專利名稱：一種重組人單鏈白細(xì)胞介素－12的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種由生物技術(shù)制備白細(xì)胞介素12(IL-12)的方法，特別是涉及一種重組人單鏈白細(xì)胞介素-12(rhscIL-12)的構(gòu)建方法，白細(xì)胞介素12(IL-12)是至今已知對(duì)免疫活性細(xì)胞誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)作用最強(qiáng)的多功能細(xì)胞因子，天然IL-12是由兩條多肽鏈通過二硫鍵共價(jià)結(jié)合的異二聚體蛋白，重鏈為P40蛋白，輕鏈為P35蛋白，IL-12只有在P40和P35以1∶1比例形成異二聚體時(shí)才有活性。本發(fā)明前一些研究人員通過分別構(gòu)建P40和P35亞基的質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染或在單一質(zhì)粒中構(gòu)建分別含P40和P35表達(dá)元件的載體，也有人用含有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列的轉(zhuǎn)錄病毒中多順反子轉(zhuǎn)錄子表達(dá)P40和P35，或?qū)40和P35cDNA分別插入重組腺病毒載體的E1區(qū)和E3區(qū)進(jìn)行表達(dá)。這些方法不但復(fù)雜，而且很難達(dá)到P40和P35以1∶1比例形成異二聚體，無(wú)法控制產(chǎn)生有活性的異二聚體蛋白。
本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)單的使IL-12的P40和P35兩條亞基能共同表達(dá)、并能使P40和P35以1∶1形式進(jìn)行自然組合的重組人單鏈白細(xì)胞介素-12(rhscIL-12)的構(gòu)建方法。
本發(fā)明的目的是通過以下方式實(shí)現(xiàn)的一種重組人單鏈白細(xì)胞介素-12的構(gòu)建方法，包括hIL-12(人白細(xì)胞介素12)P40和P35亞單位cDNA的克隆、hIL-12 P40和P35亞單位的基因融合、rhscIL-12(重組人單鏈白細(xì)胞介素-12)真核表達(dá)載體的構(gòu)建，其特征在于通過重組PCR技術(shù)將hIL-12的P40亞單位編碼區(qū)cDNA序列的3′端和P35亞單位編碼區(qū)cDNA序列的5′端，通過一個(gè)疏水性多肽的人工接頭(Linker)進(jìn)行拼接，構(gòu)建rhIL-12(重組人白細(xì)胞介素12)P40-Linker-P35單鏈融合基因，并在真核細(xì)胞中表達(dá)得到rhscIL-12(重組人單鏈白細(xì)胞介素-12)。
具體方法是以PDBu刺激人B淋巴母細(xì)胞株NC37細(xì)胞提取mRNA，以RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增hIL-12P40和P35亞單位cDNA，將獲得的P40亞單位編碼區(qū)cDNA序列的3′端和P35亞單位編碼區(qū)cDNA序列的5′端，用一個(gè)編碼疏水性多肽的人工接頭——15氨基酸殘基，通過重組PCR技術(shù)進(jìn)行拼接，構(gòu)建出rhIL-12P40-Linker-P35單鏈融合基因，插入pcDNA3.1真核表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建rhscIL-12(重組人單鏈白細(xì)胞介素-12)融合基因真核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞cos7，表達(dá)有活性的rhseIL-12。
與已有技術(shù)相比，本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)是采用了公認(rèn)的Linker即15個(gè)氨基酸殘基的多肽接頭，(它具有良好的柔順性和折疊性，并具有足夠的長(zhǎng)度保證單鏈IL-12融合蛋白形成與天然IL-12類似的空間構(gòu)象，)通過重組PCR對(duì)P40的3端和P35的5端進(jìn)行拼接，構(gòu)建出rhIL-12P40-Linker-P35單鏈融合基因，使P40和P35以1∶1的匹配形式形成異二聚體，保證了IL-12的活性，并可在一個(gè)啟動(dòng)子的控制之下翻譯表達(dá)活性蛋白，達(dá)到控制產(chǎn)生異二聚體的目的。本發(fā)明可在生物工程領(lǐng)域的生產(chǎn)單位實(shí)施，實(shí)施本發(fā)明得到的產(chǎn)品—重組人單鏈白細(xì)胞介素-12(rhscIL-12)可廣泛應(yīng)用于免疫和瘤腫疾病的治療。
動(dòng)物體外實(shí)驗(yàn)證明，rhscIL-12具有增強(qiáng)T淋巴細(xì)細(xì)胞增生活性、刺激T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生干擾素、刺激自然殺傷細(xì)胞增生、增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞活性、抑制單純皰疹病毒復(fù)制、抑制肝癌細(xì)胞系增生的功能。動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)證明，rhscIL-12可使裸鼠的移植性人肝癌完全消退。實(shí)驗(yàn)過程中，未發(fā)現(xiàn)所使用rhscIL-12對(duì)裸鼠有任何毒性。
實(shí)施例一、hIL-12(人白細(xì)胞介素-12)P40和P35亞單位cDNA的克隆Nc37細(xì)胞株培養(yǎng)→Nc37細(xì)胞mRNA提取——RT-PCR合成IL-12P40和P35cDNA(具體步驟按Promege公司Access RT-PCR system說(shuō)明進(jìn)行)。分別插入pGEM-Teasy載體。
二、重組人單鏈IL-12(rhscIL-12)融合基因構(gòu)建rhscIL-12P40和P35亞單位cDNA在一編碼具柔性的疏水性多肽DNA片段的連接下構(gòu)成人單鏈IL-12融合基因(rhscIL-12)。用于重組PCR的內(nèi)引物根據(jù)Linker序列，P40 3端序列、P35 5序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，以overlapping extension原理進(jìn)行基因重組。Linker為15氨基酸殘基的疏水性多肽。具體步驟以PCR分別擴(kuò)增hIL-12P35和P40cDNA，以pGMET-P40和pGEMT-P35質(zhì)粒為模板，分別用P40和P35內(nèi)外引物進(jìn)行擴(kuò)增，并在真核細(xì)胞中表達(dá)，獲得加有Linker互補(bǔ)序列的P40和P35PCR產(chǎn)物——重組人單鏈IL-12(rhscIL-12)。
權(quán)利要求
1.一種重組人單鏈白細(xì)胞介素-12的構(gòu)建方法，包括hIL-12(人白細(xì)胞介素12)P40和P35亞單位cDNA的克隆、hIL-12 P40和P35亞單位的基因融合、rhscIL-12(重組人單鏈白細(xì)胞介素-12)真核表達(dá)載體的構(gòu)建，其特征在于通過重組PCR技術(shù)將hIL-12的P40亞單位編碼區(qū)cDNA序列的3′端和P35亞單位編碼區(qū)cDNA序列的5′端，通過一個(gè)疏水性多肽的人工接頭(Linker)進(jìn)行拼接，構(gòu)建rhIL-12(重組人白細(xì)胞介素12)P40-Linker-P35單鏈融合基因，并在真核細(xì)胞中表達(dá)得到rhscIL-12(重組人單鏈白細(xì)胞介素-12)。
全文摘要
白細(xì)胞介素12(IL－12)是至今已知對(duì)免疫活性細(xì)胞誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)作用最強(qiáng)的多功能細(xì)胞因子,IL－12只有在P40和P35以1∶1比例形成異二聚體時(shí)才有活性。本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單方法,使IL－12的P40和P35兩條亞基能共同表達(dá)、能使P40和P35以1∶1形式進(jìn)行自然組合的重組人單鏈白細(xì)胞介素－12(rhscIL－12)并保持原有的生物活性。本發(fā)明可在生物工程領(lǐng)域的生產(chǎn)單位實(shí)施,可廣泛應(yīng)用于免疫和瘤腫疾病的治療。
文檔編號(hào)C12N15/19GK1318644SQ0011378
公開日2001年10月24日 申請(qǐng)日期2000年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月18日
發(fā)明者司履生, 王一理 申請(qǐng)人:西安醫(yī)科大學(xué)