光照強度為20001x，培養(yǎng)溫度為25°C的條件下培養(yǎng)26天后即生根，生根率達(dá)到97.5%，生根平均條數(shù)為6.2條。所述的生根培養(yǎng)基為:MS+0.5mg/LNAA+0.lmg/L IAA+3.5% 蔗糖 +0.5% 瓊脂，pH 值為 5.6。
[0022](6)煉苗移栽:當(dāng)步驟(5)的幼孢子苗的莖長到約3?4cm，根長到約2?3cm時，將封口膜打開，在培養(yǎng)室內(nèi)煉苗5天后取出試管苗，洗去根部附著的培養(yǎng)基，將幼孢子苗移栽到經(jīng)過高溫滅菌的草炭:蛭石=1:1的混合基質(zhì)中。移栽后，定期給小苗澆水，并保持濕度90%以上，移栽成活率為87.1%。
[0023]實施例2:
(I)孢子處理及萌發(fā)培養(yǎng):將具有成熟孢子囊且孢子尚未脫落的葉片采集下來，用清水輕輕沖洗葉面的灰塵及雜質(zhì)，輕輕擦干后放于紙袋中自然風(fēng)干，收集脫落的孢子于硫酸紙袋內(nèi)，并放置于4°C冰箱保存?zhèn)溆?。將適量孢子置于1.5mL離心管中并加入70mg/mL的赤霉素溶液，浸泡8min,以4000r/min速度以離心6min,去上清液。然后再加入3%次氯酸鈉溶液消毒6min，以4000r/min速度以離心5min，去上清液，用無菌水沖洗5次后轉(zhuǎn)入1mL離心管中，加入無菌水稀釋至密度約為3 X 13個mg/L的孢子懸濁液并接種于萌發(fā)培養(yǎng)基上進(jìn)行孢子萌發(fā)培養(yǎng)。接種后置于每天光照13小時，光照強度為25001x，培養(yǎng)溫度為27°C的條件下培養(yǎng)15天孢子即萌發(fā)，萌發(fā)率為88%。所述的萌發(fā)培養(yǎng)基為:l/2MS+3.0%蔗糖+0.45%瓊脂，pH值為5.8。
[0024](2)原葉體增殖培養(yǎng):將步驟(I)孢子萌發(fā)后的原葉體剪切至增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行原葉體增殖培養(yǎng)。接種后置于每天光照13小時，光照強度為25001x，培養(yǎng)溫度為27°C的條件下培養(yǎng)43天后增殖系數(shù)為4.9。增殖的原葉體顏色是翠綠的，長勢旺盛，兩翼伸展成葉狀。所述的增殖培養(yǎng)基為:MS+3.2%蔗糖+0.45%瓊脂，pH值為5.8。
[0025](3)愈傷組織誘導(dǎo):將步驟(I)或(2)獲得原葉體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。接種后置于每天光照14小時，光照強度為25001x，培養(yǎng)溫度為27°C的條件下培養(yǎng)26天后即形成愈傷組織，誘導(dǎo)率為76%。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+0.3mg/LKT+l.8mg/L2，4-D+2.5% 蔗糖 +0.35% 瓊脂，pH 值為 5.8。
[0026](4)叢生芽誘導(dǎo):將步驟(3)獲得的愈傷組織切割成大小一致的團(tuán)塊(3_X3_X3mm)并轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基中進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)。接種后置于每天光照14小時，光照強度為25001x，培養(yǎng)溫度為27°C的條件下培養(yǎng)34天后即形成叢生芽，誘導(dǎo)率達(dá)到85%。所述的分化培養(yǎng)基為:MS+0.lmg/L NAA+2.8%蔗糖+0.40%瓊脂，pH值為5.8。
[0027](5)生根培養(yǎng):將步驟(4)培養(yǎng)得到的叢生芽轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)生根。接種后置于每天光照13小時，光照強度為25001x，培養(yǎng)溫度為27°C的條件下培養(yǎng)29天后即生根，生根率達(dá)到100%，生根平均條數(shù)為5.7條。所述的生根培養(yǎng)基為:MS+0.8mg/LNAA+0.2mg/L IAA+3.8% 蔗糖 +0.43% 瓊脂，pH 值為 5.8。
[0028](6)煉苗移栽:當(dāng)步驟(5)的幼孢子苗的莖長到約3?4cm，根長到約2?3cm時，將封口膜打開，在培養(yǎng)室內(nèi)煉苗7天后取出試管苗，洗去根部附著的培養(yǎng)基，將幼孢子苗移栽到經(jīng)過高溫滅菌的草炭:蛭石=1:1的混合基質(zhì)中。移栽后，定期給小苗澆水，并保持濕度90%以上，移栽成活率為90.1%。
【主權(quán)項】
1.一種闊鱗鱗毛蕨組織培養(yǎng)技術(shù)，其特征在于包括以下步驟: (1)孢子處理及萌發(fā)培養(yǎng):將具有成熟孢子囊且孢子尚未脫落的葉片采集下來，用清水輕輕沖洗葉面的灰塵及雜質(zhì)，輕輕擦干后放于紙袋中自然風(fēng)干，收集脫落的孢子于硫酸紙袋內(nèi)，并放置于4°c冰箱保存?zhèn)溆?，將適量孢子置于1.5mL離心管中并加入50?10mg/mL的赤霉素溶液，浸泡5?1min,以4000r/min速度以離心3?6min,去上清液，然后再加入2%?5%次氯酸鈉溶液消毒5?15min,以4000r/min速度以離心3?6min,去上清液，用無菌水沖洗4?5次后轉(zhuǎn)入1mL離心管中，加入無菌水稀釋至密度約為3X 13個mg/L的孢子懸濁液并接種于萌發(fā)培養(yǎng)基上進(jìn)行孢子萌發(fā)培養(yǎng)，接種后置于每天光照12?15小時，光照強度為2000?30001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)直至孢子萌發(fā)； (2)原葉體增殖培養(yǎng):將步驟(I)孢子萌發(fā)后的原葉體剪切至增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行原葉體增殖培養(yǎng)，接種后置于每天光照12?16小時，光照強度為1500?25001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)，每兩周更換一次培養(yǎng)基； (3 )愈傷組織誘導(dǎo):將步驟(I)或(2 )獲得原葉體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，接種后置于每天光照12?16小時，光照強度為2000?25001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)直至形成愈傷組織； (4)叢生芽誘導(dǎo):將步驟(3)獲得的愈傷組織切割成大小一致的團(tuán)塊(3mmX3mmX3mm)并轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基中進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)，接種后置于每天光照12?16小時，光照強度為2000?25001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)直至形成叢生芽； (5)生根培養(yǎng):將步驟(4)培養(yǎng)得到的叢生芽轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)生根，接種后置于每天光照12?16小時，光照強度為2000?25001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)直至生根； (6)煉苗移栽:當(dāng)步驟(5)的幼孢子苗的莖長到約3?4cm，根長到約2?3cm時，將封口膜打開，在培養(yǎng)室內(nèi)煉苗5?7天后取出試管苗，洗去根部附著的培養(yǎng)基，將幼孢子苗移栽到經(jīng)過高溫滅菌的草炭:蛭石=1:1的混合基質(zhì)中，移栽后，定期給小苗澆水，并保持濕度90%以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種闊鱗鱗毛蕨組織培養(yǎng)技術(shù)，其特征在于步驟(2)所述的萌發(fā)培養(yǎng)基為:l/2MS+2.0%?3.5%蔗糖+0.35%?0.5%瓊脂，pH值為5.4?5.8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種闊鱗鱗毛蕨組織培養(yǎng)技術(shù)，其特征在于步驟(3)所述的增殖培養(yǎng)基為:MS+2.0%?3.5%蔗糖+0.35%?0.5%瓊脂，pH值為5.4?5.8。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種闊鱗鱗毛蕨組織培養(yǎng)技術(shù)，其特征在于步驟(4)所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+0.1 ?1.0mg/LKT+1 ?3mg/L 2，4-D+2.0% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5%瓊脂，pH值為5.4?5.8。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種闊鱗鱗毛蕨組織培養(yǎng)技術(shù)，其特征在于步驟(5)所述的分化培養(yǎng)基為:MS+0.01?0.3mg/L NAA+2.0%?3.5%蔗糖+0.35%?0.5%瓊脂，pH值為.5.4 ?5.8。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種闊鱗鱗毛蕨組織培養(yǎng)技術(shù)，其特征在于步驟(5)所述的生根培養(yǎng)基為:MS+0.1 ?1.0mg/L ΝΑΑ+0.1 ?0.5mg/L IAA+2.0% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?.0.5%瓊脂，pH值為5.4?5.8。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種闊鱗鱗毛蕨組織培養(yǎng)技術(shù)，涉及闊鱗鱗毛蕨（Dryopteris championii）通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖種苗的方法。本發(fā)明以闊鱗鱗毛蕨成熟孢子為外植體，通過孢子萌發(fā)、原葉體增殖、愈傷組織誘導(dǎo)、叢生芽分化、生根、移栽等步驟建立了闊鱗鱗毛蕨組織培養(yǎng)技術(shù)體系，有助于對這種植物的保護(hù)，更可以應(yīng)用于規(guī)?；a(chǎn)以促進(jìn)其在園林中的廣泛應(yīng)用。
【IPC分類】A01H4-00
【公開號】CN104686354
【申請?zhí)枴緾N201510092707
【發(fā)明人】劉祖英
【申請人】劉祖英
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年3月2日