專利名稱：使用活性維生素d類似物治療前列腺疾病的方法
交叉參考相關(guān)申請本申請是于1995年4月3日申請之第08/415,488號專利申請的部分繼續(xù)申請，后者是1993年9月10日申請的第08/119,895號專利申請的部分繼續(xù)申請，現(xiàn)為第5,403,831號專利。本申請還是于1995年6月7日申請之第08/486,387號專利申請的部分繼續(xù)申請，后者是1994年6月24日申請的第08/265,438號專利申請的部分繼續(xù)申請。所有上述文獻在此并入作為參考。有關(guān)聯(lián)邦資助之研究或開發(fā)的聲明不適用發(fā)明背景本發(fā)明概括地涉及治療過度增殖性前列腺疾病的方法，具體而言是涉及維生素D的活性形式在抑制這些疾病之過度增殖細胞的活性并促進細胞的分化中的應(yīng)用。
前列腺僅存在于雄性哺乳動物中，而且會產(chǎn)生某些增殖性疾病。前列腺之基底和基質(zhì)細胞的增殖作用導(dǎo)致良性的前列腺增生，這是一種常見的前列腺疾病。另一種常見的前列腺疾病是前列腺癌，特別是前列腺的腺癌。前列腺的腺癌是最常見的致命性病理前列腺癌，而且最經(jīng)常涉及前列腺之周圍區(qū)域中上皮細胞的惡性轉(zhuǎn)化。前列腺增生和前列腺癌在老年男性中都有高的發(fā)病率。在55歲以上的男性中，每4人中約有1人患有某些形式的前列腺疾病。
在美國男性中，前列腺癌目前是在肺癌之后的第二癌癥致死原因。前列腺癌的死亡率隨年齡呈對數(shù)增長，而美國黑人的死亡率比白人的死亡率高二倍。在國際范圍中，美國黑人和北歐人的死亡率是最高的，而在日本是最低的。據(jù)預(yù)測，在2000年之前，前列腺疾病的年發(fā)病率將增加90％，而年死亡率則增加37％。雖然前列腺癌在老年人中是相對無痛苦的腫瘤，但該疾病患者的壽命總地降低約10年。
前列腺癌治療的改善現(xiàn)已集中在早期檢測上。近年來，檢測某些前列腺分泌之蛋白或肽的篩選實驗已增加了診斷無癥狀患者中患有該疾病的能力，所述前列腺分泌的蛋白或肽例如是標記物(如前列腺特異性抗原(PSA)、前列腺酸磷酸酯酶(PAP)、前列腺抑制素(PIP))。
在低于65歲的男性患者中治療前列腺癌的方法主要是對該組織進行外科手術(shù)如前列腺切除術(shù)和/或放射性療法，但是，這些攻擊性方法對總存活率的影響仍有爭論。對65歲以上患者進行治療的方法長久以來是采用保守療法，并基于消除或控制睪酮的產(chǎn)生。該結(jié)果通常是通過外科手術(shù)切除睪丸、給藥垂體促性腺激素抑制劑如雌激素或黃體化激素釋放激素(LHRH)類似物或者組合使用這些治療方法來實現(xiàn)的。雌激素如己烯雌酚是從垂體腺中釋放黃體化激素(LH)的強效抑制劑，該黃體化激素是調(diào)節(jié)睪酮產(chǎn)生的促性腺激素，因而，給藥雌激素能夠使睪酮血漿濃度下降至睪丸切除的水平。給藥3mg/天劑量的己烯雌酚，通常能夠?qū)崿F(xiàn)最大的睪酮血漿濃度抑制作用。其他雌激素如經(jīng)結(jié)合的雌激素在降低睪酮血漿濃度上與己烯雌酚幾乎是同樣有效的。但是，己烯雌酚具有較差的心血管分布特性，而且心血管疾病的死亡在使用大劑量己烯雌酚治療的患者中并不是不常見的。因此，雖然最大至3mg/天劑量的己烯雌酚通常是安全的，但該治療方法并不適合于已有心血管疾病的男性患者。
前列腺癌經(jīng)常轉(zhuǎn)移至骨盆和腰椎，導(dǎo)致骨丟失以及相關(guān)的疼痛。激素調(diào)節(jié)通常對轉(zhuǎn)移前列腺癌產(chǎn)生明顯的緩解作用，改善骨疼痛以及其他與疾病有關(guān)的癥狀。因此，雄激素消除在晚期轉(zhuǎn)移前列腺癌的治療中也是一種主要的輔助療法。
盡管激素治療會首先使癥狀緩解，但大多數(shù)患有局部不可切除或轉(zhuǎn)移性疾病的患者的病情對進一步的激素療法不產(chǎn)生反應(yīng)。最近的研究表明，人前列腺癌細胞可在非雄激素依賴性和雄激素依賴性之間循環(huán)。此等循環(huán)可能是由于初始治療改善后癌癥又復(fù)發(fā)。在該大部分的患者中，其他形式的治療也令人遺憾地是無效的。放射療法通常能夠緩解骨疼痛的癥狀，但不能治愈。疾病還會隨時間而發(fā)展，并產(chǎn)生致命的結(jié)果。
如以上所述，前列腺增生是另一種常見的前列腺增殖性疾病。該疾病在45歲以上的男性中發(fā)生，而且隨年齡增加。前列腺增生在尿道周圍區(qū)域開始，并進而開始局部增殖和發(fā)展壓迫剩余的正常腺體。增生可壓迫和阻礙尿道。治療方法包括手術(shù)、以及給藥垂體促性腺激素抑制劑和/或5α-還原酶抑制劑。
在生理和生化學的另一個領(lǐng)域中，在過去二十年中對維生素D進行的廣泛研究已確定除其在骨和礦物代謝中的傳統(tǒng)作用外的重要生理作用。在不參與鈣體內(nèi)平衡的不同器官的細胞中發(fā)現(xiàn)了1α，25-二羥基維生素D3的特異性核受體。例如，Miller等人(52 CancerRes.(1992)515-520)已證實了在人前列腺癌細胞系--LNCaP中的1α，25-二羥基維生素D3的生理活性的、特異性的受體。
已有報道稱，某些維生素D化合物和類似物是惡性細胞增殖作用的強效抑制劑和細胞分化作用的誘導(dǎo)劑/束激劑。例如，頒與Suda等人的第4,391,802號美國專利公開了1α-羥基維生素D化合物，特別是1α，25-二羥基維生素D3和1α-羥基維生素D3，由于誘導(dǎo)惡性細胞(具體為白血病細胞)分化為非惡性的巨噬細胞(單核細胞)而具有強效的抗白血病活性，而且可用于治療白血病。已有人報道了1α，25-二羥基維生素D3和其它維生素D3類似物對前列腺癌細胞系的抗增殖作用和分化作用。近來，有人報道了維生素D受體基因多型性和前列腺癌危險之間的關(guān)聯(lián)，提示維生素D受體可能在研究前列腺癌并有可能對其進行治療中具有作用。
這些以前的研究絕大多數(shù)集中于維生素D3化合物。即使此等化合物的確能夠有效地促進分化培養(yǎng)基中的惡性細胞，但是由于它們作為影響鈣代謝的藥劑的高效用，其在分化治療中作為抗癌劑的實際應(yīng)用受到了嚴重的限制。在體內(nèi)有效作為抗白血病劑所需要的劑量時，由于其固有的鈣血癥活性，這些相同的化合物可明顯誘導(dǎo)血鈣濃度的增高并至危險的水平。也就是說，高血鈣癥的危險阻礙或者嚴重地限制了臨床使用1α，25-二羥基維生素D3和其它維生素D3類似物作為抗癌劑。這表明仍需要有更大的特異性活性和選擇性的化合物，即、具有抗增殖作用和分化作用但高鈣血癥活性低的維生素D化合物。此等化合物的需要在治療前列腺增生和腫瘤性前列腺疾病中是最為迫切的。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供治療前列腺疾病的方法，所述前列腺疾病例如是那些以過度增殖細胞生長和/或異常細胞分化為特征者，如前列腺癌和前列腺增生。所述方法包括使用活性維生素D化合物以抑制異常的細胞生長并促進細胞分化。
本發(fā)明的前述和其他優(yōu)點是通過其一個方面實現(xiàn)的，在該方面中提供抑制人腫瘤或增生細胞之過度增殖活性的方法，其包括用有效量的1α-羥基維生素D化合物治療所述細胞，所述1α-羥基維生素D化合物在其分子的側(cè)鏈上于C-24位處具有烴鏈基團。治療步驟包括抑制此等前列腺細胞的增殖作用，誘導(dǎo)并增強該前列腺細胞的分化作用。
1α-羥基維生素D化合物是活性維生素D，并可適當?shù)赜孟率?I)表示。式(I)化合物中優(yōu)選的是1α，24-二羥基維生素D2、1α，24-二羥基維生素D4、1α，25-二羥基維生素D4、1α，25-二羥基維生素D2、1α-羥基維生素D2、以及1α-羥基維生素D4。
可根據(jù)本發(fā)明給藥的1-羥基維生素D化合物的有效或治療量為0.01μg/kg體重/天-2.0μg/kg體重/天。
在另一個方面中，本發(fā)明提供治療人前列腺癌的方法，其包括向患有前列腺癌的男性患者給藥有效量的活性維生素D化合物以降低或穩(wěn)定癌癥的細胞異常增殖活性，該活性維生素D化合物具有或者通過體內(nèi)代謝獲得與維生素D受體(VDR)的結(jié)合親和性，該結(jié)合親和性基本上等于1α，25-二羥基維生素D3的結(jié)合親和性，但高鈣血癥的危險大大低于1α，25-二羥基維生素D3。
在根據(jù)本發(fā)明治療前列腺疾病時，可適當?shù)匾栽谒幬锝M合物中的活性成分(即、第一抗癌劑)單獨給藥所述活性維生素D，或者以包含第二抗癌劑、雄激素消除劑、5α-還原酶抑制劑或它們之組合的混合物的形式給藥。
另一方面，本發(fā)明提供藥物組合物，其包括為活性維生素D化合物的第一抗癌劑和選自于以下組中的藥劑(i)第二抗癌劑、(ii)骨治療劑、(iii)雄激素消除劑、和(iv)5α-還原酶抑制劑以及它們的組合，以及生理上可接受的載體。
在結(jié)合權(quán)利要求書詳細閱讀優(yōu)選實施方案的具體描述后，可了解本發(fā)明的其它優(yōu)點和具體的適應(yīng)癥、組分的變化和物理特性。
附圖
簡述無發(fā)明詳細描述本發(fā)明提供有效治療腫瘤性和增生性疾病的方法。具體而言，本發(fā)明涉及抑制、改善或緩解前列腺疾病之過度增殖性細胞活性并誘導(dǎo)、增強或促進患病細胞之細胞分化作用的治療方法，所述疾病例如是前列腺癌和前列腺增生。本發(fā)明提供用活性維生素D類似物治療患有過度增殖性疾病之患者的新方法，所述疾病例如是前列腺癌或前列腺增生，所述活性維生素D類似物在其分子的側(cè)鏈的C-24位處具有烴基團。優(yōu)選的是，所述活性維生素D類似物是1α-羥基維生素D化合物，并適當?shù)赜孟率?I)表示。向患者給藥所述活性維生素D類似物時，不產(chǎn)生劑量限制性的高鈣血癥和高鈣尿癥，即、分別為非生理性升高且有害的血鈣濃度和尿鈣濃度。這些特性可通過本發(fā)明之式(I)化合物的具體化學性質(zhì)來實現(xiàn)。
根據(jù)本發(fā)明，在向患有前列腺癌或前列腺增生的患者給藥有效量的式(I)類似物時，異常前列腺細胞的增殖活性被抑制或緩解，而細胞的分化作用則被誘導(dǎo)、促進或增強，與按已知制劑給藥相同量的活化維生素D3相比，明顯降低了高鈣血癥和高鈣尿癥。因此，相對于維生素D3類似物的活性形式，式(I)的化合物具有更高的治療指數(shù)。
已知的是，在活化前，即、產(chǎn)生生理反應(yīng)前，維生素D3必須在C-1和C-25位被羥基化?；罨渌问降木S生素D，如維生素D2和維生素D4，也似乎需要類似的代謝過程。因此，在此所用術(shù)語“活化維生素D”或“活性維生素D”是指已至少在分子的A環(huán)的C-1位被羥基化而且該化合物本身或者作為前體藥物(如1α-羥基維生素D2)時其代謝物結(jié)合維生素D受體(VDR)的維生素D化合物或類似物。僅在C-1位被羥基化的維生素D化合物在此稱為“前體藥物”。此等化合物在體內(nèi)經(jīng)歷進一步的羥基化，而且它們的代謝物結(jié)合VDR。
同樣，對于烷基、烯基、?；颦h(huán)烷基而言，在此所用術(shù)語“低級”是指具有1-4個碳原子的直鏈或支鏈、飽和或不飽和的烴鏈。此等烴鏈的具體例子是甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、乙烯基、丙烯基、丁烯基、異丁烯基、異丙烯基、甲酰基、乙?；⒈；?、丁?；颦h(huán)丙基。術(shù)語“芳香酰基”是指未被取代或經(jīng)取代的苯甲?；?。
在此所用術(shù)語“烴基團”是指低級烷基、低級烯基、低級?；虻图壄h(huán)烷基，即、直鏈或支鏈、飽和或不飽和的C1-C4烴基。
根據(jù)本發(fā)明的化合物是活性維生素D化合物，其條件是該化合物在C-24位處具有烴基團，即、在C-24位處的低級烷基、烯基或?；?。另外，根據(jù)本發(fā)明的活性維生素D可具有不飽和的側(cè)鏈，即、在C-22和C-23、C-25和C-26或者C-26和C-27之間適當?shù)鼐哂须p鍵。
本發(fā)明的1α-羥基維生素D優(yōu)選具有以下通式(I)
其中B和C分別是氫或在C-22和C-23之間形成雙鍵的碳-碳鍵；R1和R2分別獨立地是氫、羥基、低級烷基、低級氟代烷基、O-低級烷基、低級烯基、低級氟代烯基、O-低級烯基、O-低級酰基、O-芳香?；?、低級環(huán)烷基、或與它們所連接的碳一起形成C3-C8環(huán)碳環(huán)；R3是低級烷基、低級烯基、低級氟代烷基、低級氟代烯基、O-低級烷基、O-低級烯基、O-低級?；?、O-芳香?；虻图壄h(huán)烷基；X1是氫或羥基；而X2是氫、羥基、或與R1或R2構(gòu)成雙鍵。
本發(fā)明的式(I)1α-羥基維生素D化合物是那些特別是對前列腺疾病如前列腺癌和前列腺增生的細胞具有有效的抗增殖活性和細胞分化活性(即、反轉(zhuǎn)惡性轉(zhuǎn)化)，但產(chǎn)生高鈣血癥和/或高鈣尿癥之副作用的能力低或者無此能力者。換言之，本發(fā)明的式(I)化合物在與惡性或其它過度增殖細胞接觸時可起到抗增殖劑和細胞分化劑的作用，但不明顯改變鈣的代謝。該作用的選擇性和特異性可使式(I)的1α-羥基維生素D化合物用于安全地抑制過度增殖作用并促進惡性或增殖細胞的分化，而且是此方面的優(yōu)選藥劑。因此，本發(fā)明的1α-羥基維生素D化合物克服了上述已知活性維生素D3化合物的缺陷，并可作為用于控制和治療惡性疾病如前列腺癌以及良性前列腺增生的優(yōu)選藥劑。
優(yōu)選的式(I)活性維生素D化合物是1α，24-二羥基維生素D2、1α，24-二羥基維生素D4、1α，25-二羥基維生素D2、1α，25-二羥基維生素D4、1α-羥基維生素D2、和1α-羥基維生素D4。應(yīng)理解的是，在那些側(cè)鏈(如C-24)中具有手性中心的式(I)化合物中，差向異構(gòu)體(如S和R)和外消旋化合物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
因此，本發(fā)明提供用有效量的式(I)化合物治療惡性前列腺細胞以及其它過度增殖性前列腺細胞的方法(即、抑制它們的過度增殖活性和/或誘導(dǎo)并增強它們的分化作用)。有效劑量為約0.01-2.0μg/kg/天。
式(I)的化合物可用于治療患者所患的前列腺癌和前列腺增生。具體而言，本發(fā)明提供用于治療患有過度增殖性細胞作用的前列腺癌和前列腺增生的患者的方法，其是向所述患者給藥治療有效量的式(I)化合物，該化合物優(yōu)選為1α，24-二羥基維生素D2、1α，24-二羥基維生素D4、1α，25-二羥基維生素D2、1α，25-二羥基維生素D4、1α-羥基維生素D2、和1α-羥基維生素D4。
式(I)化合物可根據(jù)Knutson等人的第5,448,120號、DeLuca等人的第4,554,106號美國專利、以及Stmgnell等人(310 Biochem.J.(1995)，第233-241頁)的方法來制備。上述文獻的內(nèi)容在此并入作為參考。
已研究了式(I)化合物的生物效用，并與1α，25-二羥基維生素D3的生物效用進行了比較，后者為維生素D的活性激素形式，并且是所用維生素D化合物和類似物的測量標準。例如，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，式(I)化合物或其活性代謝物的維生素D受體(VDR)結(jié)合親和性基本上等于(即、等于或弱3倍)1α，25-二羥基維生素D3的親和性。此等受體結(jié)合親和性是有效生理活性的指示。
同時，已發(fā)現(xiàn)式(I)化合物的毒性明顯低于相應(yīng)的維生素D3類似物。例如，在第08/265,438號共同未決的母案申請(該文獻的內(nèi)容在此并入作為參考)中，1α-羥基維生素D4的LD50在男性中是1.0mg/kg，在女性中為3.0mg/kg，也就是說大大低于1α-羥基維生素D3的毒性(LD50為0.2mg/kg)。另外，在第5,403,831號母案美國專利、及其第5,104,864號母案的母案美國專利(這兩個文獻的內(nèi)容在此并入作為參考)中，已表明1α-羥基維生素D2的生物效用與1α-羥基維生素D3和1α，25-二羥基維生素D3的相同，但毒性卻更低。即使對患有絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的婦女給藥至10μg/天的1α-羥基維生素D2，也僅誘發(fā)中等程度的高鈣尿癥(U.Ca＞300mg/24小時)，而且僅由于1α-羥基維生素D2也不會產(chǎn)生明顯的高鈣血癥(S.Ca＞11.0mg/dl)。另外，根據(jù)肌酸酐清除和BUN測定，該化合物對腎功能沒有副作用；也沒有增加羥基脯氨酸的尿排泄，這表明對骨重吸收沒有產(chǎn)生任何的刺激作用。以最大至8μg/天的劑量向成年男性給藥1-羥基維生素D2沒有表現(xiàn)出明顯的臨床高鈣血癥或其它副作用。
式(I)化合物可在藥物組合物中作為活性成分，降低副作用的產(chǎn)生，而且與維生素D3已知的活性形式類似物相比，毒性更低。本發(fā)明的藥理活性化合物可根據(jù)藥學常規(guī)方法進行處理，以制成用于給藥于患者如包括人的哺乳動物的藥劑。例如，式(I)的化合物可以與常規(guī)賦形劑的混合物形式使用，所述賦形劑例如是適用于腸道(如口服)或非胃腸道給藥而且不損壞性地與活性化合物反應(yīng)的藥物學上可接受的載體物質(zhì)。
合適的藥物學上可接受的載體包括但不限于水、鹽溶液、醇、阿拉伯膠、植物油(如玉米油、棉籽油、花生油、橄欖油、椰子油)、魚肝油、油酯如Polysorbate 80、聚乙二醇、明膠、碳水化合物(如乳糖、直鏈淀粉或淀粉)、硬脂酸鎂、滑石、硅酸、粘性石蠟、脂肪酸單甘油酯和二甘油酯、季戊四醇脂肪酸酯、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、等等。
藥物制劑可是無菌的，而且如果需要的話，可與輔助試劑混合，所述輔助試劑例如是潤滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑、乳化劑、調(diào)節(jié)滲透壓的鹽、緩沖劑、著色劑、調(diào)味劑和/或一種或多種其它活性成分。
對于非胃腸道給藥，無菌注射液是特別合適的，優(yōu)選為油性或含水溶液、以及混懸液、乳液、或者植入劑包括栓劑。安瓿是常規(guī)的單元劑量。
對于腸內(nèi)給藥，特別合適的是片劑、糖衣片劑、液體、滴劑、錠劑、粉末或膠囊劑。如果需要甜味載體，糖漿、甘香酒劑等也可使用。
對于直腸給藥，化合物可形成為包含栓劑基質(zhì)如可可油或其他三甘油酯的藥物組合物。為延長儲存時間，所述組合物可有利地包括抗氧劑，如抗壞血酸、丁基化羥基茴香醚或氫醌。
口服給藥本發(fā)明的藥物組合物是優(yōu)選的。通常情況下，在治療前列腺癌或增生時，本發(fā)明化合物的劑量約0.01-2.0μg/kg/天，優(yōu)選為約0.01-1.0μg/kg/天。本發(fā)明的化合物通常是以單元劑量劑型分配在藥物學上可接受的載體中。
在治療前列腺癌時，非胃腸道給藥式(I)化合物的劑量為約0.01-1.0μg/kg/天。
應(yīng)認識到，在具體情況下活性化合物的實際優(yōu)選用量可根據(jù)所用具體化合物的功效、配制的具體組分、給藥形式以及所治療的具體部位和生物而變化。例如，對于具體患者的具體劑量取決于患者年齡、性別、體重、健康狀況、飲食、給藥的時間和方式、排泄速率、復(fù)合用藥、以及所治療疾病的嚴重性。用于某一宿主的劑量可根據(jù)常規(guī)方法來確定，例如通過合適的常規(guī)藥理學方法比較所用化合物與已知藥劑的不同活性。
與已知的雄激素消除或控制劑或睪酮濃度降低劑如雌激素(如己烯雌酚)、LHRH類似物以及5α-還原酶抑制劑如非那司提(finasteride)、抗雌激素物質(zhì)(如TamoxifenTM)和抗雄激素物質(zhì)(如氟他胺(flutamide))一起給藥式(I)的化合物，也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。(例如見第5,372,996號美國專利，其容納在此并入作為參考)。通過這些組合，可期望得到協(xié)同生物作用，并可產(chǎn)生更強的治療作用。同時，與單獨或大劑量地使用這些化合物相比，本發(fā)明的治療方法可顯著降低用這些藥物進行治療時的副作用，如雌激素的有害心血管作用。這些共同給藥的雄激素控制劑或睪酮濃度降低劑的可能劑量范圍是0.01-0.20μg/kg/天。
另外，共同給藥式(I)的活性維生素D和第二抗癌劑也包括在本發(fā)明的范圍中，所述第二抗癌劑例如是細胞毒性劑，這對于激素治療后復(fù)發(fā)的轉(zhuǎn)移性前列腺癌尤為如此。所述第二抗癌劑可合適地包括雌莫司汀(estramustine)磷酸鹽、松龍苯芥、順鉑、5-氟尿嘧啶、苯丙氨酸氮芥、羥基脲、絲裂霉素、去甲氧柔紅霉素、氨甲蝶呤、阿霉素和柔紅霉素。復(fù)合使用式(I)的活性維生素D和各種抗癌劑，可期望對癌細胞產(chǎn)生顯著增強的細胞毒性作用，并由此增加治療效果。具體而言，與單獨使用各抗癌劑相比，低濃度地使用上述組合的抗癌藥物即可明顯增加生長抑制作用，而且與單獨或大劑量地使用抗癌劑相比，可顯著降低與這些抗癌藥物有關(guān)的副作用。這些共同給藥的第二抗癌劑的可能劑量范圍是0.1-1μg/kg/天。
共同給藥有效劑量的式(I)類似物和其它已知可緩解骨疾病的激素或藥物如雌激素，也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。以上應(yīng)注意的是，前列腺癌經(jīng)常轉(zhuǎn)移至骨上，導(dǎo)致骨丟失和相關(guān)的疼痛。此等骨治療劑可包括結(jié)合雌激素或其等價物、降鈣素、二膦酸酯、鈣添加劑、鈷胺素、百日咳毒素和硼。這些共同給藥的治療劑的可能劑量范圍見表1。表1與式(I)之1α-羥基維生素D共同給藥的各種藥劑的可能口服劑量范圍
如TamoxifenTM的抗雌激素物質(zhì)也是已知的骨治療劑，其可與本發(fā)明的1α-羥基維生素D化合物和組合物復(fù)合使用。
以下將根據(jù)實施例進一步闡明本發(fā)明的實施方案，這些實施例不應(yīng)被理解為是對本發(fā)明范圍的限制，其僅是用于說明本發(fā)明。
VDR結(jié)合分析實施例11α，24-二羥基維生素D2[1α，24-(OH)2D2]使用從Incstar(Stillwater，Minnesota)購得的牛胸腺VDR試劑盒及標準1α，25-(OH)2D3溶液，測定1α，24-(OH)2D2對哺乳動物維生素D受體(VDR)的結(jié)合親和性?；瘜W合成的1α，24-(OH)2D2的半最大結(jié)合是約150pg/ml，而1α，25-(OH)2D3的半最大結(jié)合為80pg/ml。因此，1α，25-(OH)2D2對牛胸腺VDR的親和性類似于1α，25-(OH)2D3，這表明具有強的生物活性。實施例21α，24-二羥基維生素D4[1α，24-(OH)2D4]研究1α，24-(OH)2D4的VDR親和結(jié)合作用。將1α，24-(OH)2D4與維生素D受體和放射性標記的痕量1α，25-(OH)2D3一起培養(yǎng)。培養(yǎng)后，測量結(jié)合于受體的放射活性量，并與共同培養(yǎng)后未標記及標記的1α，25-(OH)2D3的結(jié)合量進行比較。發(fā)現(xiàn)50pg/試管的1α，24-(OH)2D4等于約20pg的1α，25-(OH)2D3。
這些結(jié)果表明，1α，24-(OH)2D4與維生素D受體的結(jié)合略低于1α，25-(OH)2D3。該數(shù)據(jù)意味著，1α，24-(OH)2D4對VDR具有高親和性和顯著的生理活性，類似于1α，25-(OH)2D3。這些數(shù)據(jù)與用1α，24-(OH)2D4進行的基因表達研究(以下將描述)是一致的，后者表明1α，24-(OH)2D4的活性略低于1α，25-(OH)2D3。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，這些結(jié)果是令人驚奇的，同時也是出乎意料的。它們與維生素D領(lǐng)域中以前認為維生素D4化合物的生理活性低的觀點正相反。實施例31α，24-二羥基維生素D2[1α，24-(OH)2D2]用Skowronski等人的方法(136 Endocrinology(1995)20-26，該文獻的內(nèi)容在此并入作為參考)證實維生素D化合物在前列腺細胞中與VDR的結(jié)合。將前列腺衍生的細胞系培養(yǎng)至接近融合，然后洗滌并刮集。離心洗滌細胞，然后將細胞沉淀物重新懸浮在經(jīng)緩沖的鹽溶液中，該溶液包含蛋白酶抑制劑。用超聲破碎細胞，并同時在冰上冷卻。在4℃、207000×g下離心經(jīng)破碎的細胞35分鐘，分析由此得到的上清液以檢測結(jié)合情況。200μl可溶性提取物(1-2mg蛋白/ml上清液)用1nM的3H-1α，25-(OH)2D3培養(yǎng)，并在4℃下于16-20小時中增加1α，24-(OH)2D2的濃度(0.01-100nM)。用羥基磷灰石通過標準方法分離結(jié)合及游離的激素。從測定的總結(jié)合中減去在250倍過量的非放射性1α，25-(OH)2D3存在時得到的非特異性結(jié)合，由此計算特異性結(jié)合。結(jié)果表明，1α，24-(OH)2D2對前列腺VDR具有強的親和性，這說明1α，24-(OH)2D2對前列腺細胞具有強的生理活性。實施例41α，24-二羥基維生素D4[1α，24-(OH)2D4]使用活性維生素D類似物1α，24-(OH)2D4重復(fù)實施例3的方法，并測定特異性結(jié)合。結(jié)果表明，1α，24-(OH)2D4對前列腺VDR具有強的親和性，這說明1α，24-(OH)2D4對前列腺細胞具有強的生理活性。實施例51α，25-二羥基維生素D4[1α，25-(OH)2D4]使用活性維生素D類似物1α，25-(OH)2D4重復(fù)實施例3的方法，并測定特異性結(jié)合。結(jié)果表明，1α，25-(OH)2D4對前列腺VDR具有強的親和性，這說明1α，25-(OH)2D4對前列腺細胞具有強的生理活性。
基因表達實施例61α，24-二羥基維生素D4[1α，24-(OH)2D4]使用質(zhì)粒p(CT4)4TKGH(其是維生素D受體(VDR)表達質(zhì)粒)和pSG5-hVDR1/3(其是包含生長激素(GH)基因的質(zhì)粒)，在維生素D應(yīng)答元素(VDRE)的對照下進行實驗，以發(fā)現(xiàn)1α，24-(OH)2D4與1α，25-(OH)2D3相比誘導(dǎo)維生素D依賴性生長激素的能力，該激素的作用是作為報道基因。用上述兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染在培養(yǎng)基中的細胞。在維生素D應(yīng)答元素(VDRE)的對照下，一種質(zhì)粒包含表達生長激素(GH)的基因，另一種質(zhì)粒包含表達維生素D受體(VDR)的結(jié)構(gòu)基因。這些經(jīng)轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基與1α，24-(OH)2D4或1α，25-(OH)2D3一起培養(yǎng)，然后測量生長激素的產(chǎn)生。下表2示出了該實驗的結(jié)果。
表2維生素D化合物誘導(dǎo)生長激素的產(chǎn)生
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這些數(shù)據(jù)表明，1α，24-(OH)2D4刺激維生素D依賴性的生長激素的能力接近等于1α，25-(OH)2D3。該結(jié)果是非常令人驚奇的，而且是所有現(xiàn)有技術(shù)都沒有公開的。實施例71α，24(S)-二羥基維生素D2和1α，24(R)-二羥基維生素D2[1α，24(S)-(OH)2D2和1α，24(R)-(OH)2D2]進行實施例6所述的基因表達研究，以比較化學合成的1α，24(S)-(OH)2D2和1α，24(R)-(OH)2D2與1α，25-(OH)2D3和25-OH-D3的體外生理活性。使用維生素D依賴性的轉(zhuǎn)錄活化模型系統(tǒng)，其中將質(zhì)粒pSG5-hVDR1/3和p(CT4)4TKGH共同轉(zhuǎn)染在綠猴腎COS-1細胞中。
經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞與維生素D代謝物一起培養(yǎng)，然后測定生長激素的產(chǎn)生。如表3所示，在該系統(tǒng)中，1α，24(S)-(OH)2D2及其差向異構(gòu)體--1α，24(R)-(OH)2D2都具有明顯更高的活性，而1α，24(R)-(OH)2D2的活性幾乎與1α，25-(OH)2D3的相同。表3在經(jīng)轉(zhuǎn)染的COS-1細胞中維生素D誘導(dǎo)的生長激素產(chǎn)生
*兩次測量的平均值對前列腺細胞增殖的抑制作用實施例81α，24-二羥基維生素D2[1α，24-(OH)2D2]使用Skowronski等人的方法(132 Endocrinology(1993)1952-1960，以及136 Endocrinology(1995)20-26，這兩個文獻的內(nèi)容在此并入作為參考)證實對細胞增殖的抑制作用。將得自于人前列腺之腺癌的細胞系--LnCaP和PC-3接種在六孔組織培養(yǎng)板上，它們的密度為約50000個細胞/板。在連接細胞并穩(wěn)定后，約為2-3天，用包含載體或濃度為10-11-10-17M的活性維生素D類似物--1α，24-(OH)2D2的培養(yǎng)基補充前述培養(yǎng)基。包含測試類似物或載體的培養(yǎng)基每3天更換一次。6-7天后，除去培養(yǎng)基，并沖洗細胞，用冷卻的5％三氯乙酸沉淀，然后用冷乙醇洗滌。將細胞溶解在0.2N氫氧化鈉中，然后通過標準方法測定DNA的量。結(jié)果表明，根據(jù)本發(fā)明用1α，24-(OH)2D2培養(yǎng)的培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基相比具有顯著更少的細胞。實施例91α，24-二羥基維生素D4[1α，24-(OH)2D4]使用活性維生素D類似物1α，24-(OH)2D4重復(fù)實施例8的方法，并測定細胞數(shù)量。用1α，24-(OH)2D4培養(yǎng)的培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基相比具有顯著更少的細胞。實施例101α，25-二羥基維生素D4[1α，25-(OH)2D4]使用活性維生素D類似物1α，25-(OH)2D4重復(fù)實施例8的方法，并測定細胞數(shù)量。用1α，25-(OH)2D4培養(yǎng)的培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基相比具有顯著更少的細胞。
對前列腺細胞分化的刺激作用實施例111α，24-二羥基維生素D2[1α，24-(OH)2D2]
使用Skowronski等人的方法(132 Endocrinology(1993)1952-1960，以及136 Endocrinology(1995)20-26，這兩個文獻的內(nèi)容在此并入作為參考)，將得自于人前列腺之轉(zhuǎn)移腺癌的細胞系--LnCaP的細胞接種在六孔組織培養(yǎng)板上，其密度為約50000個細胞/板，而且已知該細胞可表達PSA。在連接細胞并穩(wěn)定后，約為2-3天，用包含載體或濃度為10-11-10-17M的活性維生素D類似物--1α，24-(OH)2D2的培養(yǎng)基補充前述培養(yǎng)基。6-7天后，除去培養(yǎng)基，并在-20℃下儲存，用于前列腺特異性抗原(PSA)的分析。
沖洗平行培養(yǎng)基中的細胞，然后通過標準方法測定DNA的量。用標準的已知方法測定PSA。以PSA量/細胞計，用1α，24-(OH)2D2培養(yǎng)的培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基相比具有顯著更多的PSA。實施例121α，24-二羥基維生素D4[1α，24-(OH)2D4]使用活性維生素D類似物1α，24-(OH)2D4重復(fù)實施例12的方法，并測定PSA。以PSA量/細胞計，用1α，24-(OH)2D4培養(yǎng)的培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基相比具有顯著更多的PSA。實施例131α，25-二羥基維生素D4[1α，25-(OH)2D4]使用活性維生素D類似物1α，25-(OH)2D4重復(fù)實施例12的方法，并測定PSA。以PSA量/細胞計，用1α，25-(OH)2D4培養(yǎng)的培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基相比具有顯著更多的PSA。
臨床研究實施例141α，24-二羥基維生素D2[1α，24-(OH)2D2]患有晚期非雄激素依賴性前列腺癌的患者參加1α，24-(OH)2D2的開標研究。合格的患者至少為40歲，有前列腺之腺癌的組織學證據(jù)，而且患有以前對激素治療有反應(yīng)的進行性疾病。在允許參加研究后，患者開始持續(xù)26周口服1α，24-(OH)2D2的治療過程，但中止使用以前的鈣添加劑、維生素D添加劑、以及維生素D激素替代治療。在治療過程中，在規(guī)定的時間間隔處檢測患者以下項目(1)高鈣血癥、高磷血癥、高鈣尿癥、高磷尿癥和其它毒性；(2)轉(zhuǎn)移疾病發(fā)展的證據(jù)；以及(3)對預(yù)定實驗藥物劑量的耐受性。
分兩個階段進行該研究。在第一階段中，對一系列組的患者給藥逐漸增高劑量的1α，24-(OH)2D2，由此測定其每日口服的最大耐受劑量(MTD)。所有給給藥都是在早飯之前進行。第一組患者用25.0μg的1α，24-(OH)2D2進行治療。隨后的組用50.0、75.0和100.0μg/天的劑量治療。在研究階段不間斷地連續(xù)給藥，除非血清鈣超過11.6mg/dl或者觀察到3或4級的其它毒性，在這些情況下，暫時停止給藥，直至沒有所觀察到的毒性作用，并在濃度已下降10.0μg時重新開始。
該研究第一階段的結(jié)果表明，1α，24-(OH)2D2的MTD為20.0μg/天以上，該水平高于1α，25-(OH)2D3的10-40倍。從參加患者身上定時收集的血樣分析揭示，1α，24-(OH)2D2的循環(huán)濃度與給藥劑量成比例地增加，在最高劑量時升高至100pg/ml以上的最大濃度，而且1α，25-(OH)2D3的循環(huán)濃度被抑制，通常至檢測不到的水平。血清和尿鈣劑量依賴性地升高。對于用1α，24-(OH)2D2之MTD治療的患者，至少在6個月的時間中稱與轉(zhuǎn)移性疾病有關(guān)的骨疼痛顯著減少。
在第二階段中，用0.5-1.0倍于MTD的1α，24-(OH)2D2治療患者24個月。治療1和2年后，用于評估轉(zhuǎn)移性疾病進展的CAT掃描、X-射線和骨掃描都表明，許多患者在較低劑量時疾病穩(wěn)定或者部分減輕，而且在高劑量時疾病穩(wěn)定并有部分或完全的減輕。實施例151α-羥基維生素D2[1α-OH-D2]用活性維生素D化合物--1α-OH-D2重復(fù)實施例14的研究。階段一研究的結(jié)果表明，用1α-OH-D2之MTD治療至少6個月的患者中與轉(zhuǎn)移性疾病有關(guān)的骨疼痛顯著降低。階段二研究的結(jié)果表明，2年后，用于評估轉(zhuǎn)移性疾病進展的CAT掃描、X-射線和骨掃描都表明，許多患者在較低劑量時疾病穩(wěn)定或者部分減輕，而且在高劑量時疾病穩(wěn)定并有部分或完全的減輕。
雖然已具體地描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認識到，還可在本發(fā)明的范圍內(nèi)進行各種改進，其包括改變、添加和省略。因此，這些改進也應(yīng)在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，而且本發(fā)明的范圍僅應(yīng)局限在所附權(quán)利要求書的法律解釋范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.抑制人前列腺癌或增生細胞之過度增殖活性的方法，其包括用有效量的1α-羥基維生素D化合物治療所述細胞，所述1α-羥基維生素D化合物在其分子的側(cè)鏈上于C-24位處具有烴基團。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述1α-羥基維生素D化合物是用下式(I)表示者
其中B和C分別是氫或在C-22和C-23之間形成雙鍵的碳-碳鍵；R1和R2分別獨立地是氫、羥基、低級烷基、低級氟代烷基、O-低級烷基、低級烯基、低級氟代烯基、O-低級烯基、O-低級?；?、O-芳香酰基、低級環(huán)烷基，其條件是R1和R2不同時為烯基，或者與它們所連接的碳一起形成C3-C8環(huán)碳環(huán)；R3是低級烷基、低級烯基、低級氟代烷基、低級氟代烯基、O-低級烷基、O-低級烯基、O-低級?；?、O-芳香酰基或低級環(huán)烷基；X1是氫或羥基、或者在R3為烯基時與R3構(gòu)成一個鍵；而X2是氫、羥基、或與R1或R2構(gòu)成雙鍵。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述式(I)化合物是1α，24-二羥基維生素D2、1α，24-二羥基維生素D4、1α，25-二羥基維生素D4、1α，25-二羥基維生素D2、1α-羥基維生素D2、以及1α-羥基維生素D4。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述治療步驟包括抑制所述前列腺細胞的增殖作用，并誘導(dǎo)和增強其分化作用。
5.治療以異常細胞分化或細胞增殖為特征的前列腺疾病的方法，其包括向需要此等治療的男人或動物給藥有效抑制增殖作用的量的式(I)化合物
其中B和C分別是氫或在C-22和C-23之間形成雙鍵的碳-碳鍵；R1和R2分別獨立地是氫、羥基、低級烷基、低級氟代烷基、O-低級烷基、低級烯基、低級氟代烯基、O-低級烯基、O-低級酰基、O-芳香?；?、低級環(huán)烷基，其條件是R1和R2不同時為烯基，或者與它們所連接的碳一起形成C3-C8環(huán)碳環(huán)；R3是低級烷基、低級烯基、低級氟代烷基、低級氟代烯基、O-低級烷基、O-低級烯基、O-低級酰基、O-芳香酰基或低級環(huán)烷基；X1是氫或羥基、或者在R3為烯基時與R3構(gòu)成一個鍵；而X2是氫、羥基、或與R1或R2構(gòu)成雙鍵。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述治療量是0.01-2.0μg/kg/天。
7.治療人前列腺癌的方法，其包括向患有前列腺癌的男性患者給藥有效量的第一抗癌劑以降低或穩(wěn)定癌癥的細胞異常增殖活性，所述第一抗癌劑是活性維生素D化合物，該化合物或者其體內(nèi)代謝物具有VDR結(jié)合親和性，該結(jié)合親和性基本上等于1α，25-二羥基維生素D3的結(jié)合親和性，但高鈣血癥的危險大大低于1α，25-二羥基維生素D3。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述活性維生素D是以混合物的形式給藥，該混合物包括第二抗癌劑，其選自于以下組中雌莫司汀磷酸鹽、松龍苯芥、順鉑、5-氟尿嘧啶、苯丙氨酸氮芥、羥基脲、絲裂霉素、去甲氧柔紅霉素、氨甲蝶呤、阿霉素和柔紅霉素。
9.藥物組合物，其包括(a)第一抗癌劑，其為活性維生素D化合物；以及(b)選自于以下組中的藥劑(i)第二抗癌劑、(ii)骨治療劑、(iii)雄激素控制劑、(iv)5α-還原酶抑制劑以及它們的組合。
10.如權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其中，所述活性維生素D化合物是用下式(I)表示者
其中B和C分別是氫或在C-22和C-23之間形成雙鍵的碳-碳鍵；R1和R2分別獨立地是氫、羥基、低級烷基、低級氟代烷基、O-低級烷基、低級烯基、低級氟代烯基、O-低級烯基、O-低級酰基、O-芳香?；?、低級環(huán)烷基，其條件是R1和R2不同時為烯基，或者與它們所連接的碳一起形成C3-C8環(huán)碳環(huán)；R3是低級烷基、低級烯基、低級氟代烷基、低級氟代烯基、O-低級烷基、O-低級烯基、O-低級?；?、O-芳香?；虻图壄h(huán)烷基；X1是氫或羥基、或者在R3為烯基時與R3構(gòu)成一個鍵；而X2是氫、羥基、或與R1或R2構(gòu)成雙鍵。
11.如權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其中，所述活性維生素D化合物是1α，24-二羥基維生素D2、1α，24-二羥基維生素D4、1α，25-二羥基維生素D4、1α，25-二羥基維生素D2、1α-羥基維生素D2、以及1α-羥基維生素D4。
12.如權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其中，所述第二抗癌劑選自于雌莫司汀磷酸鹽、松龍苯芥、順鉑、5-氟尿嘧啶、苯丙氨酸氮芥、羥基脲、絲裂霉素、去甲氧柔紅霉素、氨甲蝶呤、阿霉素和柔紅霉素。
13.如權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其中，所述活性維生素D的劑量是約0.01-2.0μg/kg/天。
14.如權(quán)利要求10所述的藥物組合物，其進一步包括藥物學上可接受的載體。
15.如權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其中，所述雄激素控制劑選自于以下組雌激素、LHRH類似物、抗雌激素物質(zhì)和抗雄激素物質(zhì)。
16.如權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其中，所述5α-還原酶抑制劑是非那司提。
17.如權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其中，所述骨治療劑選自于以下組結(jié)合雌激素、抗雌激素物質(zhì)、降鈣素、氟化鈉、二膦酸酯、鈣添加劑、鈷胺素、百日咳毒素和硼。
18.治療人以降低前列腺癌或增生的過度增殖細胞的活性的方法，其包括向需要此等治療的人給藥治療有效量的活性維生素D化合物，所述活性維生素D化合物在C-24位處具有烴基團。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于抑制、改善或緩解前列腺疾病之過渡增殖細胞活性的治療方法,所述前列腺疾病例如是前列腺癌和前列腺增生,該方法包括向患者給藥活性維生素D類似物。本發(fā)明的方法可促進、誘導(dǎo)或增強細胞的分化作用,但不使患者產(chǎn)生劑量限制性的高鈣血癥和高鈣尿癥。
文檔編號A01N45/00GK1248917SQ97181974
公開日2000年3月29日 申請日期1997年12月10日 優(yōu)先權(quán)日1996年12月30日
發(fā)明者查爾斯·W·畢曉普, 喬伊斯·C·克努森, 理查德·B·馬澤斯 申請人:骨療國際公司