本技術(shù)披露的主題總體上涉及植物育種領(lǐng)域。更特別地，本主題涉及賦予植物品系cms(細(xì)胞質(zhì)雄性不育)的方法。此外，本技術(shù)披露的主題涉及在轉(zhuǎn)化方法中使用的cms誘導(dǎo)系(例如，cenh3編輯)的特定特征。另外，本主題總體上涉及單倍體誘導(dǎo)。序列表本技術(shù)附有一個(gè)序列表，該序列表命名為82657-wo-reg-org-p-1.xml，創(chuàng)建于2023年5月5日，其大小為大約187千字節(jié)。該序列表通過引用以其全文并入本文。該序列表隨同此申請經(jīng)由efs-web提交，并且符合37c.f.r.§1.824(a)(2)-(6)和(b)。

背景技術(shù)：

1、在玉米雜交種的生產(chǎn)中，可以利用雄性不育玉米近交種來消除對去雄的需要，從而顯著節(jié)省成本。被稱為細(xì)胞質(zhì)雄性不育(cms)的母系遺傳性狀是有效產(chǎn)生雜種種子的有用工具。已經(jīng)鑒定出了三種主要類型的cms(cms-t、cms-s和cms-c)。被稱為育性恢復(fù)系(rf)的核基因可以推翻細(xì)胞質(zhì)的雄性不育效應(yīng)。具有rf基因的品系產(chǎn)生功能性花粉，即使它們?nèi)匀粩y帶cms細(xì)胞質(zhì)。已知恢復(fù)系基因座rf1和rf2抑制cms-t品系的cms表型，而rf3基因恢復(fù)cms-s品系的育性。參見laughnan等人annu.rev.genet.[遺傳學(xué)年鑒]1983.17:27-48。cms-c的恢復(fù)系基因座rf4映射至sisco等人在crop?science[作物科學(xué)]第31卷第5期,第1263-1266頁,1991中報(bào)告的染色體8。kohls等人在2010年玉米遺傳學(xué)會議(maizegenetics?conference)上報(bào)告了對rf4的精細(xì)作圖。此外，作為wo?2012047595公布的專利申請(通過引用并入本文)報(bào)告了對與rf4相關(guān)的基因和標(biāo)記的鑒定。育種者使用cms系統(tǒng)，通過開發(fā)攜帶cms細(xì)胞質(zhì)但缺乏恢復(fù)系基因的雌性品系以及開發(fā)攜帶適當(dāng)恢復(fù)系基因的雄性品系來產(chǎn)生雜交種子。由雌性品系產(chǎn)生的f1雜種種子攜帶cms細(xì)胞質(zhì)，但由于父本貢獻(xiàn)的核恢復(fù)系基因的作用而產(chǎn)生可育的植物。對于玉米，細(xì)胞型c被鑒定為所希望的cms系統(tǒng)，因?yàn)樗傮w上在各種環(huán)境和遺傳背景中都具有穩(wěn)定性。

2、為了形成雜交種子，育種者將近交親本品系雜交，一個(gè)充當(dāng)父本，一個(gè)充當(dāng)母本。開發(fā)基本上純合的近交親本品系的過程通常需要雜交種進(jìn)行多個(gè)世代的選擇和自花授粉(自交)以變得接近純合。這個(gè)過程耗時(shí)且昂貴。為了縮短在玉米、稻、小麥、大麥和其他作物中開發(fā)純合近交種的時(shí)間，育種者可以選擇使用單倍體誘導(dǎo)系來誘導(dǎo)雜交親本的單倍體種子產(chǎn)生。然后將單倍體植物的染色體加倍，例如通過染色體加倍劑如秋水仙堿，以形成雙單倍體純合品系。在許多植物物種(如高粱、大麥、小麥和其他草)中觀察到了單倍體誘導(dǎo)。

3、在玉米中，單倍體誘導(dǎo)(hi)與基因matrilineal、ig1、cenh3和dmp有關(guān)?？傮w上參見wo?2017/087682(通過引用并入本文)；t.kelliher等人,matrilineal,a?sperm-specific?phospholipase,triggers?maize?haploid?induction[作為精子特異性磷脂酶的matrilineal觸發(fā)玉米單倍體誘導(dǎo)],nature[自然]542,105-109(2017)；美國專利號7,439,416(通過引用并入本文)；m?pollacsek,management?of?the?ig?gene?for?haploidinduction?in?maize[對用于玉米中單倍體誘導(dǎo)的ig基因的管理],agronomie[農(nóng)業(yè)學(xué)],12:247-251(1991)；美國專利號8,618,354(通過引用并入本文)；還參見a.b.britt和s.kuppu,cenh3:an?emerging?player?in?haploid?induction?technology[cenh3：單倍體誘導(dǎo)技術(shù)中的新興選手],front.plant?sci.[植物科學(xué)前沿]7:357(2016)doi:10.3389/fpls.2016.00357；以及cn?111763687b(通過引用并入本文)。單倍體誘導(dǎo)系可以以各種方式建立，例如通過基因組編輯。如本文所披露的，例如，可以通過cenh3突變生成單倍體誘導(dǎo)系。cenh3是histone3(h3)的著絲粒(centromere)特異性變體，并且是有絲分裂和減數(shù)分裂中動粒(kinetochore)成核和紡錘體附著所必需的。

4、在本技術(shù)披露的主題中，具有cenh3突變的cms-c型品系在cms轉(zhuǎn)化方法中充當(dāng)單倍體誘導(dǎo)系。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、用以將具有正常細(xì)胞型的玉米品系轉(zhuǎn)化為細(xì)胞質(zhì)雄性不育(cms)植物的方法有利于節(jié)省雜交種子生產(chǎn)的成本和時(shí)間。當(dāng)前工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)使用性狀漸滲來對雌性雜種優(yōu)勢池中的優(yōu)良系進(jìn)行雜交，以成為cms細(xì)胞質(zhì)。本文披露了在不進(jìn)行漸滲的情況下并且替代地通過單倍體誘導(dǎo)過程實(shí)現(xiàn)向cms細(xì)胞質(zhì)的這種轉(zhuǎn)化的方法。這個(gè)過程導(dǎo)致在單交中核基因組100％轉(zhuǎn)化為cms細(xì)胞質(zhì)。在此方法中，第一植物(本文稱為“chip”)是cms，該第一植物在其核基因組中關(guān)于cenh3中的敲除突變?yōu)殡s合的(即，cenh3的一個(gè)等位基因是野生型；“cenh3+/-”)，并且是父本單倍體誘導(dǎo)系(即，它可以產(chǎn)生父本單倍體)。任選地，chip還可以在其核基因組中包含恢復(fù)系因子(例如，rf3、rf4、rf10、rf11等)，并且如果是這樣，盡管它具有cms細(xì)胞型，但還是自交可育的?？商娲?，chip還可以包含非恢復(fù)系等位基因(例如，rf3、rf4、rf10、rf11、rf12)。如果是這樣，則chip是雄性不育的并且需要保持系來繼續(xù)繁殖。保持系不是cms(即，具有正常細(xì)胞質(zhì))。另外，在chip中任選的花色素苷標(biāo)記是純合的。

2、第二植物(本文稱為“dip”)不是單倍體誘導(dǎo)系(即，關(guān)于cenh3為純合野生型(“cenh3+/+”))，具有正常細(xì)胞型(即，非細(xì)胞質(zhì)雄性不育)，并且包含希望的有待轉(zhuǎn)化為cms細(xì)胞質(zhì)的核基因組。dip是花粉供體。

3、將chip與dip花粉雜交，后代包括二倍體子代(“f1”)、單倍體子代(僅包含dip的核基因組)和非整倍體子代。僅單倍體子代是希望的，并且將包含(i)dip的具有一個(gè)野生型cenh3等位基因的單倍體核基因組(即，所希望的基因組)(“cenh3+/空”)，以及(ii)cms-c細(xì)胞型，(iii)進(jìn)一步缺乏恢復(fù)系因子，以及任選地(iv)視覺標(biāo)記。

4、當(dāng)使用時(shí)，可以采用視覺標(biāo)記，如花色素苷標(biāo)記(例如，r1-nj或r1-scm2)將不希望的二倍體f1子代與所希望的單倍體子代區(qū)分開。如果使用，標(biāo)記以純合狀態(tài)存在于單倍體誘導(dǎo)系基因組(即，chip)中。通過使用誘導(dǎo)系親本的遺傳標(biāo)記將非整倍體與真單倍體子代區(qū)分開，即顯示雌性(誘導(dǎo)系)親本標(biāo)記(指示chip核dna)的任何推定單倍體都將作為非整倍體被丟棄?？商娲兀梢酝ㄟ^測序、選擇性標(biāo)記、株型、或倍性水平測量將單倍體子代與二倍體和非整倍體區(qū)分開。

5、對序列表中的序列的簡述

6、seq?id?no:1為實(shí)例1的syn-inbc34近交未成熟胚和實(shí)例2的syn-inbc34?x?syn-inbc34rs近交未成熟胚的生物彈道轟擊中由lbcas12a?rnp攜帶的grna140的核苷酸序列，該grna140靶向基因id?grmzm2g158526的第二外顯子。

7、seq?id?no:2是taqman測定3895中使用的引物的核苷酸序列。

8、seq?id?no:3是taqman測定3895中使用的引物的核苷酸序列。

9、seq?id?no:4是taqman測定3895中使用的探針的核苷酸序列。

10、seq?id?no:5是表示cenh3中的19堿基對缺失的核苷酸序列。

11、seq?id?no:6是表示cenh3中的10堿基對缺失的核苷酸序列。

12、seq?id?no:7是野生型cenh3(grmzm2g158526)的部分核苷酸序列。

13、seq?id?no:8是cenh3?10堿基對缺失突變體(509a115a)的部分核苷酸序列。

14、seq?id?no:9是cenh3?19堿基對缺失突變體(509a151a)的部分核苷酸序列。

15、seq?id?no:10是cenh3等位基因(grmzm2g158526)的部分氨基酸序列。

16、seq?id?no:11是kd(佐治亞大學(xué)(university?of?georgia)的kelly?dawe)cenh3等位基因的推導(dǎo)氨基酸序列的部分氨基酸序列。

17、seq?id?no:12是具有10堿基對缺失的cenh3等位基因的部分氨基酸序列。

18、seq?id?no:13是具有19堿基對缺失剪接變體a的cenh3等位基因的部分氨基酸序列。

19、seq?id?no:14是具有19堿基對缺失剪接變體c的cenh3等位基因的部分氨基酸序列。

20、seq?id?no:15是具有19堿基對缺失剪接變體b的cenh3等位基因的部分氨基酸序列。

21、seq?id?no:16是具有19堿基對缺失剪接變體d的cenh3等位基因的部分氨基酸序列。

22、seq?id?no:17是具有19堿基對缺失剪接變體e的cenh3等位基因的部分氨基酸序列。

23、seq?id?no:18是具有10堿基對缺失剪接變體a的cenh3等位基因的部分氨基酸序列。

24、seq?id?no:19是具有10堿基對缺失剪接變體b的cenh3等位基因的部分氨基酸序列。

25、seq?id?no:20是具有10堿基對缺失剪接變體c的cenh3等位基因的部分氨基酸序列。

26、seq?id?no:21是具有10堿基對缺失剪接變體d的cenh3等位基因的部分氨基酸序列。

27、seq?id?no:22是具有10堿基對缺失剪接變體e的cenh3等位基因的部分氨基酸序列。

28、seq?id?no:23是用于測定sm0253eq的正向引物的核苷酸序列。

29、seq?id?no:24是用于測定sm0253eq的反向引物的核苷酸序列。

30、seq?id?no:25是用于測定sm0253eq的探針的核苷酸序列。

31、seq?id?no:26是用于測定sm0253eq的探針的核苷酸序列。

32、seq?id?no:27是用于測定sm0253eq的靶標(biāo)的核苷酸序列。

33、seq?id?no:28是用于測定sm0093b的正向引物的核苷酸序列。

34、seq?id?no:29是用于測定sm0093b的反向引物的核苷酸序列。

35、seq?id?no:30是用于測定sm0093b的探針的核苷酸序列。

36、seq?id?no:31是用于測定sm0093b的探針的核苷酸序列。

37、seq?id?no:32是用于測定sm0093b的靶標(biāo)的核苷酸序列。

38、seq?id?no:33是用于測定sm0435a的正向引物的核苷酸序列。

39、seq?id?no:34是用于測定sm0435a的反向引物的核苷酸序列。

40、seq?id?no:35是用于測定sm0435a的探針的核苷酸序列。

41、seq?id?no:36是用于測定sm0435a的探針的核苷酸序列。

42、seq?id?no:37是用于測定sm0435a的靶標(biāo)的核苷酸序列。

43、seq?id?no:38是用于測定sm1071cq的正向引物的核苷酸序列。

44、seq?id?no:39是用于測定sm1071cq的反向引物的核苷酸序列。

45、seq?id?no:40是用于測定sm1071cq的探針的核苷酸序列。

46、seq?id?no:41是用于測定sm1071cq的探針的核苷酸序列。

47、seq?id?no:42是用于測定sm1071cq的靶標(biāo)的核苷酸序列。

48、seq?id?no:43是用于測定sm1280cq的正向引物的核苷酸序列。

49、seq?id?no:44是用于測定sm1280cq的反向引物的核苷酸序列。

50、seq?id?no:45是用于測定sm1280cq的探針的核苷酸序列。

51、seq?id?no:46是用于測定sm1280cq的探針的核苷酸序列。

52、seq?id?no:47是用于測定sm1280cq的靶標(biāo)的核苷酸序列。

53、seq?id?no:48是用于測定sm1447aq的正向引物的核苷酸序列。

54、seq?id?no:49是用于測定sm1447aq的反向引物的核苷酸序列。

55、seq?id?no:50是用于測定sm1447aq的探針的核苷酸序列。

56、seq?id?no:51是用于測定sm1447aq的探針的核苷酸序列。

57、seq?id?no:52是用于測定sm1447aq的靶標(biāo)的核苷酸序列。

58、seq?id?no:53是用于測定sm1847aq的正向引物的核苷酸序列。

59、seq?id?no:54是用于測定sm1847aq的反向引物的核苷酸序列。

60、seq?id?no:55是用于測定sm1847aq的探針的核苷酸序列。

61、seq?id?no:56是用于測定sm1847aq的探針的核苷酸序列。

62、seq?id?no:57是用于測定sm1847aq的靶標(biāo)的核苷酸序列。

63、seq?id?no:58是用于測定sm1286aq的正向引物的核苷酸序列。

64、seq?id?no:59是用于測定sm1286aq的反向引物的核苷酸序列。

65、seq?id?no:60是用于測定sm1847aq的探針的核苷酸序列。

66、seq?id?no:61是用于測定sm1847aq的探針的核苷酸序列。

67、seq?id?no:62是用于測定sm1286aq的靶標(biāo)的核苷酸序列。

68、seq?id?no:63是用于測定sm2513的正向引物的核苷酸序列。

69、seq?id?no:64是用于測定sm2513的反向引物的核苷酸序列。

70、seq?id?no:65是用于測定sm2513的探針的核苷酸序列。

71、seq?id?no:66是用于測定sm2513的探針的核苷酸序列。seq?id?no:67是用于測定sm2513的靶標(biāo)的核苷酸序列。seq?id?no:68是用于測定sm2962的正向引物的核苷酸序列。seq?id?no:69是用于測定sm2962的反向引物的核苷酸序列。seq?id?no:70是用于測定sm2962的探針的核苷酸序列。seq?id?no:71是用于測定sm2962的探針的核苷酸序列。seqid?no:72是用于測定sm2962的靶標(biāo)的核苷酸序列。seq?id?no:73是用于測定sm2988的正向引物的核苷酸序列。seq?id?no:74是用于測定sm2988的反向引物的核苷酸序列。seq?idno:75是用于測定sm2988的探針的核苷酸序列。seq?id?no:76是用于測定sm2988的探針的核苷酸序列。seq?id?no:77是用于測定sm2988的靶標(biāo)的核苷酸序列。seq?id?no:78是用于測定sm3400的正向引物的核苷酸序列。seq?id?no:79是用于測定sm3400的反向引物的核苷酸序列。seq?id?no:80是用于測定sm3400的探針的核苷酸序列。seq?id?no:81是用于測定sm3400的探針的核苷酸序列。seq?id?no:82是用于測定sm3400的靶標(biāo)的核苷酸序列。seqid?no:83是用于測定sm3747的正向引物的核苷酸序列。seq?id?no:84是用于測定sm3747的反向引物的核苷酸序列。seq?id?no:85是用于測定sm3747的探針的核苷酸序列。seq?idno:86是用于測定sm3747的探針的核苷酸序列。seq?id?no:87是用于測定sm3747的靶標(biāo)的核苷酸序列。seq?id?no:88是用于測定sm4788的正向引物的核苷酸序列。seq?id?no:89是用于測定sm4788的反向引物的核苷酸序列。seq?id?no:90是用于測定sm4788的探針的核苷酸序列。seq?id?no:91是用于測定sm4788的探針的核苷酸序列。seq?id?no:92是用于測定sm4788的靶標(biāo)的核苷酸序列。seq?id?no:93是用于測定sm5515的正向引物的核苷酸序列。seq?id?no:94是用于測定sm5515的反向引物的核苷酸序列。seq?id?no:95是用于測定sm5515的探針的核苷酸序列。

72、seq?id?no:96是用于測定sm5515的探針的核苷酸序列。

73、seq?id?no:97是用于測定sm5515的靶標(biāo)的核苷酸序列。

74、seq?id?no:98-100是用于測定pm1901(野生型zmcenh3)的引物和探針的核苷酸序列。

75、seq?id?no:101-103是用于測定pm1909(zmcenh3中包含10bp缺失的突變)的引物和探針的核苷酸序列。

76、seq?id?no:101、102和104是用于測定pm1913(zmcenh3中包含19bp缺失的突變)的引物和探針的核苷酸序列。

77、seq?id?no:105-108是用于測定sm0576cq的引物和探針的核苷酸序列。

78、seq?id?no:109-112是用于測定sm0956iq的引物和探針的核苷酸序列。

79、seq?id?no:113-116是用于測定sm2669的引物和探針的核苷酸序列。

80、seq?id?no:117-120是用于測定sm2670的引物和探針的核苷酸序列。

81、seq?id?no:121-124是用于測定sm2915的引物和探針的核苷酸序列。

82、seq?id?no:125-128是用于測定sm2916的引物和探針的核苷酸序列。

83、seq?id?no:129-132是用于測定sm6623的引物和探針的核苷酸序列。

84、seq?id?no:133-136是用于測定sm8040的引物和探針的核苷酸序列。

85、seq?id?no:137-140是用于測定sm8091的引物和探針的核苷酸序列。

86、seq?id?no:141-144是用于測定sm2918的引物和探針的核苷酸序列。

87、seq?id?no:145-148是用于測定sm4813的引物和探針的核苷酸序列。

88、seq?id?no:149-152是用于測定sm2914的引物和探針的核苷酸序列。

89、seq?id?no:153-156是用于測定sm4812的引物和探針的核苷酸序列。

90、seq?id?no:157-160是用于測定sm0954bq的引物和探針的核苷酸序列。

91、seq?id?no:161-164是用于測定sm6568的引物和探針的核苷酸序列。

92、seq?id?no:165-168是用于測定sm0953bq的引物和探針的核苷酸序列。

93、seq?id?no:169-172是用于測定sm7200的引物和探針的核苷酸序列。

94、seq?id?no:173-176是用于測定sm5665的引物和探針的核苷酸序列。

95、seq?id?no:177是來自表1(509a150a)的cenh3?19堿基對缺失突變體的部分核苷酸序列。

96、定義

97、除非下文中另有定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語旨在具有與如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。對本文采用的技術(shù)的提及旨在是指本領(lǐng)域中通常所理解的技術(shù)，包括對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言很清楚的那些技術(shù)的變型和/或等效技術(shù)的替代方案。雖然認(rèn)為以下術(shù)語可以被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員很好地理解，還是對以下定義進(jìn)行了陳述，以便于解釋本技術(shù)披露的主題。

98、根據(jù)長期存在的專利法公約，在本技術(shù)(包括權(quán)利要求)中使用的術(shù)語“一個(gè)/一種(a/an)”和“該(the)”是指“一個(gè)/種或多個(gè)/種”。例如，短語“一個(gè)/種細(xì)胞”是指一種或多種/一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞，并且在一些實(shí)施例中可以是指組織和/或器官。類似地，短語“至少一個(gè)/種”當(dāng)在本文中用于指代實(shí)體時(shí)，是指例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100個(gè)或更多個(gè)該實(shí)體，包括但不限于1與100之間的所有整數(shù)值以及大于100的整數(shù)。

99、除非另外指示，本說明書和權(quán)利要求中使用的表示成分的量、反應(yīng)條件等的所有數(shù)字應(yīng)被理解為在所有情況下用術(shù)語“約”來修飾。如本文所用的術(shù)語“約”，當(dāng)指代可測量的值例如質(zhì)量、重量、時(shí)間、體積、濃度或百分比的量時(shí)，意味著涵蓋在一些實(shí)施例中與規(guī)定量相比±20％的變化、在一些實(shí)施例中與規(guī)定量相比±10％的變化、在一些實(shí)施例中與規(guī)定量相比±5％的變化、在一些實(shí)施例中與規(guī)定量相比±1％的變化、在一些實(shí)施例中與規(guī)定量相比±0.5％的變化、以及在一些實(shí)施例中與規(guī)定量相比±0.1％的變化，因?yàn)檫@樣的變化適合于執(zhí)行所披露的方法和/或使用所披露的組合物、核酸、多肽等。因此，除非相反地指示，在本說明書和所附權(quán)利要求中所列出的數(shù)值參數(shù)是可以取決于試圖通過本技術(shù)披露的主題獲得的期望特性而變化的近似值。

100、如本文所用，術(shù)語“等位基因”是指遺傳基因座處的變體或替代序列形式。在二倍體中，在每一個(gè)基因座處的單個(gè)等位基因由子代個(gè)體分別從每一個(gè)親本處遺傳。雖然本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解在任何特定個(gè)體中的等位基因不必代表存在于該物種中的所有等位基因，但是存在于二倍體生物體中的給定基因座的兩個(gè)等位基因占據(jù)一對同源染色體上相對應(yīng)的位置。

101、如本文所使用的，術(shù)語“擴(kuò)增”意指使用至少一種核酸分子作為模板，構(gòu)建核酸分子的多個(gè)拷貝或與該核酸分子互補(bǔ)的多個(gè)拷貝。擴(kuò)增系統(tǒng)包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)系統(tǒng)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(lcr)系統(tǒng)、基于核酸序列的擴(kuò)增(nasba，安大略省密西索加的坎基尼公司(cangene，mississauga，ontario))、q-β復(fù)制酶系統(tǒng)、基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)(tas)、以及鏈置換擴(kuò)增(sda)。參見，例如，diagnostic?molecular?microbiology:principles?andapplications[診斷分子微生物學(xué)：原理與應(yīng)用],persing等人編,american?society?formicrobiology[美國微生物學(xué)會],華盛頓(washington,d.c.),(1993)。擴(kuò)增的產(chǎn)物被稱為“擴(kuò)增子”。

102、如本文所用，術(shù)語“和/或”當(dāng)在列舉實(shí)體的上下文中使用時(shí)，是指實(shí)體單獨(dú)存在或以組合存在。因此，例如，短語“a、b、c和/或d”包括單獨(dú)地a、b、c和d，但也包括a、b、c和d的任何和所有組合和子組合(例如，ab、ac、ad、bc、bd、cd、abc、abd和bcd)。在一些實(shí)施例中，“和/或”所指的一個(gè)或多個(gè)要素也可以單獨(dú)存在于一個(gè)或多個(gè)組合和/或一個(gè)或多個(gè)子組合中的單次或多次出現(xiàn)中。

103、術(shù)語“非整倍體”是指在單倍體組中具有異常染色體數(shù)的植物。

104、如本文所用，術(shù)語“回交(backcrossing或backcrossed)”在本發(fā)明的范圍內(nèi)應(yīng)理解為是指使雜種子代與親本之一重復(fù)往回雜交的方法。

105、術(shù)語“轟擊(bombarding/bombardment)”和“生物彈道轟擊”是指使粒子加速沖向靶標(biāo)生物樣品(例如，細(xì)胞、組織等)，以損傷靶標(biāo)生物樣品中細(xì)胞的細(xì)胞膜和/或使粒子進(jìn)入靶標(biāo)生物樣品中的過程。用于生物彈道轟擊的方法是本領(lǐng)域已知的(例如，us?5,584,807)，并且是可商購的(例如，來自伯樂公司(biorad)的氦氣驅(qū)動的加速器(pds-1000/hetm))。生物彈道pds-1000基因槍(伯樂公司，加州赫拉克勒斯)使用氦氣壓力使涂有dna的金或鎢微粒加速沖向靶細(xì)胞。

106、如本文所用，術(shù)語“擴(kuò)大(bulk)”是指增加種子數(shù)目的過程。

107、如本文所用，術(shù)語“cdna”是指與mrna互補(bǔ)并衍生自mrna的單鏈或雙鏈dna。

108、如本文所用，術(shù)語“chip”是指本發(fā)明的方法中初次雜交的親本之一。此親本在其核基因組中具有雜合cenh3突變(c)，是父本單倍體誘導(dǎo)系(hi)，并且如上所述，是親本(p)之一。chip是雌性可育的和cms雄性不育的。chip可以任選地在其核基因組中含有純合恢復(fù)系因子。chip還可以任選地在其核基因組中含有純合花色素苷標(biāo)記。

109、在本文所用的術(shù)語“染色體”是如本領(lǐng)域公認(rèn)的，意指細(xì)胞核中含有細(xì)胞dna并具有線性基因陣列的自我復(fù)制的基因結(jié)構(gòu)。

110、術(shù)語“包含(comprising)”與“包括(including)”、“含有(containing)”和“特征在于(characterized?by)”是同義的，是包含性的或開放式的，并且不排除另外的未列舉的要素和/或方法步驟?！鞍笔且庵杆付ǖ囊睾?或步驟存在，但是其他要素和/或步驟可以添加進(jìn)來并且仍然落入相關(guān)主題的范圍內(nèi)的術(shù)語。

111、如本文所用，短語“由……組成”排除未具體列舉的任何要素、步驟或成分。當(dāng)短語“由……組成”出現(xiàn)在權(quán)利要求主體的子句中，而不是直接地接在前序部分后面時(shí)，它只限制該子句中所闡述的要素；其他要素并不整體排除在該權(quán)利要求之外。

112、如本文所用，短語“基本上由……組成”限制相關(guān)的披露或權(quán)利要求的范圍至規(guī)定的材料和/或步驟，加上并不實(shí)質(zhì)上影響所披露的和/或所要求保護(hù)的主題的一個(gè)或多個(gè)基本和新型特征的那些。

113、如本文所用，術(shù)語“細(xì)胞交換”是指細(xì)胞質(zhì)從一個(gè)品系交換到另一個(gè)品系中(例如，玉米品系中的“正常a”細(xì)胞質(zhì)交換到最初為“正常b”細(xì)胞質(zhì)的另一個(gè)玉米品系中)。

114、如本文所用，術(shù)語“dip”是指本發(fā)明的方法中初次雜交的親本之一。此親本含有希望的單倍體核基因組(“希望的親本”或“dip”)。dip是自交可育的(關(guān)于野生型cenh3為純合的)并且具有正常的細(xì)胞型。

115、如本文所用，被稱為“單倍體”的植物具有兩個(gè)完整染色體組(2n；每個(gè)親本一組)。

116、如本文所用，術(shù)語“優(yōu)良品系”或“近交品系”是指從針對更優(yōu)的農(nóng)藝表現(xiàn)的育種和選擇而產(chǎn)生的任何品系。優(yōu)良品系具有穩(wěn)定的遺傳學(xué)，即它在其基因組中是合理地或幾乎等基因的。換言之，優(yōu)良品系關(guān)于其基因組中的所有等位基因?yàn)楹侠淼鼗驇缀跫兒系摹?/p>

117、如本文所用，當(dāng)與參考多核苷酸(如植物的基因、orf或其部分、或轉(zhuǎn)基因)一起使用時(shí)，術(shù)語“表達(dá)”是指通過基因的“轉(zhuǎn)錄”(即經(jīng)由rna聚合酶的酶促作用)將基因中編碼的遺傳信息轉(zhuǎn)化為rna(例如，mrna、rrna、trna或snrna)，并在適用的情況下(例如，如果基因編碼蛋白)通過mrna的“翻譯”轉(zhuǎn)化為蛋白的方法?；虮磉_(dá)可以在該方法的許多階段進(jìn)行調(diào)節(jié)。例如，分別在反義構(gòu)建體或dsrna構(gòu)建體的情況下，表達(dá)可僅指反義rna的轉(zhuǎn)錄或僅指dsrna的轉(zhuǎn)錄。在實(shí)施例中，“表達(dá)”是指正義(mrna)或功能性rna的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定累積。“表達(dá)”還可指蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。

118、如本文所用，術(shù)語“基因”是指包括dna序列的遺傳單位，該遺傳單位占據(jù)染色體上的特定位置并且含有生物體中的具體特征或性狀的遺傳指令?！盎蚪M”

119、如本文所用，術(shù)語“基因型”是指細(xì)胞或生物體的基因組成。個(gè)體的“一組遺傳標(biāo)記的基因型”包括個(gè)體中存在的一個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)記基因座的特定等位基因。如本領(lǐng)域中已知的是，基因型可以涉及單個(gè)基因座或多個(gè)基因座，無論這些基因座是相關(guān)還是不相關(guān)的，和/或是連鎖還是非連鎖的。在一些實(shí)施例中，個(gè)體的基因型涉及一個(gè)或多個(gè)相關(guān)的基因，因?yàn)檫@些基因中的一個(gè)或多個(gè)參與目的表型(例如，如本文定義的數(shù)量性狀)的表達(dá)。因此，在一些實(shí)施例中，基因型包括個(gè)體內(nèi)在數(shù)量性狀的一個(gè)或多個(gè)遺傳基因座處存在的一個(gè)或多個(gè)等位基因的總和。在一些實(shí)施例中，基因型以單倍型(下文進(jìn)行定義)表示。

120、如本文所用，術(shù)語“種質(zhì)”是指群體或另外的個(gè)體組(例如，物種)的基因型的總體。術(shù)語“種質(zhì)”也可以指植物材料；例如，一組植物，其充當(dāng)各種等位基因的儲存庫。短語“適應(yīng)的種質(zhì)”是指已證實(shí)具有遺傳優(yōu)勢的植物材料；例如，對于給定的環(huán)境或地理區(qū)域，短語“未適應(yīng)的種質(zhì)”、“原始種質(zhì)”和“外來種質(zhì)”是指遺傳價(jià)值未知或未經(jīng)證實(shí)的植物材料；例如，對于給定的環(huán)境或地理區(qū)域；這樣，短語“未適應(yīng)的種質(zhì)”在一些實(shí)施例中是指不屬于已建立的育種群體并且與已建立的育種群體的成員沒有已知關(guān)系的植物材料。

121、如本文所用，被稱為“單倍體”的植物具有單個(gè)染色體組(基因組)，并且單倍體植物中減少的染色體數(shù)目(1n)等于配子中的染色體數(shù)目。如本文所用，通過使單倍體染色體組加倍(從1n到2n)而開發(fā)被稱為“雙單倍體”的植物。從自交到任何世代數(shù)的雙單倍體植物獲得的植物或種子仍然可以被鑒定為雙單倍體植物。雙單倍體植物被認(rèn)為是純合植物。如果植物是可育的，即使該植物的整個(gè)營養(yǎng)部分不是由具有加倍的染色體組的細(xì)胞組成的，該植物也被認(rèn)為是雙單倍體；也就是說，如果植物含有存活的配子，即使它是嵌合的，也將被認(rèn)為是雙單倍體。

122、如本文所用，“單倍體bc1(haploidbc1)”是指單倍體植物的子代，其已經(jīng)用其輪回親本授粉，以便在子代中實(shí)行回交。單倍體bc1子代包含二倍體基因組。

123、如本文所用，單倍體誘導(dǎo)率(“hir”)意指在用單倍體誘導(dǎo)系花粉對穗進(jìn)行授粉后存活的單倍體籽粒的數(shù)目除以籽粒的總數(shù)。

124、如本文所用，當(dāng)提及基因或核酸使用時(shí)，術(shù)語“異源”是指編碼某因子的基因不是在其天然環(huán)境中(即，已經(jīng)通過人工改變)。例如，異源基因可以包括從一個(gè)物種引入另一個(gè)物種中的基因。異源基因還可以包括對生物體來說是天然的基因，該基因已經(jīng)以某種方式加以改變(例如，突變、以多個(gè)拷貝添加、連接至非天然啟動子或增強(qiáng)子多核苷酸等)。異源基因可以進(jìn)一步包含植物基因多核苷酸，該植物基因多核苷酸包含植物基因的cdna形式；cdna可以以正義方向(以產(chǎn)生mrna)或反義方向(以產(chǎn)生與mrna轉(zhuǎn)錄物互補(bǔ)的反義rna轉(zhuǎn)錄物)被表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，異源基因與內(nèi)源植物基因的區(qū)別在于，該異源基因多核苷酸典型地與包含調(diào)節(jié)元件如啟動子的多核苷酸接合，未發(fā)現(xiàn)這些多核苷酸與該異源基因編碼的蛋白質(zhì)的基因或與染色體中的植物基因多核苷酸天然地相關(guān)，或者這些多核苷酸與在自然界中未發(fā)現(xiàn)的染色體的部分(例如，在通常不表達(dá)該基因的基因座中表達(dá)的基因)相關(guān)。此外，在實(shí)施例中，“異源的”多核苷酸是不與引入它的宿主細(xì)胞天然地相關(guān)的多核苷酸，包括天然存在的多核苷酸的非天然存在的多個(gè)拷貝。

125、如本文所用，術(shù)語“雜合的”是指當(dāng)不同的等位基因位于同源染色體上的相應(yīng)基因座處時(shí)存在的遺傳條件。

126、如本文所用，術(shù)語“純合的”是指當(dāng)相同的等位基因位于同源染色體上的相應(yīng)基因座處時(shí)存在的遺傳條件。

127、如本文所用，術(shù)語“人誘導(dǎo)的突變”是指由于直接或間接的人作用而發(fā)生的任何突變。此術(shù)語包括但不限于通過任何靶向誘變方法獲得的突變。

128、如本文所用，術(shù)語“雜交種”是指通過雜交兩株遺傳上不同的親本植物而產(chǎn)生的后代。此雜交的所得子代是“雙親本”群體。在植物育種的上下文中，術(shù)語“雜種”、“雜種植物”和“雜種子代”是指植物，該植物是通過雜交不同品系或品種或物種的植物(包括但不限于兩個(gè)近交品系(例如，基因雜合的或大部分雜合的個(gè)體)之間的雜交)而產(chǎn)生的基因上不同的親本的后代。短語“單交f1雜種”是指由兩個(gè)近交品系之間的雜交產(chǎn)生的f1雜種。

129、在兩個(gè)核酸或氨基酸序列的情況下，術(shù)語“同一性”或“相同的”是指在全面比對兩個(gè)序列時(shí)，如與測試(“受試”)序列相比，參考(“查詢”)序列(或其互補(bǔ)鏈)的線性多核苷酸或氨基酸序列中相同核苷酸或氨基酸的百分比。除非另有陳述，否則如本文所用的序列同一性是指如下獲得的值：使用在emboss?needle比對工具中實(shí)現(xiàn)的needleman和wunsch算法((1970)j.mol.biol.[分子生物學(xué)雜志]48:443--453)，使用默認(rèn)矩陣文件eblosum62(用于蛋白質(zhì))和默認(rèn)參數(shù)(空位開放＝10，空位延伸＝0.5，末端空位罰分＝假，末端空位開放＝10，末端空位延伸＝0.5)或dnafull(用于核酸)和默認(rèn)參數(shù)(空位開放＝10，空位延伸＝0.5，末端空位罰分＝假，末端空位開放＝10，末端空位延伸＝0.5)；或其任何等效程序。emboss?needle可例如從embl-ebi獲得，例如在以下網(wǎng)站：ebi.ac.uk/tools/psa/emboss_needle/并且如在以下出版物中所述：“the?embl-ebi?search?and?sequence?analysistools?apis?in?2019.[2019年embl-ebi搜索和序列分析工具api]”madeira等人nucleicacids?research[核酸研究],2019年6月,47(w1):w636-w641。如本文所用，術(shù)語“等效程序”是指任何序列比較程序，對于任兩個(gè)所討論序列，在與通過emboss?needle生成的相應(yīng)比對相比時(shí)，該程序生成具有相同的核苷酸或氨基酸殘基匹配和相同的序列同一性百分比的比對。在一些實(shí)施例中，基本上相同的核酸或氨基酸序列可以發(fā)揮基本上相同的功能。

130、短語“近交品系”是指在基因上是純合的或近乎純合的群體。例如，近交品系可以通過若干循環(huán)的兄弟/姐妹育種或自體受精來獲得。在一些實(shí)施例中，近交品系針對一個(gè)或多個(gè)目的表型性狀進(jìn)行純育?！敖弧?、“近交個(gè)體”或“近交子代”是來自一個(gè)近交品系的單獨(dú)的樣品。術(shù)語“近交”是指基本上純合的個(gè)體或品系。

131、如本文所用，“引入”是指遞送、表達(dá)、施用、運(yùn)輸、轉(zhuǎn)移、滲透或其他相似的術(shù)語以指示所希望的物體的核酸或蛋白質(zhì)或其組合向一個(gè)物體的遞送。例如，編碼定點(diǎn)核酸酶的核酸和任選地至少一種指導(dǎo)rna可通過單倍體誘導(dǎo)引入單倍體胚中。同樣地，現(xiàn)存編輯機(jī)器(包含定點(diǎn)核酸酶蛋白質(zhì)和任選地至少一種指導(dǎo)rna)可通過施用適宜的細(xì)胞穿透肽引入到單倍體胚中。

132、如本文所用，術(shù)語“漸滲(introgression)”，“漸滲的(introgressed)”和“進(jìn)行漸滲(introgressing)”是指自然過程和人工過程，其中通過將一個(gè)物種、品種或栽培品種與另一個(gè)物種、品種或栽培品種雜交來將該一個(gè)物種、品種或栽培品種的基因組區(qū)域移至該另一個(gè)物種、品種或栽培品種的基因組。該過程可以任選地通過與輪回親本回交來完成。

133、如本文所用，當(dāng)在本發(fā)明的核酸分子或多核苷酸的上下文中使用時(shí)，術(shù)語“分離的”是指在相應(yīng)源生物體內(nèi)的染色體多核苷酸上下文中識別并分離/分開的多核苷酸。如果分離的核酸或多核苷酸確實(shí)具有天然存在的對應(yīng)物，則其分離的核酸或多核苷酸不是其在其天然環(huán)境中存在的核酸。相比之下，非分離的核酸是核酸(如dna和rna)，它們是在自然界存在的狀態(tài)下發(fā)現(xiàn)的。例如，在相鄰基因附近的宿主細(xì)胞染色體上發(fā)現(xiàn)給定的多核苷酸(例如，基因)。分離的核酸分子可以單鏈或雙鏈形式存在?？商娲?，其可以包含正義鏈和反義鏈(即，核酸分子可以是雙鏈的)。在優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明的核酸分子理解為分離的。

134、如本文所用，術(shù)語“敲除突變”是指其中所述基因的表達(dá)被停止或‘敲除’的基因突變。此突變可以包括但不限于通過任何靶向誘變方法獲得的突變。

135、如本文所用，術(shù)語“基因座”是指在給定的物種中在染色體上的位置(例如，基因、遺傳標(biāo)記等的位置)。

136、如本文所用，“母本單倍體誘導(dǎo)系”是指產(chǎn)生花粉并且當(dāng)作為雄性雜交時(shí)導(dǎo)致單倍體種子的雌核發(fā)育的品系。“父本單倍體誘導(dǎo)系”是指當(dāng)在雜交中用作雌性時(shí)導(dǎo)致單倍體種子的雄核發(fā)育的品系。單倍體誘導(dǎo)系植物可以使用這些母本或父本機(jī)制中的任一種來衍生單倍體。

137、如本文所用，術(shù)語“保持系”是指如下的植物品系，其是雄性可育的，包含正常細(xì)胞質(zhì)，與cms植物品系基本上遺傳相似(例如，等基因)，并且用于保持cms誘導(dǎo)系的儲備。保持系優(yōu)選地關(guān)于非恢復(fù)系等位基因(例如，rf4)以及r1顏色標(biāo)記(例如，r1-nj或r1-scm2)為純合的。另外，保持系可包含cenh3突變。在本文中，保持系用作與cms品系雜交的雄性，該cms品系可以包含或可以不包含cenh3突變。如本文所用，術(shù)語“正常細(xì)胞質(zhì)”是指可育的細(xì)胞型(與細(xì)胞質(zhì)雄性不育相反)?？梢詫⒈３窒底越灰栽黾悠浞N子儲備。

138、如本文所用，當(dāng)鑒定hi相關(guān)的基因座的存在/不存在時(shí)，術(shù)語“分子標(biāo)記”可以用于指如上文所定義的遺傳標(biāo)記，或其用作參比點(diǎn)的編碼產(chǎn)物(例如，蛋白質(zhì))。分子標(biāo)記可以源自基因組核苷酸序列或表達(dá)的核苷酸序列(例如，源自rna、cdna等)。該術(shù)語也指與標(biāo)記序列互補(bǔ)或與位于其側(cè)翼的核苷酸序列，如用作能夠擴(kuò)增標(biāo)記序列的探針和/或引物的核苷酸序列。當(dāng)核苷酸序列在溶液中特異性雜交時(shí)，這些核苷酸序列是“互補(bǔ)的”(例如，根據(jù)沃森-克里克堿基配對原則)。此術(shù)語也指通過與標(biāo)記序列互補(bǔ)或與位于其側(cè)翼的核苷酸序列(如用作能夠擴(kuò)增標(biāo)記序列的探針和/或引物的核苷酸序列)的不存在指示性狀的遺傳標(biāo)記。

139、如本文所用，術(shù)語“核苷酸序列”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核酸分子”和“核酸片段”是指單鏈或雙鏈的rna或dna的聚合物，任選地含有合成的、非天然的、和/或改變的核苷酸堿基。“核苷酸”是從其構(gòu)建dna或rna聚合物并且由嘌呤或嘧啶堿基、戊糖和磷酸基團(tuán)組成的單體單元。核苷酸(通常以其5'-單磷酸酯形式發(fā)現(xiàn))以其單字母名稱表示如下：“a”表示腺苷酸或脫氧腺苷酸(分別用于rna或dna)，“c”表示胞苷酸或脫氧胞苷酸，“g”表示鳥苷酸或脫氧鳥苷酸，“u”表示尿苷酸，“t”表示脫氧胸苷酸，“r”表示嘌呤(a或g)，“y”表示嘧啶(c或t)，“k”表示g或t，“h”表示a或c或t，“i”表示肌苷，并且“n”表示任何核苷酸。

140、術(shù)語“后代”是指作為一種或多種親本植物或其后裔的營養(yǎng)或有性繁殖的子代的任何植物。例如，后代植物可以通過親本植物的克隆或自交或者通過兩個(gè)親本植物的雜交而獲得，并且包括自交體以及f1或f2或甚至更遠(yuǎn)的世代。f1是由親本(其中至少一方是首次用作性狀的供體)生成的第一世代后代，而第二世代(f2)或隨后世代(f3、f4等)的后代是由f1、f2等的自交生成的樣本。因此，f1可以是由兩個(gè)純種親本(純種是關(guān)于性狀為純合的)之間的雜交產(chǎn)生的雜種，而f2可以是由該f1雜種的自花授粉產(chǎn)生的后代。

141、術(shù)語“pcr(聚合酶鏈反應(yīng))”在本發(fā)明的范圍內(nèi)被理解為是指產(chǎn)生dna的相對較大量的具體區(qū)域，從而進(jìn)行可能的基于那些區(qū)域的不同的分析的方法。

142、如本文所用，術(shù)語“植物”可以是指全株植物、其任何部分、或從植物衍生的細(xì)胞或組織培養(yǎng)物。因此，除非另有說明，否則術(shù)語“植物”可以指以下中的任一項(xiàng)：全株植物、植物組分或器官(例如，葉片、莖、根等)、植物組織、種子和/或植物細(xì)胞。

143、“植物細(xì)胞”是植物的結(jié)構(gòu)和生理單元，包含原生質(zhì)體和細(xì)胞壁。植物細(xì)胞可以呈分離的單一細(xì)胞或經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞的形式，或作為高等組織化單元(如例如，植物組織、植物器官或全株植物)的一部分。

144、如本文所用，“保存的花粉”是指手動收集的并且以一些方式儲存以供將來使用的花粉(參見通過引用并入本文的美國申請?zhí)?3/289299)。

145、如本文所用，術(shù)語“引物”是指如下寡核苷酸，當(dāng)置于誘導(dǎo)引物延伸產(chǎn)物合成的條件下(例如，在核苷酸和用于聚合的試劑(如dna聚合酶)的存在下以及在合適的溫度和ph下)時(shí)，其能夠退火至核酸靶標(biāo)(在一些實(shí)施例中，特異性地退火至核酸靶標(biāo))，以允許dna聚合酶和/或逆轉(zhuǎn)錄酶與其附接，從而用作dna合成的起始點(diǎn)。在一些實(shí)施例中，采用一個(gè)或多個(gè)引物來擴(kuò)增植物核酸(例如，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；pcr)。

146、如本文所用，術(shù)語“探針”是指可以與靶核酸序列中的互補(bǔ)序列形成氫鍵合的雙鏈體的核酸(例如，單鏈核酸或雙鏈或更高級核酸的鏈、或其子序列)。典型地，探針具有足夠的長度以便與其互補(bǔ)序列形成穩(wěn)定且序列特異性的雙鏈體分子，并且這樣可以在一些實(shí)施例中用于檢測在多個(gè)核酸中存在的目的序列。

147、術(shù)語“植物細(xì)胞培養(yǎng)物”意指植物單元(如例如，原生質(zhì)體、細(xì)胞培養(yǎng)物細(xì)胞、植物組織中的細(xì)胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、接合子以及處于不同發(fā)育階段的胚)的培養(yǎng)物。

148、“植物材料”是指葉、莖、根、花或花的部分、果實(shí)、花粉、卵細(xì)胞、接合子、種子、切條、細(xì)胞或組織培養(yǎng)物、或植物的任何其他部分或產(chǎn)物。

149、“植物器官”是植物的獨(dú)特而明顯的已結(jié)構(gòu)化并且分化的部分，如根、莖、葉、花蕾或胚。

150、如本文所使用的，“植物組織”是指被組織化成結(jié)構(gòu)和功能單元的植物細(xì)胞群組。包括植物中或培養(yǎng)中的任何植物組織。此術(shù)語包括但不限于全株植物、植物器官、植物種子、組織培養(yǎng)物以及被組織化成結(jié)構(gòu)和/或功能單元的任何植物細(xì)胞群組。此術(shù)語與如以上列出的或由該定義以其他方式涵蓋的任何特定類型的植物組織的聯(lián)合應(yīng)用或單獨(dú)應(yīng)用并不旨在排除任何其他類型的植物組織。

151、術(shù)語“植物部分”指示植物的一部分，包括單細(xì)胞和細(xì)胞組織(例如植物中完整的植物細(xì)胞)、細(xì)胞團(tuán)塊和可以再生植物的組織培養(yǎng)物。植物部分的實(shí)例包括但不限于來自以下的單細(xì)胞和組織：花粉、胚珠、葉片、胚、根、根尖、花藥、花、果實(shí)、莖、芽和種子；以及花粉、胚珠、葉、胚、根、根尖、花藥、花、果實(shí)、莖、芽、接穗、根莖、種子、原生質(zhì)體、愈傷組織等。

152、如本文所用，術(shù)語“表型”、“表型性狀”或“性狀”是指植物或植物細(xì)胞的一種或多種性狀。表型是可通過裸眼或通過本領(lǐng)域已知的任何其他評估方式(例如，顯微術(shù)、生物化學(xué)分析、或電子機(jī)械測定)觀察的。在一些情況下，表型直接由單一基因或遺傳基因座控制(即，對應(yīng)于“單基因性狀”)。在單倍體誘導(dǎo)的情況下，使用顏色標(biāo)記(例如r?navajo)和其他標(biāo)記(包括通過種子內(nèi)顏色的存在或不存在來可視化的轉(zhuǎn)基因)證明種子是否是誘導(dǎo)的單倍體種子。使用rnavajo作為顏色標(biāo)記和使用轉(zhuǎn)基因作為檢測雌株上單倍體種子誘導(dǎo)的手段在本領(lǐng)域是熟知的。在其他情況下，表型是若干個(gè)基因之間相互作用的結(jié)果，在一些實(shí)施例中，其也由植物和/或植物細(xì)胞與其環(huán)境相互作用引起。

153、如本文所用，術(shù)語“群體”意指共享共同的遺傳衍生(genetic?derivation)的植物的遺傳上異質(zhì)的集合。

154、如本文所用，術(shù)語“引物”是指如下寡核苷酸，當(dāng)置于誘導(dǎo)引物延伸產(chǎn)物合成的條件下(例如，在核苷酸和用于聚合的試劑(如dna聚合酶)的存在下以及在合適的溫度和ph下)時(shí)，其能夠退火至核酸靶標(biāo)(在一些實(shí)施例中，特異性地退火至核酸靶標(biāo))，以允許dna聚合酶和/或逆轉(zhuǎn)錄酶與其附接，從而用作dna合成的起始點(diǎn)。在一些實(shí)施例中，采用一個(gè)或多個(gè)引物來擴(kuò)增植物核酸(例如，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；pcr)。

155、如本文所用，術(shù)語“引物”是指如下寡核苷酸，當(dāng)置于誘導(dǎo)引物延伸產(chǎn)物的合成的條件下(例如在核苷酸和用于聚合的試劑如dna聚合酶的存在下并且在合適的溫度和ph下)時(shí)，其能夠退火至擴(kuò)增靶標(biāo)，以允許dna聚合酶附接，從而用作dna合成的起始點(diǎn)。(擴(kuò)增)引物優(yōu)選地是單鏈的，以獲得最大的擴(kuò)增效率。優(yōu)選地，引物是寡脫氧核糖核苷酸。引物通常足夠長以在用于聚合的試劑存在下引發(fā)延伸產(chǎn)物的合成。引物的確切長度將取決于許多因素，包括引物的溫度和組成(a/t和g/c含量)。一對雙向引物由dna擴(kuò)增領(lǐng)域中(諸如在pcr擴(kuò)增中)常用的一個(gè)正向引物和一個(gè)反向引物組成。應(yīng)當(dāng)理解的是，如本文所用，“引物”可以指超過一種引物，特別是在關(guān)于待擴(kuò)增的靶區(qū)域的一個(gè)或多個(gè)末端序列的信息中存在一些模糊性的情況下。因此，“引物”包括含有代表該序列中的可能變異的序列的引物寡核苷酸的集合，或包括允許典型的堿基配對的核苷酸。寡核苷酸引物可以通過任何合適的方法制備。用于制備特異性序列的寡核苷酸的方法是本領(lǐng)域已知的，并且包括例如適當(dāng)序列的克隆和限制以及直接化學(xué)合成?；瘜W(xué)合成方法可以包括例如在例如us?4,458,066中披露的磷酸二酯或三酯法、二乙基氨基磷酸酯法和固相載體法。如果需要，可以通過并入可通過例如光譜方法、熒光方法、光化學(xué)方法、生物化學(xué)方法、免疫化學(xué)方法或化學(xué)方法檢測的手段來對引物進(jìn)行標(biāo)記。一種或多種寡聚核苷酸引物的模板依賴性延伸由聚合試劑在適量的四種脫氧核糖核苷酸三磷酸(datp、dgtp、dctp和dttp；即dntp)或類似物的存在下、在反應(yīng)介質(zhì)(包含適當(dāng)?shù)柠}、金屬陽離子和ph緩沖體系)中催化。合適的聚合劑是已知催化引物和模板依賴性dna合成的酶。已知的dna聚合酶包括例如大腸桿菌dna聚合酶或其klenow片段、t4dna聚合酶和taq?dna聚合酶。用這些dna聚合酶催化dna合成的反應(yīng)條件是本領(lǐng)域已知的。合成的產(chǎn)物是由模板鏈和引物延伸鏈組成的雙鏈分子，其包括靶序列。這些產(chǎn)物反過來作為另一輪復(fù)制的模板。在第二輪復(fù)制中，第一輪循環(huán)的引物延伸鏈用其互補(bǔ)引物退火；合成產(chǎn)生“短”產(chǎn)物，該產(chǎn)物通過引物序列或其互補(bǔ)物在5'-末端和3'-末端兩者上結(jié)合。變性、引物退火和延伸的重復(fù)循環(huán)導(dǎo)致由引物限定的靶區(qū)域的指數(shù)累積。進(jìn)行足夠的循環(huán)以實(shí)現(xiàn)所希望量的含有核酸靶區(qū)域的多核苷酸。所希望的量可以變化，并且由產(chǎn)物多核苷酸起到的功能決定。pcr方法在手冊中已經(jīng)很好地描述，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。通過pcr進(jìn)行擴(kuò)增后，可以通過與探針多核苷酸雜交來檢測靶多核苷酸，該探針多核苷酸在低、中度或甚至高度嚴(yán)格的雜交和洗滌條件下與靶序列的多核苷酸形成穩(wěn)定的雜交體。如果預(yù)期探針將與靶序列基本上完全互補(bǔ)(即，約99％或更多)，則可以使用高度嚴(yán)格條件。如果預(yù)期有一些錯(cuò)配，例如如果預(yù)期變體品種會導(dǎo)致探針不完全互補(bǔ)，則可以降低雜交的嚴(yán)格性。然而，典型地選擇排除非特異性/偶然結(jié)合的條件。影響雜交并針對非特異性結(jié)合而選擇的條件是本領(lǐng)域已知的，并且描述于例如sambrook和russell,2001中。通常，較低的鹽濃度和較高溫度增加了雜交條件的嚴(yán)格性?！皃cr引物”在本發(fā)明的范圍內(nèi)優(yōu)選地被理解為是指dna的特定區(qū)域的pcr擴(kuò)增中所用的單鏈dna的相對短的片段。

156、如本文所用，術(shù)語“探針”是指可以與靶核酸序列中的互補(bǔ)序列形成氫鍵合的雙鏈體的核酸(例如，單鏈核酸或雙鏈或更高級核酸的鏈、或其子序列)。典型地，探針具有足夠的長度以便與其互補(bǔ)序列形成穩(wěn)定且序列特異性的雙鏈體分子，并且這樣可以在一些實(shí)施例中用于檢測在多個(gè)核酸中存在的目的序列。

157、術(shù)語“探針”是指將與靶核酸分析物或其cdna衍生物中的基本上互補(bǔ)的寡核苷酸形成氫鍵合雙鏈體的單鏈寡核苷酸。

158、如本文所用，術(shù)語“標(biāo)記探針”和“探針”是指可以用于檢測較大序列內(nèi)序列的存在或不存在的核苷酸序列或核酸分子，例如，通過核酸雜交與標(biāo)記或標(biāo)記基因座的全部或部分互補(bǔ)的核酸探針。包含約8、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100個(gè)或更多個(gè)連續(xù)核苷酸的標(biāo)記探針可以用于核酸雜交。

159、術(shù)語“子代”是指特定雜交的一個(gè)或多個(gè)后裔。典型地，子代由兩個(gè)個(gè)體的育種產(chǎn)生，但一些物種(特別是一些植物和雌雄同體的動物)可以自體受精(即，同一個(gè)植物充當(dāng)雄性和雌性配子兩者的供體)。該一個(gè)或多個(gè)后裔可以是例如f1、f2或任何后續(xù)世代。

160、如本文所用，術(shù)語“子代”和“子代植物”是指從一個(gè)或多個(gè)親本植物通過營養(yǎng)繁殖或有性繁殖生成的植物。在單雌生殖-介導(dǎo)的單倍體誘導(dǎo)中，母本上的單倍體胚包含雌性染色體排除雄性染色體—因此它不是雄性單倍體-誘導(dǎo)品系的子代。單倍體玉米種子典型地仍然具有含有雄性染色體組的正常的三倍體胚乳。經(jīng)編輯的單倍體子代和隨后的經(jīng)編輯的雙單倍體植物和隨后的種子不是唯一的所希望子代。還有常常攜帶cas9轉(zhuǎn)基因的來自單倍體誘導(dǎo)系本身的種子、和后續(xù)植物以及單倍體誘導(dǎo)植物的種子子代。單倍體種子和單倍體誘導(dǎo)系(自花授粉誘導(dǎo)的)種子可以是子代。子代植物可以通過克隆單一親本植物或使單一親本植物自交、或者通過使兩個(gè)或更多個(gè)親本植物雜交來獲得。例如，子代植物可以通過一個(gè)親本植物的克隆或自交或者通過兩個(gè)親本植物的雜交而獲得，并且包括自交體以及f1或f2或甚至更遠(yuǎn)的世代。f1是生成自兩個(gè)親本的第一世代子代(兩個(gè)親本中至少一個(gè)是第一次用作性狀的供體)，而第二代(f2)或后續(xù)代(f3、f4等)的子代是生成于f1、f2等的自交、互交、回交和/或其他雜交的樣本。因此，f1可以是(并且在一些實(shí)施例中是)從兩個(gè)純種親本(即，純種的親本各自關(guān)于目的性狀或其等位基因都為純合的)之間的雜交產(chǎn)生的雜交種，而f2可以是(并且在一些實(shí)施例中是)從f1雜交種自花授粉產(chǎn)生的子代。

161、術(shù)語“r1-nj”和“r1-scm2”是指r1-navajo和r1-scm2花色素苷標(biāo)記。這些視覺標(biāo)記可用于區(qū)分單倍體與二倍體(或非整倍體)。如本文所述，單倍體植物的顏色被鑒定為奶油色，而二倍體的顏色是紫色。

162、如本文所用，術(shù)語“再生”及其語法變體是指從組織培養(yǎng)物中生成植物。

163、如本文所用，“恢復(fù)系因子”或“育性恢復(fù)系”或“rf”或“恢復(fù)系等位基因”是指植物中恢復(fù)雄性不育植物的育性的一個(gè)或多個(gè)基因。恢復(fù)系因子基因的實(shí)例包括但不限于rf3、rf4、rf10、rf11和rf12。植物關(guān)于一種或多種恢復(fù)系因子基因可以為雜合的或純合的。例如，植物可以含有rf4以及rf11，但也可以是rf10。雜交中的另一種植物可以是rf4，但也可以是rf11和rf10。因此，每一植物都可以含有和缺乏恢復(fù)系等位基因和非恢復(fù)系等位基因。因此，包含至少一個(gè)恢復(fù)系等位基因的cms植物仍將是雄性可育的。

164、非恢復(fù)系等位基因(也稱為“rf”)意指植物中不會恢復(fù)雄性不育植物的育性的一種或多種基因。非恢復(fù)系等位基因的實(shí)例包括但不限于rf3、rf4、rf10、rf11和rf12。如果植物具有cms，則關(guān)于非恢復(fù)系等位基因?yàn)榧兒系闹参飳⑹切坌圆挥摹?/p>

165、如本文所用，“自發(fā)染色體加倍”(“scd”)或“自發(fā)單倍體基因組加倍”或“單倍體雄性育性”或“自發(fā)基因組加倍”可互換使用，以描述在沒有任何干預(yù)的情況下單倍體基因組的加倍。scd允許正確的染色體減數(shù)分裂減少和隨后形成成熟花粉。在本披露中，scd通過將可育性單倍體植物的數(shù)目/除以植物的總數(shù)來計(jì)算。

166、如本文所用，“自發(fā)雙單倍體植物”是指其小花已經(jīng)歷自發(fā)加倍的植物。自發(fā)雙單倍體植物的其他組織可以保留其單倍體狀態(tài)(例如，根、葉、莖)。

167、如本文所用，術(shù)語“靶向誘變”或“誘變策略”是指導(dǎo)致所選擇的基因的有意誘變的任何誘變方法。靶向誘變包括crispr、tilling、talen方法和其他尚未發(fā)現(xiàn)但可以用于實(shí)現(xiàn)相同結(jié)果的其他方法。如本文所用，術(shù)語“靶向誘變”或“誘變策略”是指導(dǎo)致所選擇的基因的有意誘變的任何誘變方法。靶向誘變包括crispr、tilling、talen方法和其他尚未發(fā)現(xiàn)但可以用于實(shí)現(xiàn)相同結(jié)果的其他方法。

168、如本文所用，術(shù)語“性狀”是指目的表型、促成目的表型的基因、以及與促成目的表型的基因相關(guān)聯(lián)的核酸序列。例如，“hi性狀”是指單倍體誘導(dǎo)表型、以及促成單倍體誘導(dǎo)的基因(例如，玉蜀黍中的matl或水稻中的os03g27610)和與單倍體誘導(dǎo)表型的存在或不存在相關(guān)的核酸序列(例如，hi相關(guān)的基因產(chǎn)物)。

169、如本文所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)染”是指將核酸引入細(xì)胞中。

170、如本文所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”是指通過某些形式的人工轉(zhuǎn)移技術(shù)引入生物體或一個(gè)或多個(gè)其祖先中的核酸分子。因此，人工轉(zhuǎn)移技術(shù)建立“轉(zhuǎn)基因生物體”或“轉(zhuǎn)基因細(xì)胞”。應(yīng)當(dāng)理解的是，人工轉(zhuǎn)移技術(shù)可以在祖先生物體(或其中的細(xì)胞和/或可以發(fā)育成祖先生物體的細(xì)胞)中發(fā)生，并且即使一種或多種自然和/或輔助育種導(dǎo)致了人工轉(zhuǎn)移的核酸分子存在于子代個(gè)體中，具有人工轉(zhuǎn)移的核酸分子或其片段的任何子代個(gè)體仍然被認(rèn)為是轉(zhuǎn)基因的。