[0047] 圖4示本發(fā)明實施例1提供的保存液（樣品組）胎盤保存24h后，分離的間充質(zhì) 干細胞的流式檢測結(jié)果；
[0048] 圖5示空白對照組（不加抗體）的保存液胎盤保存24h后，分離的間充質(zhì)干細胞 的流式檢測結(jié)果；
[0049] 圖6示本發(fā)明實施例1提供的保存液（樣品組）胎盤保存24h后，分離的間充質(zhì) 干細胞的流式檢測結(jié)果；
[0050] 圖7示空白對照組（不加抗體）的保存液胎盤保存24h后，分離的間充質(zhì)干細胞 的流式檢測結(jié)果；
[0051] 圖8示本發(fā)明實施例1提供的保存液（樣品組）胎盤保存24h后，分離的間充質(zhì) 干細胞的流式檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0052] 本發(fā)明公開了一種組合物及其用途、胎盤保存制劑及其制備方法，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動 對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用 已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對 本文所述的方法和應(yīng)用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0053] 本發(fā)明提供的組合物及其用途、胎盤保存制劑及其制備方法中所用原料及試劑均 可由市場購得。其中，Ix青-鏈霉素（雙抗）購自Gibco公司，每毫升包含10000單位青霉 素（堿）和10000 μ g鏈霉素（堿），利用〇· 85%鹽液形式的青霉素 G (鈉鹽）和硫酸鏈霉 素。
[0054] 下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明：
[0055] 實施例1保存液的制備：
[0056] 枸櫞酸鈉緩沖溶液配制：稱取枸櫞酸鈉粉末26. 3g、枸櫞酸粉末3. 27g、葡萄糖 12. 7g、磷酸二氫鈉4. 44g、腺嗓呤0. 55g，把上述各組分溶于400mL的去離子水中，充分攪拌 混勻后形成5倍枸櫞酸鹽緩沖溶液，0. 22 μ m過濾，分裝。
[0057] 維生素 C溶液配制：稱取維生素 C粉末，溶解于I級水中，形成0. 5mg/mL的維生素 C溶液，0.22 μ m過濾，分裝。
[0058] N-乙酰半胱氨酸：稱取N-乙酰半胱氨酸粉末，溶解于I級水中，形成5mmol/L的 維生素 C溶液，0. 22 μ m過濾，分裝。
[0059] 臍血漿：把臍血轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，封口后2500rpm離心15min，吸取上層淡黃 色血漿至新的離心管中，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0060] 制備保存液JOOmLPBS中含有Ix枸櫞酸鈉、8 %臍血漿、2x青-鏈霉素（雙抗）、 0· lmg/mL的罌粟堿、5mmol/L N-乙酰半胱氨酸、0· 5mg/mL維生素 C。
[0061] 實施例2保存液的制備：
[0062] 枸櫞酸鈉緩沖溶液配制：稱取枸櫞酸鈉粉末26. 3g、枸櫞酸粉末3. 27g、葡萄糖 12. 7g、磷酸二氫鈉4. 44g、腺嗓呤0. 55g，把上述各組分溶于400mL的去離子水中，充分攪拌 混勻后形成5倍枸櫞酸鹽緩沖溶液，0. 22 μ m過濾，分裝。
[0063] 維生素 C溶液配制：稱取維生素 C粉末，溶解于I級水中，形成0. 5mg/mL的維生素 C溶液，0.22 μ m過濾，分裝。
[0064] N-乙酰半胱氨酸：稱取N-乙酰半胱氨酸粉末，溶解于I級水中，形成5mmol/L的 維生素 C溶液，0. 22 μ m過濾，分裝。
[0065] 臍血漿：把臍血轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，封口后2500rpm離心15min，吸取上層淡黃 色血漿至新的離心管中，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0066] 制備保存液：PBS中含有2x枸櫞酸鈉、5%臍血漿、Ix青-鏈霉素（雙抗）、0.05mg/ mL的罌粟堿、lmmol/L N-乙酰半胱氨酸、5mg/mL維生素 C。
[0067] 實施例3保存液的制備：
[0068] 枸櫞酸鈉緩沖溶液配制：稱取枸櫞酸鈉粉末26. 3g、枸櫞酸粉末3. 27g、葡萄糖 12. 7g、磷酸二氫鈉4. 44g、腺嗓呤0. 55g，把上述各組分溶于400mL的去離子水中，充分攪拌 混勻后形成5倍枸櫞酸鹽緩沖溶液，0. 22 μ m過濾，分裝。
[0069] 維生素 C溶液配制：稱取維生素 C粉末，溶解于I級水中，形成0. 5mg/mL的維生素 C溶液，0.22 μ m過濾，分裝。
[0070] N-乙酰半胱氨酸：稱取N-乙酰半胱氨酸粉末，溶解于I級水中，形成5mmol/L的 維生素 C溶液，0. 22 μ m過濾，分裝。
[0071] 臍血漿：把臍血轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，封口后2500rpm離心15min，吸取上層淡黃 色血漿至新的離心管中，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0072] 制備保存液：PBS中含有IX枸櫞酸鈉、10%臍血漿、2X青-鏈霉素（雙抗）、 0· 01mg/mL的罌粟堿、3mmol/L N-乙酰半胱氨酸、3mg/mL維生素 C。
[0073] 實施例4胎盤保存
[0074] 胎盤運輸：把實施例1配制好的胎盤保存液在中保存，與胎盤采集盒一并運送至 醫(yī)院中。由醫(yī)護人員把新鮮采集的胎盤放置在胎盤采集盒中，并把4°C胎盤保存液轉(zhuǎn)移至胎 盤中（胎盤保存液應(yīng)浸沒胎盤）；封好采集盒蓋子后置于4°C中保存。
[0075] 實施例5胎盤運輸：
[0076] 實施例4保存后的離體胎盤分別在24h、48h、96h小時內(nèi)進入實驗程序（運輸過程 應(yīng)保持4°C )。
[0077] 實施例6對實施例5獲得的保存、運輸后的胎盤提取間充質(zhì)干細胞的質(zhì)量評價
[0078] ① 細胞質(zhì)量評價（活力與體積、貼壁率、形態(tài)、增殖速度、表面抗原）
[0079] a.活力與體積檢測：
[0080] 常規(guī)方法獲得胎盤間充質(zhì)干細胞。（胎盤干細胞的原代分離方法可以按照《不同 消化分離方法分離人羊膜間充質(zhì)干細胞效果比較》中最優(yōu)的酶解方案進行原代分離）
[0081] 取剛分離出來的胎盤干細胞，調(diào)整細胞密度為IX 106cell/mL。按細胞懸液：0.4% 臺盼藍=3:1 (v:v)充分混勾，取20uL細胞混勾液加入細胞計數(shù)板中，用Countstar細胞計 數(shù)器進行細胞活率及體積檢測。
[0082] b.貼壁率：
[0083] 胎盤間充質(zhì)干細胞在分離培養(yǎng)（用Lonza完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。Lonza完全培養(yǎng) 的組分為：無血清培養(yǎng)基（Lonza UltraQJLTURETM) +血清替代物（PALL Ultroser G)+IX 谷氨酰胺+1 X NEAA)后，調(diào)整密度為5 X IO5CelΙ/mL，接種8mL至直徑為9cm的平皿中，待其 自然貼壁生長48小時后，去除未貼壁的細胞后，用0.25%胰蛋白酶進行酶解，計算出貼壁 細胞的數(shù)量，從得出貼壁率。
[0084] c.形態(tài)檢測：取處于對數(shù)生長期的胎盤干細胞，置倒置顯微鏡下觀察細胞的形 ??τ O
[0085] d.增殖速度
[0086] 細胞接種后48h后，進行換液處理；每隔48h取一皿細胞進行酶解，直至該批批細 胞融合度達100%，統(tǒng)計細胞數(shù)量，得出細胞增殖速度。
[0087] e.流式結(jié)果檢測
[0088] 取處于對數(shù)生長期的胎盤干細胞，調(diào)整細胞密度為I X IO6的細胞懸液，分別取抗 人 CD105、、CD90、CD73、CD45、CD34、HLA-DR 的單克隆抗體各 2. 5 μ L，加入細胞懸液 500 μ L， 室溫下避光孵育20min，同時設(shè)立空白同型對照，1500r/min離心5min，棄上清，用含10% FBS的PBS洗滌2遍，用500 μ L 1640重懸后上機檢測。
[0089] 細胞的質(zhì)量檢測：
[0090] ①胎盤保存24h、48h、96h后，分離細胞的活力和體積，見圖I (A)、圖I (B)、圖I (C) 和表1 :
[0091] 表1分離細胞的活力
[0092]
【主權(quán)項】
1. 一種組合物，其特征在于，包括緩沖液、抗血凝劑、血漿、雙抗、氨基酸和維生素。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，包括PBS、枸櫞酸鈉、血漿、雙抗、N-乙 酰半胱氨酸和維生素C。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其特征在于，所述PBS中含有Ix~2x枸櫞酸鈉 緩沖液、5%~10% (v/v)的臍血漿、Ix~2x雙抗、終濃度為0?Ol~0?lmg/mL的罌粟堿、 終濃度為1~5mmol/L的N-乙酰半胱氨酸溶液、終濃度為0. 5~5mg/mL的維生素C溶液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于，所述枸櫞酸鈉緩沖液的制備方法為：取 枸橡酸鈉26. 3質(zhì)量份、枸橡酸粉末3. 27質(zhì)量份、葡萄糖12. 7質(zhì)量份、磷酸二氫鈉4. 44質(zhì) 量份、腺嘌呤〇. 55質(zhì)量份，溶于400質(zhì)量份的水中，混合，獲得5倍枸橡酸鹽緩沖溶液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的組合物，其特征在于，所述臍血漿的制備方法為：取臍 血，于2500rpm離心15min，吸取上層淡黃色血衆(zhòng)，4°C保存?zhèn)溆谩?br>6. 根據(jù)權(quán)利要求3至5任一項所述的組合物，其特征在于，所述N-乙酰半胱氨酸溶液 的制備方法為：取N-乙酰半胱氨酸，溶于水中，形成5mmol/L的維生素C溶液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項所述的組合物在制備胎盤保存制劑中的應(yīng)用。
8. -種胎盤保存制劑，其特征在于，包括如權(quán)利要求1至6任一項所述的組合物。
9. 一種如權(quán)利要求8所述的胎盤保存制劑的制備方法，其特征在于，取所述抗血凝劑、 所述血漿、所述雙抗、所述氨基酸和所述維生素溶于所述緩沖液。
10. -種胎盤的保存方法，其特征在于，采用如權(quán)利要求8所述的胎盤保存制劑保存所 述胎盤。
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及組合物及其用途、胎盤保存制劑及其制備方法。本發(fā)明首次采用了臍血漿作為胎盤間充質(zhì)干細胞保存液的營養(yǎng)成分，不僅為種子細胞提供多元的營養(yǎng)物質(zhì)，維持細胞活力，還能很好的胎盤間充質(zhì)干細胞原有細胞形態(tài)及生物特性。添加了N-乙酰半胱氨酸、維生素C等還原劑和抗氧化劑，大大的提高了胎盤間充質(zhì)干細胞的抵抗能力。在24h內(nèi)仍能很好的維持胎盤間充質(zhì)干細胞的活力。
【IPC分類】A01N1-02
【公開號】CN104839146
【申請?zhí)枴緾N201510289535
【發(fā)明人】王一飛, 陳海佳, 葛嘯虎, 盧瑞珊, 王小燕, 李平, 馬巖巖
【申請人】廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年5月29日