的酶對纖維素降解的能力比綠色木霉產的酶高出許多倍(Gilbert et al.1992)，但厭氧真菌生長速度慢，不適合于工業(yè)化生產。一種有效的方法為將厭氧真菌編碼纖維素酶的基因轉入綠色木霉，這樣既能分泌大量酶，而且這些酶的活性高，例如厭氧真菌Orpinomyces的Cellulase B(CelB)(Lietal，1997)的特異酶活性為220,000國際單位/克，比綠色木霉的酶的特異活性高出十倍以上。如何將高特異活性的厭氧真菌的CelB基因轉入綠色木霉生產菌中，從而提高纖維酶素的產量，達到400,000-1200,000國際單位/升，而β-葡聚糖酶活性可達到1000,000-3000,000國際單位，是本領域需解決的技術難題。酶制劑的生產關鍵技術為大罐發(fā)酵液每升的活性單位，單位體積生產的活性水平直接制約生產成本，能耗及能否用于工農業(yè)的各種領域。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的為提高纖維素酶的活性產量，生產出一種活性高、能廣泛應用于上述行業(yè)的產品。其原理是將編碼高特異活性的纖維素酶Cellulase B基因用轉基因方法植入現有生產菌珠HypocreaiecorinaMGG80，同時通過重組DNA技術，將生產菌珠在生產條件下受到誘導的啟動子(Promoter)加入該基因位點，從而指導植入基因的高效表達，獲得一種新的纖維素酶組合物。
本發(fā)明采用基因重組技術制造出一種高活性纖維素酶組合物，其特征在于它是由下述重量百分比的纖維素酶構成由木霉菌株產生的纖維素酶CBH I 30～40％、CBH II 10～25％、EG I 10～15％、EG II 6～10％、EG III 1～4％、EG IV 0.5～2％、EG V 0.5～1.0％，和厭氧真菌產生的纖維素酶CelB10～30％，其中，CelB基因為CBH I基因的啟動子和終止信號(Terminater)，分泌信號(Secretion Signal)是CBHI編碼的前28個氨基酸編碼。
所述CBHI編碼的前28個氨基酸詳細編碼為MYRKLAVISAFLATARAQSACTLQSETH。
高活性纖維素酶組合物的制備方法，是采用DNA重組技術，包括質粒的構建、里氏木霉菌的轉化、高產菌株的篩選、菌種發(fā)酵表達，其特征在于(1)質粒的構建里氏木霉的DNA用Easy-DNA試劑提取，用HindIII限制性內切酶作為部分水解，然后裝入用同樣酶水解后的PUC18質粒中，用T4連接酶(T4 ligase)連接里氏木霉(T·reesei)和PUC18的DNA片斷，連接后的樣品用來轉化大腸桿菌(E·coli)，轉化后的樣品均勻地接種在含50微克/克的固體LB培養(yǎng)基上進行菌落篩選；通過篩選，十二個含CBHI基因的菌落被選出，它們所含的質粒DNA被分離出來，然后進行DNA序列測定；CBH I基因5′端1500個堿基對，和3′的1000個堿基對用聚合酶鏈反應〔Polymerase Chain Reactions(PCR)]進行放大，重新裝入PUC18質粒中，5′端片斷除含啟動子部分外，還含有編碼CBHI的前28個氨基酸的序列，而且5′端和3′接合處加入幾種限制性內切酶位點，厭氧真菌的CelB基因也是通過PCR進行放大，只包括編碼對羥甲基纖維素CMC有活性的中間部分氨基酸的區(qū)間，同時加入了限制性內切酶的位點，以便順利嵌入CBH I基因5′和3′端的接合處；(2)里氏木霉的轉化里氏木霉的轉化采用Penttila的方法，在雙層瓊脂糖培養(yǎng)基上，獲得大約120個轉化菌落，對轉化菌落進行了選擇和非選擇培養(yǎng)交替培養(yǎng)三次，再從每個初級轉化菌落中任意分離兩個單個菌落，接種于土豆瓊脂培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)5天，記錄每株菌種生長速度；(3)高產菌株的篩選在上述菌株中挑選生長速度快、形態(tài)與轉化前接近的菌珠，在無菌條件下取出大約一平方厘米的菌絲體，用于接種50毫升的纖維素酶誘導液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)瓶用棉塞封口，接種后于28℃的搖床培養(yǎng)5天，培養(yǎng)結束后，將菌絲體和殘留纖維素用離心去掉，得上清液，取上清液測酶活性，對上清液活性比同樣條件下未轉化菌株高出1.5倍的菌株進行進一步分離培養(yǎng)；(4)菌種發(fā)酵表達通過上述基因工程所獲得高產菌種，以微晶纖維素作為主要碳源和誘導底物，于28℃、PH4.6-4.8、溶氧20％以上條件三級發(fā)酵，即可得到高活性纖維素酶組合物的發(fā)酵液，其產量可達到300,000-500,000國際單位/升。
獲得的高活性纖維素酶發(fā)酵液，經板框過濾，得澄明濾液，經0.4um微膜過濾后再經孔徑為10000道爾頓超濾膜超濾濃縮3-8倍，得不同活性單位濃縮液后，按蔗糖20％、苯甲酸鈉0.2％、山梨酸鉀0.2％的比例，檢測合格后按規(guī)格分裝即可。
在同等條件下發(fā)酵，本發(fā)明的纖維素酶活性提高1-5倍，達到400,000-1200,000國際單位/升，產品價格較國外進口同類品種下降33％以上，且產品質量穩(wěn)定，使用效果良好，通過此種方法獲得的產品因其質優(yōu)價廉，可廣泛應用于紡織、釀酒、食品、飲料、醫(yī)藥、石油開采和飼料行業(yè)，產生巨大的經濟、社會效益，提升這些行業(yè)的產業(yè)水平。


圖1是本發(fā)明的重組基因設計示意圖。
1—CBHI的啟動子(CBHI Promoter)2—厭氧真菌的CelB基因(0rpinomyces CelB Gene)3—CBHI的終止信號(CBHI Terminater)4—質粒序列(Plasmid Sequence)5—CBHI的分泌信號(CBHI Secretion Signal)具體實施方式
實施例1如圖1所示，含有圖1的質粒通過對里氏木霉的轉化(Transformation)和篩選，獲得帶有圖1所示遺傳信息的菌株，然后用于生產所得產品中保留原生產菌株所產的和加入新來源基因所產的幾種纖維素酶，重新組合的產品為復合酶，具體組份為H.iecorina產生的CBHI36％、CBHII20％、EGI12％、EGII8％、EGIII2％、EGIV1％、EGV1％和厭氧真菌產生的CelB20％，各組分之間有協(xié)同促進作用，新加入的CelB基因中為CBHI基因的啟動子和終止信號，分泌信號是CBHI編碼的前28個氨基酸編碼。
其制備方法，是采用DNA重組技術，包括質粒的構建、里氏木霉菌的轉化、高產菌株的篩選、菌種發(fā)酵表達和產品提取等步驟。具體分別為(1)質粒的構建里氏木霉QM9414的DNA用美國Invitrogen公司的Easy-DNA試劑提取，用HindIII限制性內切酶作為部分水解，然后裝入用同樣酶水解后的PUC18質粒中，用T4Ligase連接T·reesei和PUC18的DNA片斷，連接后的樣品用來轉化大腸桿菌(E·coli)，轉化后的樣品均勻地接種在含50微克/克的固體LB培養(yǎng)基上進行菌落篩選；用于篩選的探針為T.reesei的DNA片斷(Shoemaker et al.1983)。通過篩選，十二個含CBHI基因的菌落被選出，它們所含的質粒DNA被分離出來，然后進行DNA序列測定，總共測定了大約600個堿基對，而且正反鏈的序列都進行了測定；CBH I基因5′端1500個堿基對，和3′的1000個堿基對用Polymerase ChainReactions(PCR)進行放大，重新裝入PUC18質粒中，5′端片斷除含啟動子部分外，還含有編碼CBHI的前28個氨基酸的序列，而且5′端和3′接合處加入幾種限制性內切酶位點。兩種片斷裝入PUC18后，進行DNA測序，以排除在PCR放大時引入突變的可能。厭氧真菌的CelB基因也是通過PCR進行放大，只包括編碼對CMC有活性的中間部分氨基酸的區(qū)間，同時加入了限制性內切酶的位點，以便順利嵌入CBH I基因5′和3′端的接合處。嵌入CelB基因后的質粒也進行了測序。
(2)里氏木霉的轉化里氏木霉的轉化采用Penttila等(1987)的方法。為了便于選擇嵌合了PUC18片斷的菌落，含有Aspergillusnidulans的乙酰胺酶(acetamidase)基因的PUC18作為一種co-transfomation的質粒(Penttila等，1987)。轉化的方法請參照Penttila等(1987)。在雙層瓊脂糖培養(yǎng)基上，獲得大約120個轉化菌落，對轉化菌落進行了選擇和非選擇培養(yǎng)交替培養(yǎng)三次，再從每個初級轉化菌落中任意分離兩個單個菌落，接種于土豆瓊脂培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)5天，記錄每株菌種生長速度；(3)高產菌株的篩選在上述菌株中挑選生長速度快、形態(tài)與轉化前接近的菌珠，在無菌條件下取出大約一平方厘米的菌絲體，用于接種50毫升的纖維素酶誘導液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)瓶為250毫升三角瓶，用棉塞封口，接種后于28℃的搖床培養(yǎng)5天，培養(yǎng)結束后，將菌絲體和殘留纖維素用離心去掉(5000rpm，15min)，取上清液測酶活性(1％CMC，50℃，PH4.8)，對上清液活性比同樣條件下未轉化菌株高出1.5倍的菌株進行進一步分離培養(yǎng)；(4)菌種發(fā)酵表達通過上述基因工程所獲得高產菌種，以微晶纖維素作為主要碳源和誘導底物，于28℃、PH4.6-4.8、溶氧20％以上條件三級發(fā)酵，即可得到高活性纖維素酶組合物的發(fā)酵液，其產量可達到300,000-500,000國際單位/升。
(5)產品提取取上述發(fā)酵液，經板框過濾，得澄明濾液，經0.4um微膜過濾后再經孔徑為10000道爾頓超濾膜超濾濃縮3-8倍，得不同活性單位濃縮液后，按蔗糖20％、苯甲酸鈉0.2％、山梨酸鉀0.2％的比例，檢測合格后按規(guī)格分裝即可。
權利要求
1.一種高活性纖維素酶組合物，其特征在于它是由下述重量百分比的纖維素酶構成由木霉菌株產生的纖維素酶CBH I 30～40％、CBH II 10～25％、EG I 10～15％、EG II 6～10％、EG III 1～4％、EGIV0.5～2％、EGV0.5～1.0％，和厭氧真菌產生的纖維素酶CelB10～30％，其中，CelB基因為CBH I基因的啟動子和終止信號(Terminater)，分泌信號(Secretion Signal)是CBHI編碼的前28個氨基酸編碼。
2.權利要求1的纖維素酶組合物的制備方法，是采用DNA重組技術，包括質粒的構建、里氏木霉菌的轉化、高產菌株的篩選、菌種發(fā)酵表達，其特征在于(1)質粒的構建里氏木霉的DNA用Easy-DNA試劑提取，用HindIII限制性內切酶作部分水解，然后裝入用同樣酶水解后的PUC18質粒中，用T4Ligase連接T·reesei和PUC18的DNA片斷，連接后的樣品用來轉化大腸桿菌(E·coli)，轉化后的樣品均勻地接種在含50微克/克的固體LB培養(yǎng)基上進行菌落篩選；通過篩選，十二個含CBHI基因的菌落被選出，它們所含的質粒DNA被分離出來，然后進行DNA序列測定；CBH I基因5′端1500個堿基對，和3′的1000個堿基對用聚合酶鏈反應Polymerase Chain Reactions(PCR)進行放大，重新裝入PUC18質粒中，5′端片斷除含啟動子部分外，還含有編碼CBHI的前28個氨基酸的序列，而且5′端和3′接合處加入幾種限制性內切酶位點，厭氧真菌的CelB基因也是通過PCR進行放大，只包括編碼對CMC有活性的中間部分氨基酸的區(qū)間，同時加入了限制性內切酶的位點，以便順利嵌入CBH I基因5′和3′端的接合處；(2)里氏木霉的轉化里氏木霉的轉化采用Penttila的方法，在雙層瓊脂糖培養(yǎng)基上，獲得大約120個轉化菌落，對轉化菌落進行了選擇和非選擇培養(yǎng)交替培養(yǎng)三次，再從每個初級轉化菌落中任意分離兩個單個菌落，接種于土豆瓊脂培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)5天，記錄每株菌種生長速度；(3)高產菌株的篩選在上述菌株中挑選生長速度快、形態(tài)與轉化前接近的菌珠，在無菌條件下取出大約一平方厘米的菌絲體，用于接種50毫升的纖維素酶誘導液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)瓶用棉塞封口，接種后于28℃的搖床培養(yǎng)5天，培養(yǎng)結束后，將菌絲體和殘留纖維素用離心去掉，取上清液測酶活性，對上清液活性比同樣條件下未轉化菌株高出1.5倍的菌株進行進一步分離培養(yǎng)；(4)菌種發(fā)酵表達通過上述基因工程所獲得高產菌種，以微晶纖維素作為主要碳源和誘導底物，于28℃、PH4.6-4.8、溶氧20％以上條件三級發(fā)酵，即可得到高活性纖維素酶組合物的發(fā)酵液，其產量可達到300,000-500,000國際單位/升。
3.根據權利要求2所述的纖維素酶組合物的制備方法，其特征在于取發(fā)酵液，經板框過濾，得澄明濾液，經0.4um微膜過濾后再經孔徑為10000道爾頓超濾膜超濾濃縮3-8倍，得不同活性單位濃縮液后，按蔗糖20％、苯甲酸鈉0.2％、山梨酸鉀0.2％的比例先后加入蔗糖、苯甲酸鈉、山梨酸鉀，檢測合格后按規(guī)格分裝即可。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高活性纖維素酶組合物及其制備方法,它是由下述重量百分比的纖維素酶構成:CBHI 30～40%、CBHII 10～25%、EGI 10～15%、EGII 6～10%、EGIII 1～4%、EGIV 0.5～2%、EGV 0.5～1.0%,Ce1B 10～30%,其中,Ce1B基因為CBHI基因的啟動子和終止信號,分泌信號是CBHI編碼的前28個氨基酸編碼。其制備方法是采用DNA重組技術,包括質粒的構建、里氏木霉菌的轉化、高產菌株的篩選、菌種發(fā)酵表達等。本發(fā)明在同等條件下發(fā)酵,纖維素酶活性提高1—5倍達到400,000—1200,000國際單位/升,產品價格較國外進口同類品種下降33%以上,且產品質量穩(wěn)定,使用效果良好,可廣泛應用于紡織、釀酒、食品、飲料、醫(yī)藥、石油開采和飼料行業(yè)。
文檔編號C12N15/56GK1335395SQ01128578
公開日2002年2月13日 申請日期2001年9月4日 優(yōu)先權日2001年9月4日
發(fā)明者李新良, 羅永清, 沈建新 申請人:湖南尤特爾生化有限公司