專利名稱：利用海洋微藻異養(yǎng)培養(yǎng)生產(chǎn)長鏈多不飽和脂肪酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)長鏈多不飽和脂肪酸(簡稱為PUFA)的方法。PUFA是細胞和有機體生物膜的重要組成成份，可調(diào)節(jié)細胞構(gòu)型、動態(tài)平衡、相轉(zhuǎn)變及細胞膜的滲透性，同時還調(diào)節(jié)與膜有關(guān)的生理過程，因此它們可以影響細胞的化學組成、信號傳遞、免疫及冷適應(yīng)性，以及與此有關(guān)的疾病的發(fā)生，PUFA可以轉(zhuǎn)化成調(diào)節(jié)人體某些生理功能的代謝產(chǎn)物。在人體內(nèi)的PUFA類二十碳烯酸物質(zhì)(eicosanoid)系統(tǒng)具有重要的生理調(diào)節(jié)功能，如前列腺素(postaglandins)，凝血黃素(thromboxanes)等，它們同激素一樣，在組織中存在量很少，但是具有很強的調(diào)節(jié)功能，如前列腺素可以調(diào)節(jié)血壓，而凝血黃素(thromboxanes)可以誘導血小板凝集。此外，它們心血管、呼吸、腸胃、視覺和免疫系統(tǒng)均有一定的調(diào)節(jié)作用，其中二十二碳烯酸(簡稱DHA)具有更重要的生理功能，近來研究也發(fā)現(xiàn)了二十二碳五烯酸(簡稱為DPA)的商業(yè)應(yīng)用價值。DHA是細胞膜中長鏈多不飽和脂肪酸的主要成份，可以預(yù)防和治療心血管疾病、預(yù)防和治療癌癥。在神經(jīng)系統(tǒng)中，DHA主要存在于大腦灰質(zhì)中，是人腦中ω-3PUFA的主要成分。研究發(fā)現(xiàn)哺乳動物腦中的DHA主要與記憶、學習能力有關(guān)。大腦中DHA含量的降低可導致學習記憶能力的減退。專家建議在婦女懷孕期及嬰兒大腦發(fā)育早期應(yīng)進食ω-3PUFA含量高的食品，如海魚等以補充適量的DHA。
有關(guān)這些長鏈多不飽和脂肪酸的生理功能及其實際應(yīng)用的研究已有較多報道，這也是人們重視食用魚油的理論依據(jù)。傳統(tǒng)的長鏈多不飽和脂肪酸多是從魚油中提取的，但是由于從魚油中提取的PUFA含有強烈的魚腥味，而且魚油中脂肪酸成份復(fù)雜，PUFA特別是EPA和DHA的分離提取過程不僅步驟多而且損失近50％。所以現(xiàn)在有很多專利是用來申請PUFA分離及純化方法的，如果可以尋找一種脂肪酸成份單一、且多不飽和脂肪酸含量高的微生物來生產(chǎn)PUFA，不僅可以用傳統(tǒng)的工業(yè)化發(fā)酵罐進行高細胞密度異養(yǎng)培養(yǎng)藻體，而且簡化了DPA和DHA的純化工藝和降低了難度。另一方面從海洋生物的食物鏈來看，藻類是魚類的最基本食物，實驗已表明魚體內(nèi)的多不飽和脂肪酸來源于藻類。然而，這些藻類如Thraustochytriaceae中的DPA和DHA含量不是很高。例如在C.Ratledge and S.G.Wilkinson所編輯的Microbial Lipid(P774-775，London Academic Press，1988-1989)一書中提到Thraustochytrium aureum的DPA含量占總脂肪酸的6.6％，DHA含量占總脂肪酸的10.8％。這樣不利于降低生產(chǎn)成本。
另外，一般認為，微藻特別是有鞭毛的可以游動的藻類對機械攪拌比較敏感，傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式是鼓泡和振蕩培養(yǎng)，或者是在很低的攪拌速度下進行培養(yǎng)。在下述的兩篇文章中均提到機械攪拌培養(yǎng)可導致細胞干重的降低Baipai P.K.，Baipai.，and Ward O.P.，Optimization of production ofdocosahexaenoic acid(DHA)by Thraustochytrium aureum ATCC 34304，J.Am.Oil Chem.Soc.，1991，68509-514；and Iwao Iida，Toro Nakahara，ToshihiroYokochi，Yasushi Kamisaka，Hisaaki Yagi，Masakazu Yamaoka and OsamuSuzuki，Improvement of docosahexaenoic acid of Thraustochytrium aureum bymedium optimization，J.Ferm.Bioeng.，1996，8176-78.
關(guān)于Thraustochytriaceae的培養(yǎng)，一般報告認為是在較低的溫度下進行培養(yǎng)，高溫會嚴重影響細胞的生長在以上兩篇文獻中培養(yǎng)溫度為25℃。在LIZ.Y.and Ward O.P.，Production of docosahexaenoic acid byThraustochytrium roseum，J.Ind.Microb，1994，13238-241中提到，當培養(yǎng)溫度升到30℃時，細胞干重降低大約25％。在另一本由編寫的書中MarineThraustochytrids and chytridiomycetes in the North area and in the selected otherregion提到在5-10℃之間細胞生長較好，在14℃時，細胞生長受到阻滯，在20℃葉細胞幾乎停止生長。，其中還提到一篇文章也談到這一問題，UlkenA.，uber zwei marine niedere pilze vom meeresboden der nordsee，veroff inst.Meeresforsch，Bremerh，Sonderbd，1968，371-74。
在本專利申請之前，僅有一篇中國專利涉及微藻培養(yǎng)生產(chǎn)DHA的報告(申請?zhí)?4106621.5)，但它是利用隱甲藻Crypthecodiniumcohnii在液體培養(yǎng)基中連續(xù)振蕩培養(yǎng)生產(chǎn)DHA。該發(fā)明所得到的Crypthecodiniumcohnii細胞，DHA產(chǎn)量低，細胞的長鏈多不飽和脂肪酸成分中只含有DHA一種長鏈多不飽和脂肪酸，如果用于營養(yǎng)補充劑生產(chǎn)工業(yè)，該發(fā)明很難有較高的經(jīng)濟效益，不適用于工業(yè)化生產(chǎn)。而且隱甲藻細胞壁厚，不易破壁，難于被人體消化，有的甲藻細胞還產(chǎn)生一種毒素，所以也很難利用整個細胞來作為營養(yǎng)添加劑。因此，需要提供一種高效、簡便、經(jīng)濟地生產(chǎn)PUFA的方法。
本發(fā)明的目的是提供一種海洋微藻的培養(yǎng)方法；本發(fā)明的另一目的是提供一種生產(chǎn)長鏈多不飽和脂肪酸，尤其是二十二碳六烯酸(DHA)和二十二碳五烯酸(DPA)的方法。
發(fā)明的詳細描述本發(fā)明提供了一種海洋微藻培養(yǎng)用的培養(yǎng)基，其包括碳源、氮源、無機鹽，其中所述的碳源選自廢糖蜜、玉米粉、蔗糖、果糖、乳糖、葡萄糖、可溶性淀粉、二氧化碳或其混合物；所述的氮源選自有機和無機氮化合物或其混合物；所述的無機氮化合物包括硝酸銨、硫酸銨、尿素或其混合物，有機氮化合物包括脯氨酸、精氨酸、、天冬氨酸、酪氨酸、蛋白胨、谷氨酸或其混合物。優(yōu)選的氮源為硝酸銨、脯氨酸或其混合物。所述的無機鹽這一種或多種選自下列的物質(zhì)鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、碳酸鹽鐵鹽、錳鹽、鈷鹽、鉬酸鹽、鋅鹽、硼化物、溴化物及其混合物。
在本發(fā)明的培養(yǎng)基中，所述的碳源濃度為10-200g/L，最好為20-100g/L；所用的氮源濃度是培養(yǎng)基中碳源濃度的1/2-1/10；所述的無機鹽濃度，以鈉鹽為標準，為0.01-12ppm。培養(yǎng)基，其pH值為3.0-12.0。
對于無機鹽類，使用天然海水是最好的，但也可以用各種鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、碳酸鹽等配制，同時鐵鹽、錳鹽、鈷鹽、鉬酸鹽、鋅鹽、硼化物、溴化物等也包括在本發(fā)明中。其中所配制的無機鹽濃度以鈉鹽為標準，其濃度在0.01-12ppm。
本發(fā)明還提供了一種在上述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微藻的方法。這種方法是在通氣和機械攪拌條件進行。所述的微藻是Thraustothytriaceae屬藻類。
本發(fā)明所用的海洋微藻是能生產(chǎn)長鏈多不飽和脂肪酸的Thraustochytriaceae藻種，包括可以從ATCC(美國典型培養(yǎng)物收集中心)、日本大坂發(fā)酵工程研究所等保藏機構(gòu)獲得的藻種。上述微藻的說明性實例包括Schizochytrium sp.ATCC 18915，Schizochytrium aggregatum ATCC 28209，Schizochytrium sp.ATCC 20888，Schizochytrium sp.ATCC 20889，Schizochytrium limacinum SR21，Thraustochytrium roseum ATCC 28211，Schizochytrium mangrovei G13，Thraustochytrium sp.ATCC 18907等保藏藻種，其中最佳的是Schizochytrium aggregatum ATCC 28209。藻種均保藏于固體斜面上。
首先，對Thraustothytriaceae藻類進行馴化。即多次的高溫條件下傳代培養(yǎng)，只保留生長旺盛的藻種，而淘汰生長慢和生長微弱的藻種。
其次，對Thraustothytriaceae藻類進行預(yù)培養(yǎng)，所述的培養(yǎng)基中，硫酸銨的濃度應(yīng)盡可能的小。優(yōu)選脯氨酸與硫酸銨的比例大于2∶1，優(yōu)選大于5∶1，更優(yōu)選大于10∶1，最優(yōu)選，脯氨酸完全代替硫酸銨。預(yù)培養(yǎng)的溫度為5-30℃，優(yōu)選為5-20℃，更優(yōu)選為10-20℃。
經(jīng)預(yù)培養(yǎng)后，再接種到上述的培養(yǎng)基中，其中在培養(yǎng)基中所用的碳源的濃度應(yīng)高于預(yù)培養(yǎng)中所用的濃度，優(yōu)選為預(yù)培養(yǎng)中所用的碳源濃度的1.5-15倍，更優(yōu)選為2-8倍，最優(yōu)選2-6倍。
由于經(jīng)過馴化和預(yù)培養(yǎng)，本發(fā)明中所用的Thraustothytriaceae微藻能承受振蕩和機械攪拌的培養(yǎng)條件，且能在無光的條件下異養(yǎng)生長。
本發(fā)明的微藻的可以為光照培養(yǎng)或異養(yǎng)培養(yǎng)。如利用傳統(tǒng)的攪拌式發(fā)酵罐進行工業(yè)化生產(chǎn)PUFA。所得到藻類-Thraustochytriaceae的脂肪酸成份單一、DPA和DHA含量高。DPA/DHA含量分別占脂肪酸的10.24和30.05％。
上述的Thraustochytriaceae的微藻生產(chǎn)方法，分為兩個階段，第一是微藻的大量繁殖即以無性繁殖方式產(chǎn)生大量單鞭毛游動孢子，第二是細胞靜止生長即長鏈多不飽和脂肪酸的累積階段。
上述的Thraustochytriaceae的微藻生產(chǎn)經(jīng)預(yù)培養(yǎng)后，可以在較高溫度下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為10-50℃，優(yōu)選為15-45℃，更優(yōu)選為20-45℃，如20-40℃。
本發(fā)明還提供了一種長鏈多不飽和脂肪酸，包括二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸的生產(chǎn)方法，其包括下列步驟(1)對Thraustothytriaceae藻類進行馴化；(2)對Thraustothytriaceae藻類進行預(yù)培養(yǎng)；(3)經(jīng)預(yù)培養(yǎng)后，再接種到上述的培養(yǎng)基中，進行脂肪酸的生成和累積培養(yǎng)；(4)提取細胞和酯化從而得到所需要的長鏈多不飽和脂肪酸，包括二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。
上述的馴化是多次在高溫條件下傳代培養(yǎng)，只保留生長旺盛的藻種，而淘汰生長慢和生長微弱的藻種。馴化方法是在低溫下培養(yǎng)如10℃，再于高溫10-50℃搖瓶振蕩培養(yǎng)，選擇有活性的藻株，再于低溫下，如此反復(fù)，選擇性能穩(wěn)定的藻珠。
在預(yù)培養(yǎng)中，所用的培養(yǎng)基硫酸銨的濃度應(yīng)盡可能的小。優(yōu)選脯氨酸完全代替硫酸銨。預(yù)培養(yǎng)的溫度為5-30℃，優(yōu)選為5-20℃，更優(yōu)選為10-20℃。
本發(fā)明是通過對藻種的馴化，而使藻種在較高的攪拌速度下進行快速生長和生產(chǎn)多不飽和脂肪酸。
關(guān)于Thraustochvtriaceae的培養(yǎng)，一般報告認為是在較低的溫度下進行培養(yǎng)，高溫會嚴重影響細胞的生長，而本專利所涉及的藻種可以在較高的溫度下有較高的生長速率，而且多不飽和脂肪酸含量沒有降低。
海洋微藻Thraustochytriaceae的繁殖過程有無性或有性繁殖兩種。在無性繁殖過程中，每個營養(yǎng)細胞經(jīng)過細胞分裂釋放2-8個游動孢子，這些孢子成熟后以經(jīng)過細胞分裂使細胞數(shù)目成倍增加。有性繁殖過程中，細胞游動速度逐漸減慢，最后形成靜止不動的配子母細胞，經(jīng)過細胞分裂形成有性配子，兩個配子結(jié)合形成體積膨大的接合子，再經(jīng)過減數(shù)分裂，每個細胞分裂成四個單細胞完成其繁殖過程。在細胞的無性繁殖過程中，孢子游動速度快，細胞活躍，生長速度達到最高，如果可以在較短的時間內(nèi)使細胞進入該生長階段延長該段大量繁殖時間，可以有效的提高細胞干重。但是一般有利于細胞快速生長的培養(yǎng)基都會影向細胞長鏈多不飽和脂肪酸的含量，本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，設(shè)計了一種有效的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，可以明顯改善細胞干重，并且可以有效地提高細胞長鏈多不飽和脂肪酸的含量。
另外本發(fā)明還提供了一種可以使細胞快速生長的培養(yǎng)方法。為了使藻細胞延長快速生長時間，要先將液體種子培養(yǎng)基中藻細胞的密度在短時間內(nèi)提高到一定水平，這就需要進行種子培養(yǎng)。這個培養(yǎng)過程采用以上所述的培養(yǎng)基，在10℃-45℃間進行。
按照本發(fā)明所提供的方法，當藻細胞密度達到一定水平時，用攪拌式發(fā)酵罐作為培養(yǎng)容器進行分批培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，逐漸提高攪拌速率，如果攪拌速率過高，雖然不會對細胞產(chǎn)生損害，但是對于細胞生長和提高氧氣的溶解度沒有幫助，而且提高了能源損耗。
在培養(yǎng)過程中，最佳的培養(yǎng)溫度介于15-40℃之間，通氣速度為0.2-2vvm，攪拌速度由100到600rpm。最后通過一般的分離方法，如高速冷凍離心、過濾等，從培養(yǎng)基中回收細胞，經(jīng)過烘干或凍干后，用此回收的細胞進行長鏈多不飽和脂肪酸的提取。多不飽和脂肪酸的提取方法是通過使用有機溶劑系統(tǒng)如甲醇/氯仿、正己烷等從細胞中萃取脂肪成份，再經(jīng)過轉(zhuǎn)甲酯化，得到脂肪酸酯，最后通過柱層析得到進一步純化的脂肪酸成份。
以下所列實施例只供本專利說明之用。
實施例1菌種的保存本發(fā)明實施例所使用的培養(yǎng)基I為NaCl 5g (NH4)2SO42gKCl 2.21gMnCl20.005gCaCl2.2H2O 1.02gZnCl20.01gMgSO4.7H2O 0.92gH3BO30.01g蒸餾水1.0升。
本發(fā)明所用的實驗菌種均保存于添加5g/L葡萄糖的上述培養(yǎng)基中。為了使細胞在培養(yǎng)過程中快速生長，首先要進行預(yù)培養(yǎng)。在藻種的保存過程中，一般都是將藻種所需的營養(yǎng)要求降至最低，以降低它的生長和細胞代謝速度，達到長期保存的目的。在進行正式的培養(yǎng)之前，都要將藻種預(yù)培養(yǎng)，使其從緩慢生長狀態(tài)過渡到快速生長狀態(tài)，并達到一定的細胞濃度。所用的預(yù)培養(yǎng)液體培養(yǎng)基中，用脯氨酸取代培養(yǎng)基I中的NH4SO4所實驗的)脯氨酸和NH4SO4添加量為(1)脯氨酸∶NH4SO4＝0∶2；(2))脯氨酸∶NH4SO4＝0.5∶1；(3)脯氨酸∶NH4SO4＝1∶1；(4))脯氨酸∶NH4SO4＝1.5∶0.5；(5)脯氨酸∶NH4SO4＝2∶0。將一環(huán)藻細胞接種到上述5種培養(yǎng)基中，20℃搖床培養(yǎng)48小時，離心收集細胞，并用水洗兩次，冷凍干燥過夜，稱重。所得結(jié)果見下表。其中添加脯氨酸2.0g/L的培養(yǎng)基II所得的細胞干重最高。這個結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中添加氨基酸可以促進細胞生長，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。
表1.藻種的活化培養(yǎng)基組成
實施例2藻種的異養(yǎng)培養(yǎng)及長鏈多不飽和脂肪酸的生產(chǎn)取一環(huán)ATCC28209細胞接種到培養(yǎng)基II中，在10-20℃搖床中以50-200rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)48小時，細胞濃度達到106時完成預(yù)培養(yǎng)，再以1-20％的接種量接種到蔗糖濃度為20g/L的培養(yǎng)基II中，氮源精氨酸為3g/L，在20-45℃搖床中以100-350rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)96小時。同時以同樣的接種量、同樣的培養(yǎng)條件在光照搖床中培養(yǎng)96小時，同時在培養(yǎng)中通以二氧化碳作為無機碳源。取100ml發(fā)酵液離心收集藻細胞，并用水洗兩次，以去除殘留的培養(yǎng)基，然后進行冷凍干燥。干燥后測得光照條件下細胞產(chǎn)率為0.063g/L/hr，異養(yǎng)培養(yǎng)條件下細胞率為0.078g/L/hr。根據(jù)經(jīng)典的Bligh-Dyer(1959)脂肪酸提取及酯化方法，稱取一定量的凍干細胞，與甲醇∶氯仿∶水＝1∶2∶0.8的混合液一起攪拌30分鐘，得到藻細胞的脂，并由此進行甲酯化，從而得到多不飽和脂肪酸甲酯，進行氣相色譜檢測。經(jīng)色譜確定，兩種培養(yǎng)條件下，藻細胞中脂肪酸含量如下表所示
表二.不同培養(yǎng)條件下藻細胞中多不飽和脂肪酸的組成
實施例3發(fā)酵罐中ATCC28209的異養(yǎng)培養(yǎng)及長鏈多不飽和脂肪酸的生產(chǎn)取一環(huán)ATCC28209細胞接種到培養(yǎng)基II中，在10-20℃搖床中以50-200rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)48小時，細胞濃度達到106時完成預(yù)培養(yǎng)，再以1-20％的接種量接種到1.5L葡萄糖濃度為80g/L和氮源谷氨酸濃度為35g/L的培養(yǎng)基中，在2.4L的發(fā)酵罐中進行攪拌培養(yǎng)。攪拌速度為200-800rpm，通氣量為0.2-2vvm，培養(yǎng)基中溶解氧濃度控制在10-100之間，以聚氧丙烯甘油作為消泡劑，在發(fā)酵過程中維持自然pH值。培養(yǎng)至96小時放罐，這時取樣測定培養(yǎng)基中糖的含量，結(jié)果保持在0-2之間，這說明發(fā)酵已完畢，為正常發(fā)酵。取100ml發(fā)酵液離心收集藻細胞，并用水洗兩次，以去除殘留的培養(yǎng)基，然后進行冷凍干燥。干燥后測得細胞產(chǎn)率為0.64g/L/hr。根據(jù)經(jīng)典的Bligh-Dyer(1959)脂肪酸提取及酯化方法，稱取一定量的凍干細胞，與甲醇∶氯仿∶水＝1∶2∶0.8的混合液一起攪拌30分鐘，得到藻細胞的脂，并由此進行甲酯化，從而得到多不飽和脂肪酸甲酯，進行氣相色譜檢測，藻細胞中脂肪酸含量如表3所示。剩余的培養(yǎng)液經(jīng)離心洗滌后，與正己烷溶液混合攪拌2個小時，進行多不飽和脂肪酸的抽提，所得的多不飽和脂肪酸按Bligh-Dyer(1959)的方法進行酯化及氣相色譜法測定，測得多不飽和脂肪酸的提取率為70％。
表3.2.4L發(fā)酵罐中藻細胞多不飽和脂肪酸的含量
比較實施例3改進的2.4L發(fā)酵罐中ATCC28209的異養(yǎng)培養(yǎng)及多不飽和脂肪酸的生產(chǎn)按與實施例3相同的條件進行藻種的預(yù)培養(yǎng)及發(fā)酵培養(yǎng)，但是在本例中，發(fā)酵罐的通氣口改用砂芯玻璃，這樣提高了培養(yǎng)基中溶解氧的濃度。最后測得干細胞的生產(chǎn)率為0.84g/L，藻細胞中多不飽和脂肪酸的含量見表4。
表4.改進的2.4L發(fā)酵罐中藻細胞多不飽和脂肪酸的含量
實施例416L發(fā)酵罐中ATCC28209的異養(yǎng)培養(yǎng)及多不飽和脂肪酸的生產(chǎn)按與比較實施例3相同的條件下進行ATCC28209的16L罐發(fā)酵培養(yǎng)，采用硅油做為消泡劑，使得培養(yǎng)基中溶氧程度提高。最后得到細胞產(chǎn)率為0.95g/L，DHA的產(chǎn)率為142.5mg/L/hr。
實施例516L發(fā)酵罐中微藻的異養(yǎng)培養(yǎng)及多不飽和脂肪酸的生產(chǎn)按照實施例4的方法培養(yǎng)Schizochytrium sp.ATCC 18915，Schizochytrium aggregatum ATCC 28209，Schizochytrium sp.ATCC 20888，Schizochytrium sp.ATCC 20889，Schizochytrium limacinum SR21，Thraustochytrium roseum ATCC 28211，Schizochytrium mangrovei G13，Thraustochytrium sp.ATCC 18907，并進行細胞產(chǎn)率及多不飽和脂肪酸產(chǎn)量的測定。結(jié)果見表5。
表5.不同藻細胞中DHA和DPA的含量
-為檢測不到因此按以上所述，按照本發(fā)明的方法，通過機械攪拌式發(fā)酵罐利用微藻異養(yǎng)培養(yǎng)方法工業(yè)化生產(chǎn)DHA，可以低成本地穩(wěn)定提供沒有腥味的DHA、DPA及其它長鏈多不飽和脂肪酸，替代現(xiàn)有的從魚油中高成本的提取方法，也減少了季節(jié)和地域的限制。
以上用實施例對本發(fā)明進行了描述。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在上述的基礎(chǔ)之上可以作出多種變動而不脫離本發(fā)明的精神。
權(quán)利要求
1.一種培養(yǎng)基，包括碳源、氮源、無機鹽，其中所述的碳源選自廢糖蜜、玉米粉、蔗糖、果糖、乳糖、葡萄糖、可溶性淀粉二氧化碳或其混合物；所選述的氮源選自有機氮化合物、無機氮化合物或其混合物；所述的無機鹽這一種或多種選自下列的物質(zhì)鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、碳酸鹽鐵鹽、錳鹽、鈷鹽、鉬酸鹽、鋅鹽、硼化物、溴化物及其混合物。
2.權(quán)利要求1的培養(yǎng)基，其中所述的碳源為蔗糖、果糖、乳糖、葡萄糖、可溶性淀粉二氧化碳或其混合物，所述的無機氮化合物包括硝酸銨、硫酸銨、尿素或其混合物，有機氮化合物包括脯氨酸、精氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、蛋白胨、谷氨酸或其混合物。
3.權(quán)利要求1的培養(yǎng)基，其中所述的碳源濃度為10-200g/L，優(yōu)選為8-60g/L，如10-20g/L，最好為20-100g/L；所用的氮源濃度是培養(yǎng)基中碳源濃度的1/2-1/10；所述的無機鹽濃度，以鈉鹽為標準，為0.01-12ppm。
4.權(quán)利要求1的培養(yǎng)基，其pH值為3.0-12.0。
5.一種長鏈多不飽和脂肪酸，包括二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸的生產(chǎn)方法，其包括下列步驟(1)對Thraustothytriaceae藻類進行馴化；(2)經(jīng)馴化后Thraustothytriaceae藻類在權(quán)利要求1的培養(yǎng)基中進行預(yù)培養(yǎng)；(3)經(jīng)預(yù)培養(yǎng)后，進行藻細胞的快速生長和多不飽和脂肪酸的累積；(4)收集細胞和酯化從而得到所需要的長鏈多不飽和脂肪酸。
6.權(quán)利要求5的方法，其中預(yù)培養(yǎng)的溫度為5-30℃，優(yōu)選為10-25℃，更優(yōu)選為10-220℃。
7.權(quán)利要求5的方法，上述的Thraustochytriaceae經(jīng)預(yù)培養(yǎng)后的培養(yǎng)溫度為10-50℃，優(yōu)選為15-45℃，更優(yōu)選為20-45℃，如20-40℃。
8.權(quán)利要求5的方法，其中所述的培養(yǎng)是在通氣和攪拌條件下進行的。
9.權(quán)利要求5的方法，其中所述的培養(yǎng)可以在有光或無光條件下進行。
10.一種Thraustothytriaceae微藻培養(yǎng)方法，包括下列步驟(1)對Thraustothytriaceae微藻在高溫條件下傳代培養(yǎng)進行馴化；(2)對經(jīng)馴化后的Thraustothytriaceae藻類在權(quán)利要求1-7之一的培養(yǎng)基中進行預(yù)培養(yǎng)；(3)經(jīng)預(yù)培養(yǎng)后，再接種到上述的權(quán)利要求1-7之一的培養(yǎng)基中，其中在該步驟培養(yǎng)基中碳源的濃度為預(yù)培養(yǎng)中碳源濃度的1.5-20倍，更優(yōu)選為2-15倍，最優(yōu)選2-10倍。
11.權(quán)利要求8的方法，其中預(yù)培養(yǎng)中脯氨酸與硫酸銨的比例大于2∶1，優(yōu)選大于5∶1，更優(yōu)選大于10∶1，最優(yōu)選，脯氨酸完全代替硫酸銨。
12.權(quán)利要求8的方法，其中預(yù)培養(yǎng)的溫度為5-30℃，優(yōu)選為5-25℃，更優(yōu)選為10-20℃。
13.權(quán)利要求8的方法，上述的Thraustochytriaceae經(jīng)預(yù)培養(yǎng)后的培養(yǎng)溫度為10-50℃，優(yōu)選為15-45℃，更優(yōu)選為20-45℃，如20-40℃。
14.Thraustochytriaceae在生產(chǎn)不飽和脂肪酸，特別是二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用傳統(tǒng)的攪拌式發(fā)酵罐,以異養(yǎng)方式進行海洋微藻培養(yǎng)生產(chǎn)長鏈多不飽和脂肪酸,尤其是二十二碳六烯酸(DHA)和二十二碳五烯酸(DPA)的方法。其中所用的培養(yǎng)基為低鹽度、成份簡單工業(yè)適用的培養(yǎng)基。
文檔編號C12N1/12GK1358839SQ00135338
公開日2002年7月17日 申請日期2000年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月11日
發(fā)明者姜悅, 陳璇, 侯文偉 申請人:姜悅, 陳璇, 侯文偉