專利名稱：兩種酵母菌株及其用于制備光學(xué)純2－芳基丙酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酵母菌株和采用微生物制備光學(xué)純2-芳基丙酸的方法。
背景技術(shù)：
2-芳基丙酸(可用通式表示為Ar-C*H(CH3)-COOH，其中Ar表示含芳環(huán)的取代基，C*表示手性碳原子)，是一類非常重要的手性化合物，在醫(yī)藥和農(nóng)藥等領(lǐng)域具有十分廣泛的用途。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，2-芳基丙酸的兩種對映異構(gòu)體在生物活性上存在著明顯的差異。以酮基布洛芬[2-(3-苯甲酰苯基)-丙酸]為例，其(S)-對映體是一種高效的非甾體抗炎劑，抗炎活性比(R)對映體高100倍以上，而(R)-酮基布洛芬則具有鎮(zhèn)痛及防治骨質(zhì)疏松的作用。在其它的2-芳基丙酸類非甾體抗炎藥(如萘普生、布洛芬、芬布芬等等)和2-芳氧基丙酸系列除草劑中也存在類似的手性效應(yīng)。
通過傳統(tǒng)的有機(jī)化學(xué)方法合成得到的各種手性2-芳基丙酸一般都是等量的(R)和(S)兩種對映異構(gòu)體的外消旋混合物。拆分手性羧酸的經(jīng)典方法是先與一種單一異構(gòu)體的手性胺形成非對映異構(gòu)體的鹽，然后利用溶解度的差異使一種異構(gòu)體優(yōu)先從溶液中結(jié)晶出來。由于非對映體結(jié)晶法需要使用價(jià)格昂貴的光學(xué)純手性拆分劑，成本相對較高、過程比較繁雜，而且會產(chǎn)生大量廢水，因此近年來利用微生物或其酶催化的手性化合物對映選擇性轉(zhuǎn)化拆分方法，獲得了越來越多的開發(fā)和應(yīng)用。不少文獻(xiàn)和專利已涉及這方面的技術(shù)，較為典型的有以下兩個方面(1)使用商品化的脂肪酶制劑(主要來源于假絲酵母屬Candida sp.)為催化劑。由于商品酶來源容易，這方面的文獻(xiàn)報(bào)道較多，但在用于拆分2-芳基丙酸特別是酮基布洛芬時(shí)往往立體選擇性不夠理想，所以必須對酶進(jìn)行純化或其它額外的處理。例如文獻(xiàn)J.Am.Chem.Soc.1990，1121990-1995通過酶的純化并用脫氧膽酸鹽和丙酮處理提高酶的選擇性；專利U.S.Pat.5108916，Apr.28，1992通過離子交換或等電聚焦對粗酶進(jìn)行純化，獲取選擇性較高的單一組分(CSC-1或CSC-2)；文獻(xiàn)J.Org.Chem.直接用2-丙醇處理改善粗酶的立體選擇性文獻(xiàn)J.Am.Chem.Soc.1995，1176854則報(bào)道了交聯(lián)酶晶體拆分手性羧酸酯的效果。上述方法的一個共同缺點(diǎn)是商品酶制劑價(jià)格相對較高，額外的處理過程比較麻煩，并造成酶的活力損失，從而使酶催化劑的成本大幅度增加，影響了工業(yè)化應(yīng)用的實(shí)際可行性。
(2)直接使用含有酯酶的微生物細(xì)胞對外消旋的底物進(jìn)行立體選擇性生物轉(zhuǎn)化。由于微生物細(xì)胞易于培養(yǎng)、操作簡單、成本低廉，因此在經(jīng)濟(jì)上比商品酶更具有優(yōu)勢，關(guān)鍵是篩選到高效專一的產(chǎn)酶菌株。這方面典型的文獻(xiàn)有美國專利U.S.Pat.5516690，May14，1996公開了一株絲孢酵母菌Trichosporon labbacchii，系用乙醇為唯一碳源，從土壤中分離獲得；用它的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)化酮基布洛芬乙酯可獲得純度為93％的(S)-酮基布洛芬，如果以酮洛芬甲酯為底物則可獲得(R)-酮基布洛芬，但對映體純度僅有86％。如果要獲得更高純度的產(chǎn)品(作為醫(yī)藥品純度一般應(yīng)達(dá)到98％以上)，還需要通過非對映體結(jié)晶的方法除去殘留的少量對映體雜質(zhì)。另一篇美國專利U.S.Pat.5457051，Oct.10，1995則公開了一株專門用于制備(R)-酮基布洛芬的白僵菌Beauveria bassiana ATCC44860，用其菌絲轉(zhuǎn)化酮基布洛芬膽堿酯，最好情況下所得(R)-酸的對映體過量值也只有93.6％ee(相當(dāng)于對映體純度為96.8％)。由于酮洛芬膽堿酯的合成步驟非常復(fù)雜，而且需要使用有毒試劑(如硫酸二甲酯和碘甲烷)，因此給工業(yè)化應(yīng)用帶來了很大困難。
綜上所述，在用生物催化法拆分2-芳基丙酸時(shí)，使用商品化的酶制劑價(jià)格較高，選擇性不夠理想，需要增加額外的處理步驟，而且通常反應(yīng)的產(chǎn)物為(S)-酸和(R)-酯，后者需要經(jīng)過進(jìn)一步的化學(xué)水解才能轉(zhuǎn)變?yōu)?R)-酸；比較而言，直接使用含酶的微生物細(xì)胞催化拆分手性羧酸的酯，工藝比較簡單，成本比較低廉，因此具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景。但目前已公開的微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)中也存在著產(chǎn)酶菌株的選擇性不夠高，以及不能同時(shí)獲得高純度的(S)和(R)兩種對映體等缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是公開兩株立體專一性較高、而且對映選擇性互補(bǔ)的酵母菌株，以及使用它們的細(xì)胞或從其中分離出的酯酶對外消旋的2-芳基丙酸酯進(jìn)行一次或兩次串聯(lián)的水解反應(yīng)，以制備高光學(xué)純度的(S)和(R)-2-芳基丙酸的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的選擇性不夠高，以及不能同時(shí)獲得高純度的(S)和(R)兩種對映體等缺陷。
本發(fā)明的構(gòu)思是這樣的(1)自然界的微生物種類是非常豐富、多種多樣的。既然自然界存在著(R)和(S)兩種構(gòu)型的手性酯，那末根據(jù)進(jìn)化論的觀點(diǎn)可以推斷，自然界中必定也存在著對(R)和(S)兩種底物具有較高專一性的酯酶。因此，發(fā)明人認(rèn)為只要設(shè)計(jì)一定的方法，巧妙地篩選分離得到高度專一性的酯酶產(chǎn)生菌，那末通過高度對映選擇性的酯水解，就可獲得高度光學(xué)純的單一對映體2-芳基丙酸。
(2)微生物及其酶催化的對映體拆分過程，實(shí)質(zhì)上是以兩種對映體底物的競爭性反應(yīng)的速度快慢不同為前提的所謂“動力學(xué)拆分”過程，有關(guān)的定量分析及模擬曲線在文獻(xiàn)J.Am.Chem.Soc.1982，1047294中已有詳細(xì)記載。根據(jù)這一理論模型可以得到如下啟示當(dāng)目標(biāo)對映體為反應(yīng)的產(chǎn)物(酸)時(shí)，首先要選擇對映選擇率(E值)盡可能高的細(xì)胞或酶；其次，在細(xì)胞或酶的選擇率不是特別高(如E＜50)的情況下，應(yīng)當(dāng)控制反應(yīng)的時(shí)間，使反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率(c)適當(dāng)?shù)鸵恍?例如40％左右)；再次，當(dāng)?shù)孜镏械穆磻?yīng)對映體被一定程度富集之后，再用對映選擇性相反的另一種酶進(jìn)行二次轉(zhuǎn)化，則反應(yīng)所得產(chǎn)物的光學(xué)純度比單用后一種酶一步轉(zhuǎn)化外消旋底物時(shí)所得產(chǎn)物的光學(xué)純度要高。
使用的微生物用于本發(fā)明制備光學(xué)純2-芳基丙酸的是一種屬于Citeromyces屬的酵母菌——固囊酵母Citeromyces matriensis CGMCC No.0573和一種屬于Trichosporon屬的酵母菌——蕓苔絲孢酵母Trichosporon brassicae CGMCC No.0574，固囊酵母CGMCCNo.0573為Citeromyces屬中的唯一種；蕓苔絲孢酵母CGMCC No.0574與Trichosporon laibacchii為同一屬中的不同種。這兩種菌株已于2001年05月09日在中國微生物菌種保藏管理委員會保藏，保藏號分別為CGMCC No.0573和CGMCC No.0574。
上述菌種具有如下性質(zhì)形態(tài)特征固囊酵母CGMCC No.0573該菌在麥芽汁液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)3天后，呈球形營養(yǎng)細(xì)胞，不產(chǎn)假絲，每個子囊中含一個子囊孢子，硝酸鹽還原試驗(yàn)呈陽性，不產(chǎn)脲酶。該菌能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖和麥芽糖，不能發(fā)酵乳糖。該菌能同化琥珀酸、乳酸和乙醇，不能同化甲醇，對檸檬酸弱同化。
蕓苔絲孢酵母CGMCC No.0574在葡萄糖酵母膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)3天后，有真菌絲和節(jié)孢子，出芽細(xì)胞少見；細(xì)胞大小為(3-4.5)×(5-20)μm，有菌膜形成，沉淀物絮狀。在葡萄糖酵母膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)一個月后，劃線培養(yǎng)物灰白色，有鄒紋，鵝絨狀，質(zhì)地堅(jiān)韌，邊緣有菌絲形成。在玉米粉瓊脂Dalmau平板上培養(yǎng)時(shí)，有大量真菌絲產(chǎn)生。該菌不能發(fā)酵糖類。
根據(jù)文獻(xiàn)“Theyeastsa taxonomic study”(Kurtzman et al，1998)和“酵母菌的特性與鑒定”(Barnettett et al，1983Yeasts-characteristics and identification，青島海洋大學(xué)出版社)提供的鑒定方法和上述的試驗(yàn)結(jié)果，表明固囊酵母CGMCC0573屬于固囊酵母菌屬，而且該酵母菌類群中只有Citeromyces matriensis一個種；蕓苔絲孢酵母CGMCC0574屬于絲孢酵母屬中的Trichosporon brassicae種，該菌種于2000年5月9日由中國科學(xué)院微生物研究所鑒定定名(“2000微檢字第119號”)。通過常規(guī)的發(fā)酵方法，可以培養(yǎng)上述的固囊酵母CGMCC No.0573和蕓苔絲孢酵母CGMCC No.0574菌種。
上述的菌種是在上海地區(qū)獲得的，篩選方法如下取1g新鮮土樣，加到50ml篩選培養(yǎng)基中(含0.2％(NH4)2SO4，0.2％K2HPO4，0.05％NaCl和0.05％MgSO4·7H2O)，另加入少量酮基布洛芬乙酯的吐溫-80乳化液或乙醇溶液作為唯一碳源，進(jìn)行兩輪富集培養(yǎng)；富集后進(jìn)行薄板層析，取有酯水解產(chǎn)物(酮洛芬)的培養(yǎng)液，稀釋涂平板(培養(yǎng)基組成同上)培養(yǎng)，取有透明圈的單菌落，在搖管中用豐富培養(yǎng)基(例如葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.5％)培養(yǎng)24h后，加入酮基布洛芬乙酯的乳化液(10mM)，轉(zhuǎn)化24h后，用等體積的乙酸乙酯萃取出產(chǎn)物酸和殘留的酯，作HPLC分析(使用日本Daicel公司的手性色譜柱ChiracelOJ，φ0.46cm×25cm，流動相為正己烷/異丙醇/乙酸＝90∶10∶0.1)，計(jì)算底物的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的對映體過量值(eep)。最后從500多株侯選菌株中選出兩株分別選擇性水解(R)-和(S)-酮基布洛芬乙酯的微生物固囊酵母Citeromyces matriensis CGMCCNo.0573和蕓苔絲孢酵母Trichosporon brassicae CGMCC No.0574。
采用上述的微生物制備光學(xué)純2-芳基丙酸的方法依次包括如下步驟(1)采用常規(guī)的方法進(jìn)行菌種和細(xì)胞的培養(yǎng)菌種的準(zhǔn)備分別將固囊酵母Citeromyces matriensis CGMCC No.0573和蕓苔絲孢酵母Trichosporon brassicae CGMCC No.0574在滅過菌(121℃，20-40min)的豐富培養(yǎng)基(例如葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.5％，瓊脂1.5％)平板上劃線，于25-30℃靜置培養(yǎng)約2天后挑取單菌落，作為種子進(jìn)行斜面培養(yǎng)(培養(yǎng)條件同上)，約2天后保存于4℃冰箱中備用。
細(xì)胞的培養(yǎng)挑取上述斜面培養(yǎng)的種子，接種到裝有20mL液體培養(yǎng)基(組成同上，但不加瓊脂)的100mL小搖瓶中，在適當(dāng)溫度(20-50℃，最好25-40℃)和轉(zhuǎn)速(例如60-300r/min，一般120-180r/min)的搖床上培養(yǎng)12-18h后，按適當(dāng)比例(比如5％)接種于含有100mL生長培養(yǎng)基的500mL大搖瓶中，在搖床上(30℃，150r/min)培養(yǎng)24-30h后取出，在4℃、8000r/min離心去除上清液，所得細(xì)胞用生理鹽水(0.85％NaCl)洗滌一次。
(2)底物的轉(zhuǎn)化將保藏號為CGMCC No.0574的菌株所培養(yǎng)的細(xì)胞(胞內(nèi)含S-專一性酯酶)，以10g～200g(濕重)/L的濃度懸浮于磷酸鉀緩沖液中，磷酸鉀緩沖液的濃度為20～100mmol/L，pH為6-11，最好為pH＝8-9，加入含乳化劑的底物酯的乳化液，優(yōu)選的乳化劑為吐溫-80、聚乙烯醇或壬基酚聚氧乙烯醚中的一種及其混合物，加入量為1～20g/L，于20～50℃的搖床上振蕩反應(yīng)1～5天時(shí)間后，將反應(yīng)液用鹽酸酸化至pH為2～3左右，再加等體積的乙酸乙酯萃取，靜置，分相，收集含有酸和酯的有機(jī)相。從有機(jī)相取樣作手性高效液相色譜分析，計(jì)算底物的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的對映體含量(eep)；所說的底物酯為2-芳基丙酸與C1～C8脂肪醇所形成酯中的一種。
(3)產(chǎn)物的分離在上述含有酸和酯的有機(jī)萃取液中加入稀堿液反萃，即可獲得含有(S)-酸的水相和含有(R)-酯的有機(jī)相。稀堿液包括NaOH或/和NaHCO3，其濃度為0.01～1.0mol/L，加入量以使最終pH為10～12時(shí)較為合適；向水相中加入鹽酸酸化至pH為2-3，靜置過夜后過濾，即可得到光學(xué)純的(S)-型的單一對映體2-芳基丙酸的晶體產(chǎn)品。
將含有(R)-酯的有機(jī)相加熱蒸發(fā)，去處除溶劑，即獲得(R)-酯。
(4)二次拆分將上述萃取分離得到的(R)-酯，加入乳化劑如吐溫-80、聚乙烯醇或壬基酚聚氧乙烯醚中的一種及其混合物，乳化劑加入量為1～20g/L，制成(R)-酯的乳化液。將保藏號為CGMCC No.0573的菌株所培養(yǎng)的細(xì)胞(含R-專一性酯酶)作催化劑，以10g～200g(濕重)/L的濃度懸浮于磷酸鉀緩沖液中，磷酸鉀緩沖液的濃度為20～100mmol/L，pH為6-11，最好為pH＝8-9。將(R)-酯的乳化液與細(xì)胞的懸浮液等體積混合，于20～50℃的搖床上振蕩反應(yīng)1～5天后，用鹽酸酸化至pH為2～3左右，再加等體積的乙酸乙酯萃取，靜置，分相，收集含有酸和酯的有機(jī)相。從有機(jī)相取樣作手性高效液相色譜分析，計(jì)算底物的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的對映體過量值(eep)；向上述含有酸和酯的有機(jī)萃取液中加入稀堿液(控制最終pH在10-12)反萃，即可獲得含有(R)-酸的水相和含有(S)-酯的有機(jī)相。向分離后的水相中加入鹽酸至pH＝2-3，然后靜置過夜并過濾，即可獲得光學(xué)純(R)-芳基丙酸的晶體。
按照本發(fā)明，也可以將外消旋的2-芳基丙酸酯先用含R-專一性酯酶的固囊酵母CGMCC No.0573的細(xì)胞催化水解至30-40％轉(zhuǎn)化率，經(jīng)萃取分離出光學(xué)純度較高的(R)-型2-芳基丙酸和光學(xué)純度較低的(S)-2-芳基丙酸酯；然后再用含S-專一性酯酶的蕓苔絲孢酵母CGMCC No.0574的細(xì)胞催化水解反應(yīng)剩余的(S)-對映體部分富集的酯，再經(jīng)堿液萃取和酸化結(jié)晶，以獲得光學(xué)純的(S)-型2-芳基丙酸晶體。
按照本發(fā)明，最好將培養(yǎng)所獲得的細(xì)胞在含有丙酮或異丙醇的緩沖溶液中振蕩處理1～15小時(shí)，再用于上述的催化反應(yīng)。
采用本發(fā)明所說的生物轉(zhuǎn)化工藝，不僅可以同時(shí)獲得光學(xué)純度很高的(S)和(R)-型2-芳基丙酸單一對映體產(chǎn)品，滿足不同用途的醫(yī)藥或農(nóng)藥工業(yè)的需要，而且作為反應(yīng)底物的2-芳基丙酸乙酯易于合成，無需使用昂貴或有毒的試劑，從而降低了原料的成本；此外，還省卻了反應(yīng)剩余酯的消旋化和循環(huán)利用，從而簡化了操作步驟，并提高了原料的利用率。
具體實(shí)施例方式
以下將通過實(shí)施例對本發(fā)明的具體實(shí)施方式
進(jìn)行詳細(xì)的說明。
實(shí)施例1～6在5L發(fā)酵罐中裝入3L生長培養(yǎng)基(葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.5％)，滅菌后按5％的接種量接入CGMCC No.0574種子培養(yǎng)液，在溫度為30℃、攪拌轉(zhuǎn)速為600r/min和通氣速率為0.4vvm的條件下，約12h后葡萄糖基本耗盡，菌體密度達(dá)到8.5g(干重)/L，酯酶活力達(dá)到10.3U/L。此時(shí)，補(bǔ)加葡萄糖至5g/L，該菌又繼續(xù)生長并產(chǎn)酶，至24h放罐時(shí)菌濃可提高60％，酶活提高約50％。
各取100mL上述培養(yǎng)液，離心收集菌體，用生理鹽水洗滌后，懸浮于20mL磷酸緩沖液中(50mM，pH＝7.0)，加入0.1g吐溫-80，再加入酮基布洛芬與不同醇合成所得的酯(20mM)，于30℃和120r/min的搖床上保溫反應(yīng)，結(jié)果見下表。
表1蕓苔絲孢酵母CGMCC No.0574對酮基布洛芬不同酯水解的結(jié)果。酮基布洛芬相對速率轉(zhuǎn)化率產(chǎn)物的構(gòu)型對映選擇率的各種酯(％) (％)及其含量(％) (E值)實(shí)施例1 甲酯 211 49R(93) 34實(shí)施例2 乙酯 100 45S(96) 54實(shí)施例3氯乙酯 67 49S(80)7.0實(shí)施例4異丙酯 38 44R(85)9.7實(shí)施例5正丁酯 47 37S(70)2.9實(shí)施例6正辛酯 26 23S(65)2.0實(shí)施例7將固囊酵母CGMCC No.0573接種于含有4mL生長培養(yǎng)基(葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.5％)的搖管中，于30℃、120r/min培養(yǎng)42h后，加入20μl濃度為2M的酮基布洛芬乙酯的乙醇溶液，轉(zhuǎn)化48h后，用4mL乙酸乙酯萃取后，進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果獲得了(R)-酮基布洛芬，對映體純度為96.8％，產(chǎn)率為27％。
當(dāng)?shù)孜锿悸宸乙阴ヒ酝聹?80乳化液加入轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系中時(shí)，反應(yīng)速度明顯加快，16h時(shí)轉(zhuǎn)化率即達(dá)到31％，而產(chǎn)物(R)-酮基布洛芬的對映體純度為96.5％。
實(shí)施例8用試管各取培養(yǎng)24h后的蕓苔絲孢酵母CGMCC No.0574培養(yǎng)液10mL，離心、洗滌收集所得菌體，重新懸浮于2mL含有1％丙酮或異丙醇的磷酸緩沖液中(50mM，pH7.0)，在搖床上振蕩處理12小時(shí)后，離心、洗去處理試劑，再在2mL加有10mM底物乳化液(含0.5％吐溫-80)的磷酸緩沖液中保溫反應(yīng)，測定酯水解的相對速率和對映選擇性。結(jié)果與未作通透化處理的新鮮細(xì)胞相比，用丙酮處理過的細(xì)胞反應(yīng)的初速度提高了61％，而用異丙醇處理過的細(xì)胞的反應(yīng)速度則增加到2.35倍，反應(yīng)的對映選擇性則無明顯變化，產(chǎn)物的對映體純度保持在96-97％。
當(dāng)把上述通透處理的緩沖液由pH＝7.0的磷酸鹽替換為pH＝10的甘氨酸-NaOH緩沖液時(shí)，反應(yīng)速度又提高了75％。在pH＝10的緩沖液中用1％的異丙醇處理不同時(shí)間，結(jié)果以10h的效果為最佳。在此條件下，2％異丙醇的處理效果比1％更好，反應(yīng)速度為對照組的3倍多。當(dāng)固定異丙醇的濃度為2％而改變細(xì)胞的濃度時(shí)，對處理的效果也有明顯的影響，以30g(濕重)/L的細(xì)胞量為最佳。
實(shí)施例9用500mL的大搖瓶分別培養(yǎng)CGMCC No.0573和CGMCC No.0574的細(xì)胞(條件同上)，離心、洗滌后備用。
取4g蕓苔絲孢酵母CGMCC No.0574的細(xì)胞在(30g/L細(xì)胞、2％異丙醇，pH＝10)下處理10h后，懸浮于50mL的磷酸緩沖液中(100mM，pH 8.0)，加入1.4g酮基布洛芬乙酯(100mM)和0.25g吐溫-80(0.5％)，在30℃、120r/min保溫反應(yīng)36h后，加數(shù)滴濃鹽酸酸化至pH＝2，然后用50mL乙酸乙酯萃取生成的酮洛芬酸和反應(yīng)剩余的酯，取樣1mL作HPLC分析，結(jié)果(S)-酸的產(chǎn)率為30％，對映體純度為95.5％。其余的萃取液用0.1N NaOH溶液反萃得到(S)-酮基布洛芬的鹽溶液，用鹽酸酸化后即得到(S)-酮洛芬的沉淀，再經(jīng)過進(jìn)一步結(jié)晶(NaHCO3/HAc)后，光學(xué)純度提高到98％以上。
將上述反萃后得到的有機(jī)相蒸發(fā)濃縮，得到(R)-酮洛芬乙酯(對映體含量為78％)。取該酯0.46g懸浮于50mL磷酸緩沖液(100mM，pH＝7.0)中，加入0.25g吐溫-80和4g固囊酵母CGMCC No.0574的濕細(xì)胞，在30℃、120r/min保溫反應(yīng)90h，測得(R)-酮基布洛芬的產(chǎn)率為40％，對映體純度為97.8％；經(jīng)分離和結(jié)晶后，產(chǎn)品中(R)-對映體的含量超過99％。
根據(jù)本發(fā)明公開的技術(shù)方案和實(shí)施例，有關(guān)的工程技術(shù)人員可以方便地將本發(fā)明所說的兩株酵母菌及其培養(yǎng)與轉(zhuǎn)化工藝舉一反三地用于其它類型的2-芳基丙酸(如萘普生和布洛芬等)和2-芳氧基丙酸的對映體拆分。
權(quán)利要求
1.一種固囊酵母菌株CGMCC No.0573。
2.一種蕓苔絲孢酵母菌株CGMCC No.0574。
3.一種制備光學(xué)純2-芳基丙酸的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(1)采用常規(guī)的方法對權(quán)利要求1和權(quán)利要求2的菌株進(jìn)行培養(yǎng)；(2)將保藏號為CGMCC No.0574的菌株所培養(yǎng)的細(xì)胞，在pH為6-11的緩沖液中，與含乳化劑的底物酯的乳化液振蕩反應(yīng)，然后將反應(yīng)液用酸酸化至pH為2～3，用乙酸乙酯萃取，收集含有酸和酯的有機(jī)相；所說的底物酯為2-芳基丙酸與C1～C8脂肪醇所形成酯中的一種；(3)產(chǎn)物的分離在上述含有酸和酯的有機(jī)相中加入堿液反萃，獲得含有(S)-酸的水相和含有(R)-酯的有機(jī)相，堿液加入量以使最終pH為10～12；用酸將水相酸化至pH為2-3，收集其中的光學(xué)純的(S)-型的單一對映體2-芳基丙酸；將含有(R)-酯的有機(jī)相加熱蒸發(fā)，去除溶劑，獲得(R)-酯。(4)二次拆分以保藏號為CGMCC No.0573的菌株所培養(yǎng)的細(xì)胞在pH為6-11的緩沖液中與含乳化劑的(R)-酯的乳化液振蕩反應(yīng)，用酸酸化至pH為2～3，用乙酸乙酯萃取，收集含有酸和酯的有機(jī)相；在有機(jī)相中加入堿液，控制最終pH在10-12，收集含有(R)-酸的水相和含有(S)-酯的有機(jī)相，用酸酸化水相至pH＝2-3，收集其中的光學(xué)純(R)-2-芳基丙酸。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所說的緩沖液為磷酸鉀緩沖液，濃度為20～100mmol/L，緩沖液中的細(xì)胞以濕重計(jì)為10g～200g/L，緩沖液pH為8-9。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所說的乳化劑為吐溫-80、聚乙烯醇或壬基酚聚氧乙烯醚中的一種及其混合物，加入量為～20g/L。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所說的堿包括NaOH或/和NaHCO3，堿液濃度為0.01～1.0mol/L。
7.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所說的酸為鹽酸。
8.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，振蕩反應(yīng)溫度為20～50℃，時(shí)間為1～5天。
9.一種制備光學(xué)純2-芳基丙酸的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(1)采用常規(guī)的方法對權(quán)利要求1和權(quán)利要求2的菌株進(jìn)行培養(yǎng)；(2)將外消旋的2-芳基丙酸酯先用固囊酵母CGMCC No.0573的細(xì)胞催化水解至30-40％轉(zhuǎn)化率，經(jīng)萃取分離出光學(xué)純度較高的(R)-型2-芳基丙酸和光學(xué)純度較低的(S)-2-芳基丙酸酯，然后再用蕓苔絲孢酵母CGMCC No.0574的細(xì)胞催化水解反應(yīng)剩余的(S)-對映體部分富集的酯，再經(jīng)堿液萃取和酸化結(jié)晶，獲得光學(xué)純的(S)-型2-芳基丙酸。
10.如權(quán)利要求1～9任一所述的方法，其特征在于，將培養(yǎng)所獲得的細(xì)胞在含有丙酮或異丙醇的緩沖溶液中振蕩處理1～15小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開了兩種酵母菌株,固囊酵母CGMCCNo.0573和蕓苔絲孢酵母CGMCC No.0574,并使用它們的細(xì)胞或從其中分離出的酯酶對外消旋的2－芳基丙酸酯進(jìn)行一次或兩次串聯(lián)的水解反應(yīng),制備出高光學(xué)純度的(S)和(R)－2－芳基丙酸。本發(fā)明不僅可以同時(shí)獲得光學(xué)純度很高的(S)和(R)－型2－芳基丙酸單一對映體產(chǎn)品,滿足不同用途的醫(yī)藥或農(nóng)藥工業(yè)的需要,而且作為反應(yīng)底物的2－芳基丙酸乙酯易于合成,無需使用昂貴或有毒的試劑,從而降低了原料的成本;此外,還省卻了反應(yīng)剩余酯的消旋化和循環(huán)利用,從而簡化了操作步驟,并提高了原料的利用率。
文檔編號C12N1/16GK1336437SQ0112661
公開日2002年2月20日 申請日期2001年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月4日
發(fā)明者許建和, 武慧淵, 沈端, 宮鵬飛 申請人:華東理工大學(xué)