本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)，尤其涉及一種通過(guò)游離小孢子培養(yǎng)獲得雙單倍體辣椒植株的方法。

背景技術(shù)：

1、辣椒是世界各地廣泛種植的作物，可用作蔬菜、醬料、配料、食品著色劑和辛辣劑等，或用于藥物的制備當(dāng)中。目前，人們?cè)陔s種優(yōu)勢(shì)育種中主要采用連續(xù)自交的方法來(lái)純化親本。因此，從雜合育種材料中培育出優(yōu)良的自交系通常需要5～6代甚至更多的連續(xù)自交和選擇。雙單倍體在植物育種中的主要優(yōu)勢(shì)是可以快速實(shí)現(xiàn)完全純合，所需的基因型在一代中就固定下來(lái)，減少了品種或自交系開(kāi)發(fā)的時(shí)間和成本。通過(guò)花藥或游離的小孢子培養(yǎng)進(jìn)行體外雄核發(fā)生是實(shí)現(xiàn)純合性以及產(chǎn)生純系的最快途徑和最有效的系統(tǒng)。與花藥培養(yǎng)相比，游離的小孢子培養(yǎng)可以避免從花藥體組織中形成愈傷組織和胚。游離小孢子可以直接接觸培養(yǎng)基，加快培養(yǎng)條件的優(yōu)化；此外，游離小孢子培養(yǎng)中高水平的自發(fā)染色體加倍是游離小孢子培養(yǎng)的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)。

2、目前在辣椒單倍體育種中，游離小孢子培養(yǎng)效果最好的是采用兩步培養(yǎng)法進(jìn)行高質(zhì)量胚胎生產(chǎn)和植物再生，但是培養(yǎng)的步驟過(guò)于煩瑣，容易增加污染的概率。在本研究中，我們通過(guò)游離小孢子培養(yǎng)獲得愈傷組織，愈傷組織分化形成雙單倍體辣椒植株，為辣椒單倍體育種提供新的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種通過(guò)游離小孢子培養(yǎng)獲得雙單倍體辣椒植株的方法。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種通過(guò)游離小孢子培養(yǎng)獲得雙單倍體辣椒植株的方法，包括如下步驟：

4、(1)將辣椒花蕾低溫預(yù)處理后，消毒；

5、(2)將消毒后的花蕾與提取液混合得到懸浮液，游離收集小孢子；所述提取液包括甘露醇、氯化鈣和緩沖液；

6、(3)將步驟(2)得到的小孢子置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到愈傷組織；

7、(4)將步驟(3)得到愈傷組織置于分化培養(yǎng)基分化培養(yǎng)，得到辣椒苗。

8、優(yōu)選的，步驟(1)所述低溫預(yù)處理的溫度為3～5℃，時(shí)間為1～3d。

9、優(yōu)選的，步驟(2)所述花蕾與提取液質(zhì)量體積比為0.6g:13～18ml；所述提取液中甘露醇的濃度為50～70g/l；氯化鈣的濃度為1.0～1.2g/l；緩沖液的濃度為0.9～1.0g/l；所述緩沖液為mes。

10、優(yōu)選的，步驟(2)所述游離的方法為：將懸浮液旋切后，過(guò)濾得濾液，離心2～4次，收集小孢子。

11、優(yōu)選的，所述旋切的轉(zhuǎn)速為3000～5000rpm，時(shí)間為5～10s，旋切2～3次。

12、優(yōu)選的，所述離心的轉(zhuǎn)速為600～800rpm，時(shí)間為4～6min。

13、優(yōu)選的，步驟(3)所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：1/2n6+85～95g/l麥芽糖+0.8～1.2mg/l?2，4-d+0.4～0.6mg/lkt+0.9～1.0g/lmes，ph＝5.7～5.9。

14、優(yōu)選的，步驟(3)所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法為：先32～34℃黑暗預(yù)處理3～4d，再25～28℃暗培養(yǎng)28～42d。

15、優(yōu)選的，步驟(4)所述分化培養(yǎng)基為：1/2ms+25～35g/l蔗糖+5～7g/l瓊脂，ph＝5.7～5.9。

16、本發(fā)明還提供了所述的方法在培育雙單倍體辣椒品種中的應(yīng)用。

17、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：

18、本發(fā)明在誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)先進(jìn)行了黑暗33℃的預(yù)處理，也叫熱擊處理，在正常條件下，小孢子進(jìn)行配子體發(fā)育，最終形成成熟的花粉粒，熱擊處理(包括步驟(1)的低溫處理)都是一個(gè)脅迫的過(guò)程，能夠阻止小孢子向成熟花粉粒發(fā)育，促使小孢子進(jìn)入孢子體發(fā)育形成愈傷組織。低溫預(yù)處理的目的在于人為地改變小孢子的內(nèi)在狀態(tài)，從而誘導(dǎo)小孢子轉(zhuǎn)入孢子體發(fā)育。

19、本發(fā)明提供了一種通過(guò)辣椒游離小孢子培養(yǎng)獲得愈傷組織，愈傷組織再分化形成雙單倍體辣椒植株的方法，通過(guò)對(duì)辣椒游離小孢子發(fā)育時(shí)期的鑒定，小孢子的游離及誘導(dǎo)培養(yǎng)，形成愈傷組織，愈傷經(jīng)過(guò)分化形成辣椒幼苗，經(jīng)過(guò)倍性鑒定，本發(fā)明方法自然加倍頻率可以達(dá)到44％，而通過(guò)兩步培養(yǎng)法獲得的再生植株，自然加倍頻率僅為16.3％。

20、本發(fā)明提取液選擇使用為甘露醇、氯化鈣和mes，小孢子從花藥里游離出來(lái)后，提取液可為小孢子提供一個(gè)穩(wěn)定的滲透壓，可以保持小孢子的活力。

21、本發(fā)明方法避免了從花藥體細(xì)胞中形成愈傷組織和胚，而且通過(guò)小孢子培養(yǎng)形成了愈傷組織而不是胚狀體，愈傷組織的再分化形成了再生植株，為辣椒單倍體育種提供了新的方法。

技術(shù)特征：

1.一種通過(guò)游離小孢子培養(yǎng)獲得雙單倍體辣椒植株的方法，其特征在于，包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述低溫預(yù)處理的溫度為3～5℃，時(shí)間為1～3d。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述花蕾與提取液質(zhì)量體積比為0.6g:13～18ml；所述提取液中甘露醇的濃度為50～70g/l；氯化鈣的濃度為1.0～1.2g/l；緩沖液的濃度為0.9～1.0g/l；所述緩沖液為mes。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述游離的方法為：將懸浮液旋切后，過(guò)濾得濾液，離心2～4次，收集小孢子。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述旋切的轉(zhuǎn)速為3000～5000rpm，時(shí)間為5～10s，旋切2～3次。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述離心的轉(zhuǎn)速為600～800rpm，時(shí)間為4～6min。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：1/2n6+85～95g/l麥芽糖+0.8～1.2mg/l?2，4-d+0.4～0.6mg/lkt+0.9～1.0g/l?mes，ph＝5.7～5.9。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法為：先32～34℃黑暗預(yù)處理3～4d，再25～28℃暗培養(yǎng)28～42d。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述分化培養(yǎng)基為：1/2ms+25～35g/l蔗糖+5～7g/l瓊脂，ph＝5.7～5.9。

10.權(quán)利要求1～9任一項(xiàng)所述的方法在培育雙單倍體辣椒品種中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種通過(guò)游離小孢子培養(yǎng)獲得雙單倍體辣椒植株的方法。具體包括如下步驟：(1)將辣椒花蕾低溫預(yù)處理后，消毒；(2)將消毒后的花蕾與提取液混合得到懸浮液，游離收集小孢子；所述提取液包括甘露醇、氯化鈣和緩沖液；(3)將步驟(2)得到的小孢子置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到愈傷組織；(4)將步驟(3)得到愈傷組織置于分化培養(yǎng)基分化培養(yǎng)，得到辣椒苗。本發(fā)明方法避免了從花藥體細(xì)胞中形成愈傷組織和胚，而且通過(guò)小孢子培養(yǎng)形成了愈傷組織而不是胚狀體，愈傷組織的再分化形成了再生植株，為辣椒單倍體育種提供了新的方法。

技術(shù)研發(fā)人員：高潤(rùn)紅,張文齊,宗營(yíng)杰,李穎波,劉成洪
受保護(hù)的技術(shù)使用者：上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30