一種辣木高效再生方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種辣木高效再生方法。本發(fā)明方法通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，克服了辣木葉片再生難的問(wèn)題，提供一種以辣木葉片為外植體的辣木高效再生方法。該方法可擺脫外界條件的影響，規(guī)?；凸S化生產(chǎn)出健壯、整齊一致的辣木組培幼苗；與已經(jīng)報(bào)道的以下胚軸、莖節(jié)、莖尖作為外植體構(gòu)建再生體系相比，具有操作方便、取材廣泛、可重復(fù)性強(qiáng)及效率高等優(yōu)勢(shì)；不僅能滿足市場(chǎng)對(duì)種苗的需求，并且可以通過(guò)轉(zhuǎn)基因研究對(duì)辣木種質(zhì)資源進(jìn)行改良和創(chuàng)新，為辣木種質(zhì)資源可持續(xù)利用奠定基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】
一種辣木高效再生方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種辣木高效再生方法。
【背景技術(shù)】
[0002]辣木(Moringa Oleifera)是一種有獨(dú)特經(jīng)濟(jì)價(jià)值的辣木科(Moringaceae)辣木屬植物。原產(chǎn)于印度喜馬拉雅山、非洲等熱帶地區(qū)，后來(lái)被很多國(guó)家引種栽培。目前，在巴基斯坦、印度、中國(guó)、美國(guó)、巴西、東南亞等熱帶、亞熱帶國(guó)家和地區(qū)都有分布。辣木為多年生常綠或落葉小喬木，喜溫耐旱，抗逆性強(qiáng)。它是一種典型的多功能植物，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，全身是寶，有著悠久的食用歷史，在國(guó)外有“神奇之樹(shù)”、“母親最好的朋友”、“醫(yī)藥百寶箱”等美名，是一種極具發(fā)展前景的樹(shù)種。
[0003]目前辣木主要是通過(guò)播種育苗繁育，但種子不耐貯藏，一年后種子活力就下降50%，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，種子萌發(fā)率越來(lái)越低，而且辣木種子價(jià)格昂貴。為了節(jié)約生產(chǎn)成本，提高苗木質(zhì)量和移栽成活率，國(guó)內(nèi)外開(kāi)始對(duì)提高辣木種苗繁殖率進(jìn)行深入研究。扦插對(duì)木本需求量大，且目前也還未建立起高效的辣木扦插繁殖體系。因此，采用傳統(tǒng)的種子繁殖和扦插繁殖均不能在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的種苗滿足市場(chǎng)需求，而通過(guò)組織培養(yǎng)的方式可以解決該問(wèn)題。隨著辣木全基因組測(cè)序的完成，辣木育種也必將進(jìn)入分子育種時(shí)代，辣木遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建顯得尤為重要，而高效的再生體系是遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建的前提。
[0004]關(guān)于辣木的組織培養(yǎng)，國(guó)內(nèi)外已有幾篇成功報(bào)道，主要以莖節(jié)、莖尖、下胚軸為外植體建立再生體系，認(rèn)為莖節(jié)和下胚軸的再生能力最好，而以葉片為外植體建立辣木再生體系的研究則無(wú)成功報(bào)道。相對(duì)于莖節(jié)和下胚軸，葉片作為再生及遺傳轉(zhuǎn)化的外植體有其優(yōu)勢(shì)，取材方便、操作容易、來(lái)源廣泛，有利于再生及遺傳轉(zhuǎn)化的重復(fù)進(jìn)行等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的辣木葉片再生難的問(wèn)題，提供一種操作更簡(jiǎn)便、取材更廣泛的以辣木葉片為外植體的辣木高效再生方法，利用該方法能夠在短期內(nèi)快速獲得大量?jī)?yōu)質(zhì)的辣木種苗，提高辣木再生能力，并為種質(zhì)資源保護(hù)和基因工程研究提供有效的參考價(jià)值。
[0006]本發(fā)明的辣木高效再生方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0007]A、無(wú)菌苗的獲得:將辣木種子去殼，在水中浸泡8?24h，經(jīng)消毒后將種子播種于固體MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到無(wú)菌苗，切取無(wú)菌苗的小葉作為外植體;培養(yǎng)溫度25 土 2°C，光照強(qiáng)度25001x，光照時(shí)間12h/d。
[0008]B、芽的誘導(dǎo)及伸長(zhǎng):將小葉接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)誘導(dǎo)不定芽，接種時(shí)小葉遠(yuǎn)軸面朝上，培養(yǎng)條件為溫度25±2°C，光照強(qiáng)度25001x，光照時(shí)間12h/d;培養(yǎng)至外植體上有芽點(diǎn)出現(xiàn)時(shí)，將外植體轉(zhuǎn)移到芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上在相同條件下培養(yǎng)誘導(dǎo)不定芽伸長(zhǎng)。
[0009]所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基:每升含有BA 0.8?1.2mg、KT 0.05?0.2mg、NAA0.05mg、蔗糖30g和瓊脂4.5g，余量為MS培養(yǎng)基。
[0010] 所述的芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基:每升含有BA0.4?0.6mg、NAA 0.05mg、蔗糖30g和瓊脂4.5g，
余量為MS培養(yǎng)基。
[0011 ] C、生根培養(yǎng):待不定芽伸長(zhǎng)到3?4cm時(shí)，切取不定芽，接種于生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)誘導(dǎo)生根，得到生根苗;培養(yǎng)條件為溫度25±2°C，光照強(qiáng)度25001x，光照時(shí)間12h/d。
[0012]所述的生根培養(yǎng)基:每升含有NAA0.1?0.2mg、蔗糖30g和瓊脂4.5g，余量為MS培養(yǎng)基，pH 5.8?6.0。
[0013]D、煉苗及移栽:將生根苗取出，洗凈根上的培養(yǎng)基，將生根苗在水中浸泡2h，移栽到泥炭土上，進(jìn)行培養(yǎng)管理，得到辣木植株。
[0014]優(yōu)選，所述的步驟A的消毒是將辣木種子用體積分?jǐn)?shù)75%酒精滅菌50s，無(wú)菌水沖洗1-3次，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%升汞滅菌15?20min，無(wú)菌水沖洗3?5次。
[0015]優(yōu)選，所述的步驟D的進(jìn)行培養(yǎng)管理是在移栽的生根苗上套上塑料袋保濕，在移栽3d后逐漸移開(kāi)塑料袋，適時(shí)澆水。
[0016]優(yōu)選，所述的步驟D的泥炭土為高溫滅菌過(guò)的泥炭土。
[0017]所述的步驟A的固體MS培養(yǎng)基每升含有蔗糖30g和瓊脂4.5g，余量為MS培養(yǎng)基。
[0018]所述的MS培養(yǎng)基為國(guó)際通用的培養(yǎng)基，其成份和配置方法見(jiàn)MurashigeT1SkoogF(1962)A revised medium for rapid growth and b1assay with tobacco tissuecultures.Phys1l Plant 15:473-497。
[0019]本發(fā)明的辣木高效再生方法，可擺脫外界條件的影響，規(guī)?；凸S化生產(chǎn)出健壯、整齊一致的辣木組培幼苗；與已經(jīng)報(bào)道的以下胚軸、莖節(jié)、莖尖作為外植體構(gòu)建再生體系相比，具有操作方便、取材廣泛、可重復(fù)性強(qiáng)及效率高等優(yōu)勢(shì)。該方法不僅能滿足市場(chǎng)對(duì)種苗的需求，并且可以通過(guò)轉(zhuǎn)基因研究對(duì)辣木種質(zhì)資源進(jìn)行改良和創(chuàng)新，為辣木種質(zhì)資源可持續(xù)利用奠定基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1為消毒后種子在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)25d天后得到的無(wú)菌苗。
[0021]圖2為小葉外植體在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)20d后長(zhǎng)出的芽。
[0022]圖3為長(zhǎng)芽的外植體在芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)20d后伸長(zhǎng)的不定芽。
[0023]圖4為伸長(zhǎng)的不定芽在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)后誘導(dǎo)生出的根。
[0024]圖5為煉苗成活的辣木植株。
【具體實(shí)施方式】
[0025]以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0026]實(shí)施例1
[0027]A、無(wú)菌苗的獲得:將辣木種子去殼，在水中浸泡24h;在無(wú)菌超凈臺(tái)上，用體積分?jǐn)?shù)75 %酒精滅菌50s，無(wú)菌水沖洗3次，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1 %升汞滅菌20min，無(wú)菌水徹底沖洗5次，將種子播種于固體MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25 土 2°C，光照強(qiáng)度25001x，光照時(shí)間12h/d。種子培養(yǎng)7d左右開(kāi)始萌芽，25d后，無(wú)菌苗(如圖1所示)葉片舒展開(kāi)來(lái)，切取單個(gè)小葉作為外植體。
[0028]B、芽的誘導(dǎo)及伸長(zhǎng):將小葉接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)誘導(dǎo)不定芽，接種時(shí)小葉遠(yuǎn)軸面朝上;培養(yǎng)條件為溫度25土 2°C，光照強(qiáng)度25001x，光照時(shí)間12h/d。培養(yǎng)20d后，外植體上開(kāi)始有芽點(diǎn)出現(xiàn)(如圖2所示)，將長(zhǎng)芽的外植體轉(zhuǎn)移到芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上在相同條件下培養(yǎng)誘導(dǎo)不定芽伸長(zhǎng)，培養(yǎng)20d后伸長(zhǎng)的不定芽如圖3所示。所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基:每升含有BAl.2mg、KT 0.2mg、ΝΑΑΟ.05mg、蔗糖30g和瓊脂4.5g，余量為MS培養(yǎng)基;配制方法是將上述成份混合均勻，然后滅菌備用。所述的芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基:每升含有BA0.6mg、NAA0.05mg、蔗糖30g和瓊脂4.5g，余量為MS培養(yǎng)基;配制方法是將上述成份混合均勻，然后滅菌備用。
[0029]C、生根培養(yǎng):待不定芽伸長(zhǎng)到4cm時(shí)，切取不定芽，接種于生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)誘導(dǎo)生根，生根培養(yǎng)20d后，不定芽長(zhǎng)出多條根得到生根苗，生根情況如圖4所示;培養(yǎng)條件為溫度25 ± 2°C，光照強(qiáng)度25001X，光照時(shí)間12h/d。所述的生根培養(yǎng)基:每升含有NAA0.2mg、蔗糖30g和瓊脂4.5g，余量為MS培養(yǎng)基，pH6.0;配制方法是將上述成份混合均勻后，調(diào)pH值，然后滅菌備用。
[0030]D、煉苗及移栽:小心將生根苗從培養(yǎng)瓶中挖出，洗凈根上的培養(yǎng)基，將生根苗在自來(lái)水中浸泡2h，移栽到滅菌過(guò)的泥炭土上，在營(yíng)養(yǎng)杯上套上塑料袋保濕，3d后慢慢地移開(kāi)塑料袋，按生長(zhǎng)需求澆水。煉苗成活的辣木植株如圖5所示。
[0031]實(shí)施例2
[0032]A、無(wú)菌苗的獲得:將辣木種子去殼，在水中浸泡16h;在無(wú)菌超凈臺(tái)上，用體積分?jǐn)?shù)75%酒精滅菌50s，無(wú)菌水沖洗3次，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1 %升汞滅菌18min，無(wú)菌水徹底沖洗5次，將種子播種于固體MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25 土 2°C，光照強(qiáng)度25001x，光照時(shí)間12h/d。種子培養(yǎng)7d左右開(kāi)始萌芽，20d后，無(wú)菌苗葉片舒展開(kāi)來(lái)，切取單個(gè)小葉作為外植體。
[0033]B、芽的誘導(dǎo)及伸長(zhǎng):將小葉接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)誘導(dǎo)不定芽，接種時(shí)小葉遠(yuǎn)軸面朝上;培養(yǎng)條件為溫度25±2°C，光照強(qiáng)度25001x，光照時(shí)間12h/d。培養(yǎng)25d后，外植體上開(kāi)始有芽點(diǎn)出現(xiàn)，將長(zhǎng)芽的外植體轉(zhuǎn)移到芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上在相同條件下培養(yǎng)誘導(dǎo)不定芽伸長(zhǎng)。所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基:每升含有BA 1.0mg,KT 0.121^、嫩40.0511^、鹿糖3(^和瓊脂4.5g，余量為MS培養(yǎng)基;配制方法是將上述成份混合均勻，然后滅菌備用。所述的芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基:每升含有BA0.5mg,NAA 0.05mg、蔗糖30g和瓊脂4.5g，余量為MS培養(yǎng)基;配制方法是將上述成份混合均勻，然后滅菌備用。
[0034]C、生根培養(yǎng):待不定芽伸長(zhǎng)到4cm時(shí)，切取不定芽，接種于生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)誘導(dǎo)生根，生根培養(yǎng)20d后，不定芽長(zhǎng)出多條根得到生根苗;培養(yǎng)條件為溫度25±2°C，光照強(qiáng)度25001x，光照時(shí)間12h/d。所述的生根培養(yǎng)基:每升含有NAA0.15mg、蔗糖30g和瓊脂4.5g，余量為MS培養(yǎng)基，pH5.9;配制方法是將上述成份混合均勻后，調(diào)pH值，然后滅菌備用。
[0035]D、煉苗及移栽:小心將生根苗從培養(yǎng)瓶中挖出，洗凈根上的培養(yǎng)基，將生根苗在自來(lái)水中浸泡2h，移栽到滅菌過(guò)的泥炭土上，在營(yíng)養(yǎng)杯上套上塑料袋保濕，3d后慢慢地移開(kāi)塑料袋，按生長(zhǎng)需求澆水。由此培養(yǎng)得到健康成活的辣木植株。
[0036]實(shí)施例3
[0037]A、無(wú)菌苗的獲得:將辣木種子去殼，在水中浸泡8h;在無(wú)菌超凈臺(tái)上，用體積分?jǐn)?shù)75%酒精滅菌50s，無(wú)菌水沖洗I次，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1 %升汞滅菌15min，無(wú)菌水徹底沖洗3次，將種子播種于固體MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25 土 2°C，光照強(qiáng)度25001x，光照時(shí)間12h/d。種子培養(yǎng)7d左右開(kāi)始萌芽，15d后，無(wú)菌苗葉片舒展開(kāi)來(lái)，切取單個(gè)小葉作為外植體。
[0038]B、芽的誘導(dǎo)及伸長(zhǎng):將小葉接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)誘導(dǎo)不定芽，接種時(shí)小葉遠(yuǎn)軸面朝上;培養(yǎng)條件為溫度25 ± 2°C，光照強(qiáng)度25001X，光照時(shí)間12h/d。培養(yǎng)15d后，外植體上開(kāi)始有芽點(diǎn)出現(xiàn)，將長(zhǎng)芽的外植體轉(zhuǎn)移到芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上在相同條件下培養(yǎng)誘導(dǎo)不定芽伸長(zhǎng)。所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基:每升含有BA 0.8mg、KT 0.05mg、NAA0.05mg、蔗糖30g和瓊脂4.5g，余量為MS培養(yǎng)基;配制方法是將上述成份混合均勻，然后滅菌備用。所述的芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基:每升含有BA0.4mg,NAA 0.05mg、蔗糖30g和瓊脂4.5g，余量為MS培養(yǎng)基;配制方法是將上述成份混合均勻，然后滅菌備用。
[0039]C、生根培養(yǎng):待不定芽伸長(zhǎng)到3cm時(shí)，切取不定芽，接種于生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)誘導(dǎo)生根，生根培養(yǎng)20d后，不定芽長(zhǎng)出多條根得到生根苗;培養(yǎng)條件為溫度25±2°C，光照強(qiáng)度2500Ix，光照時(shí)間12h/d。所述的生根培養(yǎng)基:每升含有NAA0.1mg、蔗糖30g和瓊脂4.5g，余量為MS培養(yǎng)基，pH5.8。
[0040]D、煉苗及移栽:小心將生根苗從培養(yǎng)瓶中挖出，洗凈根上的培養(yǎng)基，將生根苗在自來(lái)水中浸泡2h，移栽到滅菌過(guò)的泥炭土上，在營(yíng)養(yǎng)杯上套上塑料袋保濕，3d后慢慢地移開(kāi)塑料袋，按生長(zhǎng)需求澆水。由此培養(yǎng)得到健康成活的辣木植株。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種辣木高效再生方法，其特征在于，包括以下步驟: A、無(wú)菌苗的獲得:將辣木種子去殼，在水中浸泡8?24h，經(jīng)消毒后將種子播種于固體MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到無(wú)菌苗，切取無(wú)菌苗的小葉作為外植體； B、芽的誘導(dǎo)及伸長(zhǎng):將小葉接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)誘導(dǎo)不定芽，接種時(shí)小葉遠(yuǎn)軸面朝上，培養(yǎng)至外植體上有芽點(diǎn)出現(xiàn)時(shí)，將外植體轉(zhuǎn)移到芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上在相同條件下培養(yǎng)誘導(dǎo)不定芽伸長(zhǎng)；所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基:每升含有BA 0.8?1.2mg、KT 0.05?0.2mg、NAA0.05mg、蔗糖30g和瓊脂4.5g，余量為MS培養(yǎng)基;所述的芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基:每升含有BA0.4?0.6mg、NAA 0.05mg、鹿糖30g和瓊脂4.5g，余量為MS培養(yǎng)基； C、生根培養(yǎng):待不定芽伸長(zhǎng)到3?4cm時(shí)，切取不定芽，接種于生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)誘導(dǎo)生根，得到生根苗;所述的生根培養(yǎng)基:每升含有NAA0.1?0.2mg、蔗糖30g和瓊脂4.5g，余量為MS培養(yǎng)基，pH 5.8?6.0; D、煉苗及移栽:將生根苗取出，洗凈根上的培養(yǎng)基，將生根苗在水中浸泡2h，移栽到泥炭土上，進(jìn)行培養(yǎng)管理，得到辣木植株。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟A的消毒是將辣木種子用體積分?jǐn)?shù)75%酒精滅菌50s，無(wú)菌水沖洗1-3次，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%升汞滅菌15?20min，無(wú)菌水沖洗3?5次。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟A的固體MS培養(yǎng)基每升含有蔗糖30g和瓊脂4.5g，余量為MS培養(yǎng)基。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟A、B和C的培養(yǎng)條件為溫度25±20C，光照強(qiáng)度25001x，光照時(shí)間12h/d。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟D的進(jìn)行培養(yǎng)管理是在移栽的生根苗上套上塑料袋保濕，在移栽3d后逐漸移開(kāi)塑料袋，適時(shí)澆水。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟D的泥炭土為高溫滅菌過(guò)的泥炭土。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK105961197SQ201610300811
【公開(kāi)日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年5月9日
【發(fā)明人】張俊杰, 陳曉陽(yáng), 楊躍生, 丁美美, 陳涵斌, 林孟飛
【申請(qǐng)人】華南農(nóng)業(yè)大學(xué)