一種闊鱗鱗毛蕨組織培養(yǎng)技術(shù)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)中植物組織培養(yǎng)的方法，具體地說，涉及一種闊鱗鱗毛蕨組織培養(yǎng)技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]蕨類植物也稱羊齒植物，是介于最原始的高等植物——苔蘚植物和種子植物之間的一個類群。蕨類植物和苔蘚植物一樣具有配子體和孢子體之間的世代交替現(xiàn)象。蕨類植物享有“無花之美”的美稱，觀賞蕨類植物以其優(yōu)雅的線條美和高雅的姿態(tài)美深受各國人民的喜愛。蕨類植物因有性生殖對水的依賴作用，對生境的要求較為茍刻，生長區(qū)域受限。近年來，由于氣候變暖，自然災(zāi)害等外部原因和人類對蕨類植物的過度開發(fā)造成很多蕨類物種瀕臨滅絕。蕨類植物作為一類優(yōu)良的室內(nèi)觀葉植物和耐陰地被植物，目前主要依賴于國外品種的引進，而我國作為世界上蕨類植物資源最豐富的地區(qū)之一，許多優(yōu)秀的蕨類品種沒有得到應(yīng)用和推廣。因此，對蕨類植物繁殖技術(shù)的研究和應(yīng)用推廣很為迫切。
[0003]闊鱗鱗毛蕨是鱗毛蕨科鱗毛蕨屬植物，分布于山東、河南等全國大部分地區(qū)。葉色鮮綠有光澤，耳狀小羽片，能適應(yīng)多種生境。耐旱喜光，也耐蔭可做林下片植或與山石配植，是一種優(yōu)良的地被植物。目前已有對其盆栽引種試驗的研究，但其組培繁殖技術(shù)尚未見報道。因此，建立闊鱗鱗毛蕨組織培養(yǎng)技術(shù)體系將有助于對這種植物的保護，更可以應(yīng)用于規(guī)模化生產(chǎn)以促進其在園林中的廣泛應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供出一種闊鱗鱗毛蕨組織培養(yǎng)技術(shù)，本發(fā)明以闊鱗鱗毛蕨成熟孢子為外植體，通過孢子萌發(fā)、原葉體增殖、愈傷組織誘導(dǎo)、叢生芽分化、生根、移栽等步驟建立了闊鱗鱗毛蕨組織培養(yǎng)技術(shù)體系，從而實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
[0005]本發(fā)明的一種闊鱗鱗毛蕨組織培養(yǎng)技術(shù)，其特征在于包括以下步驟:
(I)孢子處理及萌發(fā)培養(yǎng):將具有成熟孢子囊且孢子尚未脫落的葉片采集下來，用清水輕輕沖洗葉面的灰塵及雜質(zhì)，輕輕擦干后放于紙袋中自然風(fēng)干，收集脫落的孢子于硫酸紙袋內(nèi)，并放置于4°c冰箱保存?zhèn)溆?。將適量孢子置于1.5mL離心管中并加入50?10mg/mL的赤霉素溶液，浸泡5?1min,以4000r/min速度以離心3?6min,去上清液。然后再加入2%?5%次氯酸鈉溶液消毒5?15min,以4000r/min速度以離心3?6min,去上清液，用無菌水沖洗4?5次后轉(zhuǎn)入1mL離心管中，加入無菌水稀釋至密度約為3X 13個mg/L的孢子懸濁液并接種于萌發(fā)培養(yǎng)基上進行孢子萌發(fā)培養(yǎng)。接種后置于每天光照12?15小時，光照強度為2000?30001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)直至孢子萌發(fā)。
[0006](2)原葉體增殖培養(yǎng):將步驟(I)孢子萌發(fā)后的原葉體剪切至增殖培養(yǎng)基中進行原葉體增殖培養(yǎng)。接種后置于每天光照12?16小時，光照強度為1500?25001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)，每兩周更換一次培養(yǎng)基。
[0007](3 )愈傷組織誘導(dǎo):將步驟(I)或(2 )獲得原葉體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進行愈傷組織誘導(dǎo)。接種后置于每天光照12?16小時，光照強度為2000?25001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)直至形成愈傷組織。
[0008](4)叢生芽誘導(dǎo):將步驟(3)獲得的愈傷組織切割成大小一致的團塊(3mmX3mmX3mm)并轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基中進行叢生芽誘導(dǎo)。接種后置于每天光照12?16小時，光照強度為2000?25001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)直至形成叢生芽。
(5)生根培養(yǎng):將步驟(4)培養(yǎng)得到的叢生芽轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)生根。接種后置于每天光照12?16小時，光照強度為2000?25001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)直至生根。
[0009](6)煉苗移栽:當步驟(5)的幼孢子苗的莖長到約3?4cm，根長到約2?3cm時，將封口膜打開，在培養(yǎng)室內(nèi)煉苗5?7天后取出試管苗，洗去根部附著的培養(yǎng)基，將幼孢子苗移栽到經(jīng)過高溫滅菌的草炭:蛭石=1:1的混合基質(zhì)中。移栽后，定期給小苗澆水，并保持濕度90%以上。
[0010]上述步驟(2)所述的萌發(fā)培養(yǎng)基為:l/2MS+2.0%?3.5%蔗糖+0.35%?0.5%瓊月旨，pH值為5.4?5.8。
[0011]上述步驟(3)所述的增殖培養(yǎng)基為:MS+2.0%?3.5%蔗糖+0.35%?0.5%瓊脂，pH值為5.4?5.8。
[0012]上述步驟(4)所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+0.1?1.0mg/LKT+1?3mg/L2，4-D+2.0% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 瓊脂，pH 值為 5.4 ?5.8。
[0013]上述步驟(5)所述的分化培養(yǎng)基為:MS+0.01?0.3mg/L NAA+2.0%?3.5%蔗糖+0.35% ?0.5% 瓊脂，pH 值為 5.4 ?5.8。
[0014]上述步驟(5)所述的生根培養(yǎng)基為:MS+0.1?1.0mg/L ΝΑΑ+0.1?0.5mg/LIAA+2.0% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 瓊脂，pH 值為 5.4 ?5.8。
[0015]本發(fā)明的優(yōu)點是:涉及闊鱗鱗毛蕨通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖種苗的方法。本發(fā)明以闊鱗鱗毛蕨成熟孢子為外植體，通過孢子萌發(fā)、原葉體增殖、愈傷組織誘導(dǎo)、叢生芽分化、生根、移栽等步驟建立了闊鱗鱗毛蕨組織培養(yǎng)技術(shù)體系，有助于對這種植物的保護，更可以應(yīng)用于規(guī)?；a(chǎn)以促進其在園林中的廣泛應(yīng)用。
【具體實施方式】
[0016]以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，不是對本發(fā)明的限制。
[0017]實施例1:
(I)孢子處理及萌發(fā)培養(yǎng):將具有成熟孢子囊且孢子尚未脫落的葉片采集下來，用清水輕輕沖洗葉面的灰塵及雜質(zhì)，輕輕擦干后放于紙袋中自然風(fēng)干，收集脫落的孢子于硫酸紙袋內(nèi)，并放置于4°c冰箱保存?zhèn)溆谩⑦m量孢子置于1.5mL離心管中并加入50mg/mL的赤霉素溶液，浸泡6min，以4000r/min速度以離心4min，去上清液。然后再加入2%次氯酸鈉溶液消毒5min，以4000r/min速度以離心5min，去上清液，用無菌水沖洗4次后轉(zhuǎn)入1mL離心管中，加入無菌水稀釋至密度約為3X103個mg/L的孢子懸濁液并接種于萌發(fā)培養(yǎng)基上進行孢子萌發(fā)培養(yǎng)。接種后置于每天光照12小時，光照強度為20001χ，培養(yǎng)溫度為25°C的條件下培養(yǎng)17天孢子即萌發(fā)，萌發(fā)率為83.7%。所述的萌發(fā)培養(yǎng)基為:l/2MS+3.5%蔗糖+0.5%瓊脂，pH值為5.6。
[0018](2)原葉體增殖培養(yǎng):將步驟(I)孢子萌發(fā)后的原葉體剪切至增殖培養(yǎng)基中進行原葉體增殖培養(yǎng)。接種后置于每天光照12小時，光照強度為15001x，培養(yǎng)溫度為25°C的條件下培養(yǎng)45天后增殖系數(shù)為4.5。增殖的原葉體顏色是翠綠的，長勢旺盛，兩翼伸展成葉狀。所述的增殖培養(yǎng)基為:MS+3.5%蔗糖+0.35%瓊脂，pH值為5.6。
[0019](3)愈傷組織誘導(dǎo):將步驟(I)或(2)獲得原葉體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進行愈傷組織誘導(dǎo)。接種后置于每天光照12小時，光照強度為20001χ，培養(yǎng)溫度為25°C的條件下培養(yǎng)28天后即形成愈傷組織，誘導(dǎo)率為71.5%。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+0.lmg/LKT+lmg/L2，4-D+2.0% 蔗糖 +0.35% 瓊脂，pH 值為 5.6。
[0020](4)叢生芽誘導(dǎo):將步驟(3)獲得的愈傷組織切割成大小一致的團塊(3mmX3mmX3mm)并轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基中進行叢生芽誘導(dǎo)。接種后置于每天光照12小時，光照強度為20001x，培養(yǎng)溫度為25°C的條件下培養(yǎng)38天后即形成叢生芽，誘導(dǎo)率達到79.4%。所述的分化培養(yǎng)基為:MS+0.0 lmg/L NAA+2.0%蔗糖+0.35%瓊脂，pH值為5.6。
[0021](5)生根培養(yǎng):將步驟(4)培養(yǎng)得到的叢生芽轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)生根。接種后置于每天光照12小時，