專利名稱:一種豬性別控制精子及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種家畜性別控制精子分離技術，特別是涉及一種豬性別控制精子及其制備方法和應用。
背景技術：
動物的性別控制(sex control)技術是通過對動物的正常生殖過程進行人為干預，使成年雌性動物產(chǎn)出人們期望性別后代的一門生物技術，其在畜牧生產(chǎn)中具有重要意義。首先，通過控制后代的性別比例，可充分發(fā)揮受性別限制的生產(chǎn)性狀(如泌乳、產(chǎn)蛋)和受性別影響的生產(chǎn)性狀(如生長速度、肉質等)，從而獲得最大的經(jīng)濟效益；其次，通過控制后代的性別比例可增加選種強度、加快畜禽育種進程，同時也可提高珍稀動物的繁殖、保種進程，從而挽救瀕臨滅絕的珍稀動物；通過控制胚胎性別可以及時克服牛胚胎移植中出現(xiàn)的異性雙生不育的現(xiàn)象，從而排除伴性有害基因的危害；此外，還可以用于防止性連鎖遺傳疾病，迅速降低伴性有害基因在群體中的頻率。
性別控制的途徑有兩種，一是在受精之前是通過對精子的體外干預，使在受精之時便決定了后代的性別；二是在受精之后則是通過對胚胎性別進行鑒定，從而獲得所需性別的后代。前者是動物性別控制最為有效的途徑。在哺乳動物中，每一個體的X精子和Y精子的DNA含量是恒定的，相差多在3.6-4.2%之間，流式細胞分離儀就是利用這種差異，借助特異性染色劑染色，然后根據(jù)發(fā)出的熒光強度，再通過計算機來預測精子類別。目前這種技術已被廣泛應用于奶牛、羊、鹿等性別控制精子的分離。
如授權公告號為CN101347458B的中國發(fā)明專利公開了一種羊X/Y精子分離冷凍精液及其生產(chǎn)方法和應用，其應用羊X、Y精子DNA含量的差異，通過流式細胞方式分離X和Y精子，然后制成性別控制冷凍精液，其冷凍保存條件為-90 -120°C處理20-30分鐘。此發(fā)明得到的冷凍精液在用于以人工授精方式或胚胎移植方式控制羊產(chǎn)羔的性別時分離效率高，性別控制準確 率可達90%以上，適用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和養(yǎng)殖,從而大幅度提高養(yǎng)殖效應。
又如公開號為CN101411722A的中國發(fā)明專利公開了一種奶牛性別控制冷凍混合精液的生產(chǎn)新技術，其以山羊精液作為基礎，加入不同比例的分離X/Y精液來生產(chǎn)奶牛X/Y性別控制冷凍精液。此技術可以使奶牛X/Y性別控制冷凍精液的生產(chǎn)效率提高2-4倍，并且提高了凍精解凍后精子的活力、頂體完整率，延長了凍精解凍后具有授精能力的時間，使母牛的平均情期受胎率達到50%以上，性別控制準確率達到90%以上。
豬的X和Y精子之間DNA含量的差異較小，僅為3.6%，因此不容易被分辨；并且，豬精子在進行分離處理過程中極易受損，例如在分離過程中的稀釋、染色、擠壓、激光照射等處理都會豬精子造成一定的影響，從而降低精子的品質、受精能力及存活時間；此外，豬精子人工授精需要的數(shù)量大、分離所需的時間長、冷凍豬精子在解凍后活力不高(實驗室一般情況也僅有40%左右)等因素都導致這種性別控制技術在豬的應用上存在一定的難度。
公開號為CN101613677A的中國發(fā)明專利公開了一種分離豬X精子和Y精子的方法，將采集的公豬精液在30°C ±2°C的溫度下暫時保存后，用精液稀釋液按適當比例稀釋原精液，然后加入適當濃度的熒光染色劑進行染色，再加入食物色素染色后過濾，隨后在20°C 25°C下利用流式細胞儀分離X、Y精子，并用裝有精子接收液的接收管收集分離后的X、Y精子，經(jīng)離心濃縮后可用于保存或授精。利用此方法分離豬精子可提高X、Y精子的分辨率和分離準確率，然而其精子活力仍有待提高，此外該專利并未對分離的精子的冷凍保存以及解凍后精子活力作進一步研究。
由于豬精子對外界溫度的突變改變相當敏感，特別是在迅速冷卻至0_15°C時極易失去活力，此外解凍后的精子易產(chǎn)生活力喪失、精子膜的選擇通透性降低、頂體膜損傷等現(xiàn)象，目前在生產(chǎn)上難以像牛的精液冷凍一樣得到普遍地推廣應用。授權公告號為CN101869101B的中國發(fā)明專利公開了一種豬精液冷凍保存方法，該方法要求精液樣品新鮮精液活力> 0.7，冷凍時先配制豬精液冷凍稀釋液配方與稀釋液，在稀釋精液后預冷平衡，再將精液滴凍，最后解凍精液和進行凍后活力檢查。此發(fā)明雖能較好地保證凍后精子的活力、存活率、質膜完整率、頂體完整率及線粒體活性，然而此凍存方法相對繁瑣。

發(fā)明內容
本發(fā)明的首要目的是針對上述現(xiàn)有技術存在的問題提供一種簡單、實用、易于操作的豬性別控制精子及其制備方法和應用，本發(fā)明方法能夠有效避免豬X、Y精子在分離過程中受到損傷，從而提高精子的品質和受精能力，并延長精子的存活時間，此外分離的精子在進行授精時所需劑量低。
為了達到上述目的，本發(fā)明一方面提供一種豬性別控制精子的制備方法，包括如下步驟:
A)用含有精漿、染料木黃酮和牛尿酚的原精稀釋液對公豬原精液進行稀釋；
B)用流式細胞分離儀對稀釋后的公豬原精液進行分離；
C)將分離得到 的豬性別控制精子回收到含有精漿、染料木黃酮和牛尿酚的冷凍稀釋液中，制得豬性別控制精子。
其中，步驟A)中所述精楽:在原精稀釋液中的質量百分含量為5-10%,優(yōu)選為5-8%，進一步優(yōu)選為5-6%;所述染料木黃酮在原精稀釋液中的濃度為10-50 μ M，優(yōu)選為20-40 μ Μ，進一步優(yōu)選為30 μ M ;所述牛尿酚在原精稀釋液中的濃度為80-120 μ Μ，優(yōu)選為90-110 μ Μ,進一步優(yōu)選為 100 μ Mo
其中，步驟C)中所述精漿在冷凍稀釋液中的質量百分含量為5-10%，優(yōu)選為5-8%，進一步優(yōu)選為6% ;所述染料木黃酮在冷凍稀釋液中的濃度為10-50 μ Μ，優(yōu)選為20-40 μ Μ，進一步優(yōu)選為30 μ M ;所述牛尿酚在冷凍稀釋液中的濃度為80-120 μ Μ，優(yōu)選為90-110 μ Μ，進一步優(yōu)選為100 μ M0
本發(fā)明所述的精漿是精液的無形成分，可通過將動物精液離心去除精子后制得，其中含有大量的糖類、脂類、蛋白質、肽類激素、胺類、有機酸、有機堿以及無機離子等，可為分離的精子提供能量和營養(yǎng)物質，調控精子活力、活率、獲能和頂體反應，提供精子生存的微環(huán)境，從而減少精子中不同成分的丟失，提聞精子I旲的完整性，提聞受:胎率和分婉率；其中所述精漿的來源理論上不受限制，可以來源于豬、牛、羊、鹿等動物，優(yōu)選來源于豬、牛、羊，進一步優(yōu)選來源為豬。本發(fā)明中染料木黃酮和牛尿酚(Equol，又名馬雌酚)作為抗氧化齊U，用于抵抗分離及冷凍處理過程中過氧化物對細胞的損傷，從而有利于保護精子DNA的完整性，提聞精子的活力和功能。
特別是，在豬精子分離及冷凍過程的稀釋液中同時添加精漿、染料木黃酮和牛尿酚相對于單獨添加精漿或染料木黃酮和牛尿酚具有更好的效果，能夠明顯提高豬分離精子的活力并延長分離精子的存活時間；此外，凍存后的豬分離精子仍具有較好的質量和活力，在用于人工授精時所需劑量低，從而節(jié)約生產(chǎn)成本。
其中，所述原精稀釋液是通過向常規(guī)稀釋液中添加精漿、染料木黃酮和牛尿酚制得。所述常規(guī)稀釋液為現(xiàn)有技術，其中大體上包括但不限于選自奶、等滲糖、卵黃、緩沖鹽、抗生素中的多種成分，特別是所述常規(guī)稀釋液選自葡萄糖稀釋液、葡萄糖-氨基乙酸稀釋液、葡萄糖-檸檬酸鈉-乙二胺四乙酸二鈉稀釋液、葡萄糖-檸檬酸鈉-卵黃稀釋液中的一種。
其中，所述冷凍稀釋液是通過向常規(guī)冷凍液中添加精漿、染料木黃酮和牛尿酚制得。所述常規(guī)冷凍液為現(xiàn)有技術，其大體上包括但不限于選自糖、蛋白質、脂類、卵黃、緩沖鹽、抗生素、冷凍保護劑中的多種成分，如李喜和主編的《家畜性別控制技術》(北京:科學出版社，2009)中公開的冷凍I液、冷凍II液等。
特別是，所述冷凍稀釋液還含有冷凍添加劑，其中所述冷凍添加劑選自甘油、二甲基亞砜(DMSO)、丙二醇、氨基-鈉-十二烷基硫酸酯(OEP)、三羥甲基氨基甲烷(TRIS)、安鈉咖(CNB)、二丁基羥基甲苯(BHT)中的一種或多種，優(yōu)選為甘油、OEP、BHT中的一種或多種，進一步優(yōu)選為甘油。所述冷凍添加劑用于使豬精子抵抗冷凍損傷、提高凍后精子的活力、生存力、質膜與頂體的完整性、存活時間等。
尤其是，所述甘油在冷凍稀釋液中的質量百分含量為5-12%，優(yōu)選為5-8%，進一步優(yōu)選為5-6% ;所述OEP在冷凍稀釋液的質量百分含量為0.5-2%，優(yōu)選為0.8-1.2%,進一步優(yōu)選為1% ;所述BHT在冷凍稀釋液的濃度為0.1-lmM，優(yōu)選為0.2-0.8mM，進一步優(yōu)選為
0.5mM。
本發(fā)明的豬性別控制精子采用流式細胞分離儀進行制備，其方法為本領域常規(guī)方法，具體包括如下步驟:
a)取公豬原精液，用含有精漿、染料木黃酮和牛尿酚的原精稀釋液進行稀釋后，力口入熒光染色劑進行染色，制得待分離精液；
b)采用流式細胞分離儀對所述待分離精液進行分離；
c)將分離得到的豬性別控制精子回收到含有精漿、染料木黃酮和牛尿酚的冷凍稀釋液中，制得豬性別控制精子。
其中，步驟a)中所述公豬原精液的精子活力> 80% ;所述緩沖稀釋液中精漿的質量百分含量為5-10%，染料木黃酮的濃度為10-50 μ M，牛尿酚的濃度為80-120 μ M ;所述熒光染色劑為Hoechst33342，其在待分離精液中的濃度為50-120 μ g/ml，優(yōu)選為80-100 μ g/ml ;所述染色的溫度為25-37°C，染色時間為30-60min ;所述待分離精液中精子濃度為100-200X IO6 精子/ml。
特別是，步驟a)中，在制得待分離精液前向染色的公豬原精液中加入食品紅，以減弱死精子上的熒光，從而提高分離精子的活力；所述食品紅在待分離精液中的濃度為25-50 μ Mo[0028]其中，步驟c)中所述豬性別控制精子是將公豬原精液進行性別分離后得到的單一性別的精子(即X精子和Y精子)。
特別是，還包括步驟D):對所述豬性別控制精子進行冷凍保存。所述冷凍保存為現(xiàn)有技術中的常規(guī)方法，如顆粒法、細管法和塑料袋法，優(yōu)選為細管法。
尤其是，所述冷凍保存具體包括:
Dl)將所述豬性別控制精子離心后，用冷凍稀釋液A進行稀釋，將稀釋后的豬性別控制精子緩慢降溫并且平衡一段時間；
D2)在冷凍稀釋液A平衡后加入冷凍稀釋液B，平衡一段時間后進行分裝、冷凍及
液氮保存。
其中，所述冷凍稀釋液A為無甘油的常規(guī)冷凍液，此外額外添加有精漿、染料木黃酮和牛尿酚；特別是，所述冷凍稀釋液A中精漿的質量百分含量為5-10%，染料木黃酮的濃度為10-50 μ Μ，牛尿酚的濃度為80-120 μ Μ。
其中，所述冷凍稀釋液B為添加甘油的常規(guī)冷凍液，并且額外添加有精漿、染料木黃酮和牛尿酚；特別是，所述冷凍稀釋液B中精漿的質量百分含量為5-10%，染料木黃酮的濃度為10-50 μ Μ，牛尿酚的濃度為80-120 μ Μ，甘油的質量百分含量為5_12%，優(yōu)選為6%。
特別是，步驟Cl)中所述離心是在10-20°C下于800g離心10_20min，所述降溫為降溫至4-5 V，并且在4-5 °C下平衡30-120min ;步驟C2)中所述平衡是在4_5°C下平衡30_120mino
本發(fā)明另一方面提供一種上述方法制備得到的豬性別控制精子。
本發(fā)明再一方面提供一種豬性別控制精子在人工授精上的應用，特別是所述豬性別控制精子在進行人工授精時的劑量為50-200萬精子/只，優(yōu)選為100萬精子/只。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
1、本發(fā)明的方法能夠有效避免豬X、Y精子在分離過程中受到損傷，從而提高豬性別控制精子的品質和受精能力，并延長性別控制精子的存活時間；
2、本發(fā)明的方法能夠有效避免豬性別控制精子在冷凍過程中受到損傷，從而提高豬精子在凍存及解凍后的活力及存活時間；
3、本發(fā)明方法操作簡單，實用性強，制備的豬性別控制精子可用于低劑量人工授精，從而降低生產(chǎn)成本，具有廣闊的市場前景。
具體實施方式
下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內。
實施例1
一、配制溶液
1、原精稀釋液
稱取葡萄糖5.0g、檸檬酸鈉0.3g、乙二胺四乙酸二鈉0.lg、染料木黃酮0.8Img(3(^10、牛尿酚2.4211^ (100 μ M)、精漿6.0g (將新鮮的公豬精液于1600r/min離心后的上清液)溶于100毫升蒸懼水中,在使用前加入青霉素12萬國際單位,鏈霉素0.15微克，即制得原精稀釋液(即在葡萄糖-檸檬酸鈉-乙二胺四乙酸二鈉稀釋液中添加染料木黃酮、牛尿酚及精漿);
2、冷凍稀釋液A
向原精稀釋液中添加20% (體積含量)的卵黃，用磁力攪拌器充分攪拌均勻，經(jīng)離心、取上清過濾處理后，制得冷凍稀釋液A ;
3、冷凍稀釋液B
向上述冷凍稀釋液A中加入甘油至甘油的終質量百分含量為6%，即制得冷凍稀釋液B ；
二、制備豬性別控制精子
從一只健康的公豬采集新鮮精液2mL，用熒光顯微鏡檢測其活力為90% ;用上述制備的室溫(28°C)平衡的原精稀釋液將上述新鮮精液稀釋至200X IO6精子/ml，然后加入濃度為10mg/mL的熒光染色劑Hoechst33342至終濃度為80 μ g/ml，混合均勻，在28°C水浴中染色30min ;染色結束后，用含有50 μ M食品紅的上述原精稀釋液進一步稀釋至IOOX IO6精子/ml，制得待分離精液；
采用SX-MoFlo流式細胞分離儀對上述待分離精液進行分離和回收，將分離后的豬性別控制精子分別收集于上述冷凍稀釋液A中，將收集的豬性別控制精子在SOOg下離心lOmin，棄去上清，再用上述冷凍稀釋液A重新懸浮沉淀，即制得豬性別控制精子(X精子和Y精子)；
將制得的豬性別控制精子(X精子)在28°C下用熒光顯微鏡檢測精子活力，重復測定六次，豬X精子的平均 活力為68.2% ；
三、冷凍保存
將制備的豬性別控制精子在室溫(28°C)下平衡1.5h后，移入15°C條件下降溫平衡3h，然后在15°C下于800g離心lOmin，再加入上述冷凍稀釋液A，緩慢降溫至5°C，平衡2h后，再加入5°C的上述冷凍稀釋液B，并于5°C分裝于0.25mL細管中，制成100萬精子的豬性別控制精液，隨后進行冷凍及液氮保存；
將液氮保存三個月的裝有豬X精子的細管取出后進行解凍(37°C，20s),之后平衡至室溫(28°C)并測定精子活力，共取出六管進行測定，凍存后豬X精子的平均活力為42.6% ；
四、人工授精
取凍存三個月后的豬X精子以常規(guī)方法對20頭母豬進行人工授精，每只母豬一次使用100萬X精子，人工授精結果見表I。
實施例2
一、配制溶液
1、原精稀釋液
稱取葡萄糖5.0g、檸檬酸鈉0.3g、乙二胺四乙酸二鈉0.lg、染料木黃酮0.54mg(2(^10、牛尿酚2.6611^ (110 μ M)、精漿7.0g (將新鮮的公豬精液于1600r/min離心后的上清液)溶于100毫升蒸懼水中,在使用前加入青霉素12萬國際單位,鏈霉素0.15微克，即制得原精稀釋液；[0064]2、冷凍稀釋液
向上述原精稀釋液中加入甘油至甘油的終質量百分含量為8%，即制得冷凍稀釋液；
二、制備豬性別控制精子
從一只健康的公豬采集新鮮精液2mL，用熒光顯微鏡檢測其活力為90% ;用上述制備的室溫(25°C)平衡的原精稀釋液將上述新鮮精液稀釋至400X IO6精子/ml，然后加入濃度為10mg/mL的熒光染色劑Hoechst33342至終濃度為100 μ g/ml，混合均勻，在25°C水浴中染色30min ;染色結束后，用含有80 μ M食品紅的上述原精稀釋液進一步稀釋至200X IO6精子/ml，制得待分離精液；
采用SX-MoFlo流式細胞分離儀對上述待分離精液進行分離和回收，將分離后的豬性別控制精子分別收集于上述冷凍稀釋液中，將收集的豬性別控制精子在800g下離心IOmin,棄去上清，用上述冷凍稀釋液重新懸浮沉淀，即制得豬性別控制精子(X精子和Y精子)；
將制得的豬性別控制精子(X精子)在25°C下用熒光顯微鏡檢測精子活力，重復測定六次，豬X精子的平均活力為65.9% ；
三、冷凍保存
將制備的豬性別控制精子在4°C條件下分裝于0.25mL細管中，制成200萬精子的豬性別控制精液，然后置入_90°C的氮蒸汽中處理60分鐘，然后投入液氮中保存；
將液氮保存三個月后的細管取出，并進行解凍(37°C，20s)，之后平衡至室溫(25°C )，共取出六管進行測定，凍存后豬X精子的平均活力為41.3% ；
四、人工授精
取凍存三個月后的豬X精子以常規(guī)方法對20頭母豬進行人工授精，每只母豬一次使用100萬X精子，人工授精結果見表I。
實施例3
一、配制溶液
1、原精稀釋液
稱取葡萄糖5.0g、朽1檬酸鈉0.5g、染料木黃酮1.35mg (50 μ Μ)、牛尿酹1.94mg(80 μ Μ)、精漿7.5g(將新鮮的公牛精液于1600r/min離心后的上清液)溶于100毫升蒸餾水中，在使用前加入青霉素8萬國際單位，卵黃5毫升，即制得原精稀釋液；(即在葡萄糖-檸檬酸鈉-卵黃稀釋液中添加染料木黃酮、牛尿酚及精漿)
2、冷凍稀釋液
向上述原精稀釋液中加入甘油和BHT，至甘油的終質量百分含量為8%、BHT的終濃度為0.5mM,即制得冷凍稀釋液；
二、制備豬性別控制精子
從一只健康的公豬采集新鮮精液2mL，用熒光顯微鏡檢測其活力為85% ;用上述制備的室溫(32°C)平衡的原精稀釋液將上述新鮮精液稀釋至300X IO6精子/ml，然后加入濃度為10mg/mL的熒光染色劑Hoechst33342至終濃度為100 μ g/ml，混合均勻，在32°C水浴中染色30min ;染色結束后，用含有100 μ M食品紅的上述原精稀釋液進一步稀釋至150X IO6精子/ml，制得待分離精液；[0083]采用SX-MoFlo流式細胞分離儀對上述待分離精液進行分離和回收，將分離后的豬性別控制精子分別收集于上述冷凍稀釋液中，將收集的豬性別控制精子在800g下離心IOmin,棄去上清，用上述冷凍稀釋液重新懸浮沉淀，即制得豬性別控制精子(X精子和Y精子)；
將制得的豬性別控制精子(Y精子)在32°C下用熒光顯微鏡檢測精子活力，重復測定六次，豬Y精子的平均活力為63.8% ；
三、冷凍保存
將制備的豬性別控制精子在5°C條件下分裝于0.25mL細管中，制成100萬精子的豬性別控制精液；
準備好程序冷凍儀，注入液氮并將起始溫度設在5°C，移入裝有豬性別控制精子的細管，開啟程序降溫冷凍，先以6°C /分鐘的速度降溫至-10°C，恒溫停留2分鐘，然后以6°C /分鐘的速度降溫，至達到_80°C時終止，將細管投入液氮中進行保存；
將液氮保存三個月后的細管取出，并進行解凍(37°C，20s)，之后平衡至室溫(32 °C)，共取出六管進行測定，凍存后豬Y精子的平均活力為40.2% ；
四、人工授精
取凍存三個月后的豬Y精子以常規(guī)方法對20頭母豬進行人工授精，每只母豬一次使用200萬Y精子，人工授精結果見表I。
實施例4
原精稀釋液和冷凍稀釋液A同實施例1 ;
向冷凍稀釋 液A中加入甘油和0ΕΡ，其中甘油在冷凍稀釋液A中的終質量百分含量為6%，OEP在冷凍稀釋液A中的終質量百分含量為1%，即制得冷凍稀釋液B ；
制備豬性別控制精子及冷凍保存方法同實施例1，分離后的豬X精子的平均活力為68.5%，冷凍保存的豬X精子的平均活力為42.8% ；
取凍存三個月后的豬X精子以常規(guī)方法對20頭母豬進行人工授精，每只母豬一次使用50萬X精子，人工授精結果見表I。
對照例I
除配制溶液步驟中，在配制原精稀釋液及冷凍稀釋液A時不額外添加精漿、染料木黃酮和牛尿酚外，其余均與實施例1相同，分離后的豬X精子的平均活力為49.6%，凍存三個月后豬X精子的平均活力為30.8%，凍存三個月后豬X精子人工授精結果見表I。
對照例2
除配制溶液步驟中，在配制原精稀釋液及冷凍稀釋液A時僅額外添加精漿6.0g外，其余均與實施例1相同，分離后的豬X精子的平均活力為55.4%，凍存三個月后豬X精子的平均活力為34.0%，凍存三個月后豬X精子人工授精結果見表I。
對照例3
除配制溶液步驟中，在配制原精稀釋液及冷凍稀釋液A時僅額外添加染料木黃酮(30 μ M)和牛尿酚(100 μ M)外，其余均與實施例1相同，分離后的豬X精子的平均活力為53.1%，凍存三個月豬X精子的平均活力為32.7%，凍存三個月后豬X精子人工授精結果見表
1
表I凍存三個月后的豬性別控制精子進行人工授精的結果
權利要求
1.一種豬性別控制精子的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: A)用含有精漿、染料木黃酮和牛尿酚的原精稀釋液對公豬原精液進行稀釋； B)用流式細胞分離儀對稀釋后的公豬原精液進行分離； C)將分離得到的豬性別控制精子回收到含有精漿、染料木黃酮和牛尿酚的冷凍稀釋液中，制得豬性別控制精子。
2.如權利要求
1所述的制備方法，其特征在于，步驟A)中所述精漿在原精稀釋液中的質量百分含量為5-10%，所述染料木黃酮在原精稀釋液中的濃度為10-50 μ M，所述牛尿酚在原精稀釋液中的濃度為80-120 μ M0
3.如權利要求
1所述的制備方法，其特征在于，步驟C)中所述精漿在冷凍稀釋液中的質量百分含量為5-10%，所述染料木黃酮在冷凍稀釋液中的濃度為10-50 μ Μ，所述牛尿酚在冷凍稀釋液中的濃度為80-120 μ M0
4.如權利要求
1-3中任一所述的制備方法，其特征在于，所述原精稀釋液是通過向常規(guī)稀釋液中添加精漿、染料木黃酮和牛尿酚制得，其中所述常規(guī)稀釋液選自葡萄糖稀釋液、葡萄糖-氨基乙酸稀釋液、葡萄糖-檸檬酸鈉-乙二胺四乙酸二鈉稀釋液、葡萄糖-檸檬酸鈉-卵黃稀釋液中的一種。
5.如權利要求
1-3中任一所述的制備方法，其特征在于，所述冷凍稀釋液是通過向常規(guī)冷凍液中添加精漿、染料木黃酮和牛尿酚制得。
6.如權利要求
1-3中任一所述的制備方法，其特征在于，所述冷凍稀釋液還含有冷凍添加劑，其中所述冷凍添加劑選自甘油、二甲基亞砜、丙二醇、氨基-鈉-十二烷基硫酸酯、三羥甲基氨基甲烷、安鈉咖、二丁基羥基甲苯中的一種或多種。
7.如權利要求
1-3中任一所述的制備方法，其特征在于，還包括步驟D):對所述豬性別控制精子進行冷凍保存。
8.—種豬性別控制精子，其特征在于，所述按照權利要求
1所述方法制備得到。
9.權利要求
8所述的豬性別控制精子在人工授精上的應用。
10.如權利要求
9所述的應用，其特 征在于，所述豬性別控制精子在進行人工授精時的劑量為50-200萬精子/只。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種豬性別控制精子及其制備方法和應用，首先用含有精漿、染料木黃酮和牛尿酚的原精稀釋液對公豬原精液進行稀釋，再用流式細胞分離儀對稀釋后的公豬原精液進行分離，最后將分離得到的豬性別控制精子回收到含有精漿、染料木黃酮和牛尿酚的冷凍稀釋液中。本發(fā)明方法操作簡單，能夠有效避免豬X、Y精子在分離及凍存過程中受到損傷，從而提高精子的品質和受精能力，并延長精子的存活時間，分離的精子可用于低劑量授精，從而降低生產(chǎn)成本，此方法能夠廣泛應用于商業(yè)推廣，具有廣闊的市場前景。
文檔編號A01N1/02GKCN103222458SQ201310120217
公開日2013年7月31日 申請日期2013年4月8日
發(fā)明者祝發(fā)明, 韓春元, 彭勇, 翟亞玲, 賈武利, 白曉婷, 同文江 申請人:陜西石羊集團蒲城畜牧發(fā)展有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan