野木瓜種苗的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用植物組織培養(yǎng)方式綜合處理進(jìn)行野木瓜培養(yǎng)快繁以獲得大量種苗的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]野木瓜(Stauntoniachinensis DC.)為木通科(Lardizabalaceae)野木瓜屬(Stauntonia)木質(zhì)藤本植物。野生分布于廣東、廣西、香港、湖南、貴州、云南、安徽、浙江、江西、福建等地。生于海拔500-1300米的山地密林、山腰灌叢或山谷溪邊疏林中。其具有掌狀復(fù)葉5-7片，且葉色濃綠，有光澤，是一種具有很高觀賞價(jià)值的藤本植物，可作為垂直綠化的良好材料。此外野木瓜花期3-4月，果期6-10月，果長(zhǎng)圓形，長(zhǎng)7-10厘米，直徑3-5厘米，果肉可食用，可作為水果品種開(kāi)發(fā)。此外野木瓜全株可藥用，民間記載有舒筋活絡(luò)、鎮(zhèn)痛排膿、解熱利尿、通經(jīng)導(dǎo)濕的作用，可用于治腋部生癰、膀胱炎、風(fēng)濕骨痛、跌打損傷、水腫腳氣等。據(jù)研宄，其對(duì)三叉神經(jīng)痛、坐骨神經(jīng)痛也有較好的療效。因此野木瓜可作為一種具有綜合開(kāi)發(fā)價(jià)值的植物進(jìn)行開(kāi)發(fā)，具有很高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。
[0003]由于生態(tài)環(huán)境的破壞和掠奪式的采摘挖掘，野木瓜的資源日趨縮小，嚴(yán)重影響了其有序的開(kāi)發(fā)利用，因此需要對(duì)其進(jìn)行種苗繁殖技術(shù)的開(kāi)發(fā)。
[0004]利用植物組織培養(yǎng)的方式進(jìn)行野木瓜種苗的培養(yǎng)快繁是一種較好的規(guī)?；@得野木瓜種苗的方法，且該方法未見(jiàn)報(bào)道和公開(kāi)應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種生長(zhǎng)周期短、移栽存活率高、成本低、操作簡(jiǎn)單的野木瓜種苗的培養(yǎng)方法。
[0006]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:培養(yǎng)步驟依次包括預(yù)處理、無(wú)菌外植體獲得、愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)、叢生芽及胚狀體增殖和生根培養(yǎng)及移栽；具體包括以下步驟:
(1)預(yù)處理:不同的外植體的類型采用不同的浸泡預(yù)處理及冷藏預(yù)處理；
(2)無(wú)菌外植體獲得:不同的外植體的類型采用不同消毒滅菌方式獲得無(wú)菌外植體用于下一步培養(yǎng)；
(3)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng):無(wú)菌外植體接種至液體淺層愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)得到狀態(tài)良好的愈傷組織；
(4)叢生芽及胚狀體增殖培養(yǎng):將步驟(3)中獲得的良好的愈傷組織接種到固液雙層叢生芽培養(yǎng)基上進(jìn)行叢生芽增殖培養(yǎng)；或?qū)⒂鷤M織接種到固液雙層胚狀體培養(yǎng)基上進(jìn)行胚狀體增殖培養(yǎng)；
(5)生根培養(yǎng)及移栽:將步驟(4)中獲得的叢生芽或胚狀體浸泡處理后接種到固體生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，然后將得到的生根苗煉苗后栽培到基質(zhì)中進(jìn)行生長(zhǎng)得到野木瓜種苗。
[0007]采用上述技術(shù)方案，通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該野木瓜種苗的培養(yǎng)方法能夠?qū)崿F(xiàn)增殖率高，生物產(chǎn)量大，培養(yǎng)周期短；組培苗質(zhì)量好，種苗健壯，栽培成活率高。
[0008]作為本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于，所述的步驟(I)中的所述外植體為葉片或葉柄或幼嫩枝條或種子。本發(fā)明使用的外植體是葉片或葉柄或幼嫩枝條或種子，可以通過(guò)多種外植體實(shí)現(xiàn)對(duì)野木瓜種苗的培養(yǎng)，既方便外植體的獲得，又節(jié)省了材料避免了浪費(fèi)。
[0009]作為本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于，所述的步驟(I)中，當(dāng)所選外植體為葉片或葉柄或幼嫩枝條時(shí)，所述預(yù)處理的方法是:將所述外植體離體后立即置于添加l~5g/L PVP+l~3g/LVc的水溶液中進(jìn)行浸泡處理3~5h，后置于2~8°C條件下保濕冷藏5~10 d ;當(dāng)所選外植體為種子或種莢時(shí)，所述預(yù)處理的方法是:將所述外植體清洗干凈后浸泡到0.1-0.5%濃度的高錳酸鉀水溶液中浸泡0.5~2h后，噴灑少量0.5-0.2%濃度的多菌靈后于2~8°C保濕冷藏處理30~60d。不同的外植體采用不同的方法進(jìn)行預(yù)處理，所采用的預(yù)處理方法更適合各個(gè)外植體的后續(xù)培養(yǎng)；且該預(yù)處理過(guò)程有利于后續(xù)的培養(yǎng)，縮短培養(yǎng)周期。
[0010]作為本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于，所述的步驟(2 )中，當(dāng)所選外植體為葉片或葉柄或幼嫩枝條時(shí)，滅菌處理的方式為:將預(yù)處理完后的外植體采用75%酒精消毒20~40s后采用升汞滅菌5~10min，然后無(wú)菌水沖洗備用；當(dāng)所選外植體為種子時(shí)，滅菌處理的方式為:將預(yù)處理完后的外植體采用75%酒精消毒l~2min后采用升汞滅菌10~20min，然后無(wú)菌水沖洗，剝離出胚備用。無(wú)菌的處理對(duì)后續(xù)的培養(yǎng)過(guò)程是非常關(guān)鍵的，直接影響后續(xù)培養(yǎng)的誘導(dǎo)率、增殖率以及生根率，通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該滅菌方法對(duì)后續(xù)的培養(yǎng)最好。
[0011]作為本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于，所述的步驟(3)中所述愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為 WPM 或 Ms+1.0-4.0mg/L 2，4-D+0.05-0.5mg/L ΝΑΑ+0.1-1.5g/L PVP+30 g/L 蔗糖，pH5.6-6.0 ;培養(yǎng)條件為:光照0 h/d，溫度25± 1°C ;所述液體淺層厚度為0.5~3cm。愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成直接關(guān)系到愈傷組織的誘導(dǎo)率以及愈傷組織的質(zhì)量高低，為了提高野木瓜外植體的愈傷組織的誘導(dǎo)率，本發(fā)明對(duì)野木瓜外植體的愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，通過(guò)大量的篩選試驗(yàn)最終確定，采用上述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行野木瓜外植體的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，愈傷組織的誘導(dǎo)效果最好。
[0012]作為本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于，所述的步驟(4)中所述固液雙層叢生芽培養(yǎng)基中的液體培養(yǎng)基的配方為 WPM 或 Ms+1.0-4.0 mg/L 6-BA+0.02-0.5mg/L NAA+2.0mg/LKT+0.1-1.5g/L PVP +30 g/L蔗糖，pH5.6-6.0，厚度為0.2~lcm ;所述固液雙層胚狀體培養(yǎng)基中的液體培養(yǎng)基的配方為 WPM 或 Ms+0.2-2.0 mg/L TDZ+0.02-0.5mg/L NAA+1.0mg/LKT+0.1-1.5g/L PVP +30 g/L蔗糖，pH5.6-6.0，厚度為0.2~lcm ;所述固液雙層叢生芽培養(yǎng)基和所述固液雙層胚狀體培養(yǎng)基的下層均添加6.5g/L瓊脂的固體培養(yǎng)基，從而形成固液雙層培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度1500-2000 lux，光照10~15 h/d，溫度25± 1°C。通過(guò)大量的篩選試驗(yàn)證實(shí)，采用固液雙層叢生芽培養(yǎng)基或固液雙層胚狀體培養(yǎng)基可以明顯提高叢生芽的增殖率且減少其褐化率。
[0013]作為本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于，所述的步驟(5)中生根培養(yǎng)及移栽中，首先將叢生芽及胚狀體放入到添加l~5g/L PVP+l~3g/L Vc的水溶液中浸泡l~2h，后接種到固體生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，所述生根培養(yǎng)基的配方為1/2MS+1.0-2.0 mg/L ΙΒΑ+0.01-0.1mg/L NAA+40 g/L 蔗糖，ρΗ5.6-6.0 ;培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度 1500-2000 lux，光照 10-15 h/d，溫度 25±1°C。
[0014]作為本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于，所述的步驟(5)中獲得的生根苗煉苗后栽種到泥炭:珍珠巖=2~5:1的基質(zhì)中，保持適度遮陰和70%~80%的濕度進(jìn)行栽培即培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度2000-3000 lux，光照10~15 h/d，溫度20±5°C，從而得到野木瓜種苗。
[0015]采用本發(fā)明生產(chǎn)野木瓜種苗的技術(shù)方案，其產(chǎn)生的有益效果是:(I)增殖率高，生物產(chǎn)量大，培養(yǎng)周期短；(2)組培苗質(zhì)量好，種苗健壯，栽培成活率高；本發(fā)明利用通過(guò)預(yù)處理、無(wú)菌外植體獲得、愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)、叢生芽及胚狀體增殖和生根培養(yǎng)及移栽的方法對(duì)野木瓜種苗進(jìn)行培育相對(duì)于其它培養(yǎng)方式具有擴(kuò)繁效率高、培養(yǎng)時(shí)間短、轉(zhuǎn)接方便；種苗健壯、栽培成活率高及成本低，適合野木瓜種苗規(guī)?；嘤a(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0016]實(shí)施例1
一種以莖段為外植體利用植物組織培養(yǎng)方式綜合處理進(jìn)行野木瓜培養(yǎng)快繁以獲得大量種苗的方法具體步驟如下:
(1)預(yù)處理:預(yù)處理方法為將莖段離體后立即置于添加4g/L PVP+1.5g/L Vc的水溶液中進(jìn)行浸泡處理4h，后置于4°C條件下保濕冷藏9 d ;
(2)無(wú)菌外植體獲得:預(yù)處理完